Інші ефективні концентрації, наприклад, ЕК або ЕК , також 10 20можуть оцінюватися, хоча бажано використовувати параметризаціюмоделі іншу, ніж ту, що застосовується для оцінки ЕК .
50
2.2. ЗВІТ ПРО ТЕСТУВАННЯ
Звіт про тестування має включати таку інформацію:
2.2.1. Тестова речовина:
- фізична природа та відповідні фізико-хімічні властивості,
- дані щодо хімічної ідентифікації, включаючи ступіньчистоти.
2.2.2. Тестові види:
- клон (незалежно від того, чи був він генетичнотипізований), постачальник або джерело (якщо відомо), а такожумови культивування, що застосовувалися. Якщо використовувавсяінший вид Daphnia magna, це має бути вказано в звіті таобґрунтовано.
2.2.3. Умови тестування:
- застосований порядок тестування (наприклад, унапівстатичному або проточному режимі, об'єм, наповнення укількості дафній на літр),
- світловий день та інтенсивність освітлення,
- план проведення тестування (наприклад, кількістьекземплярів, кількість материнських особин на один екземпляр),
- відомості про використовуване для культивування середовище,
- якщо такі застосовувалися, добавки з органічного матеріалу,включаючи склад, джерело, метод приготування, КОВ/ХПК базовихрозчинів, оцінка остаточних показників КОВ/ХПК в тестовомусередовищі,
- детальна інформація про корм, включаючи розмір (у мгС/Daphnia/день) та режим (наприклад, тип корму, включаючи особливіназви (види) водоростей та, якщо відомо, штам, умови розведення),
- метод приготування базових розчинів і частота поновлення(розчинник або дисперсант, при цьому має вказуватися йогоконцентрація).
2.2.4. Результати:
- результати будь-яких попередніх досліджень щодо стійкостітестової речовини,
- номінальні тестові концентрації та результати всіх аналізівна визначення концентрації тестової речовини у ємностях длятестування (див. приклад протоколу результатів у Додатку 4); такожмають бути вказані відновна ефективність методу та межівизначення,
- якість води у межах ємностей для тестування (наприклад,рівень рН, температура та концентрація розчиненого кисню, КОВі/або ХПК та жорсткість, за необхідності) (див. приклад протоколурезультатів у Додатку 3),
- повна реєстрація живого потомства від кожної материнськоїособини (див. приклад протоколу результатів у Додатку 3),
- кількість померлих тварин серед материнських особин та дні,коли це траплялось (див. приклад протоколу результатів уДодатку 3),
- коефіцієнт варіації для контрольної плодовитості (щоґрунтується на загальній кількості живого потомства на одну живуматеринську особину по закінченню тестування),
- графік залежності загальної кількості живого потомства наодну живу материнську особину (для кожного повтору) по закінченнютестування від концентрації тестової речовини,
- найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК) длярозмноження, включаючи опис використовуваних статистичних методівта вказівку ефекту, розмір якого може бути визначено, а такожКонцентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ) урозмноженні; за можливості також вказується НСЕК/КНВЕ длясмертності материнських особин,
- за можливості, ЕК для розмноження та довірчі інтервали, а xтакож графік відповідної моделі, використаної для її розрахунку,нахил кривої залежності від дози та стандартна похибка,
- інші біологічні ефекти або виміри: у звіт вносятьсябудь-які інші біологічні ефекти, які спостерігалися або буливиміряні (наприклад, зростання дорослих особин), включаючибудь-яке відповідне обґрунтування,
- пояснення будь-яких відхилень від Методу тестування.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop onthe Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK,20-21 March 1993.
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Serieson Testing and Assessment No 6. Report of the Final Ring Test ofthe Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
(3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. andCalow P. (1991) A comparative study of genotype sensitivity toacute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss.Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, p. 257-265.
(4) Elendt B.P., (1990) Selenium deficiency in Crustacea; Anultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magnaStraus. Protoplasma, 154, p. 25-33.
(5) EPA (1993) Methods for Measuring the Acute Toxicity ofEffluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms.(Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C.I.Weber (ed), USEPA,Cincinnati, Ohio.
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially availablespring waters as standard medium for culturing Daphnia magna.Bull. Environ. Contam. Toxicol., 47, p. 775-782.
(7) ASTM (1988) Standard Guide for Conducting Acute ToxicityTests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a.American Society for Testing and Materials, Philadelphia P.A.p. 20.
(8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J.,Bradley M. C. and Calow P., (1989) The long term maintenance ofDaphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problemsand prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference onEcotoxicology. Copenhagen 1988 (H.Lokke, H.Tyle & F.Bro-Rasmussen.Eds.) p. 144-148.
(9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P., (1981)Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna.Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, p. 1-8.
(10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P., (1990) The sensitivity oftwo cladocerans to water quality variables: salinity and hardness.Arch. Hydrobiol., 120(2), p. 185-196.
(11) Korshikov (1990) Pseudokirchneriella subcapitata Hindak,F-1990. Biologice Prace, 36, p. 209.
(12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D., (1993) Toward astandard Daphnia juvenile production test. EnvironmentalToxicology and Chemistry, 12, p. 2053-2058.
(13) Sims I., (1993) Measuring the growth of phytoplankton:the relationship between total organic carbon with three commonlyused parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459-466.
(14) Dunnett C.W., (1955) A multiple comparisons procedurefor comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist.Assoc., 50, p. 1096-1121.
(15) Dunnett C.W., (1964) New tables for multiple comparisonswith a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
(16) Williams D.A., (1971) A test for differences betweentreatment means when several dose levels are compared with a zerodose control. Biometrics 27, p. 103-117.
(17) Williams D.A., (1972) The comparison of several doselevels with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510-531.
(18) Draper N.R. and Smith H., (1981) Applied RegressionAnalysis, second edition, Wiley, N.Y.
(19) Brain P. and Cousens R., (1989) An equation to describedose responses where there is stimulation of growth at low doses.Weed Research, 29, p. 93-96.
(20) Wilson E.O. and Bossert, W.H., (1971) A Primer ofPopulation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
(21) Poole R.W., (1974) An Introduction to quantitativeEcology. Mc Graw Hill Series in Population Biology, New York,p. 532.
(22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and BoyceM.S., (1986) Estimating uncertainty in population growth rates:Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, p. 1156-1166.
Додаток 1
ПРИГОТУВАННЯ ПОВНІСТЮ
СПЕЦИФІКОВАНИХ СЕРЕДОВИЩ ЕЛЕНДТ М7 ТА М4
Адаптація до середовищ Елендт М7 та М4
Деякі лабораторії мали труднощі з прямим перенесенням дафнійу середовища М4 (I) та М7. Проте було досягнуто певних успіхів зпоетапною адаптацією, тобто перенесенням з власного середовища до30% Елендту, потім до 60% Елендту і, нарешті, до 100% Елендту.Адаптація може потребувати періоду тривалістю до одного місяця.
ПРИГОТУВАННЯ
Домішкові елементи
Окремі базові розчини (I) індивідуальних домішкових елементівспочатку готуються у воді відповідної чистоти, наприклад,деіонізованій, дистильованій або очищеній методом зворотногоосмосу. З цих різних базових розчинів (I) готується другий єдинийбазовий розчин (II), що містить всі домішкові елементи(комбінований розчин), а саме:
----------------------------------------------------------------------
| Базовий розчин I | Кількість, | Концентрація | Для |
| (єдина речовина) | додана до води, | (відносно | приготування|
| | мг/л | середовища М4), |комбінованого|
| | | кратність | базового |
| | | | розчину II |
| | | | додати |
| | | | наступну |
| | | | кількість |
| | | | базового |
| | | | розчину I |
| | | | у воду, |
| | | | мл/л |
| | | | М 4 М 7 |
|------------------+-----------------+-----------------+-------------|
|H BO | 57 190 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
| 3 3 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|MnCl · 4 H O | 7 210 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
| 2 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|LiCl | 6 120 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|RbCl | 1 420 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|SrCl · 6 H O | 3 040 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
| 2 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|NaBr | 320 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Na MoO · 2 H O | 1 260 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
| 2 4 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|CuCl · 2 H O | 335 | 20 000 | 1,0 | 0,25 |
| 2 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|ZnCl | 260 | 20 000 | 1,0 | 1,0 |
| 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|CoCl · 6 H O | 200 | 20 000 | 1,0 | 1,0 |
| 2 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Kl | 65 | 20 000 | 1,0 | 1,0 |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Na SeO | 43,8 | 20 000 | 1,0 | 1,0 |
| 2 3 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|NH VO | 11,5 | 20 000 | 1,0 | 1,0 |
| 4 3 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|Na EDTA · 2 H O | 5 000 | 2 000 | - | - |
| 2 2 | | | | |
|------------------+-----------------+-----------------+------+------|
|FeSO · 7 H O | 1 991 | 2 000 | - | - |
| 4 2 | | | | |
|--------------------------------------------------------------------|
|Розчин Na EDTA та розчин FeSO готуються окремо, виливаються разом і|
| 2 4 |
|негайно піддаються обробці в автоклаві. Це дає: |
|--------------------------------------------------------------------|
|21 Fe-EDTA розчин | | 1 000-кратний | 20,0 | 5,0 |
----------------------------------------------------------------------
Середовища М4 та М7
Середовища М4 та М7 готуються на основі вихідного розчину II,із наступним вмістом макронутрієнтів та вітамінів:
----------------------------------------------------------------------------
| | Кількість, що | Концентрація при | Кількість |
| | додається у воду | згортанні | вихідного |
| | мг/л | (відноситься до | розчину, що |
| | | середовища М4) |використовується |
| | | |для приготування |
| | | | середовища |
| | | | мл/л |
| | | | |
| | | | М4 М7 |
|------------------+------------------+------------------+-----------------|
|Вихідний розчин II| |20 |50 |50 |
|комбінованих | | | | |
|мікроелементів | | | | |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Вихідні розчини макронутрієнтів (окрема речовина) |
|--------------------------------------------------------------------------|
|CaCl · 2 O29380 | 293 800 |1000 |1,0 |1,0 |
| 2 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|MgSO · 7 H O | 246 600 |2 000 |0,5 |0,5 |
| 4 2 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|KCl | 58 00010 |10 000 |0,1 |0,1 |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|NaHCO | 64 800 |1 000 |1,0 |1,0 |
| 3 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Na SiO · 9 H O | 00 0050 |5 000 |0,2 |0,2 |
| 2 3 2 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|NaNO | 2 740 |10 000 |0,1 |0,1 |
| 3 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|KH PO | 1 430 |1 000 |0,1 |0,1 |
| 2 4 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|K HPO | 1 840 |1 000 |0,1 |0,1 |
| 2 4 | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Реакційна маса | - |10 000 |0,1 |0,1 |
|комбінованих | | | | |
|вітамінів | | | | |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Вихідний розчин комбінованих вітамінів готується за допомогою додавання |
|3 вітамінів на 1 літр як показано нижче: |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Тіаміну |750 |10 000 |- |- |
|гідрохлорид | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Цианокобаламін |10 |10 000 |- |- |
|(B12) | | | | |
|------------------+------------------+------------------+--------+--------|
|Біотин |7,5 |10 000 |- |- |
|--------------------------------------------------------------------------|
|Реакційна маса комбінованих вітамінів зберігається в замороженому вигляді |
|у формі маленьких аліквотних проб. Вітаміни додаються до середовища |
|незадовго до його використання. |
|Примітка 1: Щоб уникнути випадання солей в осад під час приготування |
|кінцевого середовища, слід додати аліквотні проби вихідних розчинів до |
|приблизно 500-800 мл деонізованної води, а потім довести до 1 літра. |
|Примітка 2: Перший друкований опис середовища М4 можна знайти у |
|Б.П.Елендта (1990 р.) Нестача селену у ракоподібних; ультраструктурний |
|підхід до антенального порушення у Daphnia magna Straus. Протоплазма, 154,|
|ст. 25-33. |
----------------------------------------------------------------------------
Додаток 2
АНАЛІЗ ЗАГАЛЬНОГО ОРГАНІЧНОГО ВУГЛИЦЮ (ЗОВ)
ТА СТВОРЕННЯ НОМОГРАМИ ВМІСТУ ЗОВ
У ВОДОРОСТЕВІЙ ПІДКОРМЦІ
Загальновизнаним є той факт, що зазвичай вміст вуглецю уводоростевій підкормці не можливо виміряти прямо із співвідношень(тобто номограм) із сурогатними вимірами, такими як кількістьклітин у водоростях або їхня здатність поглинати світло.
ЗОВ правильніше вимірювати через окиснення при високихтемпературах, ніж через ультрафіолетове випромінювання абоперсульфатні методи. (Див. Ефективне визначення загальногоорганічного вуглецю, загальної потреби кисню та схожих складових1979 р., HMSO 1980 р.; 49 Хай Холборн, Лондон WC1V 6HB).
Для створення номограми, водорості слід відділити відживильного середовища за допомогою центрифугування з послідуючимповторним підвішуванням у дистильованій воді. Виміряйте сурогатнийкоефіцієнт та концентрацію ЗОВ в трьох екземплярах кожного зразку.Слід проаналізувати чисті зразки дистильованої води таконцентрацію ЗОВ, відраховану від концентрації ЗОВ зразківводоростей.
Номограма має бути лінією, що проходить через потрібнуобласть концентрацій вуглецю. Нижче наведені приклади номограм.
Примітка: Ці приклади не слід використовувати дляперерахувань; важливим є те, щоб лабораторії готували свої власніномограми.
Додаток 3
ЗРАЗОК ЛИСТА ДАНИХ ДЛЯ РЕЄСТРАЦІЇ
ВІДНОВЛЕННЯ СЕРЕДОВИЩА, ФІЗИЧНИХ/ХІМІЧНИХ ПОТОЧНИХ
ДАНИХ, ПІДКОРМКИ, РЕПРОДУКЦІЇ DAPHNIA
ТА СМЕРТНОСТІ СЕРЕД ДОРОСЛИХ ОСОБИН
N Дата Копія: Середовище: Тип Тестова Номінальна
експерименту: початку: харчування: речовина: концентрація:
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
|День | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10| 11| 12| 13| 14| 15| 16| 17| 18| 19| 20| 21| | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Відновлення | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|середовища | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|(відмітити) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|PH(1) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |новий | |
| |---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |старий | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|O мг/л(1) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |новий | |
| 2 |---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |старий | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Температура | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |новий | |
|(град.C)(1) |---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |старий | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Передбачене | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|харчування | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|(відмітити) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Кількість | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Загалом |
|живих | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|нащадків(2) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Посудина 1 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|2 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|4 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|5 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|6 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|7 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|8 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|9 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|10 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Загалом | |
|-----------------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---------+---------|
|Сукупна | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|смертність | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|серед дорослих | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|особин(3) | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------|
|(1) Вкажіть, яка посудина використовувалась для експерименту. |
|(2) Відмічайте смерть будь-якого дорослого живого організму літерою "С" у відповідній клітинці. |
|(3) Відмічайте втрачене потомство літерами "ВП" у відповідній клітинці. |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Додаток 4
ЗРАЗОК ЛИСТА ДАНИХ ДЛЯ РЕЄСТРАЦІЇ
РЕЗУЛЬТАТІВ ХІМІЧНОГО АНАЛІЗУ
(а) Виміряні концентрації
------------------------------------------------------------------
| Номінальна | Зразок тижня 1 | Зразок тижня 2 | Зразок тижня 3 |
|концентрація:|----------------+----------------+----------------|
| | Свіжий | Старий| Свіжий | Старий| Свіжий | Старий|
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
------------------------------------------------------------------
(b) Виміряні концентрації у процентному співвідношенні дономінальної
------------------------------------------------------------------
| Номінальна | Зразок тижня 1 | Зразок тижня 2 | Зразок тижня 3 |
|концентрація:|----------------+----------------+----------------|
| | Свіжий | Старий| Свіжий | Старий| Свіжий | Старий|
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
|-------------+--------+-------+--------+-------+--------+-------|
| | | | | | | |
------------------------------------------------------------------
Додаток 5
РОЗРАХУНОК СЕРЕДНЬОЇ ХРОНОЛОГІЧНОЇ ВЕЛИЧИНИ
Середня хронологічна величина
Відомо, що протягом часу між відновленням середовищаконцентрація пробної речовини може знижуватися, тому необхідновизначити, яку концентрацію обрати в якості зразка із рядуконцентрацій, в яких перебувала материнська Daphnia. Вибір маєзасновуватися як на біологічних, так і на статистичних засадах.Наприклад, якщо вважається, що на репродукцію більш впливаємаксимальна концентрація, тоді слід використовувати максимальнуконцентрацію. Хоча, якщо важливішим вважається сумарний чи більшдовгостроковий ефект токсичної речовини, тоді доречнішою будесередня концентрація. У цьому випадку, підходящим для використаннясереднім значенням буде середня хронологічна величинаконцентрації, так як вона враховує коливання у поточнійконцентрації протягом певного часу.
Малюнок 1: Зразок середньої хронологічної величини
Малюнок 1 показує зразок (спрощеного) випробування тривалістюв сім днів з відновленням середовища на 0, 2 та 4 днях.
Тонка зигзагоподібна лінія відображає концентрацію вбудь-який момент часу. Припускається, що зниження концентраціїслідує за процесом експоненціального розпаду.
Шість точок на графіку відображають концентрації, щоспостерігаються при вимірюванні на початку та в кінці кожногоперіоду відновлення.
Товста суцільна лінія вказує на положення середньоїхронологічної величини.
Середня хронологічна величина розраховується так, щоб площапід середньою хронологічною величиною дорівнювала площі під кривоюконцентрації. Розрахунки для вищенаведеного зразку проілюстрованіу Таблиці 1.
Таблиця 1:
розрахунки середньої хронологічної величини
-------------------------------------------------------------------------------------------------
|Відновлення| Дні |Концентрація 0|Концентрація 1|Ln (Концентрація 0)|Ln (Концентрація 1)| Площа|
| N |(days)| (Conc 0) | (Conc 1) | | |(Area)|
|-----------+------+--------------+--------------+-------------------+-------------------+------|
| 1 | 2 | 10,000 | 4,493 | 2,303 | 1,503 |13,767|
|-----------+------+--------------+--------------+-------------------+-------------------+------|
| 2 | 2 | 11,000 | 6,037 | 2,398 | 1,798 |16,544|
|-----------+------+--------------+--------------+-------------------+-------------------+------|
| 3 | 3 | 10,000 | 4,066 | 2,303 | 1,403 |19,781|
|--------------------------------------------------------------------+-------------------+------|
|Загальна кількість днів: 7 |Загальна площа |50,091|
| |-------------------+------|
| |Середня |7,156 |
| |хронологічна | |
| |величина | |
-------------------------------------------------------------------------------------------------
Days - кількість днів у періоді відновлення.
Conc 0 - концентрація, виміряна на початку кожного періодувідновлення.
Conc 1 - концентрація, виміряна в кінці кожного періодувідновлення.
Ln (Conc 0) - натуральний логарифм від Концентрації 0.
Ln (Conc 1) - натуральний логарифм від Концентрації 1.
Area - площа під експоненціальною кривою для кожного періодувідновлення. Вона вираховується за формулою:
Conc 0 - Conc 1
Area = ------------------------- x Days
Ln (Conc 0) - Ln (Conc 1)
Середня хронологічна величина дорівнює загальній площірозділеній назагальну кількість днів.
Звичайно, для дослідження з визначення репродуктивностіDaphnia таблицю слід розширити до 21 дня.
Зрозуміло, що коли спостереження робляться тільки на початкута в кінці кожного періоду відновлення, то неможливо підтвердити,що процес розпаду, фактично, є експоненціальним. Інша кривапризведе до інших розрахунків Площі. Хоча процес експоненціальногорозпаду не є неможливим та, вірогідно, за відсутності іншоїінформації ця крива є найбільш придатною для використання.
Хоча, якщо в процесі хімічного аналізу не було знайденожодної речовини в кінці періоду відновлення, слід провестиконтрольне випробування. Поки не вдасться визначити, як швидкоречовина зникає із рідини, неможливо буде отримати реалістичнуплощу під кривою, а отже, і прийнятну середню хронологічнувеличину.
C.21. ҐРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ
ТРАНСФОРМАЦІЇ АЗОТУ
1. МЕТОД
Метод цього дослідження повторює метод OECD TG 216 (2000).
1.1. ВСТУП
Цей метод дослідження описує лабораторний метод, створенийдля дослідження довгострокових впливів хімікатів, за умови їходноразової дії, на активність трансформації азоту ґрунтовимимікроорганізмами. Дослідження, головним чином, засноване нарекомендаціях Європейської та Середземноморської організації іззахисту рослин (1). Хоча, інші інструкції, що включаютьрекомендації Німецького біологічного федерального відомства (2),Управління охорони навколишнього середовища США (3), Товаристватоксикології та хімії навколишнього середовища (4) та Міжнародноїорганізації із стандартизації (5), теж слід брати до уваги. Насемінарі Організації економічного співробітництва та розвитку(OECD) з питань відбору ґрунтів/мулів, який проходив уБельджирате, Італія в 1995 р. (6), була погоджена кількість та типґрунтів, які можна застосовувати у цьому випробуванні.Рекомендації стосовно збору, обробки та зберігання зразків ґрунтівзасновуються на Інструктивному документі МОС (7) та рекомендаціяхсемінару в Бельджирате. При встановленні та оцінці токсичниххарактеристик пробних речовин може вимагатись визначення їхвпливів на мікробну активність в ґрунтах, наприклад, коли потрібнідані про можливі побічні дії пестицидів на мікрофлору ґрунтів, абоколи очікується, що ґрунтові мікроорганізми можуть зазнати впливуне пестицидів, а інших хімікатів. Дослідження трансформації азотупроводиться з метою визначення впливів таких хімікатів намікрофлору ґрунтів. При дослідженнях агрохімікатів (наприклад,пестицидів, добрив, лісохімічних продуктів) проводятьсядослідження як трансформації азоту, так і трансформації вуглецю.При випробуванні не агрохімікатів достатньо буде лише дослідженнятрансформації азоту. Хоча, якщо при проведенні дослідженнятрансформації азоту для таких хімікатів значення EK потрапляє у
50
діапазон значень для інгібіторів нітрифікації, які випускаються
серійно, (наприклад, нітрапірін), то можна провести дослідження
трансформації вуглецю з метою збору додаткової інформації.
Ґрунти складаються із живих та неживих компонентів, якііснують у складних та неоднорідних сумішах. Мікроорганізмивідіграють важливу роль у розпаді та трансформації органічногосубстрату в родючих ґрунтах, в яких багато видів мікроорганізміввпливають на різні аспекти родючості ґрунтів. Будь-якедовгострокове втручання в ці біохімічні процеси може потенційнозавадити кругообігу поживних речовин і це може змінити родючістьґрунту. Трансформація вуглецю та азоту відбувається у всіх родючихґрунтах. Хоча скупчення мікробів, відповідальних за ці процеси,різняться для кожного ґрунту, трансформації проходять по сутіоднаково.
Описуваний метод дослідження створений для того, щобвизначати довгострокові несприятливі впливи речовини на процестрансформації азоту в аеробному верхньому шарі ґрунтів. Методдослідження також дозволяє оцінювати впливи речовин натрансформацію вуглецю мікрофлорою ґрунту. Утворення нітратуявляється результатом розпаду хімічних зв'язків вуглець-азот.Отже, якщо в обробленому та контрольному ґрунтах виявляютьсяоднакові рівні виробництва нітрату, досить вірогідним є той факт,що основні процеси розпаду вуглецю проходять нормально та активно.Поживне середовище для дослідження (мелене люцернове борошно) маєсприятливе співвідношення вуглецю до азоту (зазвичай між 12/1 та16/1). Завдяки цьому, нестача вуглецю зменшується протягомдослідження та, якщо скупчення мікробів будуть ушкодженіхімікатом, то вони зможуть відновитися протягом 100 днів.
Дослідження, із яких був розроблений цей метод дослідження,спочатку були створені для речовин, в яких можна було передбачити,яка їх кількість проникне у ґрунт. Наприклад, як у випадку зпестицидами, для яких встановлена норма використання. Дляагрохімікатів достатнім є дослідження двох доз відповідно доочікуваних чи передбачуваних норм використання. Агрохімікатиможуть випробуватися як активні речовини (а.р.) або як виробленіпродукти. Хоча, дослідження не обмежується лише агрохімікатами.Змінюючи кількість пробної речовини, що застосовується до ґрунту,разом із способом оцінки даних, дослідження можливо такожзастосовувати до хімікатів, в яких не можна передбачити ту їхкількість, що проникне в ґрунт. Таким чином, при роботі зхімікатами, що не є агрохімікатами, визначаються впливи рядуконцентрацій на трансформацію азоту. Дані цих випробуваньвикористовуються для побудови кривої залежності "доза-ефект" тарозрахунку значень EK , деx визначається у % впливу.
x
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Трансформація азоту: це повне розкладання мікроорганізмамиорганічної речовини, що містить азот, яке відбувається черезпроцес амоніфікації та нітрифікації, до відповідного неорганічногокінцевого продукту у вигляді нітрату.
ЕК (ефективна концентрація): це така концентрація пробної xречовини у ґрунті, що дає x процент затримки трансформації азоту внітрат.
ЕК (середнє значення ефективної концентрація): це така 50концентрація пробної речовини у ґрунті, що дає 50 процентів (50%)затримки трансформації азоту в нітрат.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
До просіяного ґрунту додається мелене рослинне борошно, атакож він або обробляється пробною речовиною, або залишається необробленим (контрольний зразок). Якщо випробовуються агрохімікати,рекомендується взяти щонайменше дві пробні концентрації, і їх слідобирати орієнтуючись на найвищу концентрацію, застосування якоїочікується в полі. Після 0, 7, 14 днів та 28 днів інкубації,зразки обробленого та контрольного ґрунтів екстрагуються черездодавання відповідного розчинника, і у витягах визначаютьсякількості нітрату. Рівень утворення нітрату в оброблених зразкахпорівнюється із рівнем в контрольних зразках, і вираховуєтьсяпроцентне відхилення рівня оброблених зразків від рівняконтрольних. Всі дослідження тривають щонайменше 28 днів. Якщо на28-й день різниця між обробленим та необробленими ґрунтамидорівнює або більша за 25%, вимірювання продовжуються протягом ще100 днів. Якщо випробовуються не агрохімікати, ряд концентраційпробної речовини додається до зразків ґрунту, та після 28 днівінкубації вимірюються кількості утвореного в оброблених таконтрольних зразках нітрату. Результати випробувань з декількомаконцентраціями аналізуються за допомогою моделі регресії, тарозраховуються значення EK (тобто EK , EK та/або EK ). Див.
