Про затвердження Інструкції з мікробіологічної діагностики туберкульозу

Зазначені розчини стерилізують і зберігають в стерильному закритому посуді для подальшого використання.

Другий варіант приготуваннярозчину NaOH-цитрат - в 1,0 л дистильованої води розчинити:

гідроксид натрію (NAOH) - 20,0 г

цитрат натрію (Na3C6H5O7x 2H2O) - 14,5 г.

Безпосередньо перед проведенням процедури обробки матеріалу готують робочий розчин деконтамінанту: у розчин NaOH-цитрат додають порошок муколітичного (розріджуючого) агента NALC із розрахунку 0,5 г на 100 мл розчину.

Суміш NALC-NaOH може бути використана тільки впродовж 24 год, оскільки після закінчення зазначеного терміну розчин швидко втрачає свою муколітичну активність. Тому рекомендується готувати невеликі об’єми розчину, щоб кожного разу використовувати для процедури деконтамінації свіжий розчин, не зберігаючи для подальшого використання об’єм розчину, що залишився.

У разі значного забруднення зразків сторонньою мікрофлорою концентрацію гідроксиду натрію у вихідному розчині можна збільшити до 3,0 %.

5. Для отримання фосфатного буфера (рН = 6,8) готують два розчини:

9,47 г безводного Na2HPO4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води;

9,07 г KH2PO4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води.

Потім для приготування буфера з рН = 6,8 обидва приготовані розчини змішують у рівній кількості й перевіряють рівень рН за допомогою рН-метра або індикаторної паперової смужки. Потрібного значення рН досягають, додаючи розчин а чи б. Розчин а підвищує значення рН, розчин б - знижує.

Другий варіант приготування буферного розчину: в 10,0 мл дистильованої води потрібно розчинити:

двозаміщений фосфат натрію (Na2HPO4) - 4,74 г;

однозаміщений фосфат калію (KH2PO4) - 4,54 г.

Стерилізація буфера проводиться в автоклаві за температури +121 -°C протягом 15 хв у ємності з кришкою, що частково відкручена. Після охолодження розчину до кімнатної температури кришку слід щільно закрутити.

Обробку матеріалу слід проводити в ламінарній шафі біобезпеки з дотриманням стерильності за такою схемою:

до зразка (приблизно 5,0-10,0 мл), який міститься в пластиковій градуйованій центрифужній пробірці на 50,0 мл, додати рівний об’єм NALC-NaOH;

щільно закривши кришку, змішати вміст пробірки струшуванням або за допомогою вортексу (протягом 5-20 с) до повного розрідження;

перевернути пробірку, щоб усі ділянки її внутрішніх поверхонь і кришки піддалися дії розчину.

Потрібно уникати посиленого струшування, щоб запобігти окисленню й інактивації NALC. Необхідний ступінь інтенсивності змішування деконтамінуючого розчину з оброблюваним матеріалом забезпечується під час центрифугування, для чого потрібно:

залишити зразок на 15 хв за кімнатної температури для деконтамінації (у разі якщо потрібно збільшити ступінь деконтамінації, час експозиції може бути продовжено до 25 хв);

додати до пробірки стерильний фосфатний буфер (рН = 6,8) до відмітки "50,0 мл" (для зниження дії NAOH і зменшення щільності розчину перед центрифугуванням);

щільно закрити кришку й перемішати вміст пробірки струшуванням, щоб змити всі внутрішні поверхні пробірки і кришки;

центрифугувати зразок протягом 15-20 хв за 3 000 g в антиаерозольній центрифузі для осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій;

перелити надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином за допомогою стерильної піпетки (або злити супернатант в ємність з дезінфектантом, після чого витерти край пробірки серветкою, змоченою дезінфектантом, або акуратно обпалити), а потім закрити пробірку.

Потрібно додати до осаду 0,5-2,0 мл нової порції стерильного фосфатного буфера, а потім ресуспендувати осад і використовувати його для інокуляції.

Розчин тризаміщеного фосфорнокислого натрію може використовуватися в 10,0 % концентрації.

Тризаміщений фосфорнокислий натрій (Na3PO4) добре пригнічує супутню флору і навіть при 2-3-денному зберіганні матеріалу за температури +4 -°C не пошкоджує мікобактерій і мало впливає на їх здатність до росту на живильних середовищах.

Тризаміщений фосфорнокислий натрій може використовуватися для консервації, транспортування і деконтамінації зразків мокротиння. Метод не має жорстких обмежень за часом. Цей метод обробки матеріалу використовується тільки для посіву на щільні живильні середовища.

6. Для приготування розчину потрібно розчинити у 800 мл дистильованої води 100 г тризаміщеного фосфату натрію, довести об’єм розчину до 1 л і стерилізувати автоклавуванням протягом 15 хв за температури +121 -°C.

Для обробки досліджуваний матеріал потрібно залити рівним об’ємом 10,0 % тризаміщеного фосфату натрію, щільно закрити ємність і помістити її на 10 хв на струшувач. Крім того, для кожного зразка бажано мати свою пробірку з Na3PO4 або окрему піпетку, щоб уникнути перехресної контамінації зразків під час заливання деконтамінуючого розчину.

Пробірку або флакон з матеріалом, залитим деконтамінантом, помістити на 18-20 год у термостат за температури +37 -°C.

Після цього пробірки, не відкриваючи, помістити у відповідну центрифугу, урівноважити їх і центрифугувати під за 3 000 g протягом 15 хв. При зазначеному режимі відбувається осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій.

Якщо процес деконтамінації проводився у контейнері, в якому матеріал надійшов до лабораторії, після закінчення деконтамінації осад матеріалу з контейнера слід перенести стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл у центрифужну пробірку, врівноважити пробірки й центрифугувати в описаному режимі.

Надосадову рідину відібрати стерильною піпеткою на 5,0-10,0 мл і перенести її в ємність з дезінфікуючим розчином, залишивши в кожній пробірці 1,2-1,5 мл осаду.

Використану піпетку опустити в ємність з дезінфікуючим розчином.

До осаду стерильно додати кілька крапель 6,0 % соляної кислоти або 1,0 % лимонної кислоти до отримання нейтрального значення рН, визначеного індикаторною паперовою смужкою.

Пробірку з осадом помістити у штатив в порядку реєстраційних номерів матеріалу.

Для зниження токсичного впливу на мікобактерії різних залишків речовин (у тому числі можливих хіміопрепаратів) проводять ще одну процедуру відмивання осаду 10,0-15,0 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Супернатант видаляють, а осад в об’ємі 0,8-1,0 мл готують до інокуляції й приготування мазка.

Під час проведення процедури деконтамінації потрібно пам’ятати, що центрифугування є однією з найбільш небезпечних процедур стосовно ризику утворення інфекційного аерозолю.

Процедури піпетування, переливання з ємності в ємність також має бути скорочено до мінімуму і здійснено у шафі біобезпеки.

Загальний час обробки матеріалу за методом Петрова не повинен перевищувати 40 хв.

Обробка за допомогою NaOH є досить жорсткою і може призвести до загибелі у зразку, що досліджується, до 60,0 % мікобактерій. Цей показник не залежить від додаткової загибелі бактерій за рахунок підвищеної температури під час центрифугування та інших факторів.

7. Розчин їдкого натру токсичний відносно як супутніх мікроорганізмів, так і М. tuberculosis. Тому під час використання цього методу потрібно суворо дотримуватися зазначених термінів обробки.

Приготування розчинів:

4,0 % розчин їдкого натру (NaOH):

40,0 г їдкого натру заливають дистильованою водою до об’єму 1 000 мл;

10,0 % розчин соляної кислоти:

10,0 мл концентрованої соляної кислоти додають до 90,0 мл дистильованої води.

Розчини стерилізують в автоклаві за температури +121 -°C протягом 20 хв.

Для обробки досліджуваний матеріал, який перебуває в стерильному контейнері, залити подвійним об’ємом 4,0 % розчину їдкого натру і помістити на 10-30 с на струшувач.

Витримати отриману суміш 15 хв за кімнатної температури з періодичним ручним струшуванням. При цьому не варто перевищувати часу експозиції.

Стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл перенести оброблений матеріал у пробірки.

Пробірки врівноважити і центрифугувати матеріал за 3 000 g протягом 15 хв.

Стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл перенести надосадову рідину в ємкість з дезінфікуючим розчином, залишивши в пробірці 0,8-1,2 мл осаду.

До осаду додати стерильної піпеткою 15,0 мл стерильного 0,9 % розчину хлориду натрію.

Пробірки врівноважити і повторно центрифугувати матеріал за 3 000 g протягом 15 хв.

Стерильною піпеткою об’ємом 5,0-10,0 мл перенести надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином, залишивши в пробірці 1,2-1,5 мл осаду.

До осаду додати 0,5-1,0 мл буферного розчину для отримання нейтрального значення рН.

Закрити пробірку і струснути її вміст. Пробірку з осадом помістити в штатив, розмістивши її у порядку реєстраційних номерів матеріалу.

8. Стерильним пінцетом вносять тампон з мазком із носоглотки в стерильну пробірку для центрифугування (50,0 мл). Додають 2,0 мл стерильної дистильованої води. Проводять обробку матеріалу NALC-NаOH. Перед додаванням фосфатного буфера тампон виймають із пробірки.

9. Дослідження промивних вод шлунка має бути проведено впродовж перших 4 год після їх отримання від пацієнта, оскільки через високу кислотність М. tuberculosis можуть швидко загинути. Зазвичай під час дослідження промивних вод шлунка немає потреби здійснювати деконтамінацію, якщо пробу було взято в стерильний контейнер з дотриманням правил асептики. Увесь об’єм проби центрифугують за 3 000 g впродовж 30 хв. Відразу ж після цього роблять посів матеріалу на живильне середовище.

10. З метою виділення мікобактерій із сечі до зразка рекомендують додавати:

на об’єм до 20,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 1 краплю 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,1 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми);

на об’єм 20,0-30,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 2 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,3 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми);

на об’єм 30,0-50,0 мл - 1 краплю 1,0 % Твін 80, 3 краплі 20,0 % сульфосаліцилової кислоти і 0,5 мл білкового розчину (7,0-8,0 % стерильного бичачого сироваткового альбуміну, сироватки або плазми).

Проби сечі залишають на 2 год у холодильнику за температури +2 -°C. Зразки, об’єм рідини в яких перевищує 30,0 мл, слід розділити порівну на дві пробірки. Зразки центрифугують за 3 000 g впродовж 20 хв, зливають надосадову рідину. Потім обробку матеріалу проводять за методикою деконтамінації мокротиння (NaLC-NaOH), після чого негайно роблять посів на живильне середовище. Дослідження бактеріоскопії осаду сечі на КСП проводити недоцільно.

10. Лімфатичні вузли, біоптати та інші тканини, резецировані під час хірургічного втручання, потрібно подрібнити за допомогою стерильного скальпеля або ножиць і пінцета. Зразок гомогенізують у стерильній фарфоровій ступці або в гомогенізаторі тканин, додавши 0,5-1,0 мл стерильного ізотонічного розчину хлориду натрію і, за потреби, невелику кількість стерильного піску. Цю суспензію можна використати для посіву на живильне середовище у тих випадках, коли зазначені вище маніпуляції було проведено з дотриманням правил асептики. Якщо правил асептики не дотримувалися, проводять деконтамінацію проби 4,0 % розчином сірчаної кислоти, як це рекомендують робити під час обробки сечі. Якщо отриманий матеріал не може бути відпрацьований у день отримання проби, до зразка потрібно додати рівну за об’ємом кількість (не менше ніж 1,0 мл) стерильного ізотонічного розчину, щоб запобігти висиханню тканини. Зберігати матеріал у такому вигляді можливо не більше ніж 48 год у холодильнику за температури +4 -°C.

11. Гній обробляється так само, як і аспіровані рідини. Якщо гній дуже густий, його слід обробляти так само, як мокротиння.

12. Стерильно взяту спинномозкову рідину засівають без попередньої обробки.

Якщо стерильність зразка викликає сумніви, можна обробити його за методикою, описаною для мокротиння. Рекомендується проводити посів на рідкі живильні середовища. Якщо дозволяє об’єм зразка, доцільно розділити його на дві частини, посіявши одну з них без обробки, іншу - після обробки.

13. Слизово-гнійні рідини обробляють так само, як і мокротиння, коли об’єм проби становить 10,0 мл або менше.

14. Якщо матеріал отримано з дотриманням правил асептики, його центрифугують за 3 000 g впродовж 15 хв і відразу ж роблять посів осаду на живильне середовище. Якщо об’єм проби перевищує 10,0 мл, її обробляють так само, як промивні води шлунка.

15. Кров та інші рідкі матеріали з великою домішкою крові після додавання 3,0 % розчину лимоннокислого натрію центрифугують за 3 000 g, а осад тричі відмивають стерильною дистильованою водою.

М. tuberculosis можуть "приклеюватися" до скла або пластику. Щоб досягти максимального витягання мікобактерій, контейнер обполіскують стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію. Центрифугують розчин за 3 000 g впродовж 15 хв і роблять посів 2-3 крапель осаду на живильне середовище.

16. Близько 5,0 г калу переносять у пробірку. Заливають гіпернасиченим розчином NaCl (у розчині має міститися нерозчинена сіль) і залишають на 4 год у ШББ. Зразок фільтрують через стерильну марлю в центрифужну пробірку, центрифугують за 3 000 g упродовж 20 хв, зливають надосадову рідину. До осаду додають 0,3 % розчин хлорамфеніколу в пропорції 1 : 3. Зразок поміщають на ніч у холодильник за температури +2 -°C. Потім проводять обробку матеріалу за методикою деконтамінації мокротиння (NaLC-NaOH). Посів проводять як на щільні, так і в рідкі живильні середовища. Дослідження бактеріоскопії осаду калу на КСБ проводити недоцільно.

17. Під час внутрішньолабораторного контролю якості деконтамінації та оцінки можливих причин контамінації зразка, слід уточнити, чи не був занадто великим інтервал між збором зразка і його обробкою. Якщо це так, потрібно вжити заходів для організації транспортування зразків.

Потрібно суворо дотримуватися часу контакту зразка з деконтамінантом. Короткий час контакту призводить до високої частоти контамінації, занадто тривалий контакт викликає втрату життєздатності мікобактерій.

Потрібно переконатися, що ротор досягає необхідну відносну силу центрифугування 3 000 g і підтримує її впродовж 15 хв.

Контамінація може мати місце серед зразків, оброблених протягом одного дня або серед деконтамінованих зразків, зібраних у якому-небудь одному місці. У таких випадках слід перевірити стерильність розчинів для деконтамінації, виконання процедури деконтамінації чи організацію системи збору і транспортування зразків. Якщо виявлено помилки, слід прийняти негайні корегувальні дії. Якщо виявлено проблеми у виконанні процедури, слід провести навчання співробітників лабораторії, які виконують деконтамінацію.

Якщо має місце контамінація зразків від одного і того самого пацієнта, потрібно використовувати жорсткішу процедуру деконтамінації для обробки зразків від цього пацієнта. Треба збільшити концентрацію реактиву, але не термін обробки, використавши два об’єми розчину для деконтамінації одного об’єму зразка. Таку жорстку процедуру слід застосовувати тільки для обробки контамінованих зразків.

Крос-контамінація зразків від епідеміологічно не пов’язаних між собою пацієнтів може призвести до серії позитивних результатів бактеріологічного дослідження за короткий проміжок часу. У таких випадках слід оцінити можливість крос-контамінації для виключення хибнопозитивних результатів дослідження. Потрібно з’ясувати такі обставини:

чи мають пацієнти, які отримали позитивний результат культурального дослідження, клінічні симптоми туберкульозу;

чи отримано позитивний результат культурального дослідження під час дослідження інших зразків від тих самих пацієнтів;

чи не було оброблено один або декілька зразків із ростом одиничних колоній M. tuberculosis відразу після зразків із великою кількістю КСБ.

Якщо крос-контамінацію не може бути виключено, слід переконатися, що процедури виконуються правильно, зокрема такі:

деконтамінації зразків не проводиться паралельно з посівом культур мікобактерій;

під час внесення розчинів у пробірки не відбувається торкання шийки;

розчини реагентів діляться на аліквоти;

аліквотів розчинів, відкритих упродовж робочого дня, не використовують повторно;

зразки з високою вірогідністю КСБ+ обробляються і засіваються в останню чергу;

контейнери або пробірки зі зразками не відкриваються до того, як будуть закриті попередні;

контейнери або пробірки зі зразками не відкриваються безпосередньо після діставання із центрифуги;

надосадова рідина акуратно зливається в контейнер, що містить дезінфікуючій розчин, уникаючи розпліскування, наприклад, через воронку;

рукавички в ході роботи змінюють часто і ніколи не використовують повторно.

Тестування якості деконтамінації з використанням референс-штаму проводять із використанням референс-штаму мікобактерій. Можна використати будь-який доступний референс-штам або добре вивчений клінічний ізолят мікобактерій.

Прийнятніше використати швидкорослі НТМБ (M. fortuitum тощо). Під час проведення тестування оцінюється швидкість і рясність зростання деконтамінованої й необробленої суспензії мікобактерій.

Тестування проводиться щомісяця, кожного разу під час зміни реагентів, в разі незадовільних результатів контролю якості - щотижня.

Готують суспензію M. fortuitum у 2,0 мл стерильного фосфатного буфера за стандартом каламутності McFarland 1.

Суспензія 1: 0,1 мл суспензії вносять у 9,9 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Суспензія 2: 1,0 мл суспензії 1 вносять у 9,0 мл ізотонічного розчину хлориду натрію.

Засівають по 0,2 мл суспензії 1 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Засівають по 0,2 мл суспензії 2 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

Залишки суспензії 1 і суспензії 2 піддають повній процедурі деконтамінації і центрифугування. Осад суспензії 1 ресуспендують в 1,0 мл стерильного буферу (суспензія 3). Осад суспензії 2 ресуспендують в 1,0 мл стерильного буферу (суспензія 4).

Засівають по 0,2 мл суспензії 3 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена. Засівають по 0,2 мл суспензії 4 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

Засівають по 0,2 мл суспензії 4 у дві пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена.

18. Через 5-7 днів інкубації оцінюють рясність росту M. fortuitum.

У пробірках, засіяних суспензією 1, має бути отримано густий ріст M. fortuitum (3+), у пробірках, засіяних суспензією 2,- помірний ріст (2+).

У пробірках, засіяних суспензіями 3 і 4, має бути отримано такий самий ріст (3+, 2+) або на ступінь нижче (2+, 1+).

У разі використання іншого референс-штаму слід проводити облік густоти росту після закінчення терміну, достатнього для появи видимого росту цього референс-штаму.

Процедурам деконтамінації й центрифугування піддають пробірку із середовищем Middlebrook 7Н9 чи ізотонічним розчином хлориду натрію, засіяну E. coli. Через 3 дні оцінюють наявність росту E. coli в контрольній пробірці та інших пробірках, оброблених одночасно, з метою встановлення можливої крос-контамінації.

Можна піддати процедурам деконтамінації й центрифугування незасіяну пробірку із середовищем Middlebrook 7Н9 чи ізотонічним розчином хлориду натрію. Через 3 дні оцінюють наявність росту в контрольній пробірці.

19. Для оцінки рівня контамінації визначають питому вагу контамінованих пробірок від загального числа засіяних пробірок для кожного живильного середовища. Така оцінка проводиться щомісяця, а в разі неадекватного рівня контамінації чи незадовільних результатів контролю якості - щотижня. Розрахунок рівня контамінації проводять за такою формулою:

Допустимий рівень контамінації для посівів у рідкі живильні середовища становить 6,0-8,0 %.

Високий рівень контамінації може бути викликано такими причинами:

недостатній час деконтамінації;

низька концентрація NaOH, NALC;

розчин NALC-NaOH приготований більше ніж 24 год тому;

незадовільна якість реагентів;

проблеми з референс-штамом (нежиттєздатний, неправильна каламутність суспензії);

нестерильні розчини.

Низький рівень контамінації, відсутність росту або незначний ріст культур мікобактерій може бути спричинено такими факторами:

перевищення часу деконтамінації зразків більше ніж на 20 хв;

завищена концентрація NaOH, NALC;

незадовільна якість реагентів;

проблеми з референс-штамом (нежиттєздатний, неправильна каламутність суспензії);

не належний рівень рН (вище ніж 8);

не належний режим центрифугування (час, швидкість, температура).

20. У випадках відхилення рівня контамінації від норми слід переконатися, що в лабораторії дотримуються таких вимоги внутрішнього контролю якості:

належні якість, термін придатності, концентрації реагентів і розчинів;

приготований робочий розчин використовується впродовж 24 год;

pH розчинів і зразка після деконтамінації не перевищує 8,0;

термін експозиції з деконтамінуючим розчином не перевищує 20 хв;

розчини і живильні середовища стерильні;

належна якість стерилізації в автоклаві й сухожаровій шафі;

належна якість контрольного штаму M. fortuitum.

У разі будь-якого відхилення від задовільних показників деконтамінації слід проаналізувати отримані результати й можливі причини цього.

Якщо в період, за який зареєстровано відхилення рівня контамінації, результати внутрішнього контролю якості живильних середовищ, обладнання і внутрішнього контролю якості деконтамінації, проведеної з використанням тест-штаму, були задовільними, змін до методики деконтамінації не вносять, а спостерігають за рівнем контамінації під час використання нової партії середовища.

Якщо мають місце незадовільні результати внутрішнього контролю якості деконтамінації, негайно здійснюють заходи для підвищення якості методу.

1. Для посіву діагностичного матеріалу використовують живильні середовища, серед яких можна виділити такі основні групи:

щільні живильні середовища на яєчній основі;

щільні або напіврідкі живильні середовища на агаровій основі;

рідкі живильні середовища;

рідкі синтетичні й напівсинтетичні живильні середовища.

Кожне із цих середовищ має свої переваги й недоліки. Оптимальне середовище для культивування M. tuberculosis має бути недорогим, простим у приготуванні, складатися з доступних компонентів. Крім того, середовище має пригнічувати ріст супутньої мікрофлори, забезпечувати хороший ріст під час посіву невеликої кількості мікобактерій і можливість попередньої диференціації колоній, що виросли, за морфологічними ознаками. Тобто оптимальне середовище повинне мати добрі інгібуючі, ростові й диференційні властивості. Яєчні середовища найбільшою мірою відповідають вище зазначеним вимогам у разі проведення посіву з мокротиння.

2. Переваги яєчних середовищ:

економічність (найбільш дешеві зі всіх середовищ, що використовуються для виділення мікобактерій) і простота приготування;

можуть зберігатися в холодильнику до 4 тижнів;

добре підтримують ріст більшості штамів М. tuberculosis;

дозволяють проводити попередню ідентифікацію мікобактерій за морфологією колоній;

малахітовий зелений, що входить до складу середовищ, пригнічує ріст супутньої мікрофлори, яка швидко росте, зменшуючи вірогідність контамінації посівів.

3. Недоліки яєчних середовищ:

поява росту мікобактерій упродовж 2-12 тижнів і довше;

у процесі культивування з’являється ріст супутньої мікрофлори, який спостерігається на всій поверхні живильного середовища, внаслідок чого ці пробірки потрібно відбраковувати. Для бактеріологічної діагностики ТБ потрібно використовувати щонайменше два різні за складом живильні середовища - Левенштейна-Єнсена і Фінна-II.

4. Середовище Левенштейна-Єнсена - щільне яєчне середовище, на якому хороший ріст М. tuberculosis одержують приблизно на 18-25 добу після посіву клінічного матеріалу з позитивним результатом мікроскопії на КСБ. До складу цього живильного середовища входить гліцерин, який сприяє росту M. tuberculosis. Для виділення M. bovis рекомендують варіант середовища Левенштейна-Єнсена, до складу якого замість гліцерину входить 0,5 % розчин пірувату натрію.

5. Середовище Фінна-II відрізняється від середовища Левенштейна-Єнсена тим, що замість L-аспарагіну в ньому використовується глутаміновокислий натрій (глутамат натрію) і склад солей розрахований так, що кінцева кислотність середовища має нижчі показники (рН 6,3-6,5), ніж у середовищі Левенштейна-Єнсена (рН 7,2-7,4), і більшу стабільність. Ці властивості обумовлюють більш високу ефективність середовища під час посіву матеріалу, обробленого лужними детергентами.

Ріст мікобактерій спостерігається на цьому середовищі на декілька днів раніше, ніж на середовищі Левенштейна-Єнсена, а відсоток виділення культур на 6,0-8,0 % вищий.

6. Вода для приготування живильних середовищ має бути дистильованою, вільною від речовин, що можуть сповільнити ріст мікроорганізмів.

Дистильовану воду зберігають у контейнерах, виготовлених із інертних матеріалів (наприклад, з нейтрального скла, поліетилену тощо), які мають бути вільними від будь-яких інгібуючих речовин.

Усі реактиви, що використовують для приготування живильних середовищ, повинні мати ступінь очищення не менше ніж категорія "ХЧ".

Посуд для приготування живильних середовищ має бути досить великого об’єму, щоб було зручно перемішувати середовище. Не слід готувати в одній ємності більше ніж 2,0 л середовища.

Під час приготування середовища потрібно використовувати хімічно чистий лабораторний посуд, а також щойно приготовлену дистильовану воду. Усі живильні середовища чутливі до нагрівання, тому не потрібно нагрівати їх довше, ніж цього потребує така процедура.

Для отримання якісного середовища й уникнення забруднення його сторонньою мікрофлорою рекомендують дотримуватися таких основних правил:

приміщення, де готують живильні середовища, утримують у максимальній чистоті. Рекомендують регулярно мити підлогу з додаванням дезінфікуючого засобу, а також протирати дезінфектантом обладнання й робочі поверхні. Перед приготуванням середовищ потрібно обробити приміщення УФ-опромінювачем;

використовувати тільки стерильний посуд;

використовувати потрібну кількість реагентів;

правильно проводити приготування розчинів, тобто використовувати мірний посуд, доводити об’єм розчину по нижній межі меніска;

постійно контролювати температуру у згортувачі;

не допускати перегріву середовищ у згортувачі;

суворо дотримуватись вимог асептики;

ретельно обробляти поверхню яєць перед їх розбиванням для приготування яєчної маси;

не піддавати готового середовища дії УФ променів;

зберігати готові середовища у темному прохолодному місці;

проводити контроль якості кожної партії приготованих середовищ;

розливати в пробірки по 5,0 мл середовища.

Для приготування щільних яєчних живильних середовищ використовують сольову основу різного складу залежно від найменування середовища, яке потрібно приготувати, яєчну масу та розчин малахітового зеленого (антисептик, який запобігає росту на середовищі не мікобактеріальної мікрофлори).

7. Нижче зазначено склад і рекомендації щодо приготування найбільш поширених щільних яєчних середовищ - Левенштейна-Єнсена та Фінна-II.

Левенштейна-Єнсена

Склад середовища

Розчин мінеральних солей:

Зазначені інгредієнти розчиняють у теплій дистильованій воді в зазначеній послідовності за слабкого підігрівання (не доводячи до кипіння) на водяній бані. L-аспарагін рекомендують розчиняти окремо і вносити останнім. Потім сольовий розчин стерилізують в автоклаві за 1 атм. (121 -°C) протягом 30 хв. Термін зберігання розчину становить 3-4 тижні за кімнатної температури.

Для культивування M. bovis середовище Левенштейна-Єнсена збагачують 0,5 % піруватом натрію, виключивши із сольового розчину гліцерин. Із цією метою до складу сольового розчину замість гліцерину додають 8,0 г пірувату натрію.

Розчин малахітового зеленого:

Наважку порошку малахітового зеленого потрібно розчинити в стерильній теплій дистильованій воді й помістити розчин у термостат на 1,0-2,5 год для більшого розчинення (рекомендують часте помішування, оскільки порошок розчиняється дуже погано). Потім профільтрувати розчин через паперовий фільтр, розлити по флаконах або невеликих колбах і стерилізувати за 1 атм. (+121 -°С) протягом 30 хв. Приготований розчин не підлягає тривалому зберіганню в разі появи осаду або зміни забарвлення його слід замінити свіжим розчином.

Для приготування яєчної маси свіжі (що зберігаються не довше ніж 7 днів) дієтичні курячі яйця без тріщин і дефектів шкаралупи ретельно відмивають у теплій проточній воді за допомогою ручних щіток і лужного мила. Потім яйця занурюють у 70,0 % етиловий спирт на 30 хв.

Перш ніж почати роботу з чистими й сухими яйцями, рекомендують ретельно вимити руки з милом і щіткою. Потім у стерильному боксі розбивають яйця стерильним ножем у стерильний посуд, доводячи загальний об’єм яєчної маси до 1 000 мл (для цього потрібно в середньому 20-25 яєць залежно від їх розміру).

Потрібна кількість яєчної маси визначається за об’ємом, а не за кількістю яєць. Ретельно перемішують яєчну масу стерильним вінчиком або в стерильному міксері за мінімальної швидкості. Потрібно мінімізувати утворення піни.

Для приготування середовища у велику стерильну ємність, дотримуючись правил асептики, поміщають такі розчини:

розчин мінеральних солей - 600 мл;

гомогенізована яєчна маса - 1 000 мл.

Суміш ретельно перемішують і фільтрують через стерильний марлевий фільтр, що має не менше ніж чотири шари марлі. Додають 20,0 мл розчину малахітового зеленого, ретельно перемішують, уникаючи утворення піни. Одразу розливають у пробірки приблизно по 5,0 мл, стежачи за тим, щоб у розчині не сформувалося осаду. Не допускати потряпляння піни в пробірки.

8. Для згортання середовища використовуються спеціальні апарати-згортувачі. Пробірки з розлитим у них середовищем поміщають у спеціальні касети з підібраним кутом нахилу для формування скосу середовища заввишки 8,0-10,0 см. Штативи встановлюють у згортувач і проводять коагуляцію за температури +80-85 -°C протягом 30 хв.

Згортання не є процедурою стерилізації, а тільки коагуляції.

Стерильність середовища забезпечується стерильними умовами його приготування і розливу.

Приготувння і розлив живильного середовища здійснюються в умовах дотримання стерильності, а якість приготованого яєчного середовища залежить від дотримання температурного і часового режимів коагуляції.

Приготована партія середовища повинна мати етикетку з датою виготовлення і зберігатися в холодильнику за температурою +4 -°C з ретельно закритими пробками для запобігання висиханню. Термін зберігання середовища не повинен перевищувати 4 тижні.

9. Середовище Фінна-II:

Розчин мінеральних солей:

Перелічені інгредієнти розчиняють у дистильованій воді в зазначеній послідовності за слабкого підігрівання (не доводячи до кипіння) на водяній бані. Кислотність не коригують. Стерилізують в автоклаві за 1 атм. (+121 -°С) протягом 30 хв. Термін зберігання розчину становить 3-4 тижні за кімнатної температури.

10. Приготоване яєчне середовище після його коагуляції має бути візуально оцінено. Правильно приготоване середовище має бути щільним і міцно прилипати до стінок пробірки. Вміст конденсату в пробірці із середовищем не повинен перевищувати 0,2 мл. Знебарвлення середовища або поява поглиблень чи бульбашок усередині середовища та на його поверхні свідчить про надмірну температуру коагуляції. Партію середовища з виявленими недоліками не можна використовувати для посіву і має бути знищено.

Однією з обов’язкових процедур внутрішнього контролю якості є перевірка приготованого середовища на стерильність і на ростові властивості.

Після згортання кожна приготована партія середовища спочатку піддається контролю на стерильність. Із цією метою шість пробірок зі свіжоприготовленої партії середовища поміщають у термостат за температури +37 -°C і витримують протягом трьох діб, що достатньо для росту забруднюючих мікроорганізмів.

Якщо принаймі 1 пробірка проростає супутньою мікрофлорою, аналогічним чином має бути перевірено 10 додаткових пробірок. Якщо хоча б в одній із цих 10 пробірок з’являється ріст, аналогічним чином має бути перевірено всі пробірки цієї партії. Усі пробірки з ростом забруднюючої мікрофлори слід видалити. Решту неконтамінованих пробірок може бути використано.

Потрібно проводити тестування ростових якостей кожної партії середовища за допомогою стандартного тест-штаму. Як тест-штам рекомендується використовувати лабораторний (музейний) штам M. tuberculosis H37Rv. Для приготування суспензії потрібно зробити змив чотирьохтижневої культури зі всієї поверхні щільного середовища, гомогенізувати суспензію за допомогою струшування на струшувачі (вортексі) протягом 1 хв і приготувати кілька її розведень.

Щоб утворити суспензію № 1, потрібно розвести бактеріальну суспензію за стандартом мутності 1 McF (3 x 10-8 КУО/мл).

Приготувати серійні десятикратні розведення культури із суспензії № 1, щоб одержати 3 x 10-3 і 3 x 10-4 бактерії в 1,0 мл.

Засіяти по 0,2 мл кожної із суспензій (3 x 10-3 і 3 x 10-4) на дві пробірки приготованої партії середовища. Розподілити інокулят по поверхні пробірок. Подальша інкубація - у звичайному порядку. Реєструвати щотижня ріст і відносний розмір колоній у пробірках, порівнюючи ріст на новоприготованій партії середовища з результатами росту, одержаними на попередній партії середовища й зафіксованими в журналі приготування середовищ (термін появи росту, кількість і розмір колоній).

Посів розведень 3 x 10-3 і 3 x 10-4 має дати ріст 1-10 і 10-100 колоній відповідно. За таких результатів росту на середовищах, що контролюються, їх якість вважають задовільною.

Контроль ростових властивостей середовища можна проводити одночасно з посівом діагностичного матеріалу. У разі незадовільної якості середовища негативні результати посіву, одержані на ній, вважаються недостовірними. Залишки незасіяного середовища має бути знищено.

11. Результати контролю якості середовищ фіксують у журналі приготування середовищ. У цьому журналі мають бути зазначені дата приготування середовища, об’єм приготованого середовища або кількість розлитих пробірок, ПІБ лаборанта, що приготував середовище, результати тесту на стерильність і на ростові якості (час появи росту для обох штамів, кількість колоній в різних розведеннях), дата проведення контролю, ПІБ лаборанта, що проводив контроль якості середовища, висновок про придатність середовища. Нове середовище придатне до вживання, якщо ріст на ньому еквівалентний або кращий, ніж на попередньому середовищі. Не використовувати партії середовища, якщо ріст на ньому гірший, ніж на попередній партії.

12. Мікроскопічне та бактеріологічне дослідження мають проводитися паралельно з однієї й тієї самої проби діагностичного матеріалу.

Перед процедурою посіву потрібно підготувати пробірки із живильними середовищами, пронумерувати їх відповідно до реєстраційних номерів зразків і послідовно розміщувати у вертикальному штативі. Так само потрібно підготувати й пронумерувати предметні скельця.

Осад, одержаний після попередньої обробки діагностичного матеріалу одним із вищезазначених методів, потрібно піддати паралельно бактеріологічному й мікроскопічному дослідженням.

Перед початком відбору посівного матеріалу в піпетку слід переконатися в тому, що номер пробірки з посівним матеріалом відповідає номерам пробірок з поживним середовищем і номеру предметного скла для приготування мазків:

набрати стерильною мірною піпеткою (краще одноразовою пастерівською пластиковою) 1,0-1,2 мл підготовленого осаду, залишивши приблизно 0,1-0,2 мл для подальшого приготування мазка для мікроскопії;

дотримуючись умов стерильності, внести потрібні об’єми набраного матеріалу в 2 пробірки з різними щільними живильними середовищами;

пробірки із живильним середовищем під час посіву мають знаходитися в похилому положенні (під кутом 40-45-°);

посівний матеріал нанести на середовище у верхню третину скосу живильного середовища;

засіяні пробірки закрити пробками і помістити в штатив так, щоб посівний матеріал рівномірно розподілився по всій поверхні скосу живильного середовища (краще використовувати пробірки з кришками, що загвинчуються);

залишок осаду забрати тією самою піпеткою й нанести на заздалегідь підготоване і пронумероване предметне скло 2-3 краплі осаду для отримання мазка для мікроскопічного дослідження, розподіливши матеріал рівномірним шаром у центрі скла на площі близько 1,0 x 2,0 см;

використану для посіву і приготування мазка піпетку опустити в ємність із дезінфікуючим розчином;

після закінчення посіву всіх проб засіяні пробірки перемістити в горизонтальні штативи і помістити в термостат за температури +37 -°C (при цьому поверхня скосу живильного середовища має знаходитися в горизонтальній площині, а нахил штатива має виключати змочування пробки матеріалом посіву в разі використання ватно-марлевих пробок).

Інкубація посівів з метою виділення M. tuberculosis потребує тривалого терміну для отримання видимого росту колоній. Тривалий термін інкубації потребує дотримання низки правил для збереження життєздатності клітин мікобактерій і ростових властивостей живильного середовища.

Оптимальна температура інкубації - 37 -°C.

У разі первиного посіву мікроскопічно негативного матеріалу середня тривалість росту мікобактерій на щільних живильних середовищах може становити 20-46 діб. Ріст окремих штамів спостерігається через 60 діб і більше. Це обумовлює необхідність, за відсутності росту мікобактерій, витримувати посіви в термостаті до 10 тижнів для видачі негативного результату.

У процесі інкубації посівів потрібно дотримуватися таких рекомендацій:

у разі використання ватно-марлевих пробок після закінчення першої доби інкубації їх замінюють герметичними;

пробірки переводять у вертикальне положення;

інкубацію проводять протягом 10 тижнів за обов’язкового щотижневого перегляду пробірок із посівами;

для полегшення процедури щотижневого перегляду та обліку, посіви, здійснені протягом одного дня, розміщувати в окремих ящиках із матеріалу, який піддається обробці дезінфектантами й автоклавуванню, або штативах у порядку номерів реєстрації. При цьому кожен штатив або ящик слід забезпечити етикеткою, на якій зазначаються дата посіву, перший та останній реєстраційні номери партії.

13. Під час оцінювання результатів культурального дослідження діагностичного матеріалу потрібно дотримуватися таких правил:

спостереження за посівами і перегляд пробірок з посівами слід проводити щотижня;

за відсутності росту посіви мають витримуватися в термостаті протягом 10 тижнів. Негативний результат бактеріологічного дослідження може бути видано тільки після закінчення цього терміну інкубації;

під час чергового перегляду слід відбирати всі пробірки, у яких є ріст колоній, розставляючи їх у порядку номерів реєстрації матеріалу;

реєструвати такі параметри:

"появу росту" - дату появи росту в пробірках (у тому разі, якщо ріст спостерігається одночасно в обох пробірках). Якщо культура виросла тільки в одній із пробірок (при цьому є хороший ріст культури у відповідні терміни), а в другій ріст відсутній, рекомендується зареєструвати дату появи росту і показник росту в пробірці з культурою, що виросла, і використовувати її для подальшої роботи, не чекаючи появи росту колоній в іншій пробірці. Другу пробірку залишають у термостаті для подальшої інкубації і за наявності в ній росту надалі реєструють отримані результати;

"інтенсивність росту" - число колоній, що виросли в кожній із пробірок. За наявності одночасного росту у пробірках рекомендується оцінити кількість КУО в кожній пробірці, що засіяна таким матеріалом. Цей показник має важливе діагностичне і прогностичне значення, особливо якщо посіви здійснюють у динаміці спостереження за хворим у процесі хіміотерапії;

"проріст" сторонньою мікрофлорою або грибами (за наявності такого);

"відсутність росту" (зазначений параметр реєструється через 10 тижнів культивування).

Дотримання зазначених правил дозволяє, по-перше, своєчасно виявляти видимий ріст мікобактерій або супутньої мікрофлори, а по-друге, на підставі реєстрації термінів появи росту і його особливостей здійснювати первинну ідентифікацію мікобактерій.

Поява росту кислотостійких мікобактерій протягом 7-10 днів культивування на щільних живильних середовищах може свідчити про виділення нетуберкульозних мікобактерій, що швидко ростуть, які не належать до комплексу M. tuberculosis, тому перед видачею відповіді такі культури мають піддатися первинній ідентифікації;

поява росту кислотостійких мікобактерій після 3-4 тижнів культивування свідчить про виділення M. tuberculosis, а також інших мікобактерій, що повільно ростуть, які можуть належати до потенційно патогенних нетуберкульозних мікобактерій або до нешкідливих кислотостійких сапрофітів.

Під час щотижневих переглядів посівів за підозри на забруднення сторонньою мікрофлорою потрібно видалити і знешкодити ті пробірки, у яких спостерігається забруднення всієї поверхні живильного середовища чи зміна живильного середовища (розрідження або знебарвлення).

Мікроорганізми, які забруднюють посіви, мають здатність розкладати інгредієнти середовища з утворенням кислоти, що призводить до зниження pH-середовища. На такому середовищі мікобактерії не ростуть, а ці пробірки підлягають видаленню.

Посіви із частковим забрудненням потрібно витримати до закінчення терміну інкубації або до розвитку хоча б декількох колоній мікобактерій, оскільки пізня поява забруднення не виключає росту M. tuberculosis. У таких випадках потрібно зробити мазок, пофарбувати його за методом Ціля-Нільсена і за наявності кислотостійких мікобактерій обробити культуру, що виросла, 3,0-4,0 % розчином сірчаної кислоти, а після відмивання її ізотонічним розчином хлористого натрію знову посіяти осад на живильні середовища.

У всіх випадках отримання росту, щоб уникнути невірного результату, відповідь про виділення кислотостійких мікобактерій видається тільки після мікроскопії мазка з колоній, що виросли, забарвленого за методом Ціля-Нільсена.

14. Вірулентні культури M. tuberculosis ростуть на щільних живильних середовищах у вигляді R-колоній різного розміру та вигляду, мають жовтуватий або злегка кремовий відтінок (колір слонової кістки), шорстку поверхню, що нагадує манну крупу або цвітну капусту. Колонії сухі, зморшкуваті, але в разі дисоціації можуть траплятися й вологі, злегка пігментовані колонії, рожево-жовтий пігмент яких суттєво відрізняється від оранжевого чи жовтого пігменту сапрофітних або деяких нетуберкульозних мікобактерій. Останні ростуть у S-формі. Слід зазначити, що на середовищі Фінна-II колонії часто виглядають вологішими, ніж на середовищі Левенштейна-Єнсена.

Після курсу хіміотерапії від хворих на туберкульоз можуть виділятися гладкі колонії з вологим ростом (S-форми).

Під час приготування мазків для мікроскопічного дослідження колонії M. tuberculosis проявляють свої фізико-хімічні особливості: вони не емульгуються в ізотонічному розчині, а утворюють зернисту крихтоподібну суспензію.

Під час мікроскопічного дослідження мазків із колоній, забарвлених за Цілем-Нільсеном, виявляються яскраві малиново-червоні паличкоподібні бактерії, що розміщуються поодиноко або групами. Під час культивування на рідких середовищах або в умовах підвищеної вологості M. tuberculosis утворюють скупчення чи переплетення у вигляді "кіс" - феномен "корд-фактора".

M. tuberculosis виглядають як тонкі, прямі або злегка зігнуті палички завдовжки 1-10 (частіше 1-4) мкм, завширшки 0,2-0,6 мкм, гомогенні або зернисті з ледь заокругленими кінцями. Часто в препараті, особливо з культур, що тривало ростуть, видно скупчення темно забарвлених зерен. У молодих культурах, особливо виділених від хворих, які тривалий час лікуються протитуберкульозними препаратами, мікобактерії відрізняються великим поліморфізмом аж до появи коротких, майже кокоподібних, форм.

Нетуберкульозні мікобактерії та авірулентні сапрофітні мікобактерії можуть варіювати за формою колоній і морфологією клітин. Деякі з них грубіші, товщі, іноді менш інтенсивно забарвлені, рідко утворюють джгутоподібні скупчення ("корд-фактор", зазвичай, відсутній). Проте деякі види нетуберкульозних мікобактерій (фотохромогенні) можуть рости у вигляді характерної для М. tuberculosis R-форми. Багато нетуберкульозних і сапрофітних мікобактерій мають кислотостійкі зерна, схожі за морфологією з такими у вірулентних M. tuberculosis.

Остаточний висновок про належність виділеної культури до комплексу M. tuberculosis можна зробити тільки після первинної диференціації культури, що здійснюється в ході проведення тесту на медикаментозну чутливість. Потрібно здійснити подальшу ідентифікацію виділеної культури, що дасть можливість віднести мікобактерії до того чи іншого виду.

15. Під час виділення культури кислотостійких мікобактерій відповідають певним характеристикам, а саме:

поява росту колоній на щільних живильних середовищах не раніше ніж через 3-4 тижні інкубації;

наявність колоній характерної морфології й забарвлення;

мікроскопічне підтвердження кислотостійкості виділеного мікроорганізму в разі забарвлення за методом Ціля-Нільсена потрібно провести напівкількісне оцінювання інтенсивності росту.

Усі характеристики мікобактерій, що виросли на щільних живильних середовищах, заносяться до лабораторного журналу обліку результатів культуральних досліджень, до бланків відповідей, а також до картотеки. Результати дослідження реєструються та зберігаються в лабораторному модулі Реєстру хворих на ТБ.

16. Аналізатор BACTEC MGIT 960/320 являє собою повністю автоматизований комплекс для одночасної інкубації та моніторингу 960/320 пробірок. Культивування мікобактерій здійснюється в індикаторній пробірці MGIT, що містить 7,0 мл модифікованого середовища Middlebrook 7H9. Ця система дає можливість виявляти у клінічних зразках більшість штамів M. tuberculosis протягом 10-20 днів і визначати чутливість культури збудника до медикаментозних препаратів у термін, що не перевищує двох тижнів.

Аналізатор BACTEC MGIT 960/320 є єдиною повністю автоматизованою системою для визначення чутливості мікобактерій до медикаментозних препаратів, яка забезпечує прискорене тестування культури до майже всіх препаратів, у тому числі й до піразинаміду.

Матеріалом дослідження на аналізаторі BACTEC MGIT 960/320 можуть бути респіраторні зразки, насамперед мокротиння, будь-які біологічні рідини (крім крові й сечі), а також виділення ран, промивні води шлунка і тканини організму, отримані під час хірургічних втручань. Умови збору діагностичного матеріалу і його якість мають відповідати існуючим вимогам, оскільки преаналітичний етап значно впливає на результати дослідження. Найбільш зручною ємністю для збору клінічних зразків вважають стерильну градуйовану пробірку на 50,0 мл з кришкою, що загвинчується і перешкоджає розбризкуванню матеріалу під час відкривання. Оптимальна кількість рідкого діагностичного матеріалу має становити близько 5,0 мл.

Перед інокуляцією в рідкі середовища розрідження й деконтамінацію матеріалу рекомендується проводити з використанням NALC-NAOH (за методом Kubika) з подальшим отриманням осаду в результаті центрифугування (за 3 000 g протягом 15 хв).

Цей метод дозволяє перетворити зразок у сконцентровану гомогенну суспензію, у якій практично знищена будь-яка мікрофлора, крім мікобактерій, що зберегли життєздатність. За такої обробки одним із факторів збільшення ефективності культурального (як і мікроскопічного) дослідження є збереження реакції середовища, близького до нейтрального (рН 6,8).