Про затвердження Інструкції з мікробіологічної діагностики туберкульозу

Відповідно до підпункту 2 пункту 1 статті 6 Закону України "Про протидію захворюванню на туберкульоз", пункту 4 Положення про Міністерство охорони здоров’я України , затвердженого постановою Кабінету Міністрів України від 25 березня 2015 року № 267, та з метою ефективної діагностики випадків туберкульозу

1. Затвердити Інструкцію з мікробіологічної діагностики туберкульозу, що додається.

2. Визнати таким, що втратив чинність наказ Міністерства охорони здоров’я України від 06 лютого 2002 року № 45 "Про затвердження Інструкції з бактеріологічної діагностики туберкульозу"

3. Директорату громадського здоров’я (Скіпальський А.) забезпечити подання цього наказу в установленому законодавством порядку на державну реєстрацію до Міністерства юстиції України.

4. Контроль за виконанням цього наказу покласти на заступника Міністра з питань європейської інтеграції Стефанишину О.А.

5. Цей наказ набирає чинності з дня його офіційного опублікування.

1. Ця Інструкція визначає детальний зміст та методику виконання мікробіологічних досліджень в лабораторіях, що здійснюють мікробіологічну діагностику туберкульозу, спрямовану на підвищення ефективності лікувально-діагностичного процесу, зменшення невиправданих витрат.

2. Ця Інструкція обов’язкова для виконання та поширюється на заклади охорони здоров’я державної та комунальної форм власності, які забезпечують забір, транспортування матеріалу та проведення мікробіологічних досліджень з метою діагностики туберкульозу.

3. У цій Інструкції терміни вживаються у таких значеннях:

мікроскопічне дослідження мазка мокротиння для виявлення КСБ - дослідження, що проводиться з метою виявлення найбільш небезпечних в епідеміологічному сенсі пацієнтів, хворих на туберкульоз легенів. Переваги мікроскопії, що полягають у швидкості отримання результату, відносній простоті, доступності дослідження й економічній ефективності, роблять її незамінною для виявлення більшості пацієнтів, хворих на туберкульоз легенів;

пряма мікроскопія - метод дослідження з необробленого діагностичного матеріалу або його осаду, якщо матеріал рідкий;

мікроскопія мазка з осаду - матеріал, що підготовлений для культурального дослідження після розрідження, деконтамінації, концентрації та ресуспендування;

кислотостійкі організми, у тому числі М. tuberculosis,- організми, що зберігають забарвлення карболовим фуксином після знебарвлення розчином сірчаної кислоти або солянокислого спирту; метод NALC-NаOH є методом деконтамінації, оскільки застосовується у разі посівів на щільних та рідких поживних середовищах, у тому числі в автоматизовані системи детекції мікобактерій. Під час правильного використання цей метод дозволяє отримати більше позитивних результатів культурального дослідження, ніж будь-який інший метод;

флуоресцентна мікроскопія - оптичне дослідження об’єктів, забарвлених спеціальними барвниками (флуорохромами), що світяться під дією ультрафіолетових променів;

молекулярно-генетичний метод - виявлення відмінностей у генетичній структурі чутливих і стійких штамів шляхом визначення нуклеотидних послідовностей генів, мутації, що призводять до виникнення резистентності M. tuberculosis до протитуберкульозних препаратів;

тест медикаментозної чутливості - визначення спектру чутливості мікобактерій туберкульозу до протитуберкульозних препаратів;

посів - метод виділення культури мікобактерій туберкульозу з біологічного матеріалу на щільних та рідких поживних середовищах;

внутрішній контроль якості бактеріологічних досліджень - ефективний і систематичний моніторинг та забезпечення відповідності усіх лабораторних процесів затвердженим стандартним операційним процедурам (далі - СОП) і встановленим стандартам.

1. Для отримання достовірних результатів дослідження діагностичного матеріалу потрібно дотримуватися таких умов:

робити збір матеріалу до початку хіміотерапії, оскільки навіть декілька днів застосування медикаментозної терапії може бути достатньо для того, щоб убити значну кількість мікобактерій або понизити їх життєздатність і спотворити результати дослідження;

матеріал для дослідження має збиратися рано-вранці;

під час дослідження мокротиння потрібно зібрати дві проби ранкового мокротиння впродовж двох послідовних днів;

зібраний матеріал потрібно якнайшвидше доставити до лабораторій; у разі неможливості негайної доставки матеріал зберігається в холодильнику за температури +2-8 -°C не більше ніж 72 год;

під час перевезення матеріалу потрібно особливо ретельно стежити за збереженням флаконів і правильністю їх маркування.

За відсутності можливості доставки зразків мокротиння для дослідження бактеріоскопії потрібно приготувати і доставити до лабораторії зафіксовані мазки.

Контейнер з порцією мокротиння достатнього об’єму (не менше ніж 3,0-5,0 мл), що містить ущільнені або гнійні грудочки без слини, ретельно закривають кришкою, що загвинчується, потім контейнер маркують і поміщають у спеціальний бікс для транспортування до лабораторії.

2. Для збору діагностичного матеріалу повинні використовуватись спеціальні контейнери, які:

прозорі, виготовлені з ударостійкого і прозорого матеріалу, що не допускає протікання рідини та дозволяє оцінити кількість і якість зібраної проби, не відкриваючи кришки;

легко піддаються маркуванню і надійно зберігають його протягом періоду зберігання, транспортування та проведення дослідження;

мають кришки, що загвинчуються з ущільненням (не використовувати флаконів, що мають кришки, які щільно закупорють його: під час відкриття таких кришок у контейнері виникає розріджений простір, який призводить до утворення аерозолю, створюючи потенційну небезпеку внутрішньолабораторного зараження);

мають об’єм 30,0-50,0 мл;

мають широкий отвір для збору мокротиння (не менше ніж 30,0 мм у діаметрі), щоб пацієнт міг легко відокремлювати мокротиння всередину контейнера, не піддаючи забрудненню його зовнішню поверхню.

Використання таких контейнерів дає можливість оцінити якість і об’єм зібраного матеріалу, а в разі приготування мазків з нативного мокротиння - проводити відбір гнійних грудочок приготування мазка безпосередньо з контейнера, запобігаючи етапу виливання мокротиння в чашку Петрі, надзвичайно небезпечного через утворення аерозолю. У цьому разі ефективність прямої мікроскопії може не поступатися ефективності мікроскопії з осаду.

3. Лабораторія, що проводить мікробіологічні дослідження з метою виділення M. tuberculosis, має бути готова отримати різноманітний біологічний матеріал на дослідження, а саме:

мокротиння;

виділення верхніх дихальних шляхів, після подразнюючої інгаляції;

промивні води бронхів;

бронхоальвеолярні змиви;

бронхоальвеолярний лаваж;

матеріал, отриманий під час бронхоскопії;

транстрахеальний та внутрішньолегеневий біоптати;

промивні води шлунка;

сечу;

пунктати із закритих порожнин (спинномозкову рідину, ексудати і транссудати з плевральної та черевної порожнин, гній, гнійно-некротичні маси, виділення ран, виділення відкритих порожнин тощо).

Якщо хворий не може відкашляти мокротиння, потрібно застосовувати інші методи (відхаркувальні препарати, подразнювальні аерозольні інгаляції, промивання трахеїв, бронхів тощо).

Індуковане мокротиння збирається у разі неможливості самостійного збору мокротиння пацієнтом. Для аерозольних інгаляцій користуються портативними або стаціонарними аерозольними інгаляторами.

Індуковане мокротиння нагадує на вигляд і за консистенцією слину, щоб уникнути вибраковування матеріалу на направленні і на флаконі з матеріалом має бути обов’язкове маркування, що вказує на те, що матеріал отримано після аерозольної інгаляції.

Під час дослідження промивних вод шлунка, щоб уникнути змішування мокротиння, що було проковтнуто з їжею, потрібно брати натщесерце. Останній прийом їжі має бути не менше ніж за 12 годин до взяття промивних вод шлунка.

Перед збором матеріалу пацієнту дають випити 100-150 мл стерильної дистильованої води. Отриманий матеріал нейтралізують додаванням 100 мг натрію бікарбонату, негайно доставляють в лабораторію і піддають обробці, щоб виключити пошкоджуючу дію на мікобактерії шлункових ферментів, що містяться в матеріалі.

Сеча (середня частина ранкової порції або вся ранкова порція) збирається в стерильний посуд після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Аналіз сечі на мікобактерії здійснюється тричі. У лабораторії сечу центрифугують за 3 000 g, використовуючи метод накопичення осаду.

Бактеріологічного дослідження добової сечі не проводять.

Асептично зібрані рідини (ліквор, перикардіальна, синовіальна, асцитична рідина, кров, кістковий мозок) мають збиратися лікарем в асептичних умовах у стерильний контейнер з використанням відповідних методик. До рідин, що мають схильність до згортання, додають стерильні гепарин (0,2 мг на 1,0 мл) або оксалат калію (0,01-0,02 мл 10,0 % нейтрального оксалату на 1,0 мл матеріалу). Матеріал має бути доставлено до лабораторії негайно.

Асептично зібрані тканини поміщаються в стерильні контейнери без додавання будь-яких консервантів. У разі тривалого транспортування тканини потрібно помістити в стерильний ізотонічний розчин, обкласти сухим льодом або охолодити за температури +4-8 -°C. Матеріал має бути доставлено до лабораторії негайно.

Матеріал відразу після збору слід відправляти до лабораторії (протягом декількох годин). У разі віддаленості лабораторії від місця взяття матеріалу його відправка в лабораторію може здійснюватися два рази на тиждень. У цьому разі контейнери із зібраним матеріалом мають зберігатися в холодильнику за температури +4-8 -°C не довше ніж 72 год. За потреби зберігання понад 72 год до діагностичного матеріалу додають консервант. У цьому разі термін зберігання збільшується до 5 діб.

Для інших матеріалів, якщо їх транспортування передбачається за високої температури навколишнього середовища або їх доставка до лабораторії більше, ніж через 24-72 год після збору (взяття), рекомендується використовувати такі хімічні консерванти:

10,0 % розчину тризаміщеного фосфату натрію;

1,0 % розчину цетилпіридин хлориду у 2,0 % хлориду натрію. М. tuberculosis залишаться життєздатними до 1 тижня;

подвійний об’єм 2,0-3,0 % розчину борної кислоти.

Зазначені розчини рекомендується застосовувати для збереження зразків мокротиння. У разі їх застосування матеріал може зберігатися за кімнатної температури. Однак консерванти токсичні для мікобактерій і їх застосування може знижувати висіюваність мікобактерій. Для зниження токсичності консервантів проби рекомендується зберігати в холодильнику за температури від +4 до +8 -°C.

Діагностичний матеріал може бути заморожений, а в разі, якщо він не буде піддаватись розморожуванню і повторному заморожуванню, життєздатність мікобактерій збережеться.

4. Для безпечного транспортування дослідний матеріал має бути упаковано у водонепроникну ємність, що не б’ється, а також захищену від струсів, ударів та інших можливих пошкоджень.

Для транспортування матеріалу потрібно мати в лабораторії кілька спеціальних металевих або пластикових транспортувальних ящиків, які влаштовано так, щоб у вертикальному положенні фіксувати 20-30 контейнерів з діагностичним матеріалом. Кришка ящиків має надійно закриватися, щоб виключити можливість самовільного відкривання кришки і висипання контейнерів зі зразками. Для транспортування можна використовувати металеві бікси. Під час транспортування матеріал не повинен знаходитись на сонці.

На зразки, залежно від мети дослідження, та контейнери заповнюється направлення відповідно до чинного законодавства.

Усю зазначену супровідну документацію розміщають окремо від матеріалу (у файлі, конверті, поліетиленовому пакеті тощо), поза транспортним контейнером (ящиком/біксом) зі зразками.

Перед відправкою зібраного матеріалу медичний працівник повинен перевірити:

відповідність кількості контейнерів з мокротинням їх кількості, зазначеній у списку направлення;

відповідність номера кожного контейнера номерам, зазначеним у направленні.

Після перевірки даних супроводжувальної документації медпрацівник зазначають дату відправлення матеріалу на дослідження, ставить свій підпис та вкладає у файл (конверт, поліетиленовий пакет) супроводжувальний лист і заповнені бланки направлень на мікроскопічне дослідження на кожну пробу матеріалу та прикріплює конверт до транспортного контейнера (бікса, ящика) зовні.

5. Прийом матеріалу має забезпечуватися в спеціально відведеному місці. Бікси / транспортувальні ящики з контейнерами повинні відкривати у витяжній шафі або на спеціально виділеному столі з дотриманням таких вимог:

одягнути одноразові рукавички, контейнер відкривати у шафі біологічної безпеки;

провести зовнішню обробку бікса відповідним дезінфектантом;

обережно відкрити бікс і перевірити цілісність контейнерів. Биті контейнери знезаражують шляхом занурення в дезінфектант, кип’ятіння або автоклавування. Матеріал з таких зразків не досліджується. У цьому разі потрібно запросити новий зразок на аналіз;

витягнути контейнери з матеріалом із бікса. Провести обробку дезінфектантом зовнішніх поверхонь усіх контейнерів, що знаходяться у біксі;

продезінфікувати внутрішню частину бікса. Якщо виявлено забруднення бікса, проавтоклавувати його або занурити в дезінфікуючий розчин;

перевірити відповідність номерів у супроводжувальній документації номерам, що позначені на контейнерах із матеріалом;

присвоїти матеріалу лабораторний порядковий номер. Позначити відповідним номером контейнер (на бічній стінці) і внести номер до бланка направлення;

зняти рукавички і помістити їх у контейнер для дезінфекції, а потім вимити руки з милом.

У лабораторії має бути розроблено документально оформлені правила вибракування матеріалу, що передбачають:

відмову від під часйому первинних проб без потрібної ідентифікаційної документації та маркування;

належну поведінку стосовно проб незадовільної якості;

заходи в разі виявлення пошкоджених або негерметично закритих контейнерів.

Задовільна якість матеріалу передбачає наявність у матеріалі слизового або слизово-гнійного мокротиння. Об’єм зібраного матеріалу має коливатися в межах 3,0-5,0 мл, хоча в разі задовільної якості прийфнятна і менша кількість. Потрібно відзначити якість отриманого матеріалу в журналі реєстрації досліджень і в бланку видачі результатів дослідження. У разі вибракування матеріалу потрібно запросити нову порцію на дослідження.

Дослідження зразка виконуються тільки за наявності заповненої форми направлення. Неприпустимо проведення досліджень на підставі усного запиту, без відповідного письмового направлення.

Усі отримані первинні проби має бути зареєстровано у формах первинної облікової документації відповідно до направлення.

У день надходження до лабораторії консервованого матеріалу його центрифугують, відмивають стерильною дистильованою водою і без додаткової деконтамінації використовують осад для приготування мазків та посіву на живильні середовища.

1. Метод мікроскопії є найбільш швидким, простим і менш витратним методом виявлення КСБ в нативному матеріалі (найчастіше в мокротинні) без попередньої його обробки й гомогенізації. Мікроскопічне дослідження мазків мокротиння, забарвлених за методом Ціля-Нільсена, дозволяє виявити КСБ за умови, що їх кількість буде складати 10 000 і більше в 1,0 мл мокротиння. Негативний результат не виключає діагнозу "туберкульоз", оскільки в мокротинні може міститися кількість мікобактерій нижча, ніж межа виявлення методом мікроскопії.

Основним діагностичним матеріалом для мікроскопії на КСБ слугує мокротиння.

Результати мікроскопічного дослідження на КСБ інших біологічних матеріалів (різних рідин, гною, сечі тощо) мають обмежене значення.

Дослідження мазків з осаду центрифугованої сечі не завжди дозволяє отримати достовірні результати, оскільки в сечі можуть бути наявні нетуберкульозні мікобактерії.

За потреби виявлення збудника туберкульозу в різних біологічних матеріалах рекомендується використовувати культуральний метод дослідження.

2. Процедура приготування мазка розпочинається з підготовки предметних скелець. Потрібно використовувати тільки одноразові, нові, без подряпин і сколів, знежирені у спирті або суміші Нікіфорова (96-° етиловий спирт + ефір у співвідношенні 1 : 1). Скло підписують простим олівцем по матовій смузі або алмазним олівцем по склу. Номер, проставлений на скельці, має відповідати номеру дослідження в лабораторному реєстраційному журналі.

Під час приготування мазків із нативного матеріалу контейнер відкривають акуратно, уникаючи розбризкування аерозолю, що містить мікобактерії.

Мікобактерії частіше виявляються в щільних гнійних грудочках мокротиння.

Обпаленою в полум’ї спиртівки й охолодженою бактеріологічною петлею, одноразовою бактеріологічною петлею або зламаними кінцями дерев’яної палички (нової для кожної порції мокротиння) захоплюють невелику кількість мокротиння з гнійними грудочками. Щільно притиснувши петлю або паличку перпендикулярно до скла, дрібними круговими рухами розподіляють гнійну грудочку мокротиння по поверхні предметного скельця як можна тоншим шаром площею 1,0-2,0 см x 2,0-3,0 см у вигляді овалу.

Товщина мазка у висушеному незабарвленому стані має бути такою, щоб можна було прочитати газетний шрифт, розміщений за скельцем на відстані 5,0-10,0 см. Якщо мазок занадто тонкий, під час мікроскопічного дослідження можна отримати хибнонегативний результат. Якщо мазок занадто товстий, він може бути змитий з предметного скельця в разі забарвлення.

На одному предметному склі можна робити тільки один мазок.

Використані для приготування мазка палички чи одноразову бактеріологічну петлю скидають в ємність з дезінфікуючим розчином або в контейнер з відпрацьованим інфекційним матеріалом. Пінцет і ножиці обпалюють в полум’ї пальника (за потреби).

Приготування мазків для мікроскопічного дослідження є відносно небезпечною процедурою, під час якої може відбуватися розсіювання аерозолів, що містять збудник.

У разі якщо мазок готують за допомогою бактеріологічної петлі, потрібно обпалювати петлю після кожної маніпуляції в полум’ї спиртового чи газового пальника доти, доки вона не стане червоного кольору. Перед повторним використанням петлю ретельно прожарюють в полум’ї пальника, яке під час цьому має бути безбарвним чи блакитним. Принятніше використовувати одноразові бактеріологічні петлі.

Мазки з осаду отримують після центрифугування діагностичного матеріалу. Для приготування мазка до осаду додають 1,0 мл фосфатного буфера, ресуспендують. На скельце наносять 1-2 краплі ресуспендованого осаду, розподіляючи його тонким шаром у центрі скла на площі близько 1,0-2,0 см ґ 2,0-3,0 см.

Мазки з осаду рідкого матеріалу легко змиваються в процесі забарвлення, тому їх потрібно готувати на скельцях, заздалегідь оброблених сироваткою чи бичачим сироватковим альбуміном, який наносять ватним тампоном на чисті знежирені предметні скельця, рівномірно розподіляючи на 2/3 їх поверхні. Оброблені сироваткою скельця висушують за кімнатної температури. Скельця готують заздалегідь. Термін зберігання таких скелець - до 5 діб.

Не можна здійснювати приготування мазків способом "розтяжки" матеріалу між двома предметними скельцями, оскільки такий спосіб збільшує площу мазка більше ніж у 2 рази та знижує можливість виявлення КСБ.

Приготовані мазки висушують за кімнатної температури до висихання у витяжній шафі або шафі біологічної безпеки.

Не допускається підсушування або фіксації сирих мазків над полум’ям пальника.

Приготування, фіксацію, забарвлення і перегляд препаратів потрібно завершити до кінця робочого дня. Якщо дослідження не вдається завершити, предметні скельця з мазками залишають на ніч у закритій коробці. Нефіксовані мазки не повинні залишатися відкритими на ніч в робочому приміщенні.

3. Для фіксації мазків можна використовувати такі прийоми:

скельця з мазками, що висохли, фіксують триразовим проведенням їх упродовж 3-5 с через верхню третину полум’я спиртівки до зникнення ознак запотівання скелець;

скельця з мазками, що висохли, поміщають на електронагрівач для просушування предметних скелець за температури +65-75 -°C не менше ніж на 1 год;

скельця з мазками, що висохли, поміщають у сушарну шафу за температури +105 -°C на 10 хв.

4. Барвники, які використовуються, нерідко містять різні домішки, тому під час приготування розчинів барвників потрібно враховувати вміст фарбувальної речовини. Наважку розраховують шляхом ділення потрібної кількості фарби на десятковий еквівалент вмісту фарбувальної речовини.

Якщо вміст фарбувальної речовини становить 88,0 % і більше, перераховувати наважку не потрібно.

Кристали фенолу безбарвні, а якщо вони мають коричневий колір, їх не слід використовувати, оскільки в цьому разі якість забарвлення може бути незадовільною.

Реактиви:

Забарвлюючий розчин (3,0 % розчин фуксину).

Повільно нагрівають кристали фенолу у флаконі до рідкого стану на водяній бані і додають злегка підігріту дистильовану воду.

Робочий розчин:

Змішують 10,0 мл розчину 1 і 90,0 мл розчину 2, переливають у ємність із темного скла. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців. Перед використанням розчин слід профільтрувати.

Знебарвлюючий розчин (розчин 3,0 % солянокислого спирту):

Концентрована соляна кислота - 3,0 мл

96-° етиловий спирт - 97,0 мл.

Акуратно додають концентровану соляну кислоту до спирту у флакон з темного скла. Забороняється вливати спирт у кислоту. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

Замість 3,0 % розчину солянокислого спирту для знебарвлення можна використовувати 25,0 % розчин сірчаної кислоти.

Знебарвлюючий розчин (розчин 25,0 % сірчаної кислоти):

Концентрована сірчана кислота - 25,0 мл

Дистильована вода - 75,0 мл

Акуратно додають концентровану сірчану кислоту до води, нашаровуючи її по стінці посудини.

Забороняється вливати воду в кислоту. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготуваня і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

Розчин, що дофарбовує (0,3 % розчин метиленового синього):

Хлорид метиленового синього - 0,3 г

Дистильована вода - 100 мл

Розчиняють хлорид метиленового синього в дистильованій воді.

На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати за кімнатної температури впродовж шести місяців.

5. Промарковані й зафіксовані мазки поміщають на підставку ("рейки") так, щоб вони не торкалися один одного. Не слід забарвлювати одночасно більше ніж 12 скелець.

На кожен мазок накладають смужку фільтрувального паперу. На всю поверхню фільтрувального паперу, що покриває скельце, наливають забарвлюючий розчин.

Повільно нагрівають препарат над полум’ям пальника до легкої появи парів. Не допускається закипання або повне випарювання забарвлюючого розчину на предметному скельці. Якщо розчину недостатньо, його треба додати і нагріти вдруге.

Прогрітий мазок залишають на 5 хв не допускаючи повного випарювання рідини, після чого фільтрувальний папір видаляють пінцетом і поміщають його в контейнер для відходів.

Кожне предметне скельце акуратно змивають під слабкою течією води до повного видалення забарвлюючого розчину. Не дозволяється змивати і знебарвлювати одночасно декілька мазків, щоб уникнути перехресної контамінації.

На скельця з мазками наливають знебарвлювальний розчин, повністю покриваючи всю поверхню мазка, і залишають на 3 хв.

Обережно промивають кожне предметне скельце, як зазначено вище. Знебарвлений мазок дофарбовують 0,3 % розчином метиленового синього впродовж 60 с.

Промивають скельця водою, видаляючи залишки вологи. Залишають препарат на повітрі за кімнатної температури у вертикальному або похилому положенні для висихання. Не слід промокати препарат.

6. Для налаштування мікроскопа і методики дослідження препаратів шляхом обертання макрогвинта віддаляють об’єктив від предметного столика. Обертаючи револьвер, встановлюють об’єктив із малим збільшенням (5 хв або 10 хв) точно над конденсором. Предметне скельце розміщують на предметному столику власне під об’єктивом. Дивлячись збоку для контролю відстані між склом і лінзою об’єктиву, повільно обертаючи мікрогвинт, опускають об’єктив до предметного скельця, не торкаючись лінзою препарату.

Дивлячись через окуляри, регулюють інтенсивність світлового потоку джерела світла.

Повертають макрогвинт так, щоб лінза об’єктиву відійшла від предметного столика, до отримання різкого зображення. Повертають мікрогвинт, щоб отримати чіткіше зображення.

Дивлячись на препарат збоку, вибирають об’єктив із великим збільшенням (100х). Слід переконатися, що об’єктив не торкається предметного скла. Аплікатором (піпеткою) наносять одну краплю імерсійної олії на препарат, не торкаючись скла. Щоб уникнути забруднення імерсійної олії й отримання хибноопозитивного результату, не можна торкатися піпеткою крапельниці олії до мазка. Крапля олії має вільно впасти на скельце. Опускають об’єктив до зіткнення з краплею олії. Повільно підіймають об’єктив до появи чіткого зображення. Налаштовують зображення, використовуючи мікрогвинт.

Для перегляду мазка під час мікроскопічного дослідження (додаток 1), забарвлених за методом Ціля-Нільсена, слід використовувати світловий бінокулярний мікроскоп з об’єктивом (100х) з масляною імерсією та окуляром (10х) (загальне збільшення 1 000х). Слід використовувати тільки синтетичну імерсійну олію з коефіцієнтом заломлення nD = 1,5.

Відповідними вважають поля зору, у яких видно клітинні елементи бронхіального походження (лейкоцити, слизові тяжі, клітини епітелію). Поля зору, що не містять таких елементів, не враховуються. Кількості полів зору якщо довжині мазка близько 2,0 см відповідає щонайменьше 100-120. У разі якщо результат такого дослідження виявляється негативним, для підтвердження рекомендується проглянути додатково ще 200 полів зору. Таким чином, вивчається 300 полів зору. У разі значної кількості КСБ у мазку (2+) досить дослідити 50 полів зору, а для мазка КСБ (3+) - досить проглянути 20 полів зору (додаток 1).

Після закінчення мікроскопічного дослідження кожного препарату для видалення імерсійної олії потрібно помістити мазок у витяжну шафу, накрити смужкою фільтрувального паперу і змочити її декількома краплями ксилолу. Через 2-3 хв фільтрувальний папір видаляють.

Очищений у такий спосіб від імерсійної олії препарат слід зберігати в коробці для позитивних або негативних препаратів, що були переглянуті раніше. Після перегляду кожного препарату слід ретельно протирати об’єктив мікроскопа від імерсійної олії безворсовими серветками, щоб запобігти контамінації наступного мазка. Серветки потім опускають у бак для відходів.

Кислотостійкі бактерії - тонкі малиново-червоні палички завдовжки 1-10 (частіше - 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, злегка зігнуті, більш-менш зернисті. Мікобактерії розміщуються ізольовано, або парами, або у вигляді груп, добре помітні на блакитному фоні мазка.

Кислотостійкість, що виявляється під час забарвлення за Цілем-Нільсеном, властива не тільки різним видам мікобактерій, але й іншим мікроорганізмам, наприклад, Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а також цистам Cryptosporidium та Isospora. Мікобактерії, що швидко ростуть, можуть розрізнятися за мірою кислотостійкості. Іноді вони можуть забарвлюватися у фіолетово-малиновий колір. У сумнівних випадках рекомендується тривало (впродовж 45-60 хв) знебарвлювати мазок у солянокислому спирті. Сапрофіти під час цьому втрачають забарвлення і виглядають як палички блакитного кольору.

7. Кількість виявлених КСБ визначає тяжкість захворювання і міру епідемічної небезпеки хворого. Підраховують кількість КСБ у мазку. Отже, дослідження має бути не тільки якісним, але й кількісним. Реєстрація результатів із зазначенням кількості виявлених КСБ проводиться відповідно до градації результатів мікроскопічного дослідження під час забарвленні за методом Ціля-Нільсена (додаток 2).

8. Результати мікроскопічного дослідження вносять до лабораторного реєстраційного журналу обліку мікроскопічних досліджень та бланків направлення на дослідження.

Результати мікроскопії слід повідомляти до відділення, яке надало проби, якнайшвидше, бажано впродовж 24 год з моменту отримання проб мокротиння. У бланку результату дослідження має бути зазначено такі відомості:

паспортні дані пацієнта;

найменування установи виконавця і відправника;

характеристика якості матеріалу;

використаний метод забарвлення;

кількість КСБ у мазку;

дата дослідження і прізвище співробітника, який проводив дослідження.

Мазок із виявленими КСБ є документом, від якого залежить постановка діагнозу ТБ легень у конкретної людини. Його слід зберігати в лабораторії, а результати потрібно підтвердити повторним дослідженням.

9. Флуорохромні барвники (аурамін О, родамін С тощо) зв’язуються з воскоподібними структурами бактерійних клітин, які під час опромінення ультрафіолетовими променями візуалізуються як палички жовтого або помаранчевого кольору на темному фоні.

Перевага флуоресцентного методу мікроскопії полягає в можливості перегляду більшої площі мазка, що пов’язано з використанням об’єктива з меншим збільшенням.

Аурамін має канцерогенну активність, тому не слід допускати попадання на шкіру його порошку або розчину. Зважувати аурамін потрібно у вінілових рукавичках або двох парах звичайних рукавичок та захисних окулярах. Для захисту дихальної системи потрібно використовувати респіратор. Приміщення після зважування слід провітрювати. Готувати розчин і проводити забарвлення мазків варто тільки у витяжній шафі.

Під час забарвлення мазків флуорохромними барвниками потрібно:

уникати неповного знебарвлення;

готувати досить тонкі мазки, оскільки зайва товщина мазка перешкоджає якісному знебарвленню, а додаткове дофарбовування може під часховати наявність мікобактерій. Окрім цього, товсті мазки погано фіксуються на предметному скельці, а тому можуть бути змиті в процесі фарбування;

уникати надмірно інтенсивного дофарбовування, яке приховує наявність мікобактерій.

Оскільки із часом флуоресцентне забарвлення може зблідніти, мікроскопію роблять за можливості відразу ж після закінчення процедури забарвлення і висихання мазків. У разі неможливості проведення мікроскопії безпосередньо після фарбування допускається зберігання забарвлених мазків у темному місці, бажано в холодильнику, не більше ніж 24 год.

Реактиви:

1. Забарвлюючий розчин

Кристали фенолу (температура плавлення - +41 -°С) розчиняють у дистильованій у воді, підігріваючи на водяній бані.

Робочий розчин:

У витяжній шафі змішують розчини 1 і 2, переливають у ємність із темного скла, що щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату притування і термін зберігання.

Розчин можна зберігати в ємності з темного скла в прохолодному затемненому місці впродовж трьох місяців, у процесі зберігання розчин може стати каламутним, проте це не впливає на якість фарбування.

Знебарвлюючий розчин (розчин 0,5 % солянокислого спирту):

Концентрована соляна кислота - 0,5 мл

96-° етиловий спирт - 100,0 мл

Акуратно додають концентровану соляну кислоту в етиловий спирт. Слід обережно влити кислоту в спирт, але не навпаки. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування, термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Для дофарбовування можна використовувати розчини перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього.

Розчин перманганату калію:

Перманганат калію (КMnО4) - 0,5 г

Дистильована вода - 100 мл

Перманганат калію розчиняють у дистильованій воді і переливають у бутель з темного скла, який щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Розчин акридинового помаранчевого:

Безводний двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) - 0,01 г;

Акридиновий помаранчевий - 0,01 г;

Дистильована вода - 100 мл.

Фосфат натрію розчиняють у дистильованій воді. Додають акридиновий помаранчевий. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

Розчин метиленового синього:

Метиленовий синій хлорид - 25,0 мг;

Вода дистильована - 100 мл.

25,0 мг метиленового синього хлориду розчиняють у 100 мл дистильованої води. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.

10. Промарковані й зафіксовані мазки поміщають на підставку ("рейки") так, щоб вони не торкалися один одного. Не слід забарвлювати одночасно більше ніж 12 скелець.

На кожне скельце наливають крізь воронку з паперовим фільтром забарвлюючий розчин на 15-20 хв. Не слід підігрівати мазків і користуватися смужками фільтрувального паперу.

Промивають мазок дистильованою водою. Водопровідна вода містить з’єднання хлору, які можуть вплинути на флюоресценцію.

На скельце наливають знебарвлювальний розчин і залишають на 2 хв.

Промивають мазок дистильованою водою.

Знебарвлений мазок дофарбовують розчином перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього з використанням воронки з паперовим фільтром упродовж 2 хв.

Промивають мазок дистильованою водою.

Залишають препарат на повітрі за кімнатної температури у вертикальному або похилому положенні для висихання. Не слід промокати препарат. Можливе висушування мазків у сухожаровій шафі малого об’єму впродовж 10 хв за температури +110 -°C.

Під час використання перманганату калію час його дії не повинен перевищувати 2 хв.

Точність експозиції має вирішальне значення, оскільки в разі перевищення часу експозиції інтенсивність флуоресценції може зменшуватися.

11. Облік результатів мікроскопічного дослідження під час забарвлення флуорохромними барвниками здійснюється при значно меншому збільшенні (зазвичай 400х), ніж збільшення, яке використовується для перегляду мазків, забарвлених за методом Ціля-Нільсена (1000х). Тому поле зору, що переглядається під люмінесцентним мікроскопом, має значно більшу площу, ніж поле зору світлового мікроскопа. Отже, кількість КСБ у 100 полях зору препарату, забарвленого флуорохромами і переглянутого у разі збільшення в 400 разів, буде значно вищою, ніж під час дослідження цього самого препарату, забарвленого за Цілем-Нільсеном і переглянутого в разі збільшення в 1 000 разів.

Під час мікроскопії препарату, забарвленого флуорохромними барвниками, слід переглядати не менше ніж 40 полів зору. Переглянута площа мазка під час мікроскопії 40 полів зору зі збільшенням 400х дорівнює площі 100 полів зору зі збільшенням 1 000х або одній лінії мазка, рівній 2 см.

12. Внутрішній контроль якості мікроскопічного дослідження проводиться під час фарбування кожної партії мазків.

Із цією метою досліджуються контрольні (свідомо позитивні та негативні мазки), які готують заздалегідь, фіксують і зберігають у закритому контейнері.

Для підготовки контрольних мазків бажано використовувати справжні проби мокротиння, проте допустимо додавати до проб мокротиння суспензію М. tuberculosis (для позитивних мазків), кишкової палички чи інших некислотостійких паличок (для негативних мазків).

З кожного зразка мокротиння готують принаймні по 20 мазків, максимально ідентичних за розміром і товщиною, маркуючи кожну серію мазків одним і тим самим ідентифікаційним номером.

Мазки забарвлюють, переглядають 2–3 мазки з кожної серії, зазначають середню кількість КСБ для КСБ+ мазків у журналі контролю якості.

Позитивні і негативні контрольні мазки включають до кожної партії мазків, що будуть забарвлюватися. Мікроскопію контрольних мазків слід проводити перед мікроскопією мазків від пацієнтів.

Досліджують контрольні мазки, зазначають результати в журналі контролю якості, реєструючи номер партії барвника та/або дату приготування розчину.

Незадовільними результатами контролю мікроскопічного дослідження за Цілем-Нільсеном є такі:

у позитивному контрольному мазку КСБ забарвлені не яскраво або їх кількість занадто мала;

фон позитивного контрольного мазка залишається червоним;

у негативному контрольному мазку виявляються КСБ;

у мазках наявні конгломерати барвника.

Незадовільними результатами контролю мікроскопічного дослідження із забарвленням флуорохромами є такі:

у позитивному контрольному мазку КСБ забарвлені в неяскравий жовтий колір або їх кількість занадто мала;

фон негативного контрольного мазка залишається яскраво-жовтим після знебарвлення;

фон занадто темний або містить надто багато флуоресціюючих артефактів;

у негативному контрольному мазку виявляються КСБ.

Якщо під час проведення контролю якості відзначаються проблеми принаймні в одному із вищезазначених пунктів, слід з’ясувати, чи мали місце проблеми з притуванням розчинів, і повторити забарвлення двох негативних і двох позитивних контрольних мазків, зважаючи на можливі помилки. Якщо в разі повторного фарбування мають місце незадовільні результати, слід приготувати нові розчини барвників.

13. Причини, що знижують результативність мікроскопічного дослідження:

неправильне маркування флаконів із мокротинням (наприклад, під час маркування кришки флакона, а не власне флакона);

відсутність маркування на склі або пошкодження його в процесі забарвлення, помилки під час маркування зразків;

відсутність бінокулярного мікроскопа, поганий стан або погане налаштування мікроскопа;

недостатня підготовка персоналу;

технічні помилки під час запису або передачі результатів дослідження;

неправильна реєстрація результатів.

Неправильні результати можуть бути обумовлені помилками лабораторних працівників, пов’язаними переважно із фізичними і психологічними причинами (так званий "людський фактор"). Багато помилок, що виникають у разі неправильного обліку результатів мікроскопії мазків мокротиння, можна попередити під час здійснення постійного централізованого контролю роботи з мікроскопічної діагностики ТБ курируючими бактеріологічними лабораторіями за умови правильного навчання та періодичної перепідготовки лабораторних працівників.

14. Можливі причини хибнопозитивних результатів:

повторне використання контейнерів або предметних скелець;

розчин барвника приготований із використанням води, що містить сапрофітні мікобактерії;

використання непрофільтрованого розчину або забарвлюючого розчину, що зберігався впродовж тривалого часу;

недотримання методики фарбування мазків;

крос-контамінація КСБ внаслідок відсутності проміжків між сусідніми скельцями, що забарвлюються;

неадекватне знебарвлення;

неправильна інтерпретація результатів мікроскопії, коли внаслідок недоліку досвіду наявність у мазку кристалів погано профільтрованого барвника розцінюється як КСБ+;

поганий стан або погане налаштування мікроскопа;

контамінація імерсійної олії.

Можливі причини хибнонегативних результатів:

низька якість зразка мокротиння;

недостатній об’єм зразка мокротиння, узятого для підготовки мазка;

неправильний вибір грудочок мокротиння для приготування мазка;

порушення методики приготування мазка (занадто тонкий або товстий), погана його фіксація;

погана якість барвників;

недотримання методики приготування розчинів;

недостатній час експозиції із забарвлюючим розчином;

надмірне знебарвлення;

занадто сильне дофарбовування;

перегрівання в ході фарбування;

читання менше ніж 100 полів зору, хаотичний або недостатньо ретельний перегляд;

занадто тривала експозиція забарвлених мазків за денного освітлення;

занадто довгий інтервал між фарбуванням і читанням, особливо якщо мазки були погано забарвлені і не зберігалися в темряві.

1. Проби клінічного матеріалу, що надходить до мікробіологічної лабораторії для бактеріологічного дослідження з метою діагностики і контролю хіміотерапії туберкульозу, різною мірою забруднені бактеріями, які швидко ростуть, а пишний їх ріст на багатих живильних середовищах заважає розвитку мікобактерій та ускладнює їх виділення. Тому перед посівом на живильні середовища діагностичний матеріал піддають спеціальній обробці, що забезпечує деконтамінацію, тобто загибель гноєрідної та гнилісної мікрофлори.

М. tuberculosis, що виділяються з дихальних шляхів хворого, оточені великою кількістю слизових речовин, що затрудняють їх виділення. Тому мокротиння та інші подібні матеріали перед посівом одночасно з деконтамінаціею піддають розрідженню й гомогенізації.

Усі препарати, що використовуються в певний час для розрідження і деконтамінації діагностичного матеріалу, мають виражену токсичність стосовно мікобактерій. Щоб забезпечити виживання достатньої частини мікобактеріальної популяції, потрібно використовувати бережні методи обробки, які дозволяють, з одного боку, подавити гнійні і гнилісні мікроорганізми, що швидко ростуть, а з другого - максимально зберегти життєздатність наявних у матеріалі мікобактерій.

Частота контамінації посівів (кількість проростів) у лабораторіях, де проводяться дослідження свіжозібраних проб, під час культивування мокротиння на щільних яєчних середовищах зазвичай становить 2,0-5,0 %. Якщо клінічний матеріал до надходження до лабораторії зберігався протягом декількох днів у нерегламентованих умовах, частота контамінації може досягати більше ніж 5,0 %, що припустимо. Якщо кількість проростів менше ніж 2,0 %, це свідчить про надмірно жорсткий режим деконтамінації, що може призвезти до загибелі значної кількості M. tuberculosis, які містяться в діагностичному матеріалі. Для уніфікації результатів дослідження потрібно, щоб мікробіологічні лабораторії використовували для гомогенізації й деконтамінації діагностичного матеріалу один зі стандартних методів, зазначених нижче.

Під час здійснення посівів на М. tuberculosis потрібно мати на увазі такі важливі аспекти:

клінічні зразки мають бути гомогенізовані, щоб звільнити М. tuberculosis з тканин, в яких вони можуть міститися;

ні гомогенізація, ні деконтамінація не повинні істотно зменшувати кількості життєздатних М. tuberculosis в діагностичному матеріалі;

успіх гомогенізації й деконтамінації залежить від ряду чинників, зокрема:

підвищеної стійкості мікобактерій до різко лужної або кислої реакції розчинів, які використано для гомогенізації матеріалу;

тривалості обробки матеріалу цими речовинами;

температури зразка в процесі його центрифугування;

ефективності центрифугування, яке використовується для осадження мікобактерій.

2. Процедура передпосівної обробки має бути максимально щадною й забезпечувати частоту контамінації не більше ніж 5,0 % для щільних середовищ і 8,0-10,0 % - для рідких.

Усю процедуру деконтамінації проводять тільки у шафах біологічної безпеки 2 класу. Оскільки потрібно суворо дотримуватися певної тривалості обробки матеріалу, доцільно одночасно обробляти не більше ніж 8-12 проб.

Для передпосівної обробки діагностичного матеріалу використовують тільки стерильні розчини детергентів, лугів і кислот. Для обробки й посіву матеріалу використовують тільки стерильний посуд (контейнери для збору діагностичного матеріалу, центрифужні пробірки, піпетки тощо).

Надосадову рідину, отриману в результаті центрифугування, зливають у контейнер з воронкою, що зменшує розбризкування рідини й утворення аерозолю. Використані піпетки поміщають у ємність з дезінфікуючим розчином або в пакети для автоклавування. Увесь забруднений лабораторний посуд з біологічними рідинами і використані витратні матеріали утилізуються автоклавуванням.

3. Усі реактиви, які використовують під час приготування розчинів для обробки діагностичного матеріалу, повинні мати ступінь очищення не менше ніж категорія "хімічно чисті" (ХЧ).

Для передпосівної обробки діагностичного матеріалу рекомендується використовувати нижчезазначені методи й реагенти.

4. Застосування муколітичного препарату NALC, що використовується для швидкого розрідження мокротиння, прискорює процес деконтамінації та зменшує концентрацію деконтамінуючої речовини (NAOH) до 1,0 %. NALС швидко втрачає свою активність в розчиненому вигляді, тому його розчин має готуватися щодня і вживатися свіжим. У муколітичну суміш входить цитрат натрію для зв’язування іонів важких металів, що можуть бути наявні в пробі й інактивувати дію N-ацетил-L-цистеїну.

NALC викликає тільки розрідження зразків мокротиння і не має деконтамінуючих властивостей. Тому для інших біологічних матеріалів (сеча, змиви, ліквор тощо) деконтамінацію слід проводити без додавання NALC (тільки розчином гідроксиду натрію й цитрату натрію).

Для отримання деконтамінуючого розчину, що містить 2,0 % NAOH (із цитратом натрію), потрібно з’єднати рівні об’єми 4,0 % розчину NAOH і 2,9 % розчину цитрату натрію безпосередньо перед використанням.

Розчини готують так:

розчин NAOH: 4,0 г NAOH розчинити в 100 мл дистильованої води;

розчин цитрату натрію: 2,9 г Na-цитрату дегідрату або 2,6 г Na-цитрату безводного розчинити в 100 мл дистильованої води.