З усіх наведених методик дослідження жодна сама собою не може відповісти на запитання про належність штаму до одного із видів. Тільки їх комплексне застосування дає можливість правильно ідентифікувати виділені культури. Під час ідентифікації бактеріологи повинні дати відповідь на питання, чи є виділені мікроорганізми мікобактеріями, а якщо так,- до якого виду вони належать.
12. Для забезпечення якості досліджень потрібно регулярно контролювати якість і придатність реактивів та обладнання, правильність реєстрації результатів.
Під час проведення процедур ВКЯ досліджень водночас із діагностичними пробами потрібно тестувати контрольні культури M. tuberculosis H37Rv, M. bovis і M. fortuitum або M. gordonae. У зв’язку із цим потрібно вести музей таких культур.
Слід звернути увагу на те, що M. fortuitum, так само, як і M. tuberculosis, дає позитивну нітратредуктазну реакцію.
13. Біохімічні, імунологічні й молекулярно-біологічні дослідження M. tuberculosis привели до виявлення декількох антигенів, які виявилися корисними для розробки досконаліших методів і комерційних тестів ідентифікації M. tuberculosis.
M. tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti), як відомо, продукують, тобто виділяють в живильне середовище, більше ніж 30 різних білків, де один із переважаючих - MPT64 (MPB64). Було встановлено, що НТМБ не продукують цього білка, тому виявлення MPT64 (MPB64) у пробі свідчить про належність дослідного штаму до комплексу M. tuberculosis.
Імунохроматографію можна віднести до групи реакцій із міченими антитілами. У реакції використовують моноклональні антитіла до шуканого антигена, адсорбовані на мікрочастках (забарвлений латекс або частки колоїдного золота), і моноклональні антитіла до того самого антигена, імобілізовані у вигляді смуги на хроматографічному папері. Крім того, у цій реакції є внутрішній контроль (антивидові антитіла, також закріплені у вигляді смуги на хроматографічному папері).
Тест-системи, що базуються на цьому принципі, мають високу специфічність. Такий метод може бути використано для швидкої ідентифікації комплексу M. tuberculosis, отриманих із рідких і твердих живильних середовищ.
Підготовлений дослідний матеріал (суспензія мікобактерій або позитивна рідка культура) у невеликій кількості (100 мкл) вноситься в стартове вікно тест-системи. Тут відбувається взаємодія антигена з антитілами, адсорбованими на частках, і починається рух комплексів, що утворилися, за рахунок капілярності паперу. Дійшовши до антитіл, розміщених на папері у вікні обліку результату, ці комплекси зв’язуються. При цьому частки латексу або колоїдного золота проявляються у вигляді лінії блакитного (латекс) або коричневого кольору.
Наявність смуги у вікні обліку результату свідчить про належність дослідного штаму до комплексу M. tuberculosis, а відсутність - про належність дослідного штаму мікобактерій до НТМБ. Оскільки частки, навантажені антитілами, беруться в надлишку, частина їх рухається далі і зв’язується у вікні внутрішнього контролю реакції. Смуга в цьому вікні свідчить про правильну роботу тест-системи. У разі відсутності смуги внутрішнього контролю реакції результатів інтерпретувати не можна. Інтерпретація результатів тесту проводиться через 15 хв після внесення суспензії мікобактерій у стартове вікно. Виконувати дослідження слід відповідно до інструкції виробника.
Відразу ж після отримання нової партії тестів має бути проведене тестування свідомо позитивних і негативних проб для того, щоб перевірити, чи не сталося пошкодження тестів у ході транспортування.
Внутрішній контроль якості досліджень проводиться щоразу під час проведення тестування.
Як позитивний контроль може бути використано:
музейний штам H37Rv або клінічний ізолят M. tuberculosis;
суспензію 1,0 мкл (еквівалент 1 петлі діаметром 1,0 мм) колоній M. bovis BCG в 0,2 мл 10 ммоль/л фосфатно-сольового буфера, що містить 0,1 % твіну-80;
рідку культуру M. bovis BCG (McFarland 1 (3-6 x 10-7 КУО/мл), вирощену в рідкому середовищі.
Слід мати на увазі, що деякі штами M. bovis BCG (Glaxo, пастерівський, тайський) не експресують MPT64 або MPB64. Тому тільки бразильський, японський (Токіо), російський, шведський штами M. bovis BCG можна використовувати як позитивний контроль.
Як негативний контроль може бути використано:
незасіяне рідке середовище;
10,0 ммоль/л фосфатно-сольового буфера, що містить 0,1 % твіну-80;
будь-яку НТМБ, наприклад, М. smegmatis або М. gordonae.
14. Диференціацію M. tuberculosis complex (M. tuberculosis M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti) й ідентифікацію НТМБ рекомендують проводити з використанням молекулярно-генетичних методів дослідження.
Використання молекулярно-генетичних методів для ідентифікації мікобактерій базується на гібридизації ДНК дослідного штаму зі специфічними для виду мікобактерій ДНК-зондами. Застосування молекулярно-генетичних методів дозволяє проводити ідентифікацію мікобактерій упродовж декількох робочих днів.
14. Найбільш ефективними визнано молекулярно-генетичні методи, що базуються на гібридизації з ДНК-зондами (Line Probe Assay, LPA), зокрема GenoType Mycobacterium CM/AS, GenoType MTBC, INNO-LiPA Mycobactera. Технологія проведення досліджень із використанням цих методів включає такі етапи:
виділення ДНК з культур мікобактерій;
ПЛР для ампліфікації фрагментів генів мікобактерій;
гібридизацію ПЛР-продуктів із ДНК-зондами, які іммобілізовані на смужці;
візуалізацію результатів гібридизації (при цьому визначається належність мікобактерій до певного виду).
Тест GenoType Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) ґрунтується на технології DNA-STRIP, що дає змогу ідентифікувати такі види мікобактерій: M. avium ssp., M. chelone, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, комплекс M. tuberculosis та M. xenopi.
Процедура проведення тесту складається з таких етапів:
виділення ДНК із культур, що виросли на щільному або рідкому поживному середовищі;
мультиплексна ампліфікація з біотинильованими праймерами;
реверс-гібридизація.
Гібридизація охоплює такі етапи:
хімічна денатурація продуктів ампліфікації;
гібридизація одноланцюгових ампліконів, які помічені біотином, на мембранозв’язаних зондах;
ретельне промивання;
додавання кон’югату стрептавідину / лужної фосфатази (реакція забарвлення).
Вихідним матеріалом для тесту виділення ДНК можуть бути бактерії, які виросли на щільному живильному середовищі (наприклад, Левенштейна-Єнсена) або на рідкому середовищі (наприклад, у системі BACTEC).
Тест не підходить для детекції мікобактерій із прямого матеріалу пацієнтів.
Методика виконання:
під час роботи з бактеріями, які виросли на щільному середовищі, потрібно зняти колонії аплікатором і перенести їх до 300 мкл деіонізованої води до пробірки з кришкою, що загвинчується;
під час роботи з бактеріями, які виросли в рідкому середовищі, потрібно відібрати 1 мл, центрифугувати протягом 15 хв за 10 000 g у центрифузі з аерозоль-непроникним ротором. Супернатант злити, а осад із бактеріями ресуспендувати на вортексі в 300 мкл деіонізованої води в пробірці з кришкою, що загвинчується;
інкубувати пробірки з бактеріями на водяній бані 20 хв за температури +95 -°С;
обробляти пробу в ультразвуковій бані протягом 15 хв;
центрифугувати пробу на максимальній швидкості 5 хв, а для ПЛР використовувати 5,0 мкл супернатанту. Якщо передбачається більш тривале зберігання, розчин ДНК потрібно перенести до нової пробірки.
Можна використовувати інші методи виділення ДНК, які дають змогу отримати з бактерій ДНК для ампліфікації.
Готувати ампліфікаційну суміш (по 45,0 мкл) потрібно в чистій від ДНК кімнаті. Зразки ДНК треба вносити до пробірки із сумішшю також в окремому приміщенні.
Мікс на одну пробірку:
35,0 мкл PNM;
5,0 мкл 10-кратного полімеразного буфера для інкубації;
х мкл розчину MgCl2;
1-2 одиниці термостабільної ДНК-полімерази;
у мкл води для доведення об’єму до 45,0 мкл;
для отримання кінцевого об’єму 50,0 мкл додати 5,0 мкл розчину ДНК (20,0-100 нг ДНК).
Залежно від системи фермент/буфер, що використовується, оптимальна концентрація MgCl2 може коливатися між 1,5 та 2,5 мМ (деякі інкубаційні буфери вже містять MgCl2).
Під час використання HotStar ДНК-полімерази від Qiagen для одного зразка потрібно взяти такі реагенти:
35,0 мкл PNM;
5,0 мкл 10-кратного ПЛР буфера для HotStar Tag (містить 15 мМ MgCl2);
2,0 мкл 25 мМ розчину MgCl2;
0,2 мкл (1,0 од) HotStar Tag;
3,0 мкл води (для молекулярно-біологічних досліджень);
5,0 мкл розчину ДНК.
Кінцева концентрація MgCl2 у цій ампліфікаційній суміші становить 2,5 мМ.
Визначають кількість зразків для ампліфікації (кількість дослідних проб + контрольні зразки). Проба контролю контамінації (негативний контроль) містить 5,0 мкл води замість розчину ДНК. Підготовляють мастер-мікс, що містить усі реагенти, за винятком розчину ДНК, і добре перемішують (не на вортексі!).
Аліквотують по 45 мкл до кожної підготовленої ПЛР-пробірки.
Програма ампліфікації:
15 хв 95 -°C 1 цикл
30 с 95 -°C ) 10 циклів
2 хв 58 -°C )
25 с 95 -°C )
40 с 53 -°C ) 20 циклів
40 с 70 -°C )
8 хв 70 -°C 1 цикл
Продукти ампліфікації можуть зберігатися за температури від +8 -°C до +20 -°C.
Процедура виконання гібридизації:
попередньо нагріти водяну баню із шейкером/TwinCubator до температури 45 -°C, до максимально допустиме відхилення від заданої температури ±1 -°C. Попередньо підігріти розчин HYB та STR до температури 37-45 -°C перед використанням. Реагенти мають бути вільні від осаду. Нагріти всі інші реагенти, за винятком CON-C та SUB-C, до кімнатної температури. За допомогою відповідного дозуючого приладдя розчинити концентрат кон’юганта (CON-C, помаранчевий) та концентрат субстрату (SUB-C, жовтий) у співвідношенні 1 : 100 у відповідних буферах (CON-C у CON-D та SUB-C у SUB-D) у потрібній кількості. Добре перемішати та довести до кімнатної температури. Із розрахунку на кожну смужку додати 10 мкл концентрату до 1 мл відповідного буфера. Розводити CON-C потрібно перед кожним використанням. Розчинений SUB-D можна зберігати протягом чотирьох тижнів за кімнатної температури в захищеному від світла місці;
розлити по 20,0 мкл розчину для денатурації (DEN, блакитного кольору) в куток кожної лунки;
додати 20,0 мкл продукту ампліфікації, перемішати піпетуванням та інкубувати 5 хв за кімнатної температури;
витягти смужку з пробірки за допомогою пінцета та помітити її олівцем на зворотному боці в забарвленому місці. Під час роботи зі смужками завжди використовувати рукавички;
обережно додати до кожної лунки 1,0 мл попередньо нагрітого буфера для гібридизації (HYB, зелений). Перемішати лоток до отримання гомогенного забарвлення. Потрібно дотримуватись обережності, щоб не пролити розчин у сусідні лунки;
помістити смужки до лунки. Смужки мають бути повністю занурені в розчин та розміщені лицьовим боком (можуть бути розрізнені за кольоровим маркером на нижньому краї) угору. Перегорнути стрічку, якщо зайняла хибне положення під час занурення, за допомогою пінцета. Потрібно обережно промивати пінцет після кожної операції для запобігання забрудненню. Це правило має бути обов’язковим для всіх наступних кроків;
помістити плашку на вібруючу водяну баню для перемішування/ TwinCubator та інкубувати 30 хв за температури 45 -°C. Довести частоту вібрації у водяній бані до потрібного постійного та ретельного перемішування. Для досягнення відповідного передання тепла плашка має бути занурена у воду щонайменше на третину товщини;
повністю видалити буфер для гібридизації. Наприклад, використовуючи пастерівські піпетки, що під’єднані до вакуумного насоса;
додати 1,0 мл буфера для жорсткої відмивки (STR, червоний) до кожної лунки та інкубувати 15 хв за температури 45 -°C у водяній бані із шейкером/ TwinCubator;
працювати за кімнатної температури у всіх наступних кроках.
Повністю видалити буфер для жорсткої відмивки.
Вилити відмиваючий буфер до широкого контейнера та видалити всі остаточні рідини способом перегортання плашки та обережним промокуванням її адсорбуючим папером. Ця процедура застосовується для всіх інших стадій промивання:
промити кожну смужку один раз із 1,0 мл відмиваючого розчину (RIN) на вібруючій платформі/ TwinCubator (вилити RIN після інкубації);
додати 1,0 мл розчиненого кон’юганта (див. вище) до кожної смужки та інкубувати 30 хв на вібруючій платформі/TwinCubator;
видалити розчин та промити кожну смужку двічі протягом 1 хв у відмиваючому розчині та 1 хв у дистильованій воді (тобто струменем із пластикової пляшки) на вібруючій платформі/TwinCubator (видаляти розчин кожного разу). Переконатися, що видалено будь-які залишки води після останнього промивання;
додати 1,0 мл розведеного субстрату (див. вище) до кожної смужки та інкубувати в захищених від світла умовах без вібрації.
Залежно від умов тестування (кімнатної температури) час інкубації субстрату може змінюватися від 3 хв до 15 хв. Збільшений час інкубації субстрату призведе до збільшення фонового сигналу та може вплинути на інтерпретацію результатів;
зупиняти реакцію швидким подвійним відмиванням дистильованою водою;
за допомогою пінцета дістати смужки з плашки та висушити їх між двох шарів адсорбуючого паперу.
Для оцінки та інтерпретації результатів смужки потрібно наклеїти на бланк-шаблон і зберігати в захищеному від світла місці. Еталон для оцінки додається до набору.
15. Дозволяється зберігати культури мікобактерій за температури 2-8 -°C на щільних живильних середовищах упродовж одного року або за кімнатної температури (не вище ніж 20 -°С) у темному провітрюваному місці до шести місяців.
Зберігати культури в рідкому живильному середовищі дозволяється довше ніж один місяць за температури 2-8 -°C.
Клінічні ізоляти й референс-штами для контролю якості мають бути збережені/заархівовані в належних умовах для забезпечення життєздатності й специфічних характеристик штаму. Щоб уникнути багатократного субкультивування, що може спричинити генетичні зміни, які призводять до зміни фенотипічних і біологічних характеристик штаму, доцільно заморожувати культури мікобактерій, що можуть зберігатися в таких умовах упродовж декількох років (-20 -°С) або десятиліть (-70 -°С). Слід мати на увазі, що життєздатність M. tuberculosis знижується набагато швидше за температури -20 -°C, ніж за температури -70 -°C, а також те, що велика щільність замороженої суспензії сприяє підтриманню життєздатності культури мікобактерій. Штами для контролю якості бажано зберігати за температури -70 -°C і використовувати їх упродовж одного року, оскільки після закінчення цього терміну життєздатність може значно знизитися.
Використовують один із таких варіантів середовища для заморожування:
10,0 % розчин молока, стерилізований за температури 110 -°C упродовж 10 хв (можливе використання сухого молока або комерційного реагенту Skimmed Milk Powder);
рідке живильне середовище з підвищеним вмістом гліцерину, наприклад, Middlebrook 7Н9 з добавкою ADC або триптіказо-соєвий бульйон, приготований згідно з інструкцією виробника;
5,0 % гліцерин у 0,9 % розчині NaCl, стерилізований за температури 110 -°C упродовж 10 хв.
Використовують тільки свіжі культури мікобактерій, що виросли на щільному яєчному середовищі. Якщо культура є старою (більше трьох тижнів), її пересівають на свіже середовище й культивують за температури 37 -°C. Як тільки спостерігається хороший ріст, цю культуру використовують для заморожування.
Бактеріологічною петлею знімають максимально можливу кількість колоній, намагаючись не захоплювати живильного середовища, і вносять їх до кріопробірки, що містить 1,5 мл одного з вищезазначених середовищ.
Пробірки маркують із зазначенням дати приготування суспензії, вносячи запис до журналу.
VII. Бактеріологічна ідентифікація нетуберкульозних мікобактерій
1. До НТМБ належать усі культури, що дали ріст на середовищі Левенштейна-Єнсена із саліциловокислим натрієм або на середовищі з ПНБК, і підлягають ідентифікації до виду.
Первинна ідентифікація заснована на морфологічних і фенотипічних властивостях мікобактерій. Знання видової належності мікобактерій визначає подальшу тактику лікаря. Наприклад, однократне виділення з діагностичного матеріалу патогенних мікобактерій потребує повторного бактеріологічного обстеження хворого. Часті знахідки в матеріалі від хворих сапрофітних мікобактерій, широко поширених у природі, особливо M. gordonae, можуть вказувати на контамінацію матеріалу під час забору, на забруднення водопровідної чи дистильованої води.
Остаточна ідентифікація ґрунтується на поглибленому вивченні біохімічних властивостей і культуральних потреб мікобактерій.
Первинна ідентифікація ґрунтується на таких ознаках, як:
швидкість росту;
здатність до утворення пігменту;
здатність до росту за різних температур.
Для виявлення цих ознак не потрібно спеціального обладнання й реактивів, тому їх можна вивчати в бактеріологічних лабораторіях ПТЗ. Рекомендовано мати додатковий термостат із температурою 45 -°C.
Швидкість росту мікобактерій - це час, потрібний для формування видимих зрілих колоній на щільному середовищі.
2. Мікобактерії, які формують такі колонії протягом 7 днів, називаються швидкозростаючими. До групи швидкозростаючих мікобактерій належать М. fortuitum і M. chelonae, для повного росту яких потрібно не більше ніж 5 діб. Однак, під час виділення з патологічного матеріалу швидкозростаючі мікобактерії можуть мати триваліший період росту.
Мікобактерії, яким для формування колоній потрібний триваліший період часу, називаються повільнозростаючими. До них належать M. avium, M. kansasii, M. xenopi та ін. Тоді як, надлишок посівного матеріалу може бути причиною швидкої появи росту повільнозростаючих мікобактерій. Крім того, облік швидкості росту потрібно проводити із часу утворення сформованих колоній, а не за появою ініціального росту. Швидкість росту мікобактерій оцінюють за швидкістю росту субкультури.
Методика виконання:
0,1 мл суспензії досліджуваної культури в стандартному розведенні засівають на середовище Левенштейна-Єнсена, інкубують за температури 37 -°C. Спостереження за культурою перші 5-7 діб щоденне, далі - щотижня, до моменту появи сформованих колоній.
За швидкістю росту культури можна спостерігати під час визначення чутливості мікобактерій до ПТП. Враховувати результати чутливості швидкозростаючих мікобактерій до ПТП можна через 5-7 діб, повільнозростаючих - через 21 добу.
Для визначення здатності до росту за різних температур застосовують таку методику виконання:
приготувати суспензію досліджуваної культури в ізотонічному розчині натрію хлориду за стандартом мутності № 5;
розвести у десять разів (0,5 мл суспензії додати до 4,5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду);
засіяти по 0,2 мл суспензії у 4 пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена;
інкубувати засіяні пробірки за температури 22, 28, 37 і 45 -°C.
3. Майже всі види НТМБ добре ростуть за температури 22 -°C. За температури 45 -°C ростуть 86,0 % культур М. avium і всі культури М. xenopi.
Колонії НТМБ можуть мати забарвлення від кремового до інтенсивного жовто-помаранчевого. Залежно від забарвлення колоній і здатності утворення пігменту під дією світла НТМБ розподіляються на 3 групи:
фотохромогенні мікобактерії. Продукують жовтий пігмент тільки під дією світла, а в темряві вони мають кремовий колір. Типовим представником цієї групи є М. kansasii;
скотохромогенні мікобактерії. Продукують пігмент від інтенсивно жовтого до помаранчевого кольору під час росту як при світлі, так і в темряві. До них належать М. gordonae і М. xenopi;
нехромогенні мікобактерії. Не утворюють пігменту, а їх колонії мають тільки білуваті або кремові відтінки. До цієї групи належать М. avium, M. malmoensе, M. terrae complex тощо. Серед них зустрічаються культури, які змінюють забарвлення у процесі старіння або за несприятливих умов росту (22 -°C).
Методика визначення фотохромогенних властивостей мікобактерій:
приготувати суспензію досліджуваної культури в ізотонічному розчині натрію хлориду за стандартом мутності № 5;
розвести у десять разів (0,5 мл суспензії додати до 4,5 мл ізотонічного розчину натрію хлориду);
засіяти по 0,2 мл суспензії у 2 пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Загорнути обидві пробірки в алюмінієву фольгу (для захисту від дії світла в термостаті);
інкубувати за температури 37 -°C;
через 8-10 діб з’являється ініціальний ріст культури. Взяти одну з пробірок, звільнити від фольги й помістити на 2 год під яскраве сонячне чи електричне світло. Після закінчення дії світла пробірку помаркувати написом "світло" й продовжити інкубацію в термостаті за температури 37 -°С;
через 1-2 доби перевіряти забарвлення культури. Якщо під впливом світла культура в пробірці "світло" набула жовтого забарвлення, а в контрольній пробірці залишилася кремовою, то це фотохромогенна культура.
На підставі застосування найпростіших бактеріологічних методів, що дають змогу виявити специфічні ознаки НТМБ, а також використовуючи зазначені вище саліцилатний тест і визначення нітратредуктази, можна провести первинну ідентифікацію мікобактерій (додаток 6).
Наприклад, якщо швидкозростаюча мікобактерія має позитивний результат стосовно деградації саліциловокислого натрію, це може бути M. fortuitum або M. chelonae.
Слід визначити наявність нітратредуктази: позитивна реакція у M. fortuitum, негативна - у M. chelonae.
За здатністю росту за температури 45 -°C можна розрізнити предстаників M. avium (ростуть) і представників M. terrae complex (не ростуть).
Таким чином, на підставі знання кількох властивостей мікобактерій можна провести первинну ідентифікацію. Для остаточної ідентифікації виділені культури направляють до лабораторії вищого рівня.
Остаточна ідентифікація із застосуванням складних біохімічних досліджень проводиться у лабораторіях III рівня. Ідентифікація проводиться на підставі визначення активності ферментів (амідази, арилсульфатази, каталази), толерантності до різних хімічних агентів, здатності до гідролізу Твіну 80, відновлення нітратів і телуриту калію, засвоєння заліза, росту на середовищі з хлоридом натрію.
Результати первинних досліджень мікобактерій дають змогу вибрати біохімічні тести, потрібні для остаточної ідентифікації НТМБ.
VIII. Дослідження за визначенням медикаментозної чутливості мікобактерій туберкульозу
1. Для дослідження медикаментозної чутливості (далі - МЧ) мікобактерій до ПТП потрібно дотримуватись певних стандартів досліджень. Дослідження МЧ M. tuberculosis потрібно проводити в ШББ другого класу, які забезпечують не тільки захист оператора, але й збереження від контамінації біологічного об’єкта.
У разі отримання від хворого культур M. tuberculosis з різного дослідного матеріалу (мокротиння, лаважної рідини, сечі, гною, біопсії, післяопераційного матеріалу тощо) потрібно досліджувати кожний виділений штам.
У разі одночасного отримання від хворого двох і більше культур M. tuberculosis з однорідного діагностичного матеріалу достатньо досліджувати один штам, який отримано з одного зразка дослідного матеріалу.
У разі незначного росту культури (1-2 колонії в пробірці) потрібно зібрати бактеріальну масу з різних пробірок однорідного дослідного матеріалу та здійснювати визначення МЧ.
Визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП потрібно проводити тільки з використанням ХЧ субстанцій ПТП.
На результати ТМЧ суттєво впливають такі чинники, як використане для тестування живильне середовище і стабільність препаратів, що вносяться до нього.
Істотно впливають на стабільність ПТП умови їх стерилізації та зберігання.
Багато ПТП є солями, тобто біологічно активні субстанції є тільки частиною загальної маси молекули, тоді як інші радикали (наприклад, сульфати, гідрохлориди тощо) можуть становити значну частку загальної маси. У зв’язку із цим, під час приготування живильних середовищ із препаратами потрібно враховувати кількість активної речовини й молекулярну формулу препарату.
Для визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП застосовується середовище Левенштейна-Єнсена. Це середовище рекомендують до використання всі мікробіологічні лабораторії ПТС України для отримання порівняних результатів. Дотримання стандартної технології приготування живильного середовища з препаратами має найважливіше значення для отримання достовірних результатів тестування. Як уже зазначалося, для приготування живильних середовищ із метою визначення чутливості M. tuberculosis до ПТП мають використовуватися тільки ХЧ субстанції препаратів. Під час приготування робочих розчинів із потрібними концентраціями активної субстанції розрахунки розміру наважки слід проводити з урахуванням відсотка активності препарату, яка може варіювати від серії до серії.
Особливістю такого ПТП, як піразинамід (Z), є його висока протитуберкульозна активність при знижених значеннях кислотності середовища (рН 5,5). У той же час, для культивування M. tuberculosis на щільних яєчних середовищах оптимальним є значення рН, близьке до нейтрального. Ці обставини не дозволяють використовувати стандартних методик для визначення чутливості M. tuberculosis до Z на щільних яєчних живильних середовищах.
Велике значення під час постановки ТМЧ M. tuberculosis має правильна підготовка інокулята, тому правильне приготування бактеріальної суспензії штаму має дуже велике значення для отримання достовірного результату. Якщо число бактерійних одиниць дуже мале, стандартної кількості інокулята буде недостатньо для визначення "критичної" частки стійких штамів. Якщо число мікобактерій дуже велике, ріст резистентних штамів, що природним чином утворюються, може симулювати стійкість до ПТП.
Важливим також є вік культури, що використовується для приготування посівної суспензії. Тести на визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП повинні проводити тільки з культурами, що активно ростуть (3-4 тижні). Використання старої культури для приготування посівної суспензії може призвести до хибного результату дослідження.
Оскільки у разі використання непрямих методів ТМЧ M. tuberculosis, підготовка бактерійного інокуляту проводиться в лабораторії. Під час приготування мікобактеріальної суспензії для засіву може бути вибрано таке співвідношення чутливих і резистентних мікроорганізмів, яке не відповідає дійсній ситуації в ураженому органі пацієнта. У зв’язку із цим, потрібно правильно проводити відбір бактерійної маси для дослідження (обов’язково робити змиви зі всієї поверхні середовища з культурою). Важливе значення під час проведення ТМЧ має також тривалість інкубації.
2. Для визначення МЧ M. tuberculosis мають використовуватися тільки стандартизовані методи дослідження, що дозволяють:
правильно вести лікування пацієнтів;
інтерпретувати й порівнювати дані, одержані з різних джерел;
проводити оцінення рівнів МС M. tuberculosis до ПТП, а також тенденцій, які спостерігаються в різних регіонах або країнах.
Наразі немає єдиного універсального методу визначення МЧ M. tuberculosis. Існують культуральні методи з використанням щільних і рідких живильних середовищ із автоматичною детекцією росту мікобактерій, а також молекулярно-генетичні експресні методи.
Вибір того чи іншого методу визначається методичними підходами, що традиційно склалися і використовуються в певній країні. Для ефективного управління моніторингом, забезпеченням епідеміологічного нагляду за МС M. tuberculosis до ПТП і розповсюдженням стійких штамів збудника, а також для порівняння результатів досліджень та ефективності лікування в межах світової спільноти в масштабах кожної країни рекомендують використовувати тільки один із наявних уніфікованих методів, регламентований внутрішніми нормативними документами країни.
Усі наявні методи визначення МЧ M. tuberculosis можна умовно розділити на дві категорії:
методи прямого визначення МЧ M. Tuberculosis;
методи непрямого визначення МЧ M. tuberculosis.
Під час використання методів прямого визначення МЧ M. tuberculosis, мокротиння чи інші клінічні матеріали, що заздалегідь знезаражені й гомогенізовані, висіваються безпосередньо на середовища, що містять відповідний препарат. Кількість інокуляту визначається залежно від кількості КСБ, отриманої під час мікроскопії мазка.
Методи прямого визначення МЧ мають низку недоліків:
для дослідження не можна використовувати зразків діагностичного матеріалу, що мають негативний результат мікроскопії;
під час проведення цього дослідження підвищується ризик контамінації;
може спостерігатися недостатній ріст культури, що не дозволяє зробити достовірних висновків;
неможливість стандартизувати методику.
У разі використання методів непрямого визначення МЧ M. tuberculosis проводиться виділення мікроорганізмів з клінічних зразків під час культивування, а потім на середовище, що містить препарат, висівається гомогенна суспензія або культура, що виросла на бульйоні.
3. Модифікований метод Канетті широко застосовується в усьому світі, є коректним, інформативним і точним.
Принцип методу полягає у визначенні співвідношення (пропорції) між чутливими й стійкими особинами в популяції штаму M. tuberculosis, який виділено від хворого на ТБ, до ПТП у "критичних" концентраціях. "Критична" концентрація - один із критеріїв резистентності. Це чітко визначена кількість кожного медикаментозного препарату, яку має містити середовище для постановки ТМЧ. "Критична" пропорція - також один із критеріїв стійкості - відсоток стійких особин у бактеріальній популяції, за якого або вище якого штам вважається стійким до певного медикаментозного препарату. Якщо кількість стійких особин до якогось антибактеріального препарату в популяції буде меншою, ніж 1,0 %, такий штам вважається чутливим до цього препарату. Якщо стійкість особин у популяції більша, ніж 1,0 %,- штам вважається стійким до цього препарату.
Наразі в усьому світі застосовують модифікований метод пропорцій із двома контролями.
Переваги методу пропорцій:
завдяки постійному візуальному контролю за ростом та розподілом бактеріальної популяції у двох контрольних пробірках, підрахунку кількості колоній, що виросли, можна більш об’єктивно оцінити результати резистентності в пробірках із препаратами;
можливість оцінити бактеріальну популяцію M. tuberculosis не тільки як чутливу або стійку, але й розподілити її за ступенем резистентності.
Середовища для дослідження МЧ M. tuberculosis до ПТП мають містити точні "критичні" концентрації антибактеріальних препаратів, які відповідають їх активності. Тому під час приготування розчинів препаратів потрібно враховувати їх антибактеріальну активність. Показники антибактеріальної активності має бути зазначено в паспорті до препарату.
Наважки ХЧ субстанцій препаратів готують за допомогою вагів, що повірені та дозволяють проводити зважування з точністю до 0,0001 г. Це забезпечує точність наважки препаратів із похибкою не більше ніж ±1,0 %.
Під час зберігання розведених препаратів за температури +5 -°C і вище довше ніж 6 год може відбутися зниження їх активності. Тому розчини потрібно готувати безпосередньо перед приготуванням середовищ. У лабораторіях, де є морозильні камери, що підтримують температуру нижче ніж -20 -°C, можна зберігати розведені препарати протягом шести місяців за умови недопущення їх відтанення й повторного заморожування. Така технологія дає певні переваги: приготування більшого об’єму розчину дозволяє зважувати велику наважку препарату, що, відповідно, зменшує похибку зважування, а також втрату речовини під час зважування. У разі заморожування розчину препарату він має бути розлитий по кріопробірках в об’ємі, потрібному для додавання в одну порцію середовища.
Для дослідження МЧ M. tuberculosis до ПТП методом пропорцій застосовують щільне яєчне середовище Левенштейна-Єнсена. Після додавання препарату до середовища потрібно ретельно його перемішати, не допускаючи утворення бульбашок і піни, щоб забезпечити рівномірний розподіл препарату в середовищі. Згортання середовища з препаратом має проводитися в тих самих умовах, що й середовища без препарату. Коагуляцію проводять за температури +85 -°C протягом 30 хв.
Відбір препаратів, для яких визначається МЧ виділених штамів M. Tuberculosis, залежить від категорії захворювання, випадку та профілю МС M. tuberculosis, отриманого під час попередніх досліджень, якщо їх проводили.
4. Для приготування розведень протитуберкульозних препаратів використовують ХЧ субстанції препаратів.
Схема процедур:
ізоніазид (Н) - 0,2 мкг/мл;
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення). Під час приготування наважки кожного з препаратів I та II ряду потрібно враховувати потенцію ПТП, яка залежить від фірми-виробника й хімічного складу ХЧ субстанції препарату. Щоразу потрібно робити відповідне перерахування на вміст активної речовини ХЧ субстанції препаратів;
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100,0 мкг/мл (третє розведення);
1,0 мл третього розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 10,0 мкг/мл (четверте розведення);
внести 1,0 мл четвертого розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 0,2 мкг/мл.
Рифампіцин (R) - 40,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 2,0 мл етилового спирту + 8,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл;
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Етамбутол (E) - 2,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл;
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100 мкг/мл (третє розведення);
внести 1,0 мл третього розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 2,0 мкг/мл.
Стрептоміцин (S) - 4,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 4,0 мл стерильної дистильованої води = 200 мкг/мл (третє розведення);
внести 1,0 мл третього розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання), кінцева концентрація в середовищі - 4,0 мкг/мл.
Амікацин (Аm) - 30,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 1,5 мл другог розведення до 48,5 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання), кінцева концентрація в середовищі - 30,0 мкг/мл.
Канаміцин (Кm) - 30,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 1,5 мл другого розведення до 48,5 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 30,0 мкг/мл.
Капреоміцин (Cm) - 40,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Eтіонамід (Et) - 40,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 2,0 мл димексиду (DMSO) + 8,0 мл дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Протіонамід (Pt) - 40,0 мкг/мл:
50,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл димексиду (DMSO) + 8,0 мл дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Левофлоксацин (Lfx) - 2,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH= 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100 мкг/мл (третє розведення);
внести 1,0 мл третього розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 2,0 мкг/мл.
Моксифлоксацин (Mfx) - 1,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH** = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,5 мл третього розведення до 49,5 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 1,0 мкг/мл.
ПАСК (Pas) - 1,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100,0 мкг/мл (третє розведення);
3,0 мл третього розведення + 3,0 мл стерильної дистильованої води = 50,0 мкг/мл (четверте розведення);
внести 1,0 мл четвертого розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 1,0 мкг/мл.
Готують гомогенну бактеріальну суспензію культури M. tuberculosis в ізотонічному розчині натрію хлориду. Для цього культура, що виросла на щільному живильному середовищі Левенштейна-Єнсена, знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду. При цьому тампон має торкатися всієї поверхні середовища. Потім тампон занурюють у пробірку, що містить 2,0 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, культуру змивають в рідину, попередньо розтираючи по внутрішніх стінках пробірки. Пробірку залишають на 30 хв за кімнатної температури для осадження крупних часточок культури.
Суспензію культури стандартизують за бактеріальним стандартом мутності МакФарланда (1 McF) (додаток 7).
Як стандарт мутності МакФарланда застосовують суспензію слаборозчинної у воді солі сульфату барію. Для її приготування використовують такі два розчини: BaCl2x 2H2O - 1,0 % розчин і H2SO4 - 1,0 % розчин.
Для отримання суспензії потрібної мутності змішують розчини хлориду барію і сірчаної кислоти в певних пропорціях.
Стабільність стандарту МакФарланда - шість місяців за зберігання в темряві.
Останнім часом у лабораторіях, у тому числі й в Україні, широко застосовують сучасні оптичні прилади для зручного і швидкого визначення мутності бактеріальної суспензії. Принцип роботи такого приладу - оптична абсорбція з видачею результатів вимірювання в одиницях за МакФарландом.
Процедура приготування суспензії (додаток 8) призводить до утворення інфекційного аерозолю. Вона має проводитися тільки з використанням товстостінних (переважно боросилікатних) пробірок без видимих пошкоджень. Процедура має проводитися в ШББ другого класу.
Із розведення 10--2 вносимо по 0,1 мл бактеріальної суміші до одного з двох контролів (К1) і до всіх пробірок із препаратами. Кінцева концентрація бактеріальної суміші в пробірках, що засіяні, дорівнює 10--3.
Із розведення 10--4 вносимо по 0,1 мл бактеріальної суміші до другого контролю (К2). У пробірках із середовищем кінцева концентрація бактеріальної суспензії дорівнює 10--5.
Після закінчення посіву засіяні пробірки переміщають у горизонтальні штативи і поміщають для інкубації в термостат за температури 37 -°C. При цьому поверхня скосу живильного середовища має знаходитись у горизонтальній площині, а нахил штатива має виключити торкання пробки з матеріалом посіву. Суспензія, що засівається, має рівномірно покривати всю поверхню скосу середовища.
Через дві доби можна перевести пробірки у вертикальні штативи, проте ця процедура не носить обов’язкового характеру.
Посіви переглядають щотижня. За наявності росту в контрольних пробірках через чотири тижні після посіву (щонайменше - шість тижнів) реєструють отримані результати. Кількість колоній, що виросли в контрольній пробірці К1 (вихідне розведення мікробної суспензії - 1 : 100), приймається за 100 %; кількість колоній, що виросли в К2, відповідає 1,0 % усіх бактерій популяції.
Якщо в контрольних пробірках К1 і К2 під час посіву досліджуваного штаму M. tuberculosis спостерігається ріст відповідно до вищезазначених пропорцій (100 : 1), можна робити облік результатів стійкості в пробірках із препаратами. Інтенсивність росту в контролях і в пробірках із препаратами оцінюють:
культура M. tuberculosis є "чутливою", якщо в пробірці з "критичною" концентрацією препарату немає росту або кількість колоній менша, ніж у контролі К2 з 1,0 % бактеріальної популяції;
культура M. tuberculosis є "стійкою", якщо в пробірці з "критичною" концентрацією препарату виросло більше колоній, ніж у контролі К2 із 1,0 % бактеріальної популяції.
Дослідження потрібно повторити, якщо:
немає пропорційності росту між К1 і К2;
відсутній ріст у К1 і К2 або в одній із контрольних пробірок;
К1, К2 або один із них забруднено;
забруднено пробірки з препаратами.
5. Суть методу визначення медикаментозної чутливості мікобактерій до протитуберкульозних препаратів непрямим методом абсолютних концентрацій на щільному середовищі Левенштейна-Єнсена полягає в тому, що здійснюють дозований посів ретельно підготовленої мікобактеріальної суспензії з культури M. tuberculosis в пробірки із живильним середовищем Левенштейна-Єнсена, що містить певні концентрації ПТП і контрольні пробірки без препаратів. Зазвичай використовується "критична" концентрація препаратів, яка є критерієм стійкості, пригнічує ріст всіх або майже всіх мікобактерій, що визначається як наявність 20 або менше колоній збудника та дає можливість визначити культуру M. tuberculosis як чутливу або стійку до цього ПТП.
Для дослідження МЧ мікобактерій до ПТП застосовують щільне яєчне середовище Левенштейна-Єнсена. Після додавання препарату до середовища потрібно ретельно його перемішати, не допускаючи утворення бульбашок і піни та забезпечуючи рівномірний розподіл препарату в середовищі. Згортання середовища з препаратом має проводитися в тих самих умовах, що й середовища без препарату. Згортання проводять за температури 85 -°C протягом 30 хв.
Середовища, що входять до набору для тестування першого штаму, мають готуватися з однієї партії середовища Левенштейна-Єнсена в один день.
На кожній пробірці із середовищем надписують номер культури і назву препарату. Для зручності подальшого обліку результатів дослідження МЧ мікобактерій рекомендують виконувати написи на верхній частині пробірки зі сторони, де знаходиться нахил живильного середовища. Крім того, пробірки з кожного набору середовищ слід розміщувати в штативах в однаковій послідовності (відповідно до граф лабораторного журналу).
Приготування живильних середовищ із препаратами та розведення здійснюють так само, як під час визначення МЧ мікобактерій за методом пропорцій.
Готують гомогенну бактеріальну суспензію в ізотонічному розчині натрію хлориду. Для цього культура, що виросла на твердому живильному середовищі Левенштейна-Єнсена, знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду. При цьому тампон має торкатися всієї поверхні середовища. Потім тампон занурюють у пробірку, що містить 2,0 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, культуру змивають у рідину, попередньо розтираючи по внутрішніх стінках пробірки. Пробірку залишають на 30 хв за кімнатної температури для осадження крупних часточок культури.
Суспензію культури стандартизують за бактеріальним стандартом мутності (1 McF). Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, відсмоктують піпеткою до іншої пробірки з ізотонічним розчином натрію хлориду.
Із цієї суспензії готують таке розведення:
1 : 10 (10--1) контроль 1(К1) (4,5 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,5 мл суспензії 1 McF).
Із суспензії з мутністю 1 McF вносимо по 0,2 мл бактеріологічної суміші до контролю (К1). Із розведення 10--1 вносимо по 0,2 мл бактеріологічної суміші до всіх пробірок із препаратами. Кожну пробірку із засіяною суспензією закривають кришками, що загвинчуються, і ставлять у вертикальний штатив, щоб за час досліду суспензія рівномірно стікала по поверхні косяка середовища до дна пробірки.
Після закінчення посіву всіх суспензій засіяні пробірки переміщають у горизонтальні штативи і поміщають для інкубації в термостат за температури 37 -°C. При цьому поверхня косяка живильного середовища має знаходитися в горизонтальній площині, а нахил штатива має виключати торкання пробки до матеріалу засіву. Суспензія, що засівається, має рівномірно покривати всю поверхню косяка середовища.
Через дві доби можна перевести пробірки у вертикальні штативи, проте ця процедура не носить обов’язкового характеру.
Оцінення результатів визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП проводять через три тижні інкубації в термостаті. У разі поганого росту МБТ на контрольному живильному середовищі слід почекати ще 1-2 тижні до отримання вираженого росту в контролі, після чого видається остаточна відповідь.
Під час використання методу абсолютних концентрацій культура M. tuberculosis вважається стійкою, якщо на живильному середовищі з певним препаратом виростає 20 і більше колоній мікроорганізмів у разі рясного росту в контрольній пробірці (без препарату).
6. Загальнодоступні методи визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП I ряду досконало вивчено. При цьому було досягнуто консенсусу щодо відповідних методологій, "критичних" концентрацій препаратів та достовірності й відтворюваності результатів тестування. З іншого боку, у результаті проведення вибіркових обстежень діючої практики стосовно МЧ до ПТП II ряду було виявлено істотні відмінності щодо методів тестування, "критичних" концентрацій препаратів і гранично допустимих пропорцій для виявлення резистентності. На цій підставі достовірність досліджень МЧ до ПТП II ряду було поставлено під сумнів і стала очевидною крайня потреба у стандартизації методів, встановленні критеріїв визначення резистентності та проведенні професійного тестування.
Система ВАСТЕС МGIТ 960 призначена для прискореної бактеріологічної діагностики ТБ і визначення МЧ мікобактерій до ПТП I і II ряду, дозволяє визначати МЧ мікобактерій до низьких і високих концентрацій препаратів, аналогічно до методик дослідження на щільних середовищах. Набір з індикаторних пробірок контролю росту (без препарату) і тих, що містять ПТП, розміщується на спеціальному носії із штрих-кодом, завдяки чому прилад здійснює безперервний моніторинг внесеної до пробірки культури.
Результати інтерпретуються автоматично, виходячи з обліку розмноження мікобактерій у пробірці без препарату, тобто в момент позитивності контролю росту, на 4-13-й день після інокуляції культури.
Набір MGIT 960 SIRE Kit містить чотири флакони з основними ПТП і вісім флаконів зі збагачувальною рідиною. "Критичні" (низькі) концентрації препаратів досягаються в живильному бульйоні після розведення. Для цього до кожного флакона з ліофілізованим препаратом додають 4,0 мл стерильної дистильованої або деіонізованої води, а потім 100 мкл переносять із нього до пробірки MGIT з бульйоном. Інші набори дають можливість проводити тестування за наявності високих концентрацій ПТП. Для отримання високої концентрації медикаментозних препаратів, відповідно до інструкції, до кожного флакона, що містить ліофілізований препарат, потрібно додати 2,0 мл стерильної дистильованої або дейонізованої води.