8.2.6. Приготування 1% розчину оцтової кислоти.
10 мл концентрованої оцтової кислоти (п. 3.19) відміряють циліндром (п. 3.14), переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігають в посуді з темного скла з притертим корком (п. 3.13) при температурі від 4 до 6 град. С, протягом 2 місяців.
8.2.7. Приготування боратного розчину (рН 9,00+-0,05).
Наважку (1,00+-0,01) г натрію тетраборнокислого (п. 3.22) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), додають наважку (9,00+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.23) та розчиняють у дистильованій воді (п. 3.17), об'єм розчину доводять до мітки. На іонометрі (п. 3.5) перевіряють рН розчину. Розчин зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.13) при температурі від 4 до 6 град. С, протягом місяця.
8.3. Одержання плазми крові.
Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.
У пробірку поліетиленову (п. 3.12) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,5 мл розчину натрію лимоннокислого (п. 8.2.4) та змішують з 4,5 мл крові (співвідношеня 1:9). Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).
Центрифугують (п. 3.8) протягом 10 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.12).
Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з клінічної лабораторної діагностики.
8.4. Одержання стандартної донорської плазми крові.
Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові більш ніж 7 донорів, отриману, як вказано в п. 8.4, розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.12), заморозити та зберігати протягом двох тижнів при температурі мінус 20 град. С.
Безпосередньо перед виконанням вимірювань плазму крові розморожують у бані водяній лабораторній (п. 3.4) при 37 град. С (до повного відтаювання пробірку не струшувати). Після відтаювання плазма повинна бути абсолютно прозорою.
9. ХІД ВИЗНАЧЕННЯ
9.1. У мірну пробірку (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) переносять 0,5 мл плазми крові, що досліджується (8.3) та додають 8 мл дистильованої води (п. 3.17), яку відміряють циліндром (п. 3.14).
9.2. Суміш перемішують та дозатором лабораторним (п. 3.4) додають 0,15 мл 1% оцтової кислоти (п. 8.2.6). рН суміші необхідно перевірити по паперу індикаторному (п. 3.15). Показник рН повинен дорівнювати 5,3.
9.3. Суміш залишають на 30 хв при температурі від 4 до 6 град. С. Після інкубації суміш центрифугують протягом 5 хв (п.3.9) з прискоренням 1200-1400 g. Рідину, що над осадом виливають і залишки рідини усувають перевертаючи пробірку на фільтрувальний папір (п. 3.16).
9.4. До отриманого осаду еуглобулінів додають дозатором лабораторним (п. 3.4) 0,5 мл розчину натрію тетраборатнокислого (п. 8.2.7). Осад еуглобулінів розчиняють, перемішуючи скляною паличкою.
9.5. 0,2 мл розчину еуглобулінів дозатором лабораторним (п. 3.4) переносять у пробірки (п. 3.11) і поміщають у водяну баню лабораторну (п. 3.3) при температурі 37 град. С. Через 1 хвилину дозатором лабораторним (п. 3.4) додають 0,2 мл розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5). Через декілька хвилин утворюється згусток. При появі згустку вмикають секундомір (п. 3.6) та визначають час повного лізису згустку.
Час лізису еуглобулінової фракції стандартної донорської плазми крові дорівнює 180-270 хв.
10. ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ
10.1. За результат вимірювання приймають середнє значення
(х , хв) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за
ср
формулою: х = (х + х )/2,
ср 1 2
де х , х - значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.
1 2
10.2. Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 N 1:
- форма 237/о - "Аналіз крові (показники системи згортання)";
- форма 238/о - "Аналіз крові (показники системи згортання - скорочений варіант)";
- форма 250/о - "Журнал реєстрації аналізів і їх результатів";
- форма 262/о - "Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії".
11. КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ
11.1. Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірюваня 10 проб пацієнтів поточного дня.
11.2. Вимірювання часу лізису еуглобулінової фракції проводять відповідно до розділу 9.
11.3. Отримані дані заносять у таблицю 3.
Таблиця 3
------------------------------------------------------------------
| N | Х | Х | Х - Х |( Х - Х ) в степені 2|
| | 1 | 2 | 1 2 | 1 2 |
|---+---------+---------+----------------+-----------------------|
------------------------------------------------------------------
11.4. За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п. 10.1), середньоквадратичне відхилення (дельта) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.
11.5. Будують контрольну карту кумулятивних сум.
11.6. Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2дельта) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.
11.7. Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п. 11.6, то виміри необхідно повторити.
11.8. Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювань необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.
12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ
------------------------------------------------------------------
| Документ | Найменування | N пункту |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 24104-88Е |Весы лабораторные общего | 8.2.1; |
| |назначения и образцовые. | 8.2.2; |
| |Общие технические условия | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.7 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 7328-82Е |Меры массы общего назначения и| 8.2.1; |
| |образцовые. | 8.2.2; |
| |Технические условия | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.7 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-1-2850-80 |Баня водяна лабораторна | 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 28311-89 |Дозаторы медицинские | 9.1; 9.2;|
| |лабораторные | 9.4; 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 5-375-4215-77 |Центрифуга ЦЛР-1 | 8.3; 8.4;|
| | | 9.3 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-05.2147-78 |Іономір універсальний ЕВ-74 | 8.2.1; |
| | | 8.2.7 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 13646-68 |Термометры стеклянные ртутные | 9.5 |
| |для точных измерений | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-1819.0021-90 |Секундомір механічний "Слава" | 9.5 |
| |с ДСПР 1-2-000. Технічні умови| |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-2-407-89 |Банки и флаконы с притертой | 8.2.1; |
| |пробкой | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.6; |
| | | 8.2.7 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 208 УССР 273-84 |Пробірки поліетиленові | 8.3; 8.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 1770-74 |Посуда мерная лабораторная | 8.2.1; |
| |стеклянная. Цилиндры, | 8.2.2; |
| |мензурки, колбы, пробирки. | 8.2.3; |
| |Технические условия | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.6; |
| | | 8.2.7; |
| | | 9.1; 9.2;|
| | | 9.3; 9.4;|
| | | 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 12026-76 |Бумага лабораторная | 9.3 |
| |фильтровальная | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 6-09-1181-89 |Папір індикаторний | 9.2 |
| |універсальний для | |
| |визначення рН | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 6709-79 |Вода дистильована. | 8.2.1; |
| |Технічні умови | 8.2.2; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.6; |
| | | 8.2.7; |
| | | 9.1 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4161-77 |Кальцій хлористий | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4199-76 |Натрій тетраборнокислий | 8.2.7 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 6-09-2082-78 |Натрій 5,5'- | 8.2.1 |
| |диетилбарбітуровокислий | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4233-77 |Натрій хлористий | 8.2.1; |
| | | 8.2.2; |
| | | 8.2.3 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 22280-76 |Натрій лимоннокислій 5,5 | 8.2.4 |
| |водний | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 61-75 |Кислота оцтова. | 8.2.6 |
| |Технічні умови | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 3118-77 |Фіксонал соляної кислоти | 8.2.1 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Мінхімпромом СРСР |"Правила техніки безпеки при | 5 |
|від 27.07.77: |експлуатації електроустановок"| |
|НАОП 1.1.10-1.01-85 | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про подальше удосконалення | 5 |
|від 19.12.97 N 359 |атестації лікарів" | |
|( z0014-98 ) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про атестацію середніх | 5 |
|від 23.10.91 N 146 |медичних працівників" | |
|( v0146282-91 ) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про затвердження медичної | 10.2 |
|від 04.01.01 N 1 |облікової документації, що | |
|( v0001282-01 ) |використовується в | |
| |лабораторіях | |
| |лікувально-профілактичних | |
| |закладів" | |
------------------------------------------------------------------
Міністерство охорони здоров'я України
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ МОЗ України
15.11.2002 N 417
МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ
РІВНЮ ФАКТОРА VIII В ПЛАЗМІ КРОВІ ЛЮДИНИ МВВ 42.01-20-2002
ПОГОДЖЕНО
Головний метролог
МОЗ України
А.М.Ніколенко
10.10.2002
ПОГОДЖЕНО
Головний спеціаліст з
клінічної лабораторної
діагностики МОЗ України
В.А.Дєєв
10.10.2002
1. ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ
Документ встановлює порядок виконання вимірювання вмісту фактору VIII в плазмі крові людини.
Методика призначена для використання у закладах охорони здоров'я.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ
Методика забезпечує вимірювання вмісту фактору VIII в плазмі крові людини за характеристиками, наведеними у таблиці 1.
Таблиця 1
------------------------------------------------------------------
|Діапазон вимірювань, | Середньоквадратичне | Коефіцієнт |
| хв |відхилення, дельта (хв) | варіації, V (%)|
| | | |
|---------------------+-------------------------+----------------|
| 20-110 | +-3 | 5 |
------------------------------------------------------------------
3. ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ
3.1. Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е
3.2. Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е
3.3. Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80
3.4. Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89
3.5. Іономір ЕВ-74 ТУ 25-05.2147-78
3.6. Мішалка магнітна ММ-5М ТУ 25-7415.0006-90
3.7. Секундомір механічний ТУ 25-1819.0021-90
3.8. Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ
13646-68
3.9. Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5.375-4215-77
3.10. Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ
1770-74
3.11. Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ
98-891-021-91Е
3.12. Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР
273-84
3.13. Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89
3.14. Циліндри ГОСТ 1770-74
3.15. Папір білогарифмічний ТУ 13-0248643-794-89
3.16. Вода дистильована ГОСТ 6709-79
3.17. Кальцій хлористий ГОСТ 4161-77
3.18. Каолін ГФХ, с.140
3.19. Кислота диетилбарбітурова
3.20. Натрій 5,5'-диетилбарбітуровокислий (медінал) ТУ
6-09-2082-78
3.21. Натрій лимоннокислий 5,5 водний ГОСТ 22280-76
3.22. Натрій гідроцитрат
3.23. Натрій хлористий ГОСТ 4233-77
3.24. Еритрофосфатид Р N 82/848/8 (Мінськ, Білорусь)
Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути атестовані та повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.
4. МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ
Метод визначення вмісту фактора VIII модифікованим одноступінчатим каолін-кефаліновим методом базується на використанні субстрат-плазми з різким дефіцитом антигемофільного глобуліну (АГГ) але з нормальним вмістом усіх інших факторів зсідання крові. Для отримання оптимального середовища, в якому визначають кількість АГГ, крім субстратплазми використовують каолін та еритрофосфатид.
5. ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ
При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 "Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях", затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 "Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок", затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.
6. ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ
До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 N 359, від 23.10.91 N 146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.
7. УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ
При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:
7.1. Температура середовища (22+-5) град. С.
7.2. Відносна вологість від 60% до 75%.
7.3. Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).
7.4. Напруга електромережі (220+-22) В.
7.5. Освітленість від 300 до 400 лк.
8. ПІДГОТОВКА ДО ВИЗНАЧЕННЯ
8.1. Усі прилади, засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести у робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.
8.2. Приготування розчинів
8.2.1. Приготування буферу барбіталово-солевого (рН 7,5+-0,05).
Наважки (2,06+-0,01) г натрію 5,5'-диетилбарбітуровокислого (п. 3.20), (2,76+0,01) г кислоти диетилбарбітурової (п. 3.19) та (7,30+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.23) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.10), розчиняють у дистильованій воді (п.3.16) та доводять об'єм розчину до мітки. рН буферу перевіряють на іономірі універсальному (п. 3.5). Буфер зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.13) протягом місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.2. Приготування розчину натрію хлористого з концентрацією 8,5 г/л.
Наважку (8,50+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.23) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.10), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.16) і доводять об'єм розчину до мітки. Розчин зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.13) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.3. Приготування розчину натрію лимоннокислого (гідроцитрату) (2,0 г на 100 г розчину).
Наважку (2,00+-0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.22) розчиняють у 98,0 мл дистильованої води (п. 3.16), яку відміряють циліндром (п. 3.14). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 град. С протягом одного тижня.
8.2.4. Приготування розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (3,8 г на 100 г розчину).
Наважку (3,80+-0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.21) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.16), яку відміряють циліндром (п. 3.14). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 град. С протягом одного тижня.
8.2.5. Приготування розчину кальцію хлористого 0,033 моль/л.
Наважку (3,70+-0,01) г кальція хлористого зневодненого (п. 3.17) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.10) та розчиняють у дистильованій воді (п. 3.16), об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла з притертим корком (п. 3.13) при температурі від 4 до 6 град. С протягом місяця.
8.2.6. Приготування каолін-еритрофосфатидної суміші.
2,5-3,0% емульсію еритрфосфатиду (п. 3.24) розбавляють фізіологічним розчином (п. 8.2.2) до 0,1% емульсії, розфасовують по 1 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.12), герметично закупорюють і зберігають при температурі мінус 20 град. С один рік.
Перед роботою емульсію еритрфосфатиду розморожують, розбавляють до концентрації 0,01% фізіологічним розчином (п.8.2.2) у співвідношенні (1:9) та додають (5,0+-0,1) мг каоліну (п. 3.18) на 1 мл емульсії еритрфосфатиду. Суміш перемішують на магнітній мішалці (п. 3.6) (або вручну) при кімнатній температурі для отримання рівномірної суміші.
Каолін-еритрофосфатидну суміш зберігати під час досліду у бані крижаній водяній. Суміш стабільна при температурі від 4 до 6 град. С протягом 48 годин.
8.3. Одержання стандартної донорської плазми крові.
Кров у донора беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.
У пробірку поліетиленову (п. 3.12) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,5 мл розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) та змішують з 4,5 мл крові (співвідношення 1:9). Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).
Центрифугують (п. 3.9) протягом 20 хв з прискоренням 1200-1400 g при температурі 4 град. С. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п.3.12).
Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові 7-10 донорів. Отриману стандартну плазму розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.12), заморозити та зберігати протягом 5-7 днів при температурі мінус 20 град. С.
Безпосередньо перед виконанням вимірювань плазму крові розморожують у бані водяній лабораторній (п. 3.3) при 37 град. С. Після відтаювання плазма повинна бути прозорою.
Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з клінічної лабораторної діагностики.
8.4. Приготування плазми крові, що досліджується.
Кров хворого з невідомим вмістом фактору VIII стабілізують розчином натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) у співвідношенні 1:9 і центрифугують у тих же умовах, що і стандартну плазму.
При необхідності плазму розфасовують по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.10), зберігають при температурі -20 град. С.
8.5. Одержання субстратної плазми крові хворих на гемофілію.
Субстратну плазму отримують з крові хворих тяжкою формою гемофілії А, у якій вміст фактору VIII варіює у межах 1-3%. При підборі субстратної плазми показником її якості є дані часу зсідання, що отримані у тих же умовах досліду, які застосовуються для визначення вмісту фактора VIII, за виключенням того, що розведену стандартну плазму замінюють рівною кількістю (0,1 мл) барбіталового буферу (п. 8.2.1). Час зсідання плазми крові хворого на гемофілію у межах 120-135 с вказує на придатність її для використання як субстратну плазму крові.
Кров хворого стабілізують 2% розчином натрію гідроцитрату (п. 8.2.3) у розведенні (1:4). Центрифугують (п. 3.9) при температурі 4 град. С протягом 20 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.10) і повторно центрифугують при тих же умовах для повного видалення клітин крові. Потім дозатором лабораторним (п. 3.4) плазму розфасовують по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.10), зберігають при температурі -20 град. С.
Субстрат-плазма є придатною для визначення вмісту фактору VIII при зберіганні протягом 2-3 місяців.
9. ХІД ВИЗНАЧЕННЯ
9.1. Розчини кальцію хлористого (п. 8.2.5) поміщають у баню водяну лабораторну і залишають на весь час роботи при температурі 37 град. С.
9.2. Стандартну (п. 8.3), досліджувану (п. 8.4), субстратну (п. 8.5) плазму крові та каолін-еритрофосфатидну суміш (п. 8.2.6) зберігають під час досліду у бані водяній крижаній.
9.3. Перевірка активності каолін-еритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6).
Кожного дня перед початком титрування фактора VIII необхідно перевіряти відповідність реагента - каолін-еритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6) вимогам методу. Для цього визначають час зсідання стандартної плазми у розведенні 1:9.
9.3.1. В пробірку мірну лабораторну (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,1 мл каолін-еритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6); 0,1 мл субстратної плазми (п. 8.5) і 0,1 мл розведеної в 10 разів стандартної донорської плазми (п. 8.3) перемішують і інкубують протягом шести хв (час, достатній для повної активації факторів контакту) при температурі 37 град. С на бані водяній лабораторній (п. 3.3).
9.3.2. Через 6 хв додають 0,1 мл 0,033 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і включають секундомір (п. 3.7). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 с нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку, який є критерієм закінчення реакції.
За умовами, прийнятими для даної модифікації методу, час зсідання стандартної плазми крові в розведенні (1:9) повинен бути постійним і дорівнювати 65 с, що досягається за рахунок зміни концентрації еритрофосфатиду (змінюючи його вміст у суміші з каоліном, у межах 0,2-0,075 мг/мл).
При визначенні стандартної точки (65 с) є необхідним співпадання значень двох паралельних проб.
9.4. Визначення вмісту фактору VIII в плазмі крові хворого.
В пробірку мірну лабораторну (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,1 мл каолін-еритрофосфатидної суміші (п.8.2.6), 0,1 мл субстратної плазми крові (п. 8.5), і 0,1 мл розведеної в 10 разів плазми крові, що досліджується (п. 8.4) перемішують і інкубують протягом 6 хв (час, достатній для повної активації факторів контакту) при температурі 37 град. С на бані водяній лабораторній (п. 3.3).
Через 6 хв додають 0,1 мл 0,033 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і одночасно включають секундомір (п. 3.7). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку, який є критерієм закінчення реакції.
Визначають вміст фактору VIII в плазмі крові за градуювальним графіком або за даними таблиці 2.
9.5. Побудова градуювального графіка.
Градуювальний графік будують на білогарифмічному папері (п. 3.25), використовуючи розведення стандартної донорської плазми крові барбіталовим буфером у співвідношенні 1:9, 1:19, 1:39, 1:79, 1:159, 1:319 (тобто в 10, 20, 40, 80, 160, 320 разів). Кожне наступне розведення готують із попереднього безпосередньо перед використанням. При правильному визначенні отримані експериментальні значення для кожного розведення стандартної плазми накладаються на теоретично розраховану пряму (відхилення у межах 0-3,8%).
Коагуляційну активність розведеної у співвідношенні (1:9) стандартної донорської плазми крові приймають за 100%. Концентрація фактору у наступних розведеннях відповідає 50; 25; 12,5; 6,25 та 3,125%.
При побудові градуювального графіка до 0,1 мл кожного розведення стандартної донорської плазми крові (референтної плазми крові) дозатором лабораторним (п. 3.4) додають 0,1 мл субстратної плазми (п. 8.5) і поміщають у баню водяну лабораторну при температурі 37 град. С.
До суміші плазм дозатором лабораторним (п. 3.4) додають 0,1 мл каолін-еритрофосфатидної суміші та інкубують протягом 6 хв при температурі 37 град. С.
Через 6 хв додають 0,1 мл 0,033 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і одночасно включають секундомір (п. 3.7). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку.
Використовуючи отримані дані будують градуювальний графік: на вертикальній осі відкладають час згортання зразків, що досліджувались, а на горизонтальній осі - процент активності фактору VIII ( за 100 приймають активність фактору VIII в стандартній донорській плазмі, яка розведена в 10 разів).
Розрахунок концентрації фактору VIII можна вести за таблицею, яка складена на основі даних, що отримуються при титруванні різних розведень стандартної донорської плазми крові з відомим вмістом фактору VIII.
Екстраполюючи дані часу зсідання з інтервалом в 1 секунду на пряму, що отримана на подвійній логарифмічній шкалі, визначають відповідні їм концентрації фактора VIII у процентах, що представлені у табл. 2.
-------------------------------------------------------------
| Час | Вміст | Час | Вміст | Час | Вміст |
|зсідання, |фактора |зсідання, |фактора |зсідання, |фактора |
| c | VIII,% | c | VIII,% | c | VIII,% |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 55 | 255 | 83 | 27 | 111 | 3,9 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 56 | 235 | 84 | 25 | 112 | 3,67 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 57 | 215 | 85 | 23 | 113 | 3,47 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 58 | 200 | 86 | 22 | 114 | 3,28 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 59 | 177 | 87 | 21 | 115 | 3,11 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 60 | 160 | 88 | 19 | 116 | 2,94 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 61 | 146 | 89 | 17,5 | 117 | 2,8 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 62 | 136 | 90 | 16 | 118 | 2,64 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 63 | 124 | 91 | 15 | 119 | 2,5 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 64 | 115 | 92 | 14 | 120 | 2,38 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 65 | 100 | 93 | 12,5 | 121 | 2,25 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 66 | 96 | 94 | 11,5 | 122 | 2,14 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 67 | 90 | 95 | 10,5 | 123 | 2,04 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 68 | 81 | 96 | 10 | 124 | 1,98 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 69 | 74 | 97 | 9 | 125 | 1,84 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 70 | 68 | 98 | 8,25 | 126 | 1,75 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 71 | 64 | 99 | 7,75 | 127 | 1,66 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 72 | 59 | 100 | 7,5 | 128 | 1,58 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 73 | 55 | 101 | 6,75 | 129 | 1,5 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 74 | 52 | 102 | 6,5 | 130 | 1,44 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 75 | 50 | 103 | 6,25 | 131 | 1,37 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 76 | 46 | 104 | 5,86 | 132 | 1,3 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 77 | 42 | 105 | 5,5 | 133 | 1,24 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 78 | 38 | 106 | 5,2 | 134 | 1,19 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 79 | 35 | 107 | 4,9 | 135 | 1,13 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 80 | 33 | 108 | 4,62 | 136 | 1,08 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 81 | 30 | 109 | 4,35 | 137 | 1,03 |
|----------+--------+----------+--------+----------+--------|
| 82 | 29 | 110 | 4,1 | 138 | 1,0 |
-------------------------------------------------------------
Вміст АГГ у плазмі можна розрахувати не тільки в процентах, а і в одиницях активності за наступною формулою:
вміст фактора VIII в % х Об'єм плазми, що
досліджується
Вміст фактора = -------------------------------------------------
активності 100
За 1 одиницю активності АГГ приймають кількість фактора VIII у плазмі 100% активності. Нормальні величини складають 50-200%, в середньому - 100%.
10. ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ
10.1. За результат вимірювання приймають середнє значення
(х , с) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за
ср
формулою: х = (х + х )/2,
ср 1 2
де х , х - значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.
1 2
10.2. Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 N 1:
- форма 237/о - "Аналіз крові (показники системи згортання)";
- форма 238/о - "Аналіз крові (показники системи згортання - скорочений варіант)";
- форма 250/о - "Журнал реєстрації аналізів і їх результатів";
- форма 262/о - "Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії".
11. КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ
11.1. Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.
11.2. Вимірювання вмісту фактору VIII в плазмі крові проводять відповідно до розділу 9.
11.3. Отримані дані заносять у таблицю 3.
Таблиця 3
------------------------------------------------------------------
| N | Х | Х | Х - Х |( Х - Х ) в степені 2|
| | 1 | 2 | 1 2 | 1 2 |
|---+---------+---------+----------------+-----------------------|
------------------------------------------------------------------
11.4. За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п. 10.1), середньоквадратичне відхилення (дельта) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.
11.5. Будують контрольну карту кумулятивних сум.
11.6. Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2дельта) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.
11.7. Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п. 11.6, то виміри необхідно повторити.
11.8. Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювання необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.
12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ
------------------------------------------------------------------
| Документ | Найменування | N пункту |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 7328-82Е |Меры массы общего назначения и| 8.2.1; |
| |образцовые. | 8.2.2; |
| |Технические условия | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.6 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 24104-88Е |Весы лабораторные общего | 8.2.1; |
| |назначения и образцовые. | 8.2.2; |
| |Общие технические условия | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.2.6 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-1-2850-80 |Баня водяна лабораторна | 9.1; 9.2;|
| | | 9.3; 9.4;|
| | | 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 28311-89 |Дозаторы медицинские | 8.2.6; |
| |лабораторные | 8.3; 8.4;|
| | | 9.1; 9.2;|
| | | 9.3; 9.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 5-375-4215-77 |Центрифуга ЦЛР-1 | 8.3; 8.4;|
| | | 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-05.2147-78 |Іономір універсальний ЕВ-74 | 8.2.1; |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 13646-68 |Термометры стеклянные ртутные | 9.1; 9.2;|
| |для точных измерений | 9.3; 9.4;|
| | | 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-1819.0021-90 |Секундомір механічний "Слава" | 9.1; 9.2;|
| |с ДСПР 1-2-000. Технічні умови| 9.3; 9.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-2-407-89 |Банки и флаконы с притертой | 8.2.1; |
| |пробкой | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 208 УССР 273-84 |Пробірки поліетиленові | 8.2.6; |
| | | 8.3; 8.4;|
| | | 8.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 1770-74 |Посуда мерная лабораторная | 8.2.1; |
| |стеклянная. Цилиндры, | 8.2.2; |
| |мензурки, колбы, пробирки. | 8.2.3; |
| |Технические условия | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 9.1; 9.2;|
| | | 9.3; 9.4;|
| | | 9.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 6709-79 |Вода дистильована. | 8.2.1; |
| |Технічні умови | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4161-77 |Кальцій хлористий | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГФХ, с. 140 |Каолін | 8.2.6 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Р N 82/848/8 |Еритрофосфатид | 8.2.6 |
|(Мінськ, Білорусь) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
| |Кислота диетилбарбітурова | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 6-09-2082-78 |Натрій 5,5'- | 8.2.1 |
| |диетилбарбітуровокислий | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4233-77 |Натрій хлористий | 8.2.1; |
| | | 8.2.2; |
|----------------------+------------------------------+----------|