Виявлення мікобактерій із використанням системи бульйонного культивування обов’язково передбачає паралельний посів зразка на щільне яєчне середовище. Інокуляцію діагностичного матеріалу в рідке середовище проводять одночасно з посівом на щільне яєчне середовище, що потрібно для більш повного задоволення живильних потреб мікобактерій, які можуть дати ріст тільки на одному із середовищ. Цей принцип дозволяє також уникнути деяких помилок, пов’язаних із технічними похибками, неправильною інтерпретацією росту в позитивній пробірці.
З метою підтвердження належності культури, що виросла на рідкому середовищі будь-якого аналізатора, до комплексу M. tuberculosis потрібно проводити бактеріоскопію за Цілем-Нільсеном і субкультивування на щільному яєчному середовищі вмісту позитивної процесорної ємності. Використання ПЛР-аналізу (ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція) з метою диференціювання комплексу M. tuberculosis і НТМБ у разі отримання позитивних результатів в автоматизованій системі може на 7 днів і довше скоротити час бактеріологічної діагностики туберкульозу.
17. Аналізатор ВАСТЕС MGIT 960/320 працює на прнципах технології MGIT: індикаторні пробірки після внесення до них діагностичного матеріалу інкубуються у приладі й періодично піддаються УФ-тестуванню.
Важливим компонентом системи ВАСТЕС MGIT 960/320 є пробірка MGIT із флуоресцентним індикатором, світіння якого погашене киснем. Мікробна популяція, що розмножується, активно поглинає кисень, вивільняючи флуоресцентний компонент, який починає світитися в промені ультрафіолетового світла.
Прискорення росту мікобактерій і зниження контамінації забезпечується доповненням бульйону 7Н9 рідкою живильною добавкою OADC і п’ятьма ліофілізованими антибіотиками PANTA, які вносять до індикаторної пробірки перед посівом. OADC містить чотири живильні компоненти: олеїнову кислоту, бичачий сироватковий альбумін, декстрозу і каталазу.
Суміш PANTA містить препарати, що пригнічують життєдіяльність Грам+, Грам–, анаеробних бактерій, а також грибів. Вона складається з поліміксину В, амфотерицину В, налідиксової кислоти й азлоциліну. Прилад ВАСТЕС 960 оцінює пробірку як позитивну, якщо кількість живих мікроорганізмів у ній досягла 10-5-10-6 на 1,0 мл середовища.
Таким чином, прилад ВАСТЕС MGIT 960/320 здійснює комп’ютерний моніторинг стану бактеріальної популяції у збагаченому рідкому живильному середовищі Middlebrook 7H9 і сигналізує про розмноження мінімальної кількості мікроорганізмів.
Пробірки MGIT на 7,0 мл призначені для культивування мікобактерій із використанням приладу BACTEC 960/320. У кожній пластиковій пробірці з кришкою, що загвинчується, міститься 7,0 мл середовища Міддлбрука 7Н9, яке перед інокуляцією збагачується живильними добавками й антимікробними речовинами для запобігання контамінації. Інокулятом можуть слугувати заздалегідь оброблені (розріджені, деконтаміновані й концентровані) клінічні зразки, за винятком сечі, стерильні біологічні рідини (виключаючи кров) та культури мікобактерій. Пробірки також призначені для визначення медикаментозної чутливості мікобактерій, за винятком піразинаміду. Пробірки поставляються у картонній коробці, що містить 100 пробірок. Температура зберігання +2-25 -°C.
Набір MGIT 960/320 Supрlement складається із шести флаконів із 15,0 мл ростової добавки OADC, що містить олеїнову кислоту, бичачий альбумін, глюкозу і каталазу, а також із шести флаконів із ліофілізованою сумішшю антибіотиків PANTA, що містять поліміксин Б, амфотерицин Б, налідиксову кислоту, триметопід часм і азлоцилін. Кожен набір розрахований приблизно на 100 пробірок, температура зберігання +2-8 -°C.
Набір MGIT 960/320 IRE Kit призначений для визначення чутливості культури мікобактерій до критичних концентрацій ізоніазиду, рифампіцину й етамбутолу, містить по одному флакону кожного з препаратів (стрептоміцин, ізоніазид, рифампіцин та етамбутол) у ліофілізованому стані, а також вісім флаконів по 20,0 мл збагачувальної добавки MGIT 960 AST supplement (OADC), яка відрізняється від аналогічної добавки, призначеної для виявлення мікобактерій, за кількісним співвідношенням компонентів. Перед додаванням до пробірок MGIT, препарати слід розчинити у 4,0 мл стерильної деіонізованої води. Набір розрахований на 40 тестів, температура його зберігання +2-8 -°C.
Набір BACTEC MGIT 960/320 PZA Kit призначений для визначення чутливості мікобактерій до піразинаміду, містить два флакони з ліофілізованим піразинамідом і шість флаконів живильної добавки.
Перед додаванням піразинаміду до пробірок MGIT з пониженим рН (5,9) його слід розчинити в 2,5 мл стерильної дейонізованої води. Набір розрахований на 50 тестів, температура його зберігання - 2-8 -°C.
Пробірки MGIT 960/320 PZA призначені для визначення чутливості мікобактерій до PZA. Пробірка містить 7,0 мл модифікованого бульйону Міддлбрука 7Н9 зі зниженим значенням (рН = 5,9). Пробірки поставляються в картонній коробці по 25 штук. Температура зберігання пробірок - 2-25 -°C.
Набір MycoPrep призначений для розрідження й деконтамінації клінічних зразків, направлених для мікроскопічного та культурального досліджень з метою виявлення кислотостійких мікобактерій. Набір складається з десяти флаконів (по 75,0 мл або по 150 мл) 2,0 % розчину NаOH, де в кожному флаконі міститься скляна ампула з порошкоподібним муколітиком NALC, а також із пакетів фосфатного буфера.
Безпосередньо перед використанням розчину NALC-NaOH (перед додаванням в його в рівному об’ємі до досліджуваного зразка) ампулу слід розчавити всередині флакона. Кожен пакет із солями для фосфатного буфера розчиняють у 0,5 л очищеної води й заздалегідь стерилізують автоклавуванням. Температура зберігання набору +2-25 -°C.
Реагенти для обробки клінічних зразків можна приготувати в умовах лабораторії.
Для отримання деконтамінуючого розчину, що містить 2,0 % NаOH (з цитратом натрію), потрібно з’єднати рівні об’єми 4,0 % NаOH і 2,9 % цитрату натрію або розчинити в 1 літрі дистильованої води:
| гідроксид натрію (NаOH) | - 20,0 г |
| цитрат натрію (Na3C6H5O7 x 2H2O) | - 14,5 г |
Перед обробкою додають порошок муколітичного (розріджувального) агента NALC до розчину NaOH-цитрат із розрахунку 0,5 г на 100 мл. Після додавання NALC суміш NALC-NaOH може бути використано тільки протягом 24 год, оскільки після закінчення зазначеного терміну розчин швидко втрачає муколітичну активність.
Цитрат натрію додають до розчину NаOH, щоб зв’язати іони важких металів, що можуть бути наявні у зразку й інактивувати NALC.
У разі високого забруднення зразків сторонньою мікрофлорою концентрацію гідроксиду натрію в початковому розчині можна збільшити до 3,0 %.
Для отримання фосфатного буфера в 1 л дистильованої води потрібно розчинити:
| двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) | - 4,74 г |
| однозаміщений фосфат калію (KH2PO4) | - 4,54 г |
Стерилізація буфера проводиться в автоклаві за за температури +121 -°C протягом 15 хв у ємності з кришкою, що частково відкручена. Після охолодження розчину за кімнатної температури кришку слід щільно закрутити.
18. Перш ніж провести інокуляцію в індикаторну пробірку MGIT, потрібно виконати попередню обробку клінічного зразка з метою його розрідження, деконтамінації та концентрації. Якнайкращі результати забезпечує обробка 2,0-3,0 % розчином NаOH з NALC, яку рекомендують здійснювати в ламінарній шафі з дотриманням стерильності за такою схемою:
до зразка (під часблизно 5,0 мл), що міститься в пластиковій градуйованій пробірці об’ємом 50,0 мл, додати рівний об’єм NALC-NaOH або препарату MycoPrep;
щільно закривши кришку, змішати вміст пробірки струшуванням або за допомогою вортексу 15-30 с, прагнучи досягти повного розрідження, і залишити на 15 хв за кімнатної температури, перевертаючи для змішування кожні 5 хв;
додати фосфатний буфер до відмітки "50,0 мл" і змішати струшуванням (після додавання фосфатного буфера рН досліджуваного матеріалу відповідає значенню 6,8;
центрифугувати зразок протягом 15 хв за 3 000 g, залишивши у шафі біологічної безпеки на 5 хв для осадження аерозолів;
видалити надосадову рідину;
додати до осаду 1,0 мл фосфатного буфера, загальний вміст має скласти 1,5-2,0 мл.
Використовувати отриманий матеріал для:
посіву в пробірки MGIT;
посіву на щільне середовище;
приготування мазків;
молекулярно-генетичних досліджень (GeneXpert тощо).
Якщо матеріал не використовують негайно, його потрібно заморозити (-20 -°С).
19. Інокуляцію осаду обробленого матеріалу в індикаторні пробірки MGIT проводять за допомогою одноразової пастерівської піпетки. Для цього потрібно:
зняти кришку, що відкручується, з пробірки MGIT;
додати вміст флакона зі збагачувальною добавкою MGIT (Growth supplement) (15,0 мл) до флакона з ліофілізованими антибіотиками PANTA;
перенести 0,8 мл отриманої суміші до пробірки MGIT;
внести 0,5 мл осаду діагностичного матеріалу до пробірки MGIT і паралельно провести посів 0,2 мл матеріалу на щільне середовище Левенштейна-Єнсена або Фінна-II та нанести краплю на предметне скло, промарковане заздалегідь;
переконавшись, що пробка пробірки щільно закручена, перевернути пробірку для перемішування вмісту та провести завантаження пробірки в прилад ВАСТЕС 960 відповідно до інструкції з експлуатації.
Для інкубації пробірок у системі потрібно відкрити один із ящиків приладу ВАСТЕС MGIT 960/320 і натиснути кнопку "Tube enter", що з’явилася на екрані ("завантаження пробірки"). При цьому загорається лампа сканера для зчитування штрих-коду з пробірки.
Відсканувати сканером штрих-код пробірки з інокулятом і встановити її у гніздо, що рекомендує прилад.
Слід щодня перевіряти показання приладу на предмет появи позитивних і негативних результатів.
Про позитивний результат (ріст мікобактерій) свідчить червоний сигнал позитивного індикатора на відповідному ящику і значок на дисплеї приладу.
У разі появи інформації про позитивний результат потрібно відкрити зазначений ящик, натиснути кнопку "positive", що з’явилася на екрані, витягнути відповідну пробірку з гнізда і відсканувати штрих-код.
Пробірки, у яких не зафіксовано приладом росту мікобактерій протягом 42 діб, оцінюються системою як негативні. Про негативний результат (відсутність росту мікобактерій) свідчить зелений сигнал негативного індикатора на відповідному ящику і значок на дисплеї прилаладу.
У разі появі інформації про негативний результат потрібно відкрити зазначений ящик, натиснути кнопку "negative", що з’явилася на екрані, витягнути зазначену пробірку з гнізда і просканувати її штрих-код.
20. Позитивний результат, що свідчить про зростання культури в індикаторній пробірці, може реєструватися із четвертого дня після інокуляції, а позитивний сигнал у першу - третю добу може бути розцінений як мікробна контамінація зразка.
Для підтвердження росту мікобактерій, а також ідентифікації M. tuberculosis у позитивній пробірці проводять певні процедури.
Видаливши позитивну пробірку з приладу, слід візуально оцінити прозорість бульйонного середовища для визначення можливого росту мікобактерій.
Зазвичай ріст культури M. tuberculosis виявляється у вигляді характерних придонно розміщених пластівців, які за незначного струшування піднімаються й поширюються по всьому середовищу, а рідке середовище зберігає прозорість. Помутніння середовища в позитивній пробірці свідчить про можливу контамінацію сторонньою флорою.
Приготувати мазок за методом Ціля-Нільсена для виявлення кислотостійких мікобактерій.
Провести субкультивування на щільне яєчне середовище для підтвердження росту типових колоній мікобактерій.
Провести субкультивування на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію або 500 мкг/мл паранітробензойної кислоти, для диференціації M. tuberculosis і НТМБ.
Для того, щоб переконатися у відсутності контамінації позитивної пробірки сторонньою мікробною флорою, слід приготувати мазки із забарвленням за Грамом і провести пересіви вмісту пробірки на чашку з кров’яним агаром. Наявність росту на чашці в результаті інкубації протягом 24 год за температури 37 -°C свідчить про мікробну контамінацію матеріалу.
За наявності ніацинового, нітратредуктазного чи імунохроматографічного тестів доцільно провести ідентифікацію позитивної культури, отриманої після культивування в автоматизованій системі.
21. Позитивний результат, що свідчить про виділення культури M. tuberculosis, видається на 5-41 день за таких умов:
позитивний сигнал приладу + наявність мікроколоній у вигляді "кіс" під час бактеріоскопії, позитивної проби, забарвленої за Цілем-Нільсеном;
позитивний сигнал приладу + кислотостійкі бактерії під час бактеріоскопії + характерний ріст колоній на щільному середовищі + відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію;
позитивний сигнал під часладу + відсутність кислотостійких бактерій і мікроколоній контамінуючої мікрофлори під час бактеріоскопії + характерний ріст колоній на щільному середовищі + відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію;
позитивний сигнал прилаладу + кислотостійкі бактерії і мікроколонії контамінуючої мікрофлори під час бактеріоскопії + характерний ріст колоній мікобактерій на щільному середовищі (за відсутності контамінації в контрольному мазку із цього щільного середовища) + відсутність росту на середовищі Левенштейна-Єнсена, що містить 500 мкг/мл саліциловокислого натрію;
позитивний сигнал приладу + кислотостійкі бактерії або відсутність кислотостійких бактерій і мікроколоній контамінуючої мікрофлори під час бактеріоскопії + позитивний результат ПЛР із праймерами для M. tuberculosis із позитивної процесорної ємності.
Негативний результат росту M. tuberculosis на автоматизованих системах видається на сорок другий день. За наявності ознак можливого росту M. tuberculosis на щільному середовищі (наприклад, є колонії у вигляді пластівців у рідкій фазі над скосом) негативна відповідь видається за результатами відсутності росту мікобактерій на щільному середовищі через 10 тижнів (70 днів).
Контроль якості виконується під час отримання кожної нової партії пробірок з використанням колекційних штамів таких мікобактерій: M. tuberculosis ATCC 27294, M. kansasii ATCC 12478 і M. fortuitum ATCC 6841. Контроль якості можна проводити за допомогою інших лабораторних штамів. Зокрема, штам M. tuberculosis Н37Rv (під час посіву в пробірку MGIT 0,5 мл мікробної суспензії, приготованої по 0,5 стандарту McFarland і розведенню 1 : 100) має дати ріст, підтверджений позитивним сигналом ВАСТЕС 960, на 7-9 день після внесення до приладу.
Прийнятним для збагаченого рідкого середовища вважається рівень контамінації, що досягає 5,0-8,0 % від загального числа посівів. У разі підвищення рівня контамінації більше ніж на 10,0 % потрібно терміново виявити причини і вжити заходів щодо їх усунення.
У разі отримання позитивного результату під приладу ВАСТЕС 960 (із 4 по 42 день) потрібно переконатися, що в рідкому середовищі позитивної пробірки не міститься контамінуючих мікроорганізмів. Якщо в результаті мікроскопії за Цілем-Нільсеном виявлено мікобактерії, а під час посіву на кров’яний агар контамінація матеріалу в пробірці підтверджена, за потреби можна провести повторну деконтамінацію і спробувати виділити чисту культуру мікобактерій. Із цією метою потрібно зробити таке:
перенести увесь контамінований вміст із позитивної пробірки MGIT до стерильної об’ємом 50,0 мл;
додати рівний об’єм стерильного 4,0 % розчину NAOH і провести обробку за методом Петрова;
зробити посів на щільне яєчне середовище.
Як заходи боротьби з контамінацією посівів, здійснюваних за допомогою автоматизованих систем, можуть бути рекомендовані такі заходи:
збільшення концентрації лугів під час первинної обробки матеріалу (не більше ніж до 1,5 % після з’єднання зі зразком);
збільшення часу обробки мокротиння розчином NALC-NaOH до 25 хв;
збільшення концентрації PANTA шляхом зменшення кількості рідкої добавки, яку використовують для розчинення ліофілізованої PANTA (більш концентрований розчин PANTA можна одержати під час розчинення PANTA у 10,0 мл (замість 15,0 мл) збагачувальної добавки, де перед інокуляцією до пробірки МGIT додають звичайний об’єм - 0,8 мл розчину отриманої суміші).
Зміни параметрів обробки мокротиння рекомендують проводити в зазначеному порядку. Слід пам’ятати, що в разі надмірного збільшення концентрації PANTA може спостерігатися пригнічення росту деяких видів мікобактерій (але не M. tuberculosis). Не варто змінювати відразу декілька параметрів одночасно.
Якщо контамінація одним(и) і тим(и) самим(и) видом (видами) мікроорганізмів спостерігається часто, її причина - у недостатній чистоті реактивів або відсутності стерильності реагентів і посуду.
Загальним правилом є аліквотування розчинів невеликими об’ємами. Таким чином, кожного разу використовують свіжий розчин, а розчину, що залишився від аліквоти, не зберігають.
Важливим фактором боротьби з контамінацією є скорочення часу зберігання мокротиння, чим попереджається його забруднення сторонньою мікрофлорою. За потреби, зберігати мокротиння слід у холодильнику за температури +4 -°C.
У процесі деконтамінації мокротиння розчином NALC-NaOH важливо кілька разів перевернути пробірку, щоб дії розчину було піддано всі ділянки внутрішньої стінки пробірки, особливо в її верхній частині.
VI. Диференціація мікобактерій туберкульозного комплексу, видова ідентифікація мікобактерій
1. У бактеріологічних лабораторіях II-III рівнів має проводитися попередня ідентифікація комплексу M. tuberculosis (родова ідентифікація).
Основою ідентифікації є такі характеристики:
швидкість росту бактерій довше ніж 10 днів;
морфологія і забарвлення колоній;
результати дослідження мазків, приготованих із виділеної культури й забарвлених за методом Ціля-Нільсена.
Під час перегляду посівів проводиться вивчення усіх культур, що виросли. На підставі морфологічних ознак колоній здійснюється попередній розподіл культур на ті, що належать до M. tuberculosis complex, нетуберкульозні мікобактерії та споріднені таксони.
Колонії M. tuberculosis на більшості живильних середовищ виглядають сухими, світло-кремового кольору, шорсткими (R-форма), товстими, піднятими в центрі, з вузлуватою або зморшкуватою поверхнею і нерівними краями (нагадують цвітну капусту).
На деяких живильних середовищах (Фінна-II, ліофілізованому середовищі Левенштейна-Єнсена) або під час обробки діагностичного матеріалу 1,0 % розчином сірчаної кислоти (без подальшої нейтралізації) колонії виглядають напівкулястими, гладкими (S-форма), м’якими, вологими, іноді злегка складчастими. Ріст культури M. tuberculosis характеризується як пишний - еугонічний. Після курсу хіміотерапії від хворих на ТБ можуть виділятися гладкі колонії з вологим ростом (S-форми).
M. bovis на середовищі Левенштейна-Єнсена показує дисгонічний ріст, що стелиться.
Колонії більшості нетуберкульозних мікобактерій морфологічно не схожі з M. tuberculosis. Сапрофітні мікобактерії можуть варіювати за формою колоній. Вони бувають гладкі, круглі, вологі, блискучі, куполоподібні, маслянисті. Добре емульгуються у воді. Іноді можуть мати проміжну форму. Колонії кремового кольору М. fortuitum, M. chelonae, М. kansasii і М. terrae complex бувають сухі і зморшкуваті, тому їх іноді помилково приймають за M. tuberculosis. Забарвлення колоній НТМБ може бути від білого, тілесного і кремового кольорів до світло-жовтого, жовтого і помаранчевого. Ріст культури НТМБ може бути пишним або таким, що стелиться, і мати випіт, тобто може бути дисгонічним.
Морфологічно колонії споріднених мікроорганізмів відрізняються від колоній M. tuberculosis, проте деякі види нетуберкульозних мікобактерій (фотохромогенні) можуть рости у вигляді характерної для M. tuberculosis R-форми. Оскільки нетуберкульозні мікобактерії також можуть викликати захворювання людини (мікобактеріози), вони також підлягають вибору для подальшої ідентифікації.
Головною відмінною особливістю роду мікобактерій є сувора кислото-, луго- і спиртостійкість, тому першим ступенем ідентифікації є мікроскопія усіх виділених культур із забарвленням мазків за методом Ціля-Нільсена.
2. Потрібно приготувати мазки з усіх культур, відібраних під час перегляду посівів.
Забарвити мазки за методом Ціля-Нільсена.
Провести мікроскопію мазків.
У разі забарвлення методом Ціля-Нільсена КСБ виглядають червоними на синьому фоні. Мікобактерії мають вигляд тонких, ледь зігнутих паличок, коротких, завдовжки 1-10 (частіше 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, гомогенних або зернистих із трохи заокругленими кінцями. У мазках культури M. tuberculosis, що виросла на напіврідкому або рідкому середовищі, можна побачити мікроколонії мікобактерій у вигляді кіс і джгутів, феномен "корд-фактора".
У разі приготувння мазків для мікроскопічного дослідження колонії M. tuberculosis проявляють свої фізико-хімічні особливості: вони не емульгуються в ізотонічному розчині, а утворюють зернисту крихтоподібну суспензію.
Під час перегляду мазка слід звернути увагу на морфологічні особливості паличок і розміщення їх у препараті. НТМБ у мазку з культури можуть розміщуватись у вигляді частоколу, паркету або мати форму кокобацил. Незважаючи на те, що морфологічна характеристика паличок може асоціюватися з певним видом мікобактерій, це не є підставою для видової ідентифікації.
У разі підтвердження кислотостійкості культур, що виросли, їх відносять до роду мікобактерій і проводять подальше вивчення.
На підставі морфології колоній і позитивного забарвлення мазка з культури видається попередня відповідь.
Група споріднених мікроорганізмів (нокардії, родококи тощо) відрізняється частковою або слабкою кислотостійкістю. У мазку можна одночасно спостерігати червоні і сині палички або фіолетово-сині кокобацили. Морфологічно в мазку з культури вони представлені у вигляді міцелію, що фрагментується на палички, або крупних поліморфних паличок.
Для диференціації роду мікобактерій і споріднених таксонів, окрім описаного тесту, додатково можна використовувати забарвлення мазка за методом Грама.
Мікобактерії мають дуже слабке забарвлення за Грамом. Нокардії, родококи та коринебактерії, що добре сприймають забарвлення за Грамом,- грампозитивні.
На підставі властивостей мікобактерій і споріднених таксонів (додаток 3) та швидкості росту проводиться визначення роду виділеної культури. У споріднених мікроорганізмів відзначається слабка або часткова кислотостійкість, швидкий ріст на простих і яєчних середовищах, виражене забарвлення за методом Грама і значний поліморфізм у разі мікроскопічного дослідження мазка. Нокардії й родококи не мають важливого клінічного значення і можуть досліджуватися в наукових лабораторіях.
Рід мікобактерій характеризується суворою кислотостійкістю в разі забарвленні за методом Ціля-Нільсена і слабким забарвленням за Грамом. У мазках мікобактерії представлені у вигляді довгих, тоненьких або коротких паличок. Мікобактерії характеризуються повільним ростом у разі посіву діагностичного матеріалу на яєчні середовища.
Після оцінки культур, що виросли, лікар-бактеріолог робить висновок про належність культури до комплексу M. tuberculosis, про що робить відмітку у відповідній графі журналу реєстрації досліджень і видає відповідь за результатом культурального дослідження.
3. Диференціація M. tuberculosis complex від НТМБ має проводитися в лабораторіях II і III рівнів. Культури, віднесені за морфологічними властивостями до M. tuberculosis complex, потрібно диференціювати від НТМБ.
У роботі лабораторії трапляються культури, які за морфологічними ознаками не вкладаються в характеристику M. tuberculosis, але показують кислотостійкі властивості під час забарвлення мазка. І навпаки: у разі зовнішньої схожості вирощених колоній із колоніями M. tuberculosis мікроскопічна картина (дрібні палички, кокобацили) викликають сумніви щодо належності культури до цього виду. У подібних випадках не можна видавати відповіді про виділення M. tuberculosis до проведення диференціальної діагностики з НТМБ.
У разі первинного виділення культури з діагностичного матеріалу з урогенітального тракту також слід видавати позитивну відповідь тільки після диференціальної діагностики. Це пояснюється не тільки тим, що подібний матеріал має найбільш високу ймовірність забруднення мікобактеріями навколишнього середовища, але й тим, що сапрофітні мікобактерії можуть бути нормальною мікрофлорою людини.
Ідентифікація M. tuberculosis complex і нетуберкульозних мікобактерій заснована на їх культуральних властивостях і здатності росту на диференційно-діагностичних середовищах.
Бактеріологічна характеристика М. tuberculosis:
на середовищі Левенштейна-Єнсена вони утворюють сухі колонії з нерівними краями, кольору слонової кістки;
ріст можливий за температури +35-37 -°С;
ріст на щільних живильних середовищах можливий не раніше ніж через 3 тижні. Ріст субкультури може з’явитися через 10-14 днів;
відсутність росту на середовищі з 500 мкг/мл саліциловокислим натрієм або 500 мкг/мл паранітробензойної кислоти (ПНБК), а також із 1 000 мкг/мл тіоацетазону (тібону).
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена з 500 мкг/мл саліциловокислого натрію - 100 мл (до згортання);
натрій саліциловокислий - 50,0 мг.
4. Для приготування до наважки натрію саліциловокислого 50,0 мг потрібно додати 1,0 мл етилового спирту для дезінфекції, 2,0 мл стерильної дистильованої води та 97,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання). Ретельно розмішати. Середовище із вмістом 500 мкг/мл саліциловокислого натрію розлити в пробірки по 5,0 мл і згортувати за температури +85 -°C протягом 30 хв.
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена з 500 мкг/мл ПНБК - 100 мл (до згортання);
ПНБК - 50,0 мг;
4,0 % розчин NaOH;
10,0 % розчин HCl.
Для приготування наважку ПНБК (50,0 мг) потрібно ретельно розтерти в стерильній ступці, додати 1,0 мл етилового спирту, 4,0 мл дистильованої стерильної води і 20-24 краплі 4,0 % розчину NaOH до отримання рН 8,0 (за індикаторним папірцем). За допомогою 10,0 % розчину HCl довести рН до 7,0 (додати 1-2 краплі). Приготований розчин додати до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена, ретельно розмішати. Середовище з 500 мкг/мл ПНБК розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 -°C протягом 30 хв.
M. tuberculosis та M. bovis чутливі до тіоацетазону (тіосемікарбазону пара-ацетамінобензальдегіду), тоді як інші мікобактерії, за винятком M. kansasii, до нього стійкі.
Реактиви:
тіоацетазон (тібон) - 10,0 мг;
Етиловий спирт 96°.
Готують розчин тіоацетазону з 1 000 мкг/мл препарату. Для цього до наважки 10,0 мг тібону, висипаної у пробірку, додають 1,0 мл етилового спирту і 9,0 мл стерильної дистильованої води. Отримують розведення 1 000 мкг/мл. 1,0 мл цього розведення додають до 99,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена, одержують концентрацію тібону 10,0 мкг/мл і розливають у пробірки по 5,0 мл. Середовище в пробірках згортають у скошеному вигляді за температури 85 -°C протягом 30 хв.
Для диференціації M. tuberculosis complex і нетуберкульозних мікобактерій 0,1 мл бактеріальної суспензії дослідної культури в стандартному розведенні 10-2 засіяти на середовище із саліциловокислим натрієм або на середовище з ПНБК. Визначення здатності росту мікобактерій на одному із цих діагностичних середовищ проводиться одночасно з визначенням їх стійкості до протитуберкульозних препаратів.
M. tuberculosis complex не ростуть на середовищах із саліциловокислим натрієм та ПНБК, а також із тіоацетазоном (тібоном). Ця властивість слугує для диференціації M. tuberculosis та M. bovis від нетуберкульозних мікобактерій.
У деяких випадках під час постановки тесту спостерігається почорніння, побуріння середовища із саліциловокислим натрієм без зміни кольору середовища в контролі. Здатність викликати деградацію саліциловокислого натрію є відмітною особливістю M. fortuitum і M. сhelonae.
Метод ґрунтується на здатності нетуберкульозних мікобактерій V групи рости на середовищі з 5,0 % NaCl. Крім цієї групи, на такому середовищі ростуть тільки М. terrae complex (містить М. triviale, М. terrae, М. nonchromogenicum і М. flavescens, а також деякі мікобактерії I групи (М. marinum). Усі інші мікобактерії, у тому числі М. tuberculosis і М. bovis, на цьому середовищі не ростуть.
Інгредієнти:
NaCl;
сольова основа середовища Левенштейна-Єнсена;
яєчна суміш середовища Левенштейна-Єнсена.
До сольової основи середовища Левенштейна-Єнсена додають NaCl із розрахунку 5,0 г на 100,0 мл сольової основи (5,0 %). Отриманий розчин стерилізують за температури +121 -°C 20 хв. Потім готують середовище, як зазначено в рецепті приготування середовища Левенштейна-Єнсена.
На всі зазначені вище середовища засівають по 0,2 мл зависі дослідної культури.
На підставі відсутності росту на діагностичних середовищах із саліциловокислим натрієм або ПНБК утворення сформованих непігментованих колоній протягом 3-4 тижнів за температури +37 -°C досліджену культуру можна віднести до M. tuberculosis complex.
Крім росту на цих середовищах, використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. НТМБ ростуть дифузно у вигляді кучок, на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій, що ростуть плівкою, або придонно, мають корд-фактор і ростуть у вигляді "кіс", "джгутів", "вусів" - у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може слугувати диференціальною ознакою. Проте стійкі до препаратів групи ГІНК (препарати групи гідразиду ізонікотинової кислоти) M. tuberculosis цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від НТМБ визначення корд-фактора потрібно використовувати в комплексі з іншими тестами.
Для того, щоб відрізнити М. tuberculosis від інших мікобактерій (М. bovis і НТМБ), використовують різноманітні біохімічні методи.
Видова ідентифікація M. tuberculosis complex має проводитися в усіх лабораторіях II і III рівнів. Найбільш актуальними представниками цього комплексу є М. tuberculosis, M. bovis і M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti, M. caneti.
Їх видова ідентифікація заснована на фенотипічній характеристиці та біохімічних тестах, а саме:
тесту на наявність здатності продукувати нікотинову кислоту;
тесту на наявність нітратредуктазної активності;
тесту визначення здатності росту культури на середовищі з гідразид-тіофен-2-карбоксиловою кислотою (ТСН);
тесту визначення здатності до росту на середовищі з нікотинамідом;
тесту визначення чутливості до циклосерину;
тесту визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно;
тесту на наявність термостабільної каталази;
реакції гiдролiзу твiну-80.
Ніацин продукують усі мікобактерії, але у M. tuberculosis у результаті блокування ряду метаболічних шляхів нікотинова кислота накопичується у великій кількості. Тому цей тест є одним з основних, що дає можливість відрізнити M. tuberculosis від інших мікобактерій.
Принцип методу полягає у визначенні нікотинової кислоти хімічними методами в живильному середовищі, але не у власне мікобактеріях, за допомогою ціаністих сполук, з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового. Класичний метод засновано на використанні ціаністих сполук.
Зазначений метод визначення ніацину потребує для роботи застосування ціаністого калію, робота з яким має проводитися під витяжною шафою і потребує певних умов, що обмежує широке застосування цього тесту. У зв’язку із цим, на особливу увагу заслуговує метод визначення ніацину паперовими смужками, запропонований Кубика і Кильбурн, у модифікації Бараускене.
Перевага цього методу - у використанні роданистого калію замість ціаністого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій, а також у швидкості реакції, яка дозволяє через 3-4 год дати відповідь про належність культури, що виросла на щільному середовищі, до M. tuberculosis або до інших мікобактерій.
Принцип методу полягає в екстракції ніацину з мікобактерій дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок, які заздалегідь обробляють відповідними реактивами.
Приготування реактивів:
20,0 % розчин пара-аміносаліцилової кислоти (ПАСК):
у пробірку наливають 1,75 мл 95,0 % спирту, 0,25 мл диметилсульфоксиду (димексиду) і додають 400,0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані за температури 56 -°C протягом 5-10 хв з періодичним струшуванням до повного розчинення ПАСК;
60,0 % розчин роданистого калію:
наважку 1,5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2,5 мл 8,0 % розчину лимонної кислоти (200,0 мг лимонної кислоти і 2,5 мл дистильованої води);
50,0 % розчин хлораміну "Б":
3,125 г хлораміну "Б" розчиняють у 6,25 мл дистильованої води на водяній бані за температури 56-60 -°C зі струшуванням. Гарячий розчин капають на смужки.
Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки, розміром 60,0 x 8,0 мм, позначають простим олівцем. Пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у такому порядку: 20,0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець, 60,0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50,0 % розчин хлораміну "Б" - на інший кінець. Між краплями мають залишатися сухі проміжки. Папірці висушують за кімнатної температури в темряві протягом 24 год, після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках, що загвинчуються, або закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом трьох місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендують наносити повторно одну краплю хлораміну "Б" на вже висохлу краплю.
Для тесту використовують 3-4-тижневі життєздатні культури (не менше ніж 50 колоній) у середовищі Левенштейна-Єнсена.
Екстракт мікобактерій одержують шляхом додавання до пробірки з культурою 1,0-1,5 мл дистильованої води або ізотонічного розчину натрію хлориду і витримування пробірок у горизонтальному положенні, щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 30 хв у термостаті. Якщо культура росте "газоном", поверхню середовища потрібно злегка проткнути піпеткою для того, щоб збільшити контакт дистильованої води чи ізотонічного розчину натрію хлориду із середовищем. Потім 0,6 мл екстракту мікобактерій відсмоктують мірною піпеткою до пробірки.
Індикаторну смужку поміщають кінцем, поміченим олівцем, до пробірки з 0,6 мл досліджуваного екстракту мікобактерій. Пробірку закривають пробкою та витримують за кімнатної температури, періодично струшуючи, поки вся смужка не просочиться екстрактом. У разі позитивного ніацинового тесту через 15-30 хв рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10,0 % розчину нашатирного спирту.
Використання паперових смужок для визначення ніацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях.
Наразі існують комерційні набори готових паперових смужок, крапельних наборів для проведення ніацинового тесту, що значно його спрощує і стандартизує.
Потрібно пам’ятати, що ряд НТМБ - M. simiae, M. chelonae і деякі штами M. marinum також блокують ніацин. Хромогенні штами НТМБ можуть давати хибнопозитивні реакції.
Негативний результат не є остаточним, оскільки культури M. tuberculosis, виділені від хворих, які тривалий час одержують протитуберкульозні препарати, слабо продукують ніацин. У подібних випадках потрібно повторити тест, а культуру пересіяти, щоб одержати пишний ріст, і використати для тестування 3-4-тижневу культуру.
5. Для внутрішнього контролю якості (далі - ВКЯ) як позитивний контроль слід використовувати штам M. tuberculosis, а як негативний - M. bovis.
ВКЯ ніацинового тесту проводиться щоразу під час проведення тестування. Як позитивний контроль використовують ідентифікований або референс-штам (музейний) M. tuberculosis. Як негативний контроль використовують ідентифікований або референс-штам (музейний) НТМБ, наприклад, M. fortuitum, або дистильовану воду. Слід переконатися в чистоті дослідних штамів, строго дотримуватися правил зберігання і термінів використання розчинів, реагентів і паперових смужок.
6. Для ідентифікації М. tuberculosis користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати М. tuberculosis, які мають нiтратредуктазу, від М. bovis, М. avium і від деяких НТМБ, у яких цей фермент відсутній. Виняток становлять фотохромогенні мікобактерії (М. kansasii) та деякі з III і IV груп.
Активність нiтратредуктази визначається за кількістю відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.
Реактиви:
0, 067 М фосфатний буфер (рН-7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію;
2,0 % розчин (вага/об’єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % НCl;
10,0 % розчин НCl.
Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.
Хід дослідження: 2 петлі біомаси 3-4-тижневої культури суспендують у 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН-7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, й інкубують за температури 37 -°C 15-16 год. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду до 10,0 % НCl + 1,0 мл 10,0 % НCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до М. tuberculosis (метод Тсукамура).
Крім активності зазначених ферментів, для відрізнення М. tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.
M. tuberculosis резистентні до ТСН і дають хороший ріст на середовищі з гідразид- тіофен-2-карбоксиловою кислотою. M. bovis і M. bovis-BCG чутливі до ТСН і не ростуть на середовищі, що містить цю сполуку.
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена - 600 мл (до згортання);
гідразид-тіофен-2-карбоксилової кислоти.
Приготувати наважку ТСН 20,0 мг, розчинити у 20,0 мл стерильної дистильованої води. Одержали розведення 1 000 мкг/мл (розчин А). До 12,0 мл стерильної дистильованої води додати 3,0 мл розчину А. Отримали розведення 200 мкг/мл (розчин Б).
Приготування середовища Левенштейна-Єнсена з ТСН:
1) розведення - 199 мл середовища + 1,0 мл розчину Б - розведення 1,0 мкг/мл;
2) розведення - 195 мл середовища + 5,0 мл розчину Б - розведення 5,0 мкг/мл;
3) контрольна пробірка із середовищем без реактиву.
Досліджуване і контрольне середовище розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури 85 -°C протягом 30 хв.
По 0,2 мл культури в стандартному розведенні засівається на поверхню середовища. Інкубація за температури 37 -°C. Перегляд росту культур через 3-4 тижні. Визначення чутливості мікобактерій до ТСН проводиться одночасно з визначенням їх стійкості до медикаментозних препаратів.
Метод використовується для диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу. М. tuberculosis стійкі до всіх концентрацій ТСН, M. bovis чутливі до ТСН у концентрації 1,0 і 5,0 мкг/мл (слід пам’ятати, що M. bovis іноді дають слабкий ріст на середовищі з концентрацією 1,0 мкг/мл, але ніколи не ростуть на середовищі з 5,0 мкг/мл). M. bovis-BCG чутливі до всіх досліджуваних концентрацій.
7. M. tuberculosis чутливі до нікотинаміду. M. bovis і вакцинний штам M. bovis-BCG мають природну резистентність до нікотинаміду. На цій властивості заснована диференціація M. tuberculosis complex.
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена (до згортання);
нікотинамід.
Для приготування основного розчину нікотинаміду потрібно наважку нікотинаміду 1 000 мг розчинити в 10,0 мл стерильної дистильованої води, стерилізувати через бактерійний фільтр або кип’ятінням на водяній бані за температури 100 -°C протягом 30 хв.
Розчин А: до 4,0 мл дистильованої води додати 1,0 мл основного розчину. Розведення - 20,0 мг/мл.
Розчин Б: до 3,0 мл дистильованої води додати 2,0 мл основного розчину. Розведення - 40,0 мг/мл.
Приготування середовища з нікотинамідом:
до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена додати 5,0 мл робочого розчину А; кінцева концентрація - 1,0 мг/мл;
до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена додати 5,0 мл робочого розчину Б; кінцева концентрація - 2,0 мг/мл;
одночасно приготувати 100 мл контрольного середовища Левенштейна-Єнсена.
Досліджуване і контрольне середовища розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 -°C протягом 30 хв.
По 0,2 мл досліджуваної культури в стандартному розведенні засівається на приготовані середовища; інкубація - за температури +37 -°C протягом трьох тижнів.
У всіх штамів M. bovis-BCG спостерігається стійкість до 30,0-50,0 мкг/мл циклосерину. Ця біологічна особливість вакцинного штаму BCG є важливим діагностичним тестом у його ідентифікації.
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена (200 мл до згортання);
циклосерин.
Наважку циклосерину 20,0 мг потрібно розчинити в 5,0 мл дистильованої води, розведення - 4 000 мкг/мл.
До 99,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена додати 1,0 мл приготованого розчину. Кінцева концентрація препарату - 40,0 мкг/мл.
Одночасно приготувати 100 мл контрольного середовища.
Досліджуване і контрольне середовища розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 -°C протягом 45 хв.
По 0,2 мл досліджуваної культури в стандартному розведенні засівається на приготовані середовища; інкубація - за температури 37 -°C протягом трьох тижнів.
8. M. tuberculosis і M. bovis чутливі до циклосерину, а вакцинний штам BCG росте на середовищі із циклосерином.
В окисно-відновних процесах мікробної клітини активну участь беруть такі ферменти, як каталаза і пероксидаза. У М. tuberculosis і М. bovis, чутливих до препаратів групи ГІНК, спостерігається активність обох ферментів паралельно. При цьому в чутливих культур спостерігається швидке активне виділення пухирців кисню, обумовлене діяльністю каталази, і забарвлення колоній у темно-коричневий колір, обумовлене діяльністю пероксидази. Поява коричневого пігменту пояснюється переходом пірогалолу в пурпурогалін за наявності перекису водню під впливом пероксидази. У культур М. tuberculosis, стійких до препаратів групи ГІНК, активність цих ферментів різко знижена, під час визначення каталазної активності пухирці кисню виділяються в невеликій кількості, повільно або майже відсутні, а в разі визначення активності пероксидази колонії або ледь забарвлюються, або (за високого ступеня стійкості до ізоніазиду) залишаються безбарвними. На відміну від М. tuberculosis, у НТМБ, незалежно від стійкості до ГІНК, каталазна активність завжди різко позитивна, пероксидазної зазвичай не спостерігається.
9. Принцип каталазної реакції полягає в розщеплені перекису водню ферментом каталази на воду й атомарний кисень, що супроводжується виділенням пухирців кисню та переходом пірогалолу в пурпурогалін за наявності перекису водню під впливом пероксидази.
Реактиви:
0,5 % пірогалол: 50,0 мг чистого пірогалолу розчинити в 10,0 мл дистильованої води;
2,0 % пергідроль: 0,2 мл пергідролю розвести в 10,0 мл дистильованої води.
Обидва розчини готують безпосередньо перед дослідом, змішуючи й наливаючи отриману суміш у пробірку так, щоб покрити культуру.
Обидва розчини зливають у колбу в рівній кількості і наливають по 6,0-8,0 мл суміші у пробірку з культурою. Залежно від кількості культур, що перевіряють, об’єм розчинів, які готують, відповідно збільшують.
Облік реакції активності каталази проводять через 5 хв після активного виділення пухирців кисню. Реакцію на пероксидазу враховують через 1,5-2 год після забарвлення колоній у темно-коричневий колір.
Ступінь активності каталази оцінюють за трибальною системою:
(3+) - рясне виділення пухирців кисню в першу хвилину;
(2+) - помірне виділення пухирців кисню;
(1+) - поодинокі пухирці.
За відсутності пухирців реакція вважається негативною (–).
Активність пероксидази також оцінюється за трибальною системою:
(3+) - темно-коричневе забарвлення колоній;
(2+ ) - коричневе забарвлення колоній;
(1+) - блідо-коричневе забарвлення колоній.
У разі негативної реакції колір колоній не змінюється.
Цінною реакцією для відрізнення М. tuberculosis від нетуберкульозних мікобактерій є проба на термостабільність каталази.
Каталаза у кислотостійких мікобактерій різна. У вірулентних мікобактерій вона швидко й легко руйнується під час нагрівання до температури 65-68 -°C. У НТМБ і кислотостійких сапрофітів вона термостабільна.
Готують 3,0 мл густої зависі мікобактерій. 1,5 мл зависі переносять до центрифужної пробірки, яку нагрівають на водяній бані за температури +68 -°C протягом 10 хв. Потім пробірку охолоджують і наносять на предметне скло по 1 краплі зависі: на один кінець - непрогріту (слугує контролем), а на другу - завись після нагрівання. До цих двох зависів додають по 1 краплі пергідролю. Утворення пухирців свідчить про активність ферменту, а відсутність - про пригнічення.
На підставі цієї реакції легко відрізнити М. tuberculosis, у яких каталаза завжди термолабільна, від більшості НТМБ і кислотостійких сапрофітів із різко термостабільною каталазою.
Термостабiльнiсть каталази, так само як і її активність, оцінюють за трибальною системою.
10. Важливою реакцією для ідентифікації мікобактерій всередині і груп (за Раньоном) є реакція гiдролiзу твiну-80. Твiн-80 зв’язує нейтральний червоний, а суміш до реакції має солом’яно-жовтий колір.
Принцип реакції - в ензимному гідролізі твiну-80. Під час цьому відбувається звільнення нейтрального червоного і забарвлення відновлюється від рожевого до червоного.
Позитивна реакція спостерігається у М. aquae (на відміну від М. scrofulaceum, у яких реакція негативна), а з групи вона позитивна тільки у М. terrae.
Реактиви:
1 : 15 М фосфатний буфер (рН-7) - 100,0 мл;
твiн-80 - 0,5 мл;
0,1 % основний нейтральний червоний - 2,0 мл.
Краще розчинити 0,1 г нейтраль-рот не в 100,0, а у 85,0 мл дистильованої води.
Змішати усі три реагенти. Розлити по 4,0 мл у пробірки й автоклавувати за температури +120 -°C 15 хв. Протягом доби перевіряють на стерильність у термостаті і зберігають у холодильнику. Стабільність розчину - не більше двох тижнів.
Емульгують три бактеріологічні лопатки культури в пробірках із підготованим субстратом (твiн-80 із нейтральним червоним). Пробірки поміщають у термостат. Реакцію перевіряють через 4 год на п’яту й десяту добу. Тест вважають позитивним, якщо рожево-червоне забарвлення з’явилося до десятої доби, а негативним - якщо забарвлення не з’явилося (модифікована методика Вайна). Контролем є пробірка із середовищем без реактивів.
Усі перелічені тести не повинні використовуватися в лабораторії одночасно. З іншого боку, не можна зупиняти свій вибір на застосуванні тільки одного з диференціально-діагностичних тестів, оскільки жоден тест не має 100 % чутливості й специфічності. Тільки поєднання кількох тестів дає можливість провести чітку ідентифікацію мікобактерій.
У практичних лабораторіях для ідентифікації M. tuberculosis широке застосування одержали визначення здатності росту мікобактерій на середовищі з ТСН і визначення активності нітратредуктази. Можна також використовувати в комплексі визначення активності нітратредуктази й ніацинового тесту.
У випадках, коли ідентифікації не відбулося (один з тестів позитивний, а інший - негативний), слід пересіяти культуру, дочекатися отримання пишного росту й поставити обидва тести знову. Для отримання правильного результату ідентифікації можна додати ще один (третій із перелічених) тест.
Зважаючи на появу випадків БЦЖ-ускладнень у дітей, потрібно проводити диференційну діагностику між M. tuberculosis і M. bovis-BCG. Із цією метою рекомендують використовувати три тести: на визначення нітратредуктази, ніацину і на здатність до росту на середовищі з нікотинамідом або циклосерином. Культури M. bovis-BCG не мають ніацину, не відновлюють нітратів і дають ріст на середовищі із вищезазначеними реактивами.
Культури, що не піддаються ідентифікації в умовах лабораторії протитуберкульозного диспансеру, рекомендують направляти до Центральої референс-лабораторії для проведення поглибленої ідентифікації.
Біохімічні властивості є основою визначення виду культур, виділених із патологічного матеріалу.
Остаточну біохімічну ідентифікацію із застосуванням складних біохімічних досліджень проводять у лабораторіях III рівня.
11. Під час диференціації мікобактерій, крім використання комплексу тестів, застосованих під час вивчення НТМБ культур, потрібно користуватися обов’язковими ключови тестами для диференціації окремих видів мікобактерій (додаток 4), проведення яких полегшує ідентифікацію культур.
Для клініки особливе значення мають такі види НТМБ: M. kansasii, M. marinum, M. scrofulaceum, M. xenopi, M. avium, M. intracellularae, M. fortuitum.
Для НТМБ, крім зазначених особливостей (швидкості росту, пігментоутворення, морфології колоній і паличок, температурного оптимуму), характерними є негативна ніацинова проба, відсутність пероксидазної активності в разі високої активності каталази, виражена термостабільність каталази у більшості мікобактерій, ріст на живильних середовищах із ПНБК і саліциловокислим натрієм, відсутність у більшості випадків корд-фактора. Характерною для НТМБ також є первинна стійкість до більшості ПТП. Для диференціації M. tuberculosis і M. bovis від НТМБ, відмінності їх один від одного, а також для розрізнення НТМБ всередині груп є основні тести для відрізнення M. tuberculosis, M. bovis від інших мікобактерій (додаток 5).