Про затвердження Інструкції з мікробіологічної діагностики туберкульозу

одну краплю матеріалу треба нанести на скельце з метою приготування та фарбування мазка за методом Ціля-Нільсена для світлової бактеріоскопії;

0,7 мл деконтамінованого зразка біологічного матеріалу (за використання автоматичного виділення ДНК на GenoXtract) або 0,5 мл зразка (для виділення ДНК за допомогою реагентів GenoLyse) переносять до пробірки об’ємом 2,0 мл з кришечкою, що загвинчується. Цю пробірку з матеріалом передають у приміщення виділення нуклеїнової кислоти для здійснення ПЛР дослідження відповідно до інструкції виробника реагентів.

Важливо пам’ятати, що для отримання коректного результату потрібно, щоб забраний матеріал був деконтамінований не пізніше ніж 48 год від моменту забору в пацієнта, у цьому разі зберігатися він може за температури +4 ± 2 -°C.

Набори реагентів GenoType MTBDRplus та GenoType MTBDRsl можуть бути використані для прискорення отримання лабораторної інформації щодо МЧ, виділених M. tuberculosis complex до ПТП.

Для виділення ДНК може використовуватись "ручна методика" за допомогою реагентів GenoLyse або автоматична - у приладі GenoXtract із набором реагентів GXT DNA/RNA ExtractionKit.

Під час роботи з культурами, які виросли в рідкому середовищі, потрібно перенести 500 мкл культури до чистої мікропробірки об’ємом 1,5-2,0 мл з кришкою, що загвинчується, і виділити ДНК відповідно до інструкції виробника для набору реагентів GenoLyse. Для виділення ДНК із цих культур за допомогою GenoXtract та реагентів GXT DNA/RNA ExtractionKit потрібно 700,0 мкл рідкої культури помістити до GenoXtract та запустити відповідну програму.

Під час роботи з культурами, вирощеними на щільному середовищі, потрібно перенести 1-2 колонії до 100 мкл лізуючого буфера, який входить до складу набору для ручного виділення ДНК GenoLyse, ретельно ресуспендувати їх і отриману завись мікроорганізмів використовувати для виділення нуклеїнової кислоти відповідно до інструкції виробника. Під час виділення ДНК із культур, які виросли на щільному середовищі, за допомогою GenoXtract та реагентів GXT DNA/RNA Extraction Kit потрібно до 700 мкл деіонізованої води для молекулярної біології внести 1-2 колонії мікроорганізмів, ретельно перемішати на вортексі, помістити до GenoXtract та запустити відповідну програму.

Для контролю якості етапу виділення ДНК потрібно обов’язково з кожною партією досліджуваних проб (10-12 зразків) ставити негативний контроль, у якості якого може бути використано стерильну дейонізовану воду, яку вносять до чистої пробірки і здійснюють із нею такі самі маніпуляції, як зі зразком.

Подальші етапи дослідження матеріалу в ПЛР із детекцією методом гібридизації на стрипах з типоспецифічними зондами виконують відповідно до інструкцій виробника.

Усі посіви матеріалу на живильні середовища, що були здійснені паралельно під час виконання комплексу досліджень даної проби, мають бути інкубовані в оптимальних температурних умовах. Культури, що виділені в рідкому та у щільному середовищах, підлягають обов’язковій ідентифікації та визначенню профілю резистентності до ПТП. Результати досліджень (бактеріоскопії, ідентифікації, ТМЧ, молекулярно-генетичних досліджень) заносять до журналу ТБ 04/2 та інформують про них фтизіатра для призначення та/або коригування схеми лікування хворого.

6. Формулювання відповіді про результат дослідження у картриджі Xpert MTB/RIF:

у разі отримання в системі GeneXpert результату "МБТ+/Риф+" у бланку висновку вказують - "Виявлені M. tuberculosis complex та мутації у гені rpoB, з якими пов’язують резистентність до R";

у разі отримання в системі GeneXpert результату "МБТ+/Риф–" у бланку висновку вказують - "Виявлені M. tuberculosis complex, мутації у гені rpoB не виявлено";

у разі отримання в системі GeneXpert результату "МБТ-" у бланку висновку вказують - "M. tuberculosis complex не виявлено";

у разі отримання в системі GeneXpert результату "недійсний", "помилка" або "немає результату" і за відсутності достатнього об’єму залишків цієї проби варто зазначити: "Повторити дослідження. Потрібно повторно надати матеріал для дослідження не пізніше ніж через 3 робочі дні від дати видачі цього висновку".

Формулювання відповіді про результат дослідження за використання наборів для ПЛР із детекцією методом гібридизації на стрипах із типоспецифічними зондами (набори HainLifescience):

1) під час дослідження матеріалу з використанням набору реагентів GenoType MTBDRplus:

отримання позитивного сигналу в усіх пробах дикого типу свідчить про відсутність мутацій, тому в бланку висновку варто зазаначити: "Виявлено M.tuberculosis complex, чутливі до R та Н";

відсутність сигналу хоча б в одній із проб дикого типу свідчить про стійкість збудника до відповідного антибіотика - R або H. Смужка, що проявилася в зоні гена rpoB, свідчить про стійкість досліджуваного штаму до R, смужка в зоні гена katG та inhA - про стійкість до H. У лабораторному висновку варто зазначити: "Виявлено M. tuberculosis complex, які мають мутації в гені rpoB (та/або katG та/або inhA), з якими пов’язують стійкість до R (та/або H)";

2) під час дослідження матеріалу з використанням набору реагентів GenoType MTBDRsl:

отримання позитивного сигналу в усіх пробах дикого типу свідчить про відсутність мутацій, тому в бланку висновку варто зазначити: "Виявлено M.tuberculosis complex чутливі до Q, амідоглікозидів / циклічних пептидів";

відсутність сигналу хоча б в одній із проб дикого типу свідчить про стійкість збудника до відповідного антибіотика - Q, амідоглікозидів / циклічних пептидів. Смужка, яка проявилася в зоні гена gyrA, свідчить про стійкість досліджуваного штаму до Q, смужка в зоні гена rrs - про стійкість до амідоглікозидів / циклічних пептидів, а в зоні гена embB - про стійкість до E. У лабораторному висновку потрібно вказати - "Виявлено M. tuberculosis complex, які мають мутації в гені gyrA (та/або rrs, та/або embB), з якими пов’язують стійкість до Q (та/або амідоглікозидів / циклічних пептидів, та/або E)".

7. Під дискордантними результатами слід розуміти результати лабораторних досліджень однієї і тієї самої проби досліджуваного матеріалу, отримані різними методами, які суттєво відрізняються або суперечать один одному.

Для мінімізування кількості випадків отримання дискордантних результатів дослідження важливо ретельно аналізувати кожний такий випадок з урахуванням можливих причин їх отримання.

Наявність дискордантних результатів може бути пов’язана з різними чинниками. Якщо молекулярно-генетичними методами виявлено ДНК збудника ТБ, а за допомогою бактеріоскопії із тієї самої проби отримано негативний результат, це може бути пояснено більш високою чутливістю методу ПЛР порівняно з бактеріоскопією. Випадки відсутності росту мікобактерій за позитивного результату ПЛР можуть бути пояснені присутністю в пробі нежиттєздатних бактерій, наприклад, після антибіотикотерапії. Разом з тим можуть бути випадки, коли методом ПЛР мікобактерії не виявлені, а за допомогою культурального методу отримано ріст мікроорганізмів. Одним із варіантів пояснення може бути наявність у матеріалі НТМБ, які не будуть виявлені молекулярними методами, оскільки праймери підібрані, так що виявляють тільки M. tuberculosis complex.

Можуть бути і дискордантні результати щодо чутливості мікроорганізмів до ПТП. Слід пам’ятати, що, напід часклад, з геном rpoB пов’язують близько 95,0 % випадків резистентності до R, до 5,0 % випадків резистентності можуть бути пов’язані з мутаціями в інших локусах геному. Аналогічна ситуація стосується й інших препаратів. Потрібно врахувати і той факт, що ПЛР забезпечує скринінг послідовностей нуклеїнових кислот, а не амінокислот. Деякі мутації можуть не призводити до заміни амінокислоти ("мутації, що мовчать"), тому результат може не збігатися з результатами фенотипових методів.

Якщо в досліджуваній пробі містяться гетерозиготні штами або суміш M.tuberculosis complex, або туберкульозних та НТМБ, то результати, отримані в ПЛР, можуть відрізнятися від результатів бактеріологічних досліджень.

Крім того слід пам’ятати, що такі результати можуть бути отримані у разі дослідження різних зразків (наприклад, перша проба тестувалася бактеріологічними методами, а друга - ПЛР), у разі неправильного відбору хворих (не інформативним є дослідження матеріалу від осіб, що вживали ПТП).

8. Потрібно пам’ятати, що під час роботи з одним матеріалом можуть послідовно відкриватися тільки ті пробірки та картридж, які будуть використані саме для цього матеріалу. Відкривати кілька картриджів одночасно- заборонено.

Для попередження крос-контамінації та внутрішньолабораторного інфікування лабораторних фахівців усі маніпуляції з матеріалом, підозрюваним на вміст біологічних патогенних агентів, слід виконувати з використанням засобів індивідуального захисту у ШББ 2 класу.

1. Внутрішній контроль якості бактеріоскопічних досліджень. Для стандартизації та вдосконалення якості роботи лабораторії доцільно використовувати готові (комерційного виготовлення) набори барвників, реактиви, які відповідають вимогам методики, що зареєстровані в Україні та мають сертифікат якості.

Кожна партія приготовлених у лабораторії барвників, а також набори барвників комерційного виготовлення підлягають контролю якості, який проводиться шляхом фарбування контрольних К (+) та К (-) мазків.

Послідовність приготування та фарбування мазків має бути задокументована і знаходитися на робочому місці.

Кожна лабораторія повинна мати і періодично поповнювати набір контрольних мазків.

Після висушування та фіксації контрольні мазки зберігають у ємностях для зберігання скелець, відповідно промаркованих "Нефарбовані контрольні мазки (+)", "Нефарбовані контрольні мазки (-)".

Для дотримання методики фарбування обов’язково використовують таймер.

Позитивний контроль К (+) використовується для контролю якості барвників і дотримання методики фарбування. Негативний контроль К (-) підтверджує, що реагенти, розчини барвників, дистильована вода та імерсійна олія не контаміновані КСП чи артефактами.

Перед переглядом мазків, приготовлених із клінічного матеріалу, досліджують пофарбовані контрольні позитивні та негативні мазки.

Мазки, приготовлені з клінічного матеріалу, пофарбовані за Цілем-Нільсеном, не повинні досліджуватись у разі, якщо:

у позитивному контрольному мазку К (+) не знайдені КСБ;

у негативному контрольному мазку К (-) знайдені КСБ;

недостатнє знебарвлення фону (рожевий мазок).

У разі виникнення зазначеної ситуації всі реагенти, барвники, дистильовану воду та імерсійну олію замінюють на щойно приготовлені (або новий комерційний набір барвників), ретельно обробляють об’єктиви мікроскопа, а партію мазків не досліджують, а готують нові препарати. Якщо клінічний матеріал не залишився, то повідомляють у клінічні відділення з метою доставки в лабораторію повторних зразків біологічного матеріалу від цих пацієнтів.

У мікроскопічному пункті усі переглянуті мазки, незалежно від результату, підлягають зберіганню. Для цього після закінчення дослідження видаляють залишки імерсійної олії з препарату та поміщають їх у спеціально призначені для цього коробки-контейнери для зберігання переглянутих препаратів у тому самому порядку, в якому їх зареєстровано в лабораторному журналі, та відповідно промарковано. Негативні мазки зберігаються упродовж трьох місяців для перевірки "наосліп". Позитивні мазки зберігають упродовж шести місяців.

У спеціалізованих бактеріологічних лабораторіях ПТЗ зберігають позитивні мазки впродовж шести місяців.

З метою запобігання видачі хибнопозитивного результату позитивні мазки перед реєстрацією та видачею до закладу, що направив матеріал, мають бути переглянуті іншим, досвідченішим, спеціалістом лабораторії або завідувачем для колегіального рішення щодо позитивності цього мазка та визначення градації позитивного результату.

Інформацію про результат бактеріоскопічного дослідження направляють лікарю (у відділення) не пізніше ніж за 24 год після отримання біологічного матеріалу. Потрібно враховувати, що зібране мокротиння може зберігатись у холодильнику на пункті збирання мокротиння до 5 діб, але має бути досліджене протягом однієї доби після доставлення його до лабораторії.

2. З метою вдосконалення якості бактеріоскопічних досліджень, виявлення та усунення недоліків у роботі конкретної лабораторії потрібно систематично щокварталу аналізувати отримані результати, враховуючи частоту одержання позитивних результатів. Завідувач лабораторією в довільній формі описує результати за квартал, зазначаючи частку доставлених неякісних проб мокротиння (слина), частку хворих, виявлених методом бактеріоскопії, кратність обстеження хворих тощо. Така інформація зберігається в лабораторії для внутрішньолабораторного контролю бактеріоскопії та своєчасного виявлення проблем.

Аналізуючи частоту одержання позитивних результатів, порівнюють загальну кількість досліджених проб від пацієнтів з підозрою на ТБ із кількістю позитивних результатів бактеріоскопії.

Причиною значних відхилень від попередніх показників роботи лабораторії (зменшення або збільшення кількості позитивних результатів) може бути як удосконалення роботи лікувального закладу в цілому щодо виявлення нових випадків ТБ, так і поява недоліків у роботі закладу: неправильний відбір пацієнтів на бактеріоскопічне обстеження, порушення правил збирання і транспортування клінічних зразків до лабораторії, неякісні барвники та реагенти, порушення лабораторних методик, високе навантаження персоналу лабораторії.

Особливу увагу слід звертати на випадки отримання позитивних результатів під час дослідження кількох послідовних мазків. Причиною може бути внутрішньолабораторне забруднення препаратів під час їх приготування, фарбування чи мікроскопії.

3. ЗКЯ бактеріологічних (культуральних) досліджень - процес ефективного та систематичного внутрішнього моніторингу всіх маніпуляцій, що проводяться в лабораторії, яка здійснює культуральні дослідження. Контроль якості має гарантувати, що результати досліджень у лабораторії є точними, належними й порівнянними. Це досягається за допомогою оцінки якості зразків біологічного матеріалу, ретельності їх деконтамінації, правильності виділення та ідентифікації культур, якості реагентів і живильних середовищ та стану ЗВТ і обладнання, а також систематичного аналізу результатів культуральних досліджень і документального підтвердження правильності використання методів. Для контролю якості живильних середовищ та лабораторних процедур використовують мінімальний набір тест-штамів (додаток 14).

На якість доставленого біологічного матеріалу впливають умови його зберігання.

Мокротиння може зберігатися в умовах холодильника до 5 діб після збирання. Якщо такої можливості немає, матеріал можна заморожувати за температури -20 -°C з наступним однократним розморожуванням. Але слід пам’ятати, що для попередження високого рівня контамінації матеріал для бактеріологічного дослідження потрібно якомога швидше доставити до лабораторії.

4. Для приготування яєчних щільних живильних середовищ (Левенштейна-Єнсена, Фінна-II) використовують свіжі курячі яйця (яким не більше ніж 7 днів), із цілою незабрудненою шкаралупою.

Температура та час згортання яєчних середовищ підлягають обов’язковому контролю за допомогою повірених максимальних термометрів. Результати контролю вносять до журналу або листа контролю роботи коагулятора, який ведуть у довільній формі, відображаючи інформацію про дату контролю, температуру та тривалість коагуляції за підписом відповідальної особи.

Готове яєчне середовище оцінюють візуально: колір, консистенція, наявність забруднення.

За відсутності візуально виявлених дефектів партію приготовлених яєчних середовищ перевіряють на стерильність та на ростові властивості.

Приготовлене яєчне середовище зберігають у холодильнику не довше ніж 4 тижні.

Для отримання якісного середовища і запобігання його забрудненню сторонньою мікрофлорою рекомендують виконувати такі основні правила:

- приміщення, де готують живильні середовища, утримують у максимальній чистоті. Рекомендовано регулярно мити підлогу з додаванням дезінфікуючого засобу, а також протирати дезінфектантом обладнання та робочі поверхні. Перед приготуванням середовищ потрібно обробити приміщення УФ-променями;

- розливати середовища слід у ШББ 2 класу. Використовувати тільки стерильний посуд;

- використовувати точно зважені кількості реагентів;

- правильно проводити розведення розчинів: використовувати мірний посуд, доводити об’єм розчину по нижній межі меніска;

- постійно контролювати температуру в згортувачі, не допускаючи перегріву середовищ у ньому;

- суворо дотримуватися правил асептики, обпалювати горло пробірок і колб;

- ретельно обробляти поверхню яєць перед їх розбиванням для приготування яєчної суспензії;

- не піддавати готове середовище дії УФ-променів. Зберігати готові середовища в темному місці, в умовах холодильника;

- рекомендовано розливати не менше ніж по 5,0 см-3 середовища;

- проводити контроль якості кожної партії приготованих середовищ.

Можливі причини приготування неякісного середовища:

неякісні вихідні реагенти;

невідповідний термін придатності реагентів;

невідповідна якість яєць;

недотримання температурного режиму згортання середовища;

неякісна стерилізація посуду;

невідповідна якість кришок для пробірок (нещільне прилягання до пробірки);

порушення температури культивування в термостаті.

Чутливість живильного середовища перевіряється аналізом співвідношень:

позитивна мікроскопія від хворого супроводжується негативним результатом культурального дослідження (допускається до 2,0 %);

позитивна мікроскопія (3+) супроводжується ростом поодиноких (10-20) колоній (допускається 1,0-2,0 %).

Як усі мікробіологічні середовища, кров’яний агар, виготовлений у лабораторних умовах, підлягає контролю якості. У кожній новій серії приготованого середовища 1,0-3,0 % чашок (залежно від розміру партії) перевіряють на стерильність і ростові властивості. Для контролю ростових властивостей використовуються контрольні штами Escherichia coli та Staphylococcus aureus (референс-штами).

Для зберігання в замороженому стані контрольних штамів E. coli та S. aureus приготувати густу суспензію культури у триптиказо-соєвому або живильному бульйоні з гліцерином (15,0 %) і розлитому по 1,5 мл у підписані кріопробірки. Заморозити і зберігати за температури -70 -°C.

Приготувати суспензію колоній зі щільного бактеріологічного середовища у стерильному ізотонічному розчині або стерильній дистильованій воді щільністю 0,5 McFarland (може бути використана розморожена суспензія, що є у наявності, і розведена до тієї самої щільності).

Зробити 100-кратне розведення, додаючи 10,0 мкл суспензії до 1,0 мл стерильного ізотонічного розчину або стерильної дистильованої води. Добре перемішати. Отримати розведення 10--2.

Зробити ще одне 100-кратне розведення, помістивши 10,0 мкл із пробірки з розведенням 10--2 в 1,0 мл стерильного ізотонічного розчину або дистильованої води. Посіяти на чашку 100 мкл отриманого розведення 10--4 і розподілити по поверхні кров’яного агару для отримання ізольованих колоній.

Помістити в термостат на 48 год за температури 35-37 -°C.

Таку саму кількість незасіяних чашок із кров’яним агаром помістити до термостата на 48 год за температури 35-37 -°C для перевірки на стерильність.

Задовільними вважають такі результати: відсутність росту на незасіяних чашках і типовий ріст бактерій у чашках із посівами.

Результати контролю внести до Журналу контролю якості середовищ.

5. Кожну нову партію реагентів (бульйон Мідлбрука 7Н9, ростова добавка MGIT 960 Supрlement) перевіряють на якість під час отримання (вхідний контроль) та періодично (у разі збільшення кількості проростів) перед використанням. Контролюють термін придатності, проводять візуальний огляд пробірок на цілісність та наявність забруднень. Для роботи використовують лише цілі пробірки з прозорим бульйоном без сторонніх домішок із достатнім терміном придатності.

Для перевірки ростових властивостей рідкого середовища рекомендується використовувати контрольні штами: M. tuberculosis H37Rv ATCC 27294, M. kansasii ATCC 12478, M. fortuitum ATCC 6841.

Підготовка суспензії культури:

використовують 10-15 добові культури вищевказаних штамів, вирощені на середовищі Левенштейна-Єнсена;

за допомогою стерильного аплікатора зняти з поверхні середовища всі колонії, не допускаючи знімання середовища;

обережно перенести зняту культуру до пробірки з кришкою, що герметично загвинчується, яка містить 4,0 мл стерильного бульйону Міддлбрука 7Н9 (пробірка А);

приготувати суспензію, ретельно струшуючи пробірку з культурою на струшувачі-вортексі протягом 1-2 хв (мутність більше ніж 1,0 McF);

залишити суспензію на 20 хв для осадження великих часток;

за допомогою стерильної одноразової піпетки перенести надосадову рідину до стерильної скляної пробірки з кришкою, що герметично загвинчується (пробірка В);

залишити суспензію на 15 хв за кімнатної температури;

за допомогою стерильної одноразової піпетки перенести надосадову рідину до стерильної скляної пробірки з кришкою, що герметично загвинчується (пробірка С);

довести мутність суспензії в пробірці С до 0,5 McF, додаючи бульйон Міддлбрука або ізотонічний розчин хлориду натрію, добре перемішати. Це робоча суспензія для проведення контролю якості, яку можна розлити по 1,0-2,0 мл у кріопробірки та заморозити до температури -70 -°C. Заморожена суспензія може використовуватись упродовж шести місяців. Не допускати повторного заморожування робочої суспензії.

Якщо суспензія була заморожена, її розморожують та використовують для контролю якості. Розморожена суспензія повторному заморожуванню не підлягає. Невикористані залишки мають бути знешкоджені.

Для приготування розведень замість стерильної дистильованої води можна використовувати стерильний ізотонічний розчин хлориду натрію.

Порядок приготування:

розвести робочу суспензію (0,5 McF), щойно приготовлену або розморожену, у співвідношенні 1 : 5 (до 1,0 мл суспензії додати 4,0 мл стерильної дистильованої води), ретельно перемішати (пробірка 1);

розвести ще два рази у співвідношенні 1 : 10, додаючи 0,5 мл суспензії із пробірки 1 до 4,5 мл стерильної дистильованої води (пробірка 2). Ретельно перемішати і знову додати 0,5 мл із пробірки 2 до 4,5 мл стерильної дистильованої води. Ретельно перемішати. Остаточне розведення 1 : 500 (пробірка 3). Це останнє розведення M. tuberculosis, яке використовується для проведення контролю якості.

Розведення для M. fortuitum та M. kansasii готують аналогічно, крім того, для M. fortuitum потрібно додатково приготувати розведення із пробірки 3 у співвідношенні 1 : 10. Взяти 0,5 мл суспензії із пробірки 3 і додати 4,5 мл стерильної дистильованої води, ретельно перемішати. Остаточне розведення 1 : 5000 (пробірка 4). Для проведення контролю якості використовують вміст пробірки 4.

Для M. kansasii розвести вміст пробірки 4 ще раз у співвідношенні 1 : 10 додаючи 0,5 мл із пробірки 4 до 4,5 мл стерильної дистильованої води, ретельно перемішати. Остаточне розведення 1 : 50000 (пробірка 5). Для проведення контролю якості використовують вміст пробірки 5.

Посів та інкубація:

додати до шести пробірок MGIT ростову добавку Growth Supplement та суміш антибіотиків PANTA відповідно до методики;

засіяти до двох промаркованих пробірок MGIT по 0,5 мл суспензії M. tuberculosis H37Rv із пробірки 3. Так само засіяти до двох пробірок по 0,5мл суспензії M. fortuitum із пробірки 4 та до двох пробірок суспензії M. kansasii з пробірки 5. Ретельно перемішати;

помістити засіяні пробірки до апарата ВАСТЕС MGIT 960. Після отримання позитивної індикації на апараті дістати пробірки. Оцінити дані після закінчення терміну, потрібного для отримання позитивного результату.

Очікувані результати:

M. tuberculosis - позитивна флуоресценція в пробірках через 6-10 днів;

M. fortuitum - позитивна флуоресценція в пробірках через 7-11 днів;

M. kansasii - позитивна флуоресценція в пробірках через 1-3 дні.

Якщо росту в зазначені терміни не отримано, дослідження з контролю якості повторюють. Якщо вдруге результати з контролю якості залишаються незадовільними, потрібно перевірити життєздатність суспензії, вік культури (якщо вона була заморожена) та інші процедури. Якщо всі параметри відповідають установленим специфікаціям, а результат тестування незадовільний, слід звернутися до сервісної служби компанії BD Diagnostic System.

Заходи безпеки:

усі процедури здійснюють у ШББ 2-го класу;

усі матеріали перед використанням має бути простерилізовано шляхом автоклавування;

усі процедури виконують із дотриманням вимог безпеки праці та протиепідемічного режиму.

6. Якість усіх реагентів, які використовуються для роботи в системі ВАСТЕС MGIT 960, підлягає періодичному контролю, у тому числі NALC-NaOH та буфер. Для покращення контролю за контамінацією дуже важливо здійснювати негативний контроль для партії клінічних зразків. Цю процедуру потрібно виконувати залежно від обсягів роботи, але не рідше ніж 1 раз на тиждень. Періодично можна здійснювати позитивний контроль для перевірки швидкості росту мікроорганізмів.

Для негативного контролю використовують 5,0 мл фосфатного буфера, для позитивного - 5,0 мл суспензії M. tuberculosis H37Rv 0,5 McF, розведеної у співвідношенні 1:500. Проводять передпосівну обробку негативної та позитивної контрольних проб разом із клінічними зразками, використовуючи однаковий метод обробки. Засівають осади до підготовлених пробірок MGIT та інкубують так, як і клінічні зразки.

Позитивний контроль повинен дати ріст, час детекції має бути в межах установленого терміну для кожного тесту (ці параметри встановлюються після отримання кількох результатів тестування позитивного контролю).

Негативний контроль не повинен давати росту в межах повного періоду інкубації. Якщо негативний контроль дає флуоресценцію, треба перевірити його на наявність контамінації бактеріями. У разі підтвердження контамінації перевіряють усі процедури та реагенти з метою виявити джерело забруднення.

Необхідний облік:

реєструють номери партій усіх витратних матеріалів до апарату ВАСТЕС MGIT;

аналізують дані: по кожній партії оброблених зразків, по кількості посівів, по персоналу, який виконував ці процедури, за часом появи флуоресценції, за результатами бактеріоскопії культур, за рівнем контамінації тощо;

порівнюють результати досліджень на ВАСТЕС MGIT із результатами, отриманими на щільних середовищах.

7. Внутрішній контроль якості передпосівної обробки біологічного матеріалу. Більшість зразків біологічного матеріалу перед початком дослідження піддають спеціальній обробці, потрібній для розрідження проби та її деконтамінації з метою знищення небажаної мікрофлори.

Процес гомогенізації та деконтамінації потрібно чітко контролювати. У разі неправильного його виконання більшість мікобактерій загинуть або, навпаки, буде занадто багато проростів іншими бактеріями. Тому лабораторії мають відслідковувати результати процедури за допомогою ведення обліку рівня контамінації посівів. Як правило, частота контамінації (кількість проростів) в лабораторіях, що проводять мікробіологічні дослідження проб, за культивування мокротиння на щільних яєчних середовищах становить до 3,0 %, але не більше ніж 5,0 %.

Для внутрішнього контролю якості розчинів деконтамінантів та дотримання процедури передпосівної обробки паралельно з обробкою зразків біологічного матеріалу пацієнтів застосовують одну з наступних методик- посів мокротиння, обробленого щойно приготовленим розчином для деконтамінації, на кров’яний агар та середовище Левенштейна-Єнсена виконують так:

стандартний зразок мокротиння ділять на дві порції, одна з яких не обробляється, а інша проходить передпосівну обробку відповідно до затвердженої методики одним із щойно приготовлених розчинів деконтамінанту, який застосовується в лабораторії;

до однієї чашки Петрі з кров’яним агаром засівають 2-4 краплі необробленого деконтамінантом мокротиння, до другої - 2-4 краплі мокротиння після деконтамінації;

до двох пробірок із середовищем Левенштейна-Єнсена засівають по 0,2 мл обробленого і необробленого деконтамінантом мокротиння;

інкубують у термостаті за температури 37 -°C.

Комплексне оцінювання результатів за ростом на обох середовищах:

ріст на кров’яному агарі оцінюють через 24 год. Констатують наявність рясного росту на чашці з посівом мокротиння, яке не оброблялося деконтамінантом, та відсутність росту після обробки;

на середовищі Левенштейна-Єнсена констатують відсутність проросту в пробірці, де матеріал оброблявся та проріст посіву мокротиння, яке не проходило передпосівної обробки.

Якщо результати відповідають зазначеним, вважається, що деконтамінацію проведено якісно і ці розчини для деконтамінації якісні;

1) посів суспензії культури M. fortuitum 1 McF на кров’яний агар після обробки щойно приготовленим розчином для деконтамінації виконують так:

готують суспензію культури M. fortuitum, доводять мутність до 1 McF;

3,0 мл суспензії обробляють щойно приготовленим розчином одного з деконтамінантів відповідно до методики його застосування;

до однієї чашки Петрі з кров’яним агаром засівають 2-4 краплі необробленої деконтамінантом суспензії M. fortuitum 1 McF, до другої - 2-4 краплі суспензії M. fortuitum 1 McF після деконтамінації;

інкубують у термостаті за температури 37 -°C протягом доби.

Оцінювання результатів: через 24 год на чашці Петрі з кров’яним агаром, де засіяна суспензія M. fortuitum 1 McF, після обробки деконтамінантом констатують ріст чистої культури (мономорфний ріст) M. fortuitum не менше ніж 70,0-80,0 % від росту без обробки;

2) посів штаму M. tuberculosis H37Rv на середовище Левенштейна-Єнсена після обробки щойно приготовленим розчином для деконтамінації виконують так:

готують бактеріальну суспензію густиною 1 McF штаму M. tuberculosis H37Rv;

одну частину суспензії по 0,2 мл засівають до 3 паралельних пробірок із щойно приготовленим середовищем Левенштейна-Єнсена, решту - обробляють розчином для деконтамінації, відцентрифуговують та по 0,2 мл засівають на інші 3 пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена;

інкубують у термостаті за температури 37 -°C.

Оцінювання результатів: порівнюють інтенсивність росту. Ріст на середовищі Левенштейна-Єнсена штаму M. tuberculosis H37Rv після обробки деконтамінантом має бути не менше ніж 70,0-80,0 % від росту без обробки.

Результати проведених тестів заносять до Журналу контролю якості розчинів для деконтамінації, який ведеться в довільній формі:

назва деконтамінанту (зазначити кількість відсотків);

дата приготування розчину;

кількість (л) приготовленого розчину;

матеріал, який береться для контролю (мокротиння, M. fortuitum, M. tuberculosis H37Rv);

об’єкт, що контролюється (чашки з кров’яним агаром, пробірки з середовищем Левенштейна-Єнсена);

результат контролю якості деконтамінанту: придатний чи не придатний.

Контроль якості розчинів деконтамінантів та дотримання процедури передпосівної обробки біологічного матеріалу потрібно проводити з кожною новою партією приготовленого розчину для деконтамінації, але не рідше ніж 1 раз на тиждень.

Для попередження проростів розчини деконтамінантів слід розливати по 10,0 мл та додавати окремо до кожної проби біологічного матеріалу.

З метою контролю якості розчинів для деконтамінації та дотримання методики передпосівної обробки біологічного матеріалу аналіз проростів проводять щомісячно та вносять до звіту про роботу лабораторії.

Відсоток проростів обчислюється як відношення числа пробірок, що заросли, до всіх засіяних пробірок. Норма для посівів на щільні середовища має бути у межах 3,0-5,0 %. Цей показник потрібно систематично аналізувати (щомісячно, поквартально, за рік) з метою коригування процесу приготування деконтамінантів та процедури передпосівної обробки.

Показник нижче ніж 3,0 % вказує на:

високу концентрацію розчину деконтамінанту;

занадто тривалу експозицію з деконтамінантом;

занадто високу концентрацію малахітового зеленого в яєчному середовищі (високий відсоток малахітового зеленого затримує ріст мікобактерій).

Показник вище ніж 3,0 % вказує на:

незадовільні умови транспортування та зберігання біологічного матеріалу;

занадто тривалий період від збирання біологічного матеріалу до посіву;

занадто низьку концентрацію розчину деконтамінанту;

короткий час контакту матеріалу з деконтамінантом;

проблеми під час приготування середовища: нестерильні розчини, порушення режиму автоклавування тощо;

наявність забруднення в лабораторії. В цьому разі потрібно провести додаткову санобробку приміщень та обладнання лабораторії.

У разі виявлення проростів, обумовлених нижчими грибами, потрібно перевірити температуру культивування мікроорганізмів.

Результати оцінювання частки проростів - менш трудомісткий процес, ніж щоденний контроль якості з використанням контрольних штамів, проте він не дає можливості проводити оперативний контроль і виправлення недоліків деконтамінації відразу після їх виявлення, оскільки проводиться 1 раз на місяць. У цьому разі результати значної кількості зразків від пацієнтів можуть виявитися помилковими (хибнонегативними).

8. Внутрішній контроль якості ідентифікації виділених культур імунохроматографічними смужками. Під час кожної нової поставки наборів імунохроматографічних смужок здійснюють вхідний контроль з використанням тест-штамів позитивного та негативного контролю.

Кожну партію досліджень культур, виділених із діагностичного матеріалу, також супроводжують контролем.

У якості позитивного контролю використовують культуру M. tuberculosis H37Rv, вирощену на рідкому середовищі, у якості негативного контролю може бути використана культура НТМБ, вирощена на рідкому середовищі, або незасіяне рідке середовище. Важливим показником тесту є внутрішній контроль.

Якість набору імунохроматографічних смужок або тестування досліджуваних культур вважають якісним, якщо отримано такі результати:

відслідковується чітка лінія внутрішнього контролю;

позитивний контроль (M. tuberculosis H37Rv) має показати позитивний результат;

негативний контроль (НТМБ або незасіяний бульйон) має показати негативний результат.

Якщо якийсь контрольний результат неприйнятний, результатів тестування не видають. Потрібно провести повторні дослідження з новим (субкультивованим на рідкому середовищі) контрольним штамом. Якщо результати контролю будуть очікуваними, слід повторити тестування виділених культур.

9. Контроль якості ТМЧ потрібно проводити систематично.

Мінімальні вимоги: перевіряти кожну нову партію реагентів та кожну партію приготовленого середовища з ПТП, використовувати лише чисті субстанції ПТП. Кожну партію приготовленого щільного живильного середовища потрібно перевіряти на стерильність (інкубація в термостаті). Для кожної партії середовища під час тестування на чутливість клінічних зразків потрібно одночасно провести тест на чутливість контрольного штаму M. tuberculosis H37Rv і штаму M. Tuberculosis, стійкого до препаратів 1-го ряду.

Якщо середовище з препаратами приготоване правильно, то МЧ контрольних культур (чутливого та стійкого) буде незмінною.

Якщо результати контролю якості партії реагентів та живильних середовищ незадовільні, всі результати, отримані під час роботи з цією партією, потрібно повністю переглянути, а дослідження повторити.

10. Перший раз посіви переглядають через 24 год, коли щільно загвинчують кришки для попередження висихання живильного середовища. Через 48 год посіви переглядають для контролю відсутності росту супутньої мікрофлори. Надалі посіви переглядають кожного тижня.

Якщо під час щотижневого перегляду посівів виявлено ріст контамінантів по всій поверхні живильного середовища або відбулося розрідження чи знебарвлення живильного середовища, такі пробірки видаляють із термостата та знешкоджують автоклавуванням. Деякі контамінанти із речовин, які входять до складу живильного середовища, здатні внаслідок метаболізму утворювати кислоту, що знижує рівень рН середовища та звільняє частину зв’язаного яєчним білком барвника (на це вказує поява темно-зеленого кольору середовища). Посіви з частково контамінованою поверхнею живильного середовища потрібно продовжувати інкубувати. Якщо проріст середовища з’явився пізно, не виключається можливість наявності там росту мікобактерій. В таких випадках рекомендується приготувати мазки з поверхні середовища для дослідження на КСБ. Якщо під час бактеріоскопії виявлені КСП, потрібно виконати повторну деконтамінацію матеріалу з такої пробірки та провести повторний посів.

Результат "Проріст" видається у випадку, якщо заросли всі паралельно засіяні пробірки з даного зразка біологічного матеріалу. Якщо є хоча б одна пробірка з посівом, на якій можна врахувати результат, відповідь "Проріст" не видається.

Ріст M. tuberculosis на щільному середовищі з’являється в середньому на 3-6 тиждень. Якщо отримано ріст культури, після попередньої ідентифікації (швидкість та температура росту, пігментоутворення, морфологія колоній, бактеріоскопія на КСП тощо) результати заносять до Форми ТБ 06а та направляють лікарю-фтизіатру як попереднє повідомлення про отримання росту культури, що за морфологічними ознаками схожа на мікобактерії, але остаточний результат може бути наданий після проведення повної ідентифікації та визначення ТМЧ до ПТП.

Результат посіву на щільне середовище повинен відображати не тільки якісну характеристику (позитивний чи негативний), але й кількісну оцінку (число колоній) відповідно до вимог чинних нормативних документів.

Більшість посівів дає ріст M. tuberculosis на щільному середовищі впродовж двох місяців. Тому інкубують посіви до 2,5 місяців. За відсутності росту впродовж 10 тижнів посів вважають негативним, пробірки видаляють і знешкоджують шляхом автоклавування.

11. З метою підвищення якості бактеріологічного дослідження, виявлення та усунення недоліків у роботі потрібно систематично 1 раз на квартал аналізувати отримані результати, щоб мати уяву про частоту одержання позитивних результатів, співвідношення результатів бактеріоскопічного та культурального досліджень, додатковий внесок культурального дослідження до бактеріоскопічного. Якщо під час цьому будуть виявлені значні відхилення від середнього показника, потрібно визначити причину цього.

Щокварталу результати досліджень матеріалу від хворих на легеневий туберкульоз аналізують за показниками, які обчислюють від усіх досліджених проб (додаток 15).

За наявності значних відхилень від стандартного співвідношення, зазначеного вище, потрібно з’ясувати причину, яка може залежати від правильності організації роботи в лабораторії та від недоліків на долабораторному етапі.

Треба враховувати, що в різних населених пунктах та в різних медичних закладах це співвідношення може значно відрізнятися, тому потрібно в кожному конкретному випадку визначити середнє співвідношення для певної лабораторії та аналізувати причини будь-якого відхилення від нього.

12. У разі здійснення ВКЯ молекулярно-генетичних досліджень важливо дотримуватися вимог до кожного етапу організації таких досліджень.

Планувальні рішення та обладнання приміщення лабораторії (відділу) ПЛР-досліджень мають відповідати вимогам чинних нормативних документів. Особливо це важливо для лабораторій, які використовують методику гібридизації з типоспецифічними зондами. Невиконання вимог до організації ПЛР-лабораторії може призводити до отримання хибних результатів.

Обладнання для молекулярно-генетичних досліджень також має бути зареєстроване та дозволене до використання в Україні в установленому порядку. Воно потребує сервісного обслуговування, а окремі прилади - калібрування та метрологічної повірки або атестації.

Витратні пластикові матеріали потрібно використовувати тільки з маркуванням "вільні від РНК-аз та ДНК-аз", наконечники до дозаторів - тільки з аерозольним фільтром.

Категорично заборонено переносити будь-яке обладнання та витратні матеріали з одного робочого приміщення до іншого.

Забезпечення кожного приміщення окремим набором обладнання та витратних матеріалів значно знижує ризик перенесення контамінантів. Робочі приміщення, обладнання та всі предмети, котрих зазвичай торкаються руками (у тому числі дверні ручки, телефони, ручки холодильників та морозильних камер тощо) потрібно регулярно очищати з використанням відповідних мийних засобів та методів.

Ризик зараження суттєво можна знизити шляхом ретельної утилізації відходів.

Для контролю лабораторних процедур потрібно ретельно аналізувати отримані результати - експоненціальний ріст накопичення флуоресцентного сигналу, отримання профілів під час гібридизації, якість проходження контрольних зразків (позитивного, негативного, внутрішніх). Усі протоколи дослідження мають бути роздрукованими і зберігатися так, як інші робочі журнали у лабораторії. Крім паперових носіїв, копії протоколів виконаних досліджень накопичуються й архівуються в електронному вигляді.

У разі виникнення підозри на контамінацію у лабораторії потрібно використовувати референс-зразки та перевірені негативні зразки.

Для своєчасного виявлення контамінації у лабораторії потрібно систематично контролювати стан поверхонь та обладнання відповідно до чинних нормативних документів. У разі виявлення контамінації слід негайно припинити дослідження та вжити заходів з ліквідації такого становища. До роботи можна стати тільки після отримання відповідних результатів контрольних тестів якості здійсненої деконтамінації. Результати таких досліджень заносять до Журналу реєстрації контамінації ПЛР-лабораторії нуклеїновими кислотами, який ведуть у довільній формі.

13. Технологія з використання картриджів Xpert MTB/RIF передбачає проведення двох видів внутрішнього контролю кожного дослідження:

контроль екстракції та ампліфікації ДНК проби, а також можливого пригнічення ПЛР;

контроль якості зондів. Цей контроль здійснюється автоматично до початку ПЛР і дає змогу оцінити регідратацію реагентів, наповнення ПЛР пробірки, її цілісність, стабільність барвника та гасителя.

Контроль екстракції на ампліфікації потрібний для гарантії правильності проведення тесту, містить висушені спори В. globigii та включений до кожного картриджу, що забезпечує верифікацію відповідності аналізу матеріалу на M. tuberculosis. Такий тест може підтвердити, що відбувся лізис M. tuberculosis (за їх наявності), і що аналіз проведений відповідно. Крім того, цей контроль виявляє інгібіцію ПЛР у реальному часі. Результат аналізу цього контролю має бути позитивним у разі отриманого негативного результату дослідження матеріалу і може бути негативним або позитивним у разі позитивного результату тестування клінічного матеріалу. Тест вважається пройденим, якщо результат задовольняє вказані валідовані критерії. Негативний результат дослідження не можна вважати достовірним за негативного результату тестування цього контролю.

Контроль якості зондів. Перед початком ПЛР прилад GeneXpert Dx вимірює інтенсивність вихідного рівня флуоресценції проби для оцінювання регідратації реагентів, наповнення пробірки, чистоти проби та стабільності барвника. Цей тест вважається пройденим, якщо результат задовольняє валідовані критерії.

Програмне забезпечення приладу дає змогу здійснювати моніторинг за результатами проходження зазначених внутрішніх контролів. Крім того, прилад дає змогу визначати інші помилки, що виникають під час виконання дослідження, і про всі помилки прилад сповіщає оператора. Таку інформацію слід аналізувати та вживати заходів для зменшення кількості помилок.

14. Для отримання достовірних результатів дослідження потрібно використовувати тільки зареєстровані та допущені до використання в Україні в установленому порядку обладнання, набори реагентів та витратні матеріали.

ПЛР з детекцією методом гібридизації з типоспецифічними зондами (лінійний зонд-аналіз) має високі ризики щодо контамінації реагентів, проб, витратних матеріалів, тому потрібно суворо дотримуватися вимог щодо організації роботи молекулярно-генетичними методами, викладених у чинних нормативних документах, а також інструкцій виробника наборів реагентів.

Крім того, використання позитивних та негативних контролів для кожної постановки, внутрішніх контролів для кожної проби та ретельний аналіз отриманих результатів дає можливість уникнути хибних результатів та своєчасно виявити і ліквідувати проблеми в лабораторії. Гарантією достовірних результатів дослідження є отримання передбачуваного очікуваного результату тестування контролів.

Якщо дослідження контрольних мішеней дали несподівані результати, видати підтверджений результат про дослідження клінічного матеріалу неможливо, потрібно повторити дослідження.

а, б - правильно; в - неправильно; г - одна горизонтальна лінія (3,0 см) = 150 п/з; одна вертикальна (2,0 см) = 100 п/з; д - одна горизонтальна лінія (2,0 см) = 100 п/з; дві вертикальні (по 1,0 см) = 100 п/з.