Для визначення МЧ мікобактерій до Z як контроль використовують спеціальні пробірки MGIT із рН = 5,9. До набору BACTEC MGIT 960 PZA входять два флакони з ліофілізованим Z і шість флаконів живильної добавки. Перед використанням до флакона BACTEC MGIT 960 PZA, що містить ліофілізований препарат, слід додати 2,5 мл дистильованої/дейонізованої води, щоб одержати розчин, що містить 8 000 мкг/мл Z. Потім 100 мкл одержаного розчину переносять до пробірки MGIT (рН = 5,9) для досягнення "критичної" концентрації Z у бульйоні. Тривалість тестування становить 4-20 діб.
Визначення МЧ виділених культур M. tuberculosis у вперше захворівших та хворих на рецидив ТБ легень потрібно обов’язково проводити до S, Н, E, R і Z. За наявності МС до цих препаратів або до Н та R рекомендують проведення ТМЧ до Et, Pt, Cm, Lfx, Am, Km, Mfx, Ofх, лінезоліду (Lzd), клофазиміну (Cfz), бедаквіліну (Bdq) і деламаніду (Dlm).
7. У хворих із повторним курсом лікування (невдале лікування та лікування після перерви) і хворих із хронічним перебігом ТБ потрібно проводити визначення МЧ M. tuberculosis до всіх препаратів одразу з урахуванням результатів попередніх досліджень.
ТМЧ у системі МGIT мають проводитися за такою схемою:
позитивний результат у системі МGIТ + позитивний результат на щільному середовищі Левенштейна-Єнсена.
Культура MGIT ® ТМЧ МGIT:
позитивний результат у системі МGIТ + негативний результат на щільному середовищі Левенштейна-Єнсена.
Культура МGIТ ® ТМЧ МGIT:
негативний результат у системі МGIТ + позитивний результат на щільному середовищі Левенштейна-Єнсена.
Культура Левенштейна-Єнсена ® ТМЧ МGIТ.
Розчинення препаратів першого ряду і підготовка пробірок із рідким середовищем для постановки ТМЧ (додаток 9) процедури здійснюють у ШББ.
8. Стандартні концентрації препаратів для використання в системі ВАСТЕС МGIТ (мкг/мл): S - 1,0; H - 0,1; R - 1,0; E - 5,0; Z - 100,0.
Схема процедур:
розчинити препарати (постачаються ліофілізованими у флаконах) шляхом додавання 4,0 мл стерильної дистильованої води до флаконів із S, H, R і E та 2,5 мл до флакона із Z;
промаркувати пробірки, зазначаючи на них номер зразка, найменування препарату й призначення пробірки;
для постановки одного ТМЧ мікобактерій до препаратів I ряду потрібно підготувати сім пробірок: 1 пробірка - контроль SIRE, 1 пробірка - контроль Z, 5 пробірок із препаратами;
за допомогою піпетки-дозатора зі стерильним наконечником додати по 800 мкл відповідних добавок до пробірок із препаратами й до контрольних пробірок (добавку РZА - до пробірки із Z і до Z контролю, добавку SIRE - до пробірок із S, H, R, E і до SIRE контролю);
за допомогою піпетки зі стерильним наконечником додати 100 мкл розчину препаратів (S, H, R, E і Z - до відповідних маркованих пробірок МGIT;
не додавати препаратів до пробірок, які буде використано для контролю росту мікобактерій.
9. Стандартні концентрації препаратів II ряду для використання в системі ВАСТЕС МGIТ 960 (мкг/мл): Lfx - 1,0; Mfx - 0,25 і 1,0; Ofх - 2,0; Am - 1,0; Km - 2,5; Cm - 2,5; Et - 5,0; Pt - 2,5; Lzd - 1,0; Cfz - 1,0; Bdq - 1,0; Dlm - 0,06.
Розчинення препаратів другого ряду і підготовка пробірок із рідким середовищем для постановки ТМЧ (додаток 10) процедури здійснюють у ШББ.
Розведення протитуберкульозних препаратів готують із ХЧ субстанцій препаратів II ряду з використанням стерильної дистильованої води чи інших розчинників.
Схема процедур:
Левофлоксацин (Lfx) - 1,0 мкг/мл:
8,4 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH = 840 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 84,0 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Моксифлоксацин (Мfx) - 1,0 мкг/мл:
16,8 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH = 1 680 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,0 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл стерильної дистильованої води = 84,0 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Моксифлоксацин (Мfx) - 0,25 мкг/мл:
Для приготування концентрації Mfx 0,25 мкг/мл використовуємо третє розведення, що було нами отримано під час приготування концентрації 1,0 мкг/мл (див. вище);
1,0 мл третього розведення з концентрацією Mfx 84,0 мкг/мл + 3,0 мл стерильної дистильованої води = 21,0 мкг/мл;
внести 0,1 мл розведення 21,0 мкг/мл до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 0,25 мкг/мл.
Амікацин (Am) - 1,0 мкг/мл:
16,8 мг активної речовини чистої субстанції препарату (амікацин сульфат) + 10,0 мл дистильованої води = 1 680 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,0 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл стерильної дистильованої води = 84,0 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Канаміцин (Km) - 2,5 мкг/мл:
10,5 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 5,0 мл стерильної дистильованої води = 2 100 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 210 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 2,5 мкг/мл.
Капреоміцин (Cm) - 2,5 мкг/мл:
10,5 мг активної речовини чистої субстанції препарату (капреоміцин сульфат) + 5,0 мл стерильної дистильованої води = 2 100 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 210 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 2,5 мкг/мл.
Етіонамід (Et) - 5,0 мкг/мл:
21,0 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 5,0 мл димексиду (DMSO) = 4 200 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 420,0 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 5,0 мкг/мл.
Протіонамід (Pt) - 2,5 мкг/мл:
10,5 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 5,0 мл DMSO = 2 100 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 210 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 2,5 мкг/мл.
Лінезолід (Lzd) - 1,0 мкг/мл:
4,9 мг активної речовини чистої субстанції препарату (наважка 5,0 мг – вміст упаковки) + 2,9 мл стерильної дистильованої води = 1 689 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,9 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл дистильованої води = 84,5 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Клофазимін (Cfz) - 1,0 мкг/мл:
16,8 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 10,0 мл димексиду (DMSO) = 1 680 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 168,0 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл DMSO = 84,0 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Бедаквілін (Bdq) - 1,0 мкг/мл:
4,9 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 2,9 мл димексиду (DMSO) = 1 689 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 168,9 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл DMSO = 84,5 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Деламанід (Dlm) - 0,06 мкг/мл:
4,9 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 2,9 мл димексиду (DMSO) = 1 689 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,9 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 7,0 мл дистильованої води = 21,1 мкг/мл (третє розведення);
1,0 мл третього розведення + 3,0 мл дистильованої води = 5,28 мкг/мл (четверте розведення);
внести 0,1 мл четвертого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 0,06 мкг/мл.
Промаркувати пробірки, зазначаючи на них номер зразка, найменування препарату й призначення пробірки.
9. Для постановки ТМЧ для одного штаму M. tuberculosis до препаратів II ряду потрібно підготувати п’ять пробірок: один контроль і чотири пробірки з препаратами II ряду (або вісім пробірок: один контроль і сім пробірок із препаратами II ряду залежно від того, чи має лабораторія штативи для ВАСТЕС MGIT 960 до ТМЧ II ряду на 8 гнізд.)
За допомогою піпетки зі стерильним наконечником додати по 800 мкл відповідних добавок до пробірок із препаратами й до контрольних пробірок, а добавку SIRE - до контролю та пробірок із Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz.
За допомогою піпетки зі стерильним наконечником додати 100 мкл розчину препаратів (Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz) до відповідних маркованих пробірок МGIT.
Не додавати препаратів до пробірок, які буде використано для контролю росту мікобактерій.
Для постановки ТМЧ для одного штаму M. tuberculosis до препаратів I та II ряду (додаток 11) потрібно використовувати 15 пробірок: 1 пробірка - контроль для препаратів I ряду (штатив із препаратами I ряду), 1 пробірка - контроль II ряду (штатив із препаратами II ряду), 1 пробірка - контроль Z, 12 пробірок із препаратами (SIRE та S, H, R, E, Z, Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz).
10. Приготування суспензії мікобактерій з позитивних проб (після культивування в пробірці MGIT) для постановки ТМЧ в рідкому середовищі в системі BACTEC MGIT.
Важливим фактором є "вік" культури в днях, що пройшов з моменту, коли було отримано позитивну культуру в системі MGIT.
День, у який цю культуру було вперше ідентифіковано системою як позитивну, вважається "нульовим" (день 0).
Для одержання культури, придатної до подальших тестів на ТМЧ, пробірку потрібно інкубувати в системі щонайменше ще добу (тобто до дня 1). Якщо простір у системі є критичним чинником, що стримує швидкість роботи, пробірка може бути вилучена із системи після дня 0 (тобто після одержання позитивної відповіді) і культивуватися в наступні дні в термостаті за температури 37 -°C.
Культура є придатною для посіву на ТМЧ протягом п’яти днів після дня 0 (тобто впродовж днів 1–5).
Якщо культура інкубувалась у системі або термостаті довше ніж 5 днів після повідомлення про позитивний результат (тобто починаючи із шостої доби і далі), вона непридатна для проведення ТМЧ у системі MGIT. Для того, щоб зробити ТМЧ із позитивної культури (MGIT "+"), що була витримана в термостаті довше ніж п’ять діб, потрібно здійснити її субкультивування, тобто 0,5 мл цієї культури потрібно посіяти у нову пробірку MGIT і культивувати в апараті до отримання позитивного результату.
Процедури підготовки культури для ТМЧ трохи розрізнюються залежно від "віку" культур (тобто днів, що пройшли з моменту одержання позитивного результату).
Проведення ТМЧ із культури віком 1-2 дні (додаток 12):
струсити пробірку (бажано на вортексі) для гомогенізації й подрібнення наявних згустків (скупчень мікобактерій);
залишити пробірку на 5-10 хв для осадження великих часток;
використовувати надосадову рідину для інокуляції пробірок із препаратами.
Проведення ТМЧ із культури віком 3-5 днів:
струсити пробірку (бажано на вортексі) для гомогенізації й подрібнення наявних згустків (скупчень мікобактерій);
залишити пробірку на 5-10 хв для осадження великих часток;
до окремої стерильної пробірки перенести 1,0 мл надосадової рідини й додати 4,0 мл стерильного ізотонічного розчину NаСl, щоб отримати, таким чином, розведення 1 : 5. Використовувати його для інокуляції пробірок із препаратами.
Приготувати розведення суспензії мікобактерій 1 : 100 для посіву контрольних пробірок SIRЕ. Для цього додати 0,1 мл суспензії мікроорганізмів (надосадової рідини 1-2-денної культури або розведення 1 : 5 3-5 денної культури) до пробірки з 10,0 мл стерильного ізотонічного розчину NaС1. Добре перемішати й використовувати для посіву в контрольні пробірки (без препаратів).
Під час тестування на стійкість до Z для посіву в контрольну пробірку Z готують розведення 1 : 10 (не 1 : 100). Для одержання такого розведення додати 0,5 мл суспензії (розведення 1 : 5 для 3-5-денної культури або суспензії 1-2-денної культури) до пробірки з 4,5 мл. Використовувати це розведення для інокуляції контрольних пробірок під час тестування стійкості до Z.
11. Для приготування суспензії мікобактерій, що були культивовані на щільних середовищах для постановки ТМЧ MGIT (додаток 13), потрібно:
для постановки ТМЧ використовувати культуру із щільного живильного середовища Левенштейна-Єнсена не пізніше ніж через 15 діб із моменту появи росту мікобактерій;
додати до пробірки 4,0 мл ізотонічного розчину NаСl;
за допомогою традиційного способу зібрати максимальну кількість колоній із поверхні середовища в стерильний ізотонічний розчин NаСl, уникаючи при цьому потрапляння середовища до ізотонічного розчину NаСl;
щільно закрити пробку й суспендувати на вортексі протягом 1-3 хв для повного подрібнення згустків. Проконтролювати мутність суспензії за стандартом мутності МсFarland (мутність суспензії має бути більшою, ніж 1,0);
залишити пробірку із суспензією на 20 хв для осадження великих часток;
акуратно перенести надосадову рідину піпеткою до іншої стерильної пробірки, не торкаючись осаду на дні пробірки. Залишити пробірку з надосадовою рідиною на 15 хв для осадження всіх часток, що залишилися;
акуратно перенести надосадову рідину до наступної стерильної пробірки, не торкаючись осаду;
проконтролювати мутність отриманої суспензії за стандартом мутності (має бути більшою, ніж 0,5). Довести мутність суспензії до значення 0,5 шляхом додавання до пробірки стерильного ізотонічного розчину. Стежити, щоб значення мутності не було меншим, ніж 0,5;
розвести отриману суспензію в співвідношенні 1 : 5 стерильним ізотонічним розчином NaCl. Для цього потрібно перенести 1,0 мл отриманої суспензії до пробірки із 4,0 мл стерильного ізотонічного розчину NаСl і перемішати. Використовувати отримане розведення (1 : 5) для інокуляції в пробірки МGIТ із препаратами;
приготувати розведення отриманої суспензії (1 : 100) для посіву до контрольних пробірок. Для цього потрібно додати 0,1 мл отриманої суспензії до пробірки з 10,0 мл стерильного ізотонічного розчину NаС1 і перемішати. Використовувати таке розведення для посіву в контрольні пробірки.
Під час тестування на стійкість до Z для посіву в контрольну пробірку готують розведення 1 : 10 (не 1 : 100). Для одержання такого розведення потрібно додати 0,5 мл суспензії (розведення 1 : 5) до пробірки із 4,5 мл ізотонічного розчину NаС1. Використовувати це розведення для інокуляції контрольних пробірок під час тестування стійкості до Z.
Для постановки ТМЧ одного штаму M. tuberculosis до препаратів I ряду потрібно підготувати сім пробірок: одна пробірка - контроль SIRE, одна пробірка - контроль Z, чотири пробірки із препаратами та SIRE і Z.
Для постановки ТМЧ одного штаму M. tuberculosis одночасно до препаратів I та II ряду потрібно:
використовувати 15 пробірок: одна пробірка - контроль для препаратів I ряду (штатив із препаратами I ряду), одна пробірка - контроль II ряду (штатив із препаратами II ряду), одна пробірка - контроль Z, 12 пробірок із препаратами (SIRE та S, H, R, E, Z, Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz);
внести піпеткою зі стерильним наконечником 0,5 мл розведення 1 : 100 до контрольних пробірок, які використовують для контролю росту мікобактерій під час тестування на чутливість до препаратів I (SIRE) та/або II ряду;
внести піпеткою зі стерильним наконечником 0,5 мл розведення 1 : 10 до пробірок без препаратів, які використовують для контролю росту мікобактерій під час тестування на стійкість до Z;
внести по 0,5 мл суспензії мікобактерій 1 : 5, отриманої з культури, вирощеної на щільному середовищі, або суспензії 1-2-денної культури мікобактерій, або розведення 1 : 5 для 3-5-денної культури мікобактерій, вирощених у системі МGIТ, до кожної з п’яти пробірок із препаратами I ряду (S, H, R, E і Z) та/або до пробірок із препаратами II ряду (Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz);
після інокуляції негайно щільно закрити пробки пробірок, перемішати перевертанням кілька разів, встановити пробірки в потрібному порядку в тримач МGIТ і помістити їх у ящики приладу МGIТ у гнізда, зазначені приладом. Переконатися в тому, що кришки пробірок щільно закриті. Не переміщувати й не рухати пробірок у процесі інкубації в приладі;
тривалість проведення ТМЧ у системі зазвичай становить від 4 до 21 доби.
12. Система МGIТ проводить автоматичний моніторинг росту мікобактерій і повідомляє про завершення тесту в разі досягнення певного значення мутності середовища в контрольній пробірці. У разі одержання такого повідомлення всі пробірки, у які було посіяно такий матеріал, можуть бути витягнуті із приладу й відскановані для одержання остаточного результату дослідження. Результат видається системою у вигляді повідомлень "R-resistante" (стійкий), або "S-Sensitive" (чутливий). Визначення результатів системою здійснюється шляхом виміру оптичної щільності в пробірках із препаратами й порівняння її зі щільністю контрольної пробірки. За наявності росту в контрольних пробірках раніше ніж на четверту добу (що може свідчити про контамінацію) або за його відсутності після закінчення 21 доби система видає повідомлення "X-Error" ("помилка"). Таке саме повідомлення може видаватися й під час виникнення інших обставин, що впливають на якість тесту.
Під час одержання повідомлення про помилку пробірки потрібно витягти із приладу, інокулювати нові порції суспензії мікобактерій до нових пробірок і повторити дослідження.
13. ВКЯ під час роботи на автоматизованій системі ВАСТЕС 960 здійснюється із кожною новою партією наборів для визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП. Із цією метою проводять постановку тесту з використанням чутливого (Н37Rv) й стійкого до Н штамів M. tuberculosis із колекції АТСС, а також завідомо чутливого й резистентного до Н ізолятів M. tuberculosis, виділених від хворих на ТБ.
14. Окрім методу пропорцій на щільному та рідкому живильному середовищах і непрямого методу абсолютних концентрацій для визначення МЧ M. Tuberculosis, може бути використано такі альтернативні методи:
метод коефіцієнта стійкості;
прямий метод абсолютних концентрацій.
Суть методу коефіцієнта резистентності полягає у визначенні мінімальної інгібуючої концентрації ПТП для клінічних штамів мікобактерій і співвідношення МІК тих самих препаратів для завідомо чутливого лабораторного штаму мікобактерій (як правило, H37Rv). Це найбільш трудомісткий і дорогий метод, оскільки вимагає використання великої кількості пробірок із живильним середовищем, тому його застосовують в основному для наукових досліджень.
Основним недоліком традиційних культуральних методів визначення МЧ M. tuberculosis є їх надзвичайна тривалість. Результати ТМЧ враховують через 3-4 тижні інкубації в термостаті, тому потрібну корекцію хіміотерапії може бути проведено в кращому разі лише через 2-2,5 місяця від моменту надходження до лабораторії діагностичного матеріалу.
Для прискорення досліджень може бути використано прямий метод абсолютних концентрацій. Під час постановки цього методу проводять прямий посів осаду, обробленого детергентами діагностичного матеріалу одночасно на контрольне живильне середовище, і середовища з відповідними ПТП. Паралельно проводять посів матеріалу на стандартні живильні середовища (з метою отримання культури).
Культура мікобактерій вважається стійкою, як і в разі непрямого методу абсолютних концентрацій, якщо на середовищі з ПТП виростає 20 і більше колоній.
Проте прямий метод абсолютних концентрацій може бути використано тільки для дослідження бактеріоскопічно позитивного матеріалу з масивністю бактеріовиділення не менше, ніж 2+. У такому випадку підвищується ризик контамінації. Крім того, слід враховувати, що в разі цього методу проводять недозований посів, що може ускладнити інтерпретацію результатів. Тому в ряді випадків отримані результати можуть виявитися недостовірними.
Метод носить попередній характер і збільшує вартість дослідження МЧ M. tuberculosis у цілому.
15. Для забезпечення достовірності одержаних результатів потрібно проводити контроль якості виконуваних лабораторією тестів стосовно дослідження МЧ мікобактерій до ПТП.
Потрібно перевіряти якість кожної партії середовищ для визначення МЧ мікобактерій до ПТП. Із цією метою кожну партію приготованого живильного середовища має бути перевірено на стерильність (інкубація у термостаті).
Також для кожної партії середовища під час тестування на МЧ клінічних зразків потрібно одночасно провести тест на чутливість контрольного штаму M. tuberculosis H37Rv або контрольного штаму M. tuberculosis з відомою стійкістю до всіх досліджуваних ПТП. Якщо середовище з препаратами приготоване правильно, стійкість контрольної культури буде незмінною. Поява росту контрольного штаму в пробірках із ПТП, до яких він є чутливим, або відсутність його росту в пробірках із препаратами, до яких контрольний штам є стійким, указує на те, що під час приготування середовища з препаратом було допущено помилку, або на те, що бактерійну суспензію приготовано неправильно.
За відсутності у лабораторії контрольних (музейних) штамів лабораторія може використовувати виділені від пацієнтів штами, які у багатократних дослідженнях підтверджують свою чутливість та/або стійкість.
Реєстрація результатів ВКЯ кожної партії середовищ має фіксуватися в журналі приготування середовищ.
ВКЯ включає також регулярну перевірку використовуваного лабораторного обладнання - згортувачів, термостатів, рН-метра, автоматичних дозаторів, стандартів мутності тощо.
16. Під час реєстрації бактеріологічних досліджень кожному дослідженню діагностичного матеріалу присвоюється індивідуальний номер.
Усі зразки, що надійшли до лабораторії (за винятком відбракованих) має бути зареєстровано у формі № 252-2/о "Лабораторний реєстраційний журнал (бактеріологічні дослідження) ТБ 04/2" (далі - форма ТБ 04/2).
Форму ТБ 04/2 заповнюють відповідальні лікарі бактеріологічних відділів клініко-діагностичних лабораторій чи бактеріологічних лабораторій і ведуть у лабораторіях другого й третього рівнів ПТЗ. Форму ТБ 04/2 заповнюють на підставі форми первинної облікової документації № 200-2/о "Направлення на бактеріологічне дослідження ТБ 06".
У формі реєструються пацієнти, яким призначено бактеріоскопічне та культуральне дослідження, а також тести на МЧ до ПТП.
Графи 1-19 заповнюються на основі форми первинної облікової документації № 200-2/о "Направлення на бактеріологічне дослідження ТБ 06".
У графі 1 зазначають лабораторний реєстраційний номер пацієнта.
У графу 2 заносять номер проби.
У графу 3 записують цифрами число, місяць та рік збору біоматеріалу.
У графу 4 записують цифрами число, місяць та рік доставки біоматеріалу на дослідження.
У графу 5 вписують районний реєстраційний номер випадку ТБ (якщо він є), код району, дві останні цифри року, порядковий номер.
У графі 6 зазначають прізвище, ім’я та по батькові пацієнта.
У графі 7 скорочено зазначають стать особи, якій проводять дослідження (Ч - чоловіча, Ж - жіноча).
У графі 8 зазначають рік народження пацієнта.
У графі 9 зазначають місце проживання та район адміністративної території, де мешкає пацієнт.
Потрібно найбільш повно внести ці дані, оскільки лабораторний журнал може стати єдиним джерелом даних про хворого на бацилярний туберкульоз.
У лабораторіях додатково ведуть журнал виділених культур, до якого вносять усі дані про проби, з яких було виділено культури мікобактерій.
У графі 10 зазначають: у верхній клітинці графи назву закладу чи відділення, звідки було направлено біоматеріал, у нижній клітинці графи 10 - прізвище, ініціали й телефон лікаря, який направив на дослідження біоматеріал пацієнта.
Ці дані потрібні для того, щоб:
передати результати дослідження лікарю, який направив матеріал;
у разі вибраковки результатів (проріст, незадовільна деконтамінація тощо) повідомити про те, що трапилося, лікаря і разом прийняти рішення про доцільність повторного дослідження.
У графах 11 та 12 зазначають, який саме біоматеріал направляється на дослідження - мокротиння чи щось інше. Якщо направляється інший біоматеріал, потрібно зазначити, який саме (промивні води бронхів, плевральна рідина тощо).
У графах 13-18 зазначають мету проведення дослідження - діагностика, контроль хіміотерапії чи іншу.
Дані про вид діагностичного матеріалу й мети дослідження потрібні для проведення ретроспективного аналізу ефективності роботи лабораторії.
Якщо мета проведення дослідження - діагностика нового випадку, потрібно відмітити це знаком "V" у пункті 13, якщо діагностика рецидиву - відмітити це знаком "V" у пункті 14, інший випадок повторного лікування (невдале лікування, після перерви) - відмітити це знаком "V" у пункті 15.
Якщо мета проведення дослідження - контроль хіміотерапії, у пункті 16 потрібно це відмітити знаком "V". У пункті 17 зазначити цифрою, на якому місяці лікування проводиться дослідження.
Якщо мета проведення дослідження інша, у пункті 18 потрібно зазначити, яка саме, наприклад: диспансеризація, обстеження особи, яка контактувала з хворим на туберкульоз із бактеріовиділенням тощо.
У графі 19 записують цифрою категорію захворювання на туберкульоз (1-4).
У графі 20 записують цифрами число, місяць і рік проведення дослідження.
У графах 21-23 зазначають результат бактеріоскопічного дослідження першої, другої та третьої проб.
Якщо в пробі біологічного матеріалу знайдені кислотостійкі палички (КСП), поряд із відповідним номером зразка мокротиння (1, 2 або 3) у графі 21 потрібно зазначити ступінь позитивного результату; якщо КСБ не знайдено, зазначити, що результат негативний.
Якщо в полі зору більше ніж 10 КСБ, потрібно відмітити "3+".
Якщо в полі зору від 1 до 10 КСБ, потрібно відмітити "2+".
Якщо на 100 полів зору знайдено від 10 до 99 КСБ, потрібно відмітити "1+".
Якщо на 100 полів зору знайдено від 1 до 9 КСБ, потрібно записати точну цифру знайдених КСБ.
Якщо на 100 полів зору не знайдено КСБ, зазначити, що результат негативний.
У графі 22 записують цифрами число, місяць і рік видачі результатів бактеріоскопії.
У графі 23 ставиться підпис спеціаліста, який проводив бактеріоскопію.
У графах 24 та 25 зазначають результат культурального дослідження першої, другої та третьої проб.
Якщо на живильному середовищі:
немає росту M. tuberculosis, то зазначається термін: "негативний";
виросли 1-19 колоній M. tuberculosis, то вказують точне число колоній M. tuberculosis.
виросло від 20 до 100 колоній M. tuberculosis, то ставиться "1+".
виросло 100-200 колоній M. tuberculosis, то ставиться "2+".
виросло 200-500 колоній M. tuberculosis, то ставиться "3+".
виросло більше ніж 500 колоній M. tuberculosis, то ставиться "4+".
Якщо на живильному середовищі проросла банальна мікрофлора, то ставиться "проріст".
У графі 25 записують цифрами число, місяць і рік видачі попереднього результату посівів.
У графах 26–34 зазначають результати тестів ідентифікації виділеної культури.
У графі 26 зазначають морфологію колоній: R або S.
У графі 27 знаками "–" або "+" позначають пігментоутворення: "-" - якщо колонії мають кремовий колір, характерний для мікобактерій туберкульозного комплексу; "+" - якщо колонії мають інший колір.
У графі 28 відмічають швидкість росту: "П" - повільний, "Ш" - швидкий.
У графі 29 позначають наявність чи відсутність корд-фактора знаками "+" або "–".
У графі 30 знаками "+" або "–" позначають ріст культури або відсутність росту на середовищі із саліциловокислим натрієм або з ПНБК.
У графі 31 позначають знаками "+" або "–" результати ніацинового тесту.
У графі 32 позначають знаками "+" або "–" результати нітратредуктазного тесту.
У графі 33 позначають знаками "+" або "–" наявність або відсутність термостабільної каталази.
У графі 34 позначають знаками "+" або "–" результати TCH-тесту.
У графі 35 роблять висновок, а саме: виділена культура ідентифікована як: M. tuberculosis, інші мікобактерії (потрібно вписати).
У графах 36-40 зазначають результати тесту медикаментозної чутливості виділених мікобактерій до ПТП 1-го ряду. Якщо культура чутлива до певного препарату, вписується літера "Ч", а якщо стійка,- літера "С".
У графі 41 зазначають результати тесту чутливості мікобактерій до ПТП другого ряду та вказують через кому скорочені назви ПТП 2-го ряду, до яких мікобактерії є стійкими.
У графі 42 записують цифрами число, місяць і рік видачі остаточних результатів дослідження.
У графі 43 ставиться підпис спеціаліста, який проводив культуральне дослідження.
У графі 44 зазначаються спеціальні під примітки (за потреби).
Нумерація досліджень має починатися в перший робочий день року і тривати безперервно протягом усього року. Реєстраційний номер, присвоєний зразку, має бути нанесений на контейнер зі зразком і супроводжувати його на всіх етапах бактеріологічного дослідження: на центрифужній пробірці, в якій зразок центрифугують після деконтамінації, на пробірках із ростовим середовищем, на предметних скельцях, на які наноситься матеріал для мікроскопії перед посівом і для підтвердження належності культури, що виросла, до кислотостійких бактерій (фарбування за Цілем-Нільсеном).
IХ. Молекулярно-генетичні методи діагностики туберкульозу
1. Детекція МБТ методом ПЛР. Для виявлення МБТ методом використовують мокротиння, бронхіальний секрет, плевральну та інші рідини й інші види діагностичного матеріалу.
Для цього з діагностичного матеріалу в першу чергу потрібно виділити ДНК. Потім до розчину отриманої ДНК додають реакційний буфер, суміш нуклеозидтрифосфатів, праймери, полімеразу і проводять ампліфікацію в програмованому термостаті (термоциклері), а потім оцінюють результат. Наявність у пробі послідовності-мішені свідчить про наявність M. tuberculosis у дослідному зразку.
ПЛР не дає відповіді на питання про активність туберкульозного процесу, тому інтерпретувати отриманий результат потрібно з урахуванням клініко-рентгенологічних даних. Метод ПЛР може використовуватися як додатковий діагностичний метод під час диференціальної діагностики в комплексі з іншими методами лабораторної діагностики ТБ і не застосовується як скринінговий метод для виявлення хворих на ТБ через можливість хибнопозитивних результатів.
2. Найбільш ефективними методами діагностики МЧ M. tuberculosis визнано молекулярно-генетичні методи, які ґрунтуються на гібридизації з ДНК-зондами (LPA), зокрема GenoType MTBDRplus, GenoType MTBDRsl та INNO-LiPA Rif TB Assay.
Технологія проведення досліджень із використанням цих методів охоплює такі етапи:
виділення ДНК з культур M. tuberculosis або безпосередньо з клінічного матеріалу;
ПЛР для ампліфікації фрагментів генів, що асоціюються з медикаментозною стійкістю мікобактерій;
гібридизація ПЛР-продуктів з ДНК-зондами;
візуалізація результатів гібридизації, за якої відбувається детекція мікобактерій комплексу M. tuberculosis, а також наявність або відсутність мутацій у дослідних генах.
До складу зондів належать специфічний зонд для ідентифікації мікобактерій комплексу M. tuberculosis, зонди "дикого типу" (без мутацій, WT), а також зонди для детекції мутацій (MUT), що найчастіше зустрічаються. Заміна хоча б одного нуклеотиду в послідовності ДНК-мішені призводить до порушення гібридизації із зондом, комплементарним відповідній ділянці ДНК-мішені "дикого типу", але при цьому відбувається гібридизація із зондом, що враховує цю заміну. Наявність мутацій визначається відсутністю сигналу одного або кількох зондів "дикого типу", а також наявністю сигналів від одного або кількох "мутантних" зондів. Також можливе виявлення гетерорезистентних штамів мікобактерій, у яких реєструються всі сигнали зондів "дикого типу" і один або кілька сигналів "мутантних" зондів.
Резистентність може існувати, незважаючи на наявність структури не мутантного типу. Можливі під причини гетерорезистентності: досліджуваний зразок містить штам, який має гетерорезистентність, викликану мутацією, яка не була виявлена мутаційними зондами, або досліджуваний зразок містить штам немутантного типу та резистентний штам (наприклад, внаслідок змішаної інфекції пацієнта), і ця резистентність викликана мутацією, яка не була виявлена мутаційними зондами.
Молекулярно-генетичні методи детекції мультирезистентних M.tuberculosis в цілому спрямовані на виявлення мутацій, що обумовлюють резистентність M. tuberculosis до рифампіцину (який є маркером множинної медикаментозної стійкості мікобактерій, оскільки резистентність до рифампіцину у 80,0-90,0 % штамів M. tuberculosis корелює зі стійкістю до ізоніазиду), а також до ізоніазиду. Генодіагностика резистентності до R ґрунтована на детекції мутацій, локалізованих у висококонсервативній області розміром 81 п.о. гена rpoB, що кодує b-субодиницю РНК-полімерази, оскільки 95,0-98,0 % стійких до R штамів M. tuberculosis мають мутації в цьому гені. Для визначення високого рівня стійкості до H досліджують ген katG, що кодує каталазу-пероксидазу; для визначення низького рівня стійкості до H вивчають область промотора гена inhA, що кодує еноілацил-протеінредуктазу. Діагностичні набори, наприклад GenoType MTBDRsl, дають можливість проводити визначення стійкості до Q (gyrA) аміноглікозидів/циклопептидів (rrs), тобто експрес-детекцію широкої медикаментозної стійкості.
Молекулярно-генетичні тести для визначення МЧ M. tuberculosis (за винятком Xpert MTB/RIF) рекомендують використовувати в обласних лабораторіях.
Новий швидкий і ефективний метод діагностики ТБ - тест GeneXpert MTB/RIF, що дає можливість проводити детекцію M. tuberculosis у зразку діагностичного матеріалу й чутливості до R за дві години. Усі стадії тесту повністю автоматизовані. Екстракція, ампліфікація і детекція ДНК здійснюються автоматично в закритому картриджі, що мінімізує можливість крос-контамінації.
Проведення дослідження є двоступінчастим процесом, що охоплює обробку клінічних зразків і власне ПЛР у режимі реального часу, під час якої відбувається ампліфікація специфічної послідовності гена rpoB, яка потім тестується молекулярними маяками (molecular beacons) на мутації в ділянці, що обумовлює стійкість до R. Рекомендується використання методики Xpert MTB/RIF для швидкого виявлення MDR-туберкульозу в бактеріологічних лабораторіях ПТЗ і мікроскопічних пунктах у районах із високим рівнем захворюваності на ТБ.
На відміну від попередньої версії Xpert MTB/RIF, для підвищення чутливості тесту картридж Xpert MTB/RIF Ultra, крім гена rpoB, включає дві різні мультикопійні мішені ампліфікації (IS6110 і IS1081), а також у ньому використовується більша реакційна камера (50,0 мкл ПЛР-реакції в Xpert MTB/RIF Ultra порівняно з 25,0 мкл в Xpert MTB/RIF). У нових картриджах Xpert MTB/RIF Ultra використовується повністю вкладена ПЛР, швидше термоциклювання (отримання негативного результату за 65 хв, позитивного - за 77 хв), а також поліпшені розчини та ферменти.
Xpert MTB/RIF Ultra має межу виявлення 11,8 КУО/мл, тоді як для Xpert MTB/RIF межу виявлення встановлено на рівні 114 КУО/мл, тобто нова система майже в 10 разів чутливіша.
Для підвищення точності виявлення стійкості до R у тесті Xpert MTB/RIF Ultra використано аналіз температури плавлення замість аналізу кривих флуоресценції ПЛР у реальному часі. Для визначення мутацій, що характеризують стійкість до R, використовуються чотири зонди, які визначають область гена rpoB.
У тесті Xpert MTB/RIF Ultra для оцінювання результату використовуються такі самі напівкількісні категорії, що і в Xpert MTB/RIF аналізі (високий, середній, низький і дуже низький), а також додано нову напівкількісну категорію "одиничні MБТ", яка відповідає найнижчому бактеріальному навантаженню. Результат "MБТ виявлено, одиничні" було додано для підвищення ефективності виявлення M. tuberculosis complex.
Xpert MTB/RIF Ultra не поступається Xpert MTB/RIF аналізу для діагностики MБТ і виявлення стійкості до R і може бути використаний як альтернатива останньому.
Xpert MTB/RIF Ultra потребує програмного забезпечення GeneXpert версії 4.7b або вище.
Xpert MTB/RIF Ultra потрібно використовувати як початковий діагностичний тест для дорослих і дітей з ознаками і симптомами легеневого ТБ, а також у тестуванні позалегеневих зразків (спино-мозкова рідина, біоптати лімфатичних вузлів і тканин). Інтерпретація результатів Xpert MTB/RIF Ultra для виявлення M. tuberculosis complex є такою самою, як і для Xpert MTB/RIF, за винятком "MБТ виявлено, одиничні". Інтерпретувати "MБТ виявлено, одиничні" потрібно так:
для ВІЛ-інфікованих осіб і дітей із підозрою на захворювання на легеневий ТБ, а також для позалегеневих зразків від хворих цієї категорії результат "MБТ виявлено, одиничні" слід розглядати як позитивний результат для використання в клінічних рішеннях і подальших дій щодо пацієнта;
для осіб без ризику інфікування ВІЛ, які мають початковий позитивний результат "MБТ виявлено, одиничні", потрібно зібрати свіжий зразок і повторно протестувати матеріал. Результат другого тесту Xpert MTB/RIF Ultra використовується для під часйняття клінічних рішень і подальших діях щодо пацієнта;
для усіх інших пацієнтів, які отримали позитивний результат первинного початкового тесту Xpert MTB/RIF Ultra "MБТ виявлено, одиничні", потрібні додаткові дослідження, щоб підтвердити або виключити стійкість до R.
3. Порядок використання молекулярно-генетичних методів у лабораторіях із діагностики туберкульозу. Виявлення M. tuberculosis complex у клінічних зразках є основним фактором, який свідчить про специфічну природу захворювання та має вирішальне значення для вибору раціональної схеми лікування та оцінки його ефективності. Для етіологічної діагностики ТБ в арсеналі лабораторій на сьогоднішній день викристовують такі методи: бактеріоскопічний, бактеріологічний, молекулярно-генетичний.
Під етіологічною діагностикою ТБ розуміють виявлення збудника захворювання (деякі методи дають можливість визначити його кількість, що є важливим інформаційним показником, який характеризує ступінь епідемічної небезпеки та тяжкість захворювання), ідентифікацію мікобактерій та визначення профілю резистентності мікобактерій до ПТП.
Традиційні мікробіологічні методи мають багато переваг, але їм притаманна і низка суттєвих недоліків порівняно з молекулярно-генетичними методами: культуральні дослідження досить тривалі, а швидкі бактеріоскопічні методи мають низьку чутливість: для виявлення мікобактерій 1,0 мл матеріалу має містити не менше ніж 100 тисяч мікробних клітин.
Для швидкої та всебічної лабораторної діагностики ТБ доцільно використовувати увесь комплекс доступних лабораторних методів. Результатом правильної організації діагностичного процесу є отримання максимальної кількості лабораторної інформації під час роботи з єдиною пробою біологічного матеріалу. Для отримання достовірних результатів дослідження потрібно одну пробу біологічного матеріалу досліджувати комплексно, використовуючи увесь арсенал доступних для лабораторії методів - бактеріоскопічний, бактеріологічний, молекулярно-генетичний. Цей підхід має використовуватись незалежно від того, яку ПЛР-методику застосовують у лабораторії.
Для дослідження молекулярно-генетичними методами може використовуватись різний матеріал. Разом з тим слід пам’ятати, що молекулярно-генетичні методи є прямими, отже як зразок доцільно використовувати матеріал із вхідних воріт або із епітопів, до яких збудник має тропність. У разі захворювання на ТБ досить інформативним є правильно зібране мокротиння пацієнта.
Після надходження проби для дослідження потрібно перевірити заповнення супровідних документів та оцінити якість доставленого зразка. Для комплексного дослідження матеріалу потрібно не менше ніж 5,0 мл якісної проби мокротиння.
Проба, яка досліджується, має бути деконтамінованою. Під час молекулярно-генетичних досліджень для розрідження та деконтамінації мокротиння потрібно використовувати метод обробки NALC-NaOH. Такий самий метод деконтамінації рекомендовано і в разі застосування системи ВАСТЕС MGIT 960. Хід виконання деконтамінації за допомогою NALC-NaOH викладено вище.
Для молекулярно-генетичних досліджень біологічного матеріалу на наявність збудників ТБ можуть використовуватись різні формати ПЛР: класична ПЛР, ПЛР у реальному часі, NESTED або інші, якщо на ринку виробів медичного призначення доступні реагенти для їх виконання, зареєстровані та дозволені до використання у закладах охорони здоров’я України відповідно до чинного нормативно-правового законодавства.
4. Організація та здійснення комплексного дослідження матеріалу із застосуванням системи GeneXpert MTB/RIF (GeneXpert MTB/RIF ULTRA). Лабораторні дослідження біологічного матеріалу потрібно проводити в комплексі: бактеріоскопічні, бактеріологічні та молекулярно-генетичні. Тому вимоги для зберігання та транспортування зразків є такими, як для проб, що підлягають бактеріологічному дослідженню, тобто у разі неможливості доставити матеріал негайно він може зберігатися до 48 год за температури (+4 ± 2) -оС і транспортуватися з дотриманням указаних температурних умов.
Прилад GeneXpert не потребує окремого приміщення. Оскільки прилад GeneXpert є закритою системою і працює тільки з картриджами Xpert, у яких автоматично відбуваються всі етапи ПЛР-дослідження без втручання персоналу. Усі маніпуляції з дослідним матеріалом від виділення ДНК мікроорганізмів до детекції результатів ампліфікації відбуваються в закритому, окремому для кожного зразка картриджі. Вимога ДСП 9.9.5.153-2008 поширюється на лабораторії, в яких використовуються методики, що передбачають виконання окремих етапів ПЛР-дослідження (виділення ДНК, ампліфікація, детекція) персоналом лабораторії за допомогою "відкритих" ПЛР-систем - і щодо обладнання, і щодо реагентів.
Система GeneXpert MTB/RIF може працювати під час дослідження матеріалу від осіб, які не отримували ПТП. Тому метод може бути використаний як скринінговий для виявлення M. tuberculosis complex та мутацій у гені rpoB, з яким пов’язують резистентність мікобактерій до R. Така лабораторна інформація дає можливість на ранніх етапах діагностики виявити у відповідному матеріалі збудника туберкульозної інфекції та попередити фтизіатра щодо наявності у М. tuberculosis резистентності до ПТП 1-го ряду. Разом з тим слід пам’ятати, що результати тестування в картриджах Xpert MTB/RIF є попередніми і не можуть замінити подальшого бактеріологічного дослідження.
Для дослідження в картриджах Xpert MTB/RIF за інструкцією виробника може досліджуватись мокротиння або його осад. Для інших видів матеріалу методика не валідована.
Для отримання коректного результату дослідження та враховуючи те, що в Україні дослідження з використанням приладів GeneXpert MTB/RIF проводяться в комплексі з посівами на рідке середовище за допомогою системи ВАСТЕС MGIT 960, які встановлені в лабораторіях 3-го рівня, доцільно працювати з осадами мокротиння після проведення їх передпосівної обробки (деконтамінації).
Після оцінення якості доставленого мокротиння (якість проби та заповнення документів) контейнер з матеріалом переносять у ШББ 2 класу і проводять його деконтамінацію з використанням NALC-NaOH відповідно до методики.
Із ресуспендованого осаду однієї проби потрібно зробити наступне:
посіяти 0,5 мл осаду до пробірки з рідким середовищем Мідлбрукка 7Н9 для інкубації в аналізаторі ВАСТЕС MGIT 960;
посіяти 0,2 мл до пробірки зі щільним середовищем Левенштейна-Єнсена і помістити до термостата за температури +37 -оС;
якщо лабораторія за будь-яких причин не може виконати дослідження за допомогою системи ВАСТЕС MGIT 960, потрібно зробити посів на 2 пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена по 0,2 мл. Подальші маніпуляції з посівами слід виконувати відповідно до вимог Інструкції з лабораторної діагностики ТБ;
дослідний матеріал потрібно нанести на скельце з метою приготування та фарбування мазка за методом Ціля-Нільсена для світлової бактеріоскопії;
помістити до чистої пробірки з кришкою, що загвинчується, 0,5 мл деконтамінованого осаду для попередньої підготовки проби з метою дослідження в картриджі Xpert MTB/RIF. Відповідно до інструкції виробника картриджів до 0,5 мл осаду слід додати 1,5 мл реактиву для зразків. Енергійно перемішати і залишити для інкубації у штативі у ШББ за кімнатної температури впродовж 15 хв. За цей проміжок часу потрібно 1-2 рази ретельно перемішати вміст пробірки. Після експозиції перенести 2,0 мл суміші до картриджа Xpert MTB/RIF, помістити його в аналізатор GeneXpert MTB/RIF і запустити відповідну програму виконання тесту.
Якщо не вдалося отримати результат дослідження з цією пробою (Error чи NO Result), потрібно повторити дослідження, використавши збережені залишки матеріалу з цієї самої пробірки.
За відсутності залишків проби або у разі отримання результату "недійсний" (invalid), потрібно повторно зібрати матеріал для дослідження і повторити всю низку маніпуляцій, описаних вище.
Після отримання достовірного результату тестування у картриджі Xpert MTB/RIF, його потрібно занести до Журналу ТБ 04/2 та видати відповідь лікарю-фтизіатру, який направив матеріал.
5. Організація та здійснення комплексного дослідження матеріалу з використанням ПЛР з детекцією методом гібридизації на стрипах з типоспецифічними зондами. ПТЗ, які мають відповідно обладнані ПЛР-лабораторії та влаштовані з дотриманням чинного законодавства, а також мають підготовлений персонал, можуть використовувати ПЛР з детекцією методом гібридизації на стрипах з типоспецифічними зондами для виявлення M. tuberculosis complex, ідентифікації збудника захворювання та визначення наявності мутацій у генах, з якими пов’язана резистентність до R та H, а також до препаратів 2-го ряду.
Реагенти GenoType MTBDRplus та GenoType MTBDRsl виробництва компанії HainLifescience, дозволені до використання в Україні відповідно до чинного законодавства, можуть давати коректний достовірний результат з біологічним матеріалом та бактеріальними культурами, які виросли на рідкому або щільному середовищі.
Набір GenoType MTBDRplus дає можливість виявити у пробі наявність ДНК M. tuberculosis complex, а також наявність мутацій, асоційованих з резистентністю до R та H. Якщо за результатами тестування матеріалу з наборами GenoType MTBDRplus виявлені мутації у генах, з якими пов’язують резистентність до препаратів 1-го ряду (а саме до рифампіцину та ізоніазиду), тестування може бути продовжене з набором GenoType MTBDRsl.
Дослідження з реагентами GenoType MTBDRsl дають можливість виявити наявність генних мутацій, що відповідають за резистентність M.tuberculosis complex до препаратів 2-го ряду - аміноглікозидів, циклічних пептидів, Q.
Під час проведення досліджень слід враховувати особливості використання наборів системи GenoType.
Висока якість досліджень за допомогою набору GenoType MTBDRplus гарантована за умови роботи з таким матеріалом: нативним або індукованим мокротинням (незалежно від результатів бактеріоскопії), бронхоальвеолярним лаважем, плевральними аспіратами, а також культурами, які виділені в рідкому або на щільному середовищах. Для наборів GenoType MTBDRsl як матеріал для дослідження потрібно використовувати мокротиння з позитивним результатом бактеріоскопії "КСП+" або культурами, які виділені в рідкому або на щільному живильному середовищі. Для інших видів матеріалу методика не валідована.
Під час роботи з біологічним матеріалом після проведення його деконтамінації з використанням реактиву NALС-NaOH, отриманий осад має бути ресуспендований в 1,0-1,5 мл фосфатного буфера (більші об’єми фосфатного буфера можуть негативно вплинути на чутливість тесту).
Після обробки та ресуспендування біологічного матеріалу потрібно виконати такі маніпуляції:
внести 0,5 мл підготовленого матеріалу до пробірки з рідким середовищем Мідлбрукка 7H9 для інкубації в аналізаторі ВАСТЕС MGIT 960;
внести 0,2 мл до пробірки зі щільним середовищем Левенштейна-Єнсена й помістити до термостата за температури +37 -°С;
якщо лабораторія за будь-яких під часчин не може виконати дослідження за допомогою системи ВАСТЕС MGIT 960, потрібно зробити посів на 2 пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена по 0,2 мл. Подальші маніпуляції з посівами слід здійснювати відповідно до вимог чинної Інструкції з бактеріологічної діагностики ТБ;