x 50 25 10
визначення.
1.5. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Оцінка результатів дослідження агрохімікатів засновуються напорівняно незначних різницях (тобто середнє значення +- 25%) міжконцентраціями нітрату в оброблених та контрольних зразкахґрунтів, відповідно великі розходження між контрольними зразкамиможуть вказувати на неправильні результати. Тому, розходження міжповторними пробами контрольних зразків має бути меншим за +- 15%.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Обладнання
Використовуються склянки для дослідження, зроблені з хімічноінертного матеріалу. Вони повинні мати підходящу місткість увідповідності до процедури, що використовується для інкубаціїґрунтів, тобто для загальної інкубації або як ряду окремих зразківґрунту (Див. Розділ 1.7.1.2). Слід подбати про зменшення втративоди та надати можливість газообміну відбуватися під часдослідження (наприклад, можна накрити склянки для дослідженняпористою поліетиленовою плівкою). Коли випробовуються леткіречовини, слід використовувати герметичні та газонепроникнісклянки. Вони повинні мати такий розмір, щоб приблизно одначетверть їх об'єму була заповнена зразком ґрунту.
Використовується стандартне лабораторне обладнання, включаючинаступне:
- змішувальний апарат: механічний змішувач або подібнеобладнання;
- центрифуга (3000 г) або фільтр (з фільтрувальним паперомбез нітрату);
- інструмент з відповідною чутливістю та відтворюваністю дляаналізу нітрату.
1.6.2. Відбір ґрунтів та їх кількість
Використовується один єдиний тип ґрунту. Рекомендованінаступні характеристики ґрунту:
- вміст піску: не менше ніж 50% і не більше ніж 75%,
- водневий показник: 5,5-7,5,
- вміст органічного вуглецю: 0,5-1,5%,
- слід виміряти мікробіальну біомасу (8)(9) і вміст у нійвуглецю має бути не меншим за 1% від загального вмісту органічноговуглецю в ґрунті.
У більшості випадках, ґрунт з такими характеристикамипредставляє найгірший варіант, так як поглинання пробного хімікатує мінімальним, а його доступність для мікрофлори є максимальною.Відтак, дослідження з іншими ґрунтами загалом не потрібні. Хоча, вдеяких випадках може виникнути необхідність використати додатковийґрунт - наприклад, коли очікується значне використання пробноїречовини на певних типах ґрунтів, як то на кислотних ліснихґрунтах, або коли хімікати є електростатично зарядженими.
1.6.3. Збір та зберігання зразків ґрунту
1.6.3.1. Збір
Слід отримати доступ до детальної інформації стосовно історіїмісця, з якого збирається пробний ґрунт. Інформація має включатиточне розташування, рослинний покрив, дати обробок пестицидами,обробки органічними та неорганічними добривами, додаваннябіологічних матеріалів чи випадкові забруднення. Місце, обране длязбору ґрунту, має бути одним з таких, що можуть використовуватисьпротягом тривалого часу. Підходять багаторічні пасовища, поля, якіщорічно засіваються зерновими культурами (крім кукурудзи), абогусто засіяні зелені компостні купи. Обране місце для зборузразків не повинно оброблятися пестицидами щонайменше протягомодного року до збору зразків. Також, не повинно застосовуватисяжодного органічного добрива щонайменше протягом шести останніхмісяців. Відповідно до вимог, використання мінерального добривадопускається лише за умови, що зразки посівів та ґрунту не будутьбратися щонайменше протягом трьох місяці з моменту застосуваннядобрива. Не слід використовувати ґрунт, оброблений добривами звідомими біоцидними ефектами (наприклад, цианомідом кальцію).
Не слід брати зразки під час або відразу після довгихперіодів (більше за 30 днів) посухи чи підтоплення. У випадкуорних ґрунтів зразки збираються з глибини від 0 до 20 см. Увипадку луки (пасовища) або інших ґрунтів, які не орються протягомбільш довгих періодів часу (щонайменше один посівний сезон),максимальна глибина збору зразків може бути дещо більшою за 20 см(напр., до 25 см).
Зразки ґрунту слід транспортувати, використовуючи такісклянки та за таких температурних умов, які б гарантували, щопочаткові якості ґрунту не зазнають значних змін.
1.6.3.2. Зберігання
Бажаним є використання свіжозібраних ґрунтів. Якщо не можливоуникнути зберігання у лабораторії, ґрунти можна зберігати втемряві при температурі в 4 +- 2 град.C максимум протягом трьохмісяців. Під час зберігання ґрунтів потрібно забезпечити аеробніумови. Якщо ґрунти збираються в районах, де вони перебувають взамерзлому стані щонайменше протягом трьох місяців на рік, слідрозглянути можливість їх зберігання при температурі від мінус18 град.C до мінус 22 град.C. Мікробіотична біомаса ґрунту, щозберігається, вимірюється перед початком кожного експерименту, івміст вуглецю в біомасі має бути не меншим за 1% від загальноговмісту органічного вуглецю в ґрунті (Див. Розділ 1.6.2).
1.6.4. Обробка та приготування ґрунту до дослідження
1.6.4.1. Підготовка до інкубації
Якщо ґрунт зберігався (Див. Розділ 1.6.3.2.), рекомендуєтьсяпровести його підготовку до інкубації протягом періоду від двох до28 днів. Температура та вологість ґрунту під час підготовки доінкубації мають бути такими, як і під час дослідження (Див.Розділ 1.6.4.2 та 1.7.1.3).
1.6.4.2. Фізико-хімічні властивості
Ґрунт вручну очищується від великих предметів (напр.,каміння, частин рослин, тощо), потім просіюється із зволоження длязапобігання надмірному пересиханню до розміру часточок менше чирівному 2 мм. Вміст вологи у зразку ґрунту має бути доведений задопомогою дистильованої або деіонізованої води до значення між 40%та 60% максимально можливої здатності утримувати воду.
1.6.4.3. Збагачення органічними речовинами
Ґрунт слід збагатити підходящою органічною речовиною, напр.,меленим зеленим люцерновим борошном (основна складова: Medicagosativa), із співвідношенням C/N між 12/1 та 16/1. Рекомендованеспіввідношення люцерна-ґрунт - 5 г люцерни на кілограм ґрунту(сухої ваги).
1.6.5. Приготування пробної речовини для застосування наґрунті
Зазвичай пробну речовину застосовують, використовуючисередовище-носій. Цим середовищем може бути вода (дляводорозчинних речовин) або інертна тверда речовина як, наприклад,сухий кварцовий пісок (розмір часточки: 0,1-0,5 мм). Не слідвикористовувати інші рідинні середовища-носії, окрім води (напр.,органічні розчинники такі як ацетон, хлороформ), адже вони можутьзашкодити мікрофлорі. Якщо в якості середовища-носіявикористовується пісок, то його можна наситити пробною речовиною,розчиненою або підвішеною у відповідному розчиннику. В такихвипадках розчинник слід видалити за допомогою випаровування передзмішування із ґрунтом. Для оптимального розповсюдження пробноїречовини у ґрунті рекомендується дотримуватися співвідношення 10 гпіску на кілограм ґрунту (сухої ваги). Контрольні зразкиобробляються лише відповідною кількістю води та/або кварцовогопіску.
При випробуванні летких хімікатів слід, на скільки цеможливо, під час обробки ґрунту уникати втрат речовини та сліднамагатися забезпечити однорідне розповсюдження речовини в ґрунті(напр., пробну речовину слід ввести в ґрунт в декількох місцях).
1.6.6. Пробні концентрації
При випробуванні агрохімікатів слід використовувати хоча бдві концентрації. Найнижча концентрація має відображати щонайменшемаксимальну кількість, яка може потрапити до ґрунту за звичайнихумов, тоді як найвища концентрація має бути подвоєною найнижчоюконцентрацією. Концентрації пробних речовин, які додаються доґрунту, розраховуються з припущенням, що проникнення на глибину в5 см відбуватиметься рівномірно, а розрахункова густина ґрунтудорівнює 1,5. Для агрохімікатів, які застосовуються безпосередньодо ґрунту, або для хімікатів, для яких кількість, що досягнеґрунту, можливо передбачити, рекомендуються максимальніконцентрації Прогнозованої концентрації в навколишньому середовищі(ПКНС) та в п'ять разів більша концентрація. Речовини, якіпланується застосовувати до ґрунтів декілька разів на сезон, слідвипробовувати при концентраціях, отриманих шляхом множення ПКНС намаксимально очікувану кількість застосувань речовини. Хоча,найвища пробна концентрація не повинна перевищувати максимальнуодноразову концентрацію більше ніж у 10 разів. Якщо випробовуютьсяне агрохімікати, то використовується геометричний ряд щонайменше зп'яти концентрацій. Пробні концентрації повинні включати такийдіапазон, щоб можливо було визначити значення ЕК .
x
1.7. ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.7.1. Умови впливу
1.7.1.1. Обробка і контроль
Якщо випробовуються агрохімікати, то ґрунт розділяється натри рівні порції. Дві порції змішуються з середовищем-носієм, щомістить продукт, а третя порція змішується з середовищем-носіємбез продукту (контрольний зразок). Рекомендується мінімум триповторні проби як для оброблених так і для необроблених ґрунтів.Якщо випробовуються не агрохімікати, то ґрунт розділяється нашість рівних порцій. П'ять зразків перемішуються ізсередовищем-носієм, що містить пробну речовину, а шостий зразокперемішується з середовищем-носієм без хімікату. Рекомендуєтьсятри повторні проби оброблених та контрольних зразків. Слід подбатипро забезпечення однорідного розповсюдження пробної речовини воброблених зразках ґрунту. Під час перемішування слід уникатипресування та злипання ґрунту.
1.7.1.2. Інкубація зразків ґрунту
Інкубація зразків ґрунту може проводитися двома способами:загальна інкубація всіх оброблених і необроблених зразків ґрунтуабо ряд окремих, однакових за розміром оброблених і необробленихчастин зразків ґрунту. Хоча, коли випробовуються леткі речовини,дослідження слід проводити лише з рядом окремих частин зразків.Коли проводиться загальна інкубація ґрунтів, готуються великіоб'єми оброблених та необроблених ґрунтів, та, якщо це потрібно впроцесі дослідження, беруться частини зразків для аналізу.Кількість ґрунту, що спочатку готується для обробки та контролю,залежить від розміру частин зразків, кількості повторних проб, щовикористовуються для аналізу, та передбачувана максимальнакількість відбору зразків. При загальній інкубації, ґрунти слідретельно перемішати перед вибіркою частин зразків. При інкубаціїряду окремих зразків ґрунту, кожен оброблений та необробленийґрунт розділяється на потрібну кількість частин зразків, і вониналежним чином обробляються. В експериментах, в яких кількістьвідбору зразків ґрунту може перевищувати два рази, слідпідготувати достатню кількість частин зразків, щоб вистачило навсі повторні проби та всі рази відбору ґрунту. Слід проводитиінкубацію за аеробних умов щонайменше трьох повторних проб зразківґрунту (Див. Розділ 1.7.1.1). При випробуванні летких хімікатівдослідження слід проводити лише з рядом окремих частин зразків.
1.7.1.3. Умови дослідження та тривалість
Дослідження проводиться в темряві та при кімнатнійтемпературі 20 +- 2 град.C. Під час дослідження вміст вологи взразках ґрунту має підтримуватися на рівні між 40% та 60%максимально можливої здатності ґрунту утримувати воду (Див. Розділ1.6.4.2), з можливою поправкою на +- 5%. У разі потреби можнадодавати дистильовану, деіонізовану воду.
Мінімальна тривалість дослідження 28 днів. Якщовипробовуються агрохімікати, то порівнюються рівні утвореннянітрату в оброблених та контрольних зразках. Якщо вони різнятьсябільше ніж на 25% на 28 день, то дослідження продовжується поки небуде досягнута різниця рівна або менша ніж 25%, або максимальнопротягом 100 днів. Для не агрохімікатів, дослідження закінчуєтьсячерез 28 днів. На 28 день визначається кількість нітрату воброблених та контрольних зразках ґрунту та розраховуютьсязначення ЕК .
x
1.7.2. Відбір проб та аналіз грунтів
1.7.2.1. Розклад відбору проб
Якщо досліджуються агрохімічні речовини, проби ґрунтіваналізують на нітрат на 0-ий, 7-ий, 14-ий та 28-ий день. Якщодослідження тривале, подальші вимірювання необхідно робити черезкожні два тижні після 28-денного терміну.
Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, використовуютьщонайменше 5 концентрацій, а проби ґрунтів аналізують на нітрат напочатку (день 0) та наприкінці тестування (28 днів). Якщонеобхідно, можна зробити проміжні вимірювання, наприклад, насьомий день. Дані, які отримали у 28-й день, використовують длявизначення величини ефективної концентрації для хімічної речовини.При потребі можна використати дані, отримані зі зразка нульовогодня, для звіту про початкову кількість нітрату у ґрунті.
1.7.2.2. Аналіз проб ґрунту
Кількість нітрату, який утворюється в кожній дослідній таконтрольній повторній пробі, визначається в однаковий час вибірки.Нітрат видобувається з ґрунту завдяки струшуванню проб звідповідним екстракційним розчинником, наприклад, 0,1 мольхлоридно-калієвого розчинника. Рекомендується співвідношення5 мл KCl розчинника на 1 г сухої ваги ґрунту. Щоб провестиефективну екстракцію, об'єм ґрунту та екстракційного розчинника неповинен перевищувати половину ємкості. Суміші струшуються зішвидкістю 150 обертів за хвилину протягом години. Далі вонипроходять центрифугування або фільтрацію, і рідкі фазианалізуються на нітрат. Однорідні рідкі екстракти можна зберігатидо проведення аналізу при температурі 20 +- 5 град.C до шестимісяців.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Якщо досліджуються агрохімічні речовини, необхідно записуватикількість нітрату, який утворився в усіх повторних пробах ґрунту,а середні значення усіх повторних проб подавати у формі таблиці.Рівень трансформації нітрогену треба визначити за відповідними ізагальноприйнятими статистичними методами (напр., F-критерій,5% рівня значущості). Кількість утвореного нітрату виражається вмг нітрату/кг сухої ваги ґрунту/день. Рівень утворення нітрату вкожній дослідній пробі порівнюється з рівнем нітрату у контрольнійпробі, і підраховується процент відхилення від останньої.
Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, необхідновизначити кількість нітрату, який утворюється в усіх повторнихпробах, і побудувати криву залежності доза-ефект для визначеннявеличин ефективної концентрації. Кількість нітрату (тобто мгнітрату/кг сухої ваги ґрунту), який знайдено в дослідних пробахпісля 28 днів, порівнюється з кількістю нітрату у контрольнихпробах. За допомогою цих даних визначаються процентні показникипригнічення для кожної дослідної концентрації. Ці процентніспіввідношення показують залежність від концентрації, а потім задопомогою статичних методів розраховуються величини ефективноїконцентрації. Довірчі границі (p = 0,95) для розрахованоїефективної концентрації також визначаються за допомогоюстандартних методів (10)(11)(12).
Досліджувані речовини, які містять багато нітрогену, можутьвпливати на кількість нітрату, що утворюється протягомдослідження. Якщо ці речовини досліджуються у високихконцентраціях (наприклад, хімічні речовини, яківикористовуватимуться повторно), треба брати додаткові контрольніпроби (тобто ґрунт плюс досліджувана речовина, але без рослинноїмуки). Для розрахунку ефективної концентрації необхідновраховувати дані, отримані в процесі контрольних заходів.
2.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Коли визначені результати досліджень з агрохімічнимиречовинами, а різниця між співвідношенням показників утвореннянітрату нижньої проби (тобто максимально очікувана концентрація)та контрольної проби дорівнює або менше 25% у будь-який часвибірки після 28-ого дня, продукт реакції можна оцінити як такий,що не має довгострокового впливу на трансформацію нітрогену вґрунтах. Коли визначаються результати досліджень неагрохімічнихречовин, то використовуються показники ефективної концентраціїEK , EK та/чи EK .
50 25 10
3. ЗВІТ
Звіт дослідження має включати наступну інформацію:
Повна ідентифікація досліджуваного ґрунту містить дані про:
- географічні координати місця забору (широта, довгота),
- інформація про історію місця (тобто рослинний покрив,обробка речовинами для захисту сільськогосподарських культур,удобрювання, випадкове забруднення тощо),
- характер використання (наприклад, сільськогосподарськіугіддя, ліс тощо),
- глибина відбору проб (см),
- вміст піску/мулу/глини (% сухої ваги),
- pH (води),
- вміст органічного вуглецю (% сухої ваги),
- вміст нітрогену (% сухої ваги),
- початкова концентрація нітрату (мг нітрату/кг сухої ваги),
- об'єм катіонування (мкмоль/кг),
- мікробна біомаса по відношенню до проценту усьогоорганічного вуглецю,
- довідка про методи, які використовувались для визначеннякожного параметру,
- уся інформація, що пов'язана із збиранням та зберіганнямпроб ґрунту,
- деталі попередньої інкубації ґрунту, якщо є.
Досліджувана речовина:
- фізична природа і, де необхідно, фізико-хімічнівластивості,
- хімічні ідентифікаційні дані, де необхідно, зокремаструктурна формула, чистота (наприклад, процент активногоінгредієнта для продукції, що захищає сільськогосподарськікультури), вміст нітрогену.
Субстрат:
- джерело субстрату,
- склад (тобто люцернова мука, люцернова зелена мука),
- вміст вуглецю, азоту (% сухої ваги),
- діаметр отворів решета (мм).
Умови дослідження:
- деталі поліпшення ґрунту органічним субстратом,
- кількість використаних досліджуваних хімічних речовин і, денеобхідно, оцінка вибраних концентрацій,
- деталі нанесення досліджуваної речовини на ґрунт,
- інкубаційна температура,
- показник вологості ґрунту на початку і протягомдослідження,
- метод інкубації ґрунту (тобто великими партіями чи серієюпідвибірок),
- кількість повторних проб,
- час вибірки,
- метод, що використовується для екстракції нітрату з ґрунту.
Результати:
- аналітичний метод і оснащення для аналізу нітрату,
- табличні дані, які містять індивідуальні й середніпоказники для вимірювань нітрату,
- різниця між повторними дослідними й контрольними пробами,
- пояснення корекцій в підрахунках, якщо необхідно,
- процентна різниця у показниках утворення нітрату у кожнийчас відбору, чи, якщо можливо, показник ефективної концентраціїEK з 95% довірчою границею, інші показники ефективної
50
концентрації (тобто EK чи EK ) з довірчим інтервалом, і графік
25 10
кривої залежності доза-ефект,
- статистична обробка результатів,
- уся інформація та спостереження, які можуть бути кориснимидля тлумачення результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) EPPO, (1994) Decision-Making Scheme for the EnvironmentalRisk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: SoilMicroflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
(2) BBA, (1990) Effects on the Activity of the SoilMicroflora. BBA Guidelines for the Official Testing of PlantProtection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
(3) EPA (1987) Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines;Proposed rule. September 28, 1987.
(4) SETAC-Europe, (1995) Procedures for assessing theenvironmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch,Pub. SETAC-Europe, Brussels.
(5) ISO/DIS 14238 (1995) Soil Quality - Determination ofNitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and theInfluence of Chemicals on these Processes. Technical CommitteeISO/TC 190/SC 4: Soil Quality - Biological Methods.
(6) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop onSelection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January1995.
(7) ISO 10381-6 (1993) Soil quality - Sampling. Guidance onthe collection, handling and storage of soil for the assessment ofaerobic microbial processes in the laboratory.
(8) ISO 14240-1, (1997) Soil quality - Determination of soilmicrobial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method.
(9) ISO 14240-2, (1997) Soil quality - Determination of soilmicrobial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F., (1949) A simplifiedmethod of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. andExper. Ther., 96, p. 99-113.
(11) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed.,Cambridge, London and New-York.
(12) Finney, D.J., (1978) Statistical Methods in biologicalAssay. Griffin, Weycombe, UK
C.22. ГРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ
ТРАНСФОРМАЦІЇ ВУГЛЕЦЮ
1. МЕТОД
Цей метод є повторенням OECD TG 217 (2000) (Нормативидосліджень ОЕСР N 217 (2000)
1.1. ВСТУП
Цей метод дослідження описує лабораторний метод, розробленийдля вивчення довгострокового потенційного впливу одного контактупродукції для захисту сільськогосподарських культур та можливоінших хімічних речовин на активність трансформації вуглецюґрунтових мікроорганізмів. Дослідження в основному базується нарекомендаціях Європейської та середземноморської організаціїзахисту рослин (1). Однак, бралися до уваги й інші нормативи,зокрема нормативи німецької біологічної служби (2), американськогоАгентства захисту навколишнього середовища (3) та Міжнародноїспілки з токсикології та хімії навколишнього середовища (4). НаСемінарі з добору ґрунту/осаду, що проводився у Белгіраті (Італія)у 1995 році, було визначено, яку кількість і який тип ґрунтівпотрібні для цього випробовування. Рекомендації стосовно збирання,оброблення та зберігання ґрунтів базуються на нормативномудокументі ISO (6) й рекомендаціях з семінару у Белгіраті.
При оцінюванні токсичних властивостей досліджуваних речовинможе виникнути потреба у визначенні впливу на ґрунтову мікробнуактивність, наприклад тоді, коли необхідна інформація про можливіпобічні ефекти продукції для захисту сільськогосподарських культурна ґрунтову мікрофлору, або коли очікується контакт ґрунтовихмікроорганізмів з іншим, відмінними від продукції для захистусільськогосподарських культур хімічними речовинами. Дослідженнятрансформації вуглецю проводиться для визначення впливу такиххімічних речовин на ґрунтову мікрофлору. Якщо вивчаютьсяагрохімічні речовини (наприклад, продукція для захисту продукціїдля захисту сільськогосподарських культур, добрива, хімічніречовини, які використовуються у лісовому господарстві), топроводяться дослідження трансформації як вуглецю, так і нітрогену.Якщо вивчаються неагрохімічні речовини, достатньо дослідженнятрансформації нітрогену. Однак, якщо показники середньоїефективної концентрації дослідження трансформації нітрогенупочинають потрапляти у вказаний діапазон доступних інгібіторів(напр., нітрапирін), можна провести дослідження трансформаціївуглецю, щоб отримати подальшу інформацію.
Ґрунти складаються з живих і неживих компонентів, які існуютьу складних і гетерогенних сумішах. Мікроорганізми відіграютьважливу роль у розкладі та трансформації органічного матеріалу вродючих ґрунтах, і багато біологічних видів впливають на різніаспекти родючості ґрунту. Будь-яке довгострокове втручання у цібіохімічні процеси може змінити цикл живлення ґрунту, а це в своючергу може змінити його родючість. Трансформація вуглецю інітрогену відбувається в усіх родючих ґрунтах. Хоча види мікробів,що відповідають за ці процеси, різні у різних ґрунтах, процестрансформації практично однаковий.
Цей метод дослідження розроблений для визначеннядовгострокового шкідливого впливу речовини на процес трансформаціївуглецю в аеробному пласті ґрунту. Дослідження визначає зміни урозмірах і активності мікробних угрупувань, які відповідають затрансформацію вуглецю, оскільки вони піддаються як хімічномувпливу, так і вуглецевому голодуванню. Використовують піщанийґрунт з низьким вмістом органічного матеріалу. Ґрунт обробляєтьсядосліджуваною речовиною і зберігається за умов, які сприяютьшвидкому мікробному метаболізму. За цих умов джерелазагальнодоступного вуглецю в ґрунті швидко виснажуються. Цеспричиняє вуглецеве голодування, яке вбиває мікробні клітини івикликає стан спокою і/чи споруляцію. Якщо дослідження триваєбільше, ніж 28 днів, сума цих реакцій може бути визначена задопомогою контрольних проб (з необробленого ґрунту) як прогресивнавтрата метаболічно активної мікробної біомаси (7). Якщо на біомасуу виснаженому безвуглецевому ґрунті, за умов дослідження, впливаєхімічна речовина, біомаса може не повернутись до того ж рівня, які в контрольній пробі. Отже, зміни, викликані досліджуваноюречовиною протягом дослідження, часто є незворотними.
Дослідження, на основі яких був створений цей досліднийметод, спочатку розроблялося для речовин, кількість потраплянняяких у ґрунт можна було передбачити. Наприклад, це стосуєтьсяпродукції для захисту сільськогосподарських культур, оскількивідомо, скільки її застосовується в реальних умовах. Дляагрохімічних речовин достатньо двох порцій тієї кількості, якабуде використовуватись за попередніми прогнозами. Агрохімічніречовини можна досліджувати як активні інгредієнти (a.i.) чи якскладені продукти. Однак, дослідження не обмежується речовинами зпрогнозованою концентрацією у навколишньому середовищі. Змінившияк кількість досліджуваної речовини в ґрунті, так і спосібоцінювання даних, дослідження також може проводитись для хімічнихречовин, кількість яких у ґрунті не є відомою. Отже, длянеагрохімічних речовин треба визначати вплив серії концентрацій натрансформацію вуглецю. Дані цих досліджень використовуються дляпобудови кривої залежності доза-ефект й розрахунку значеньефективної концентрації EK , деx визначається процентом впливу.
x
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Трансформація вуглецю - це виродження мікроорганізміворганічного матеріалу для утворення неорганічного кінцевогопродукту - діоксиду вуглецю.
EK (ефективна концентрація) - це концентрація досліджуваної xречовини в ґрунті, яка виражається в x% затримки трансформаціївуглецю в діоксид вуглецю.
EK (середня ефективна концентрація) - це концентрація 50досліджуваної речовини в ґрунті, яка дорівнює 50% затримкитрансформації вуглецю в діоксид вуглецю.
1.3. ЕТАЛОННА РЕЧОВИНА
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Просіяний крізь решето ґрунт обробляється досліджуваноюречовиною або залишається необробленим (для контрольної проби).Якщо досліджуються агрохімічні речовини, рекомендується матимінімум дві досліджувані концентрації, і їх треба забирати зурахуванням найвищої концентрації, яка прогнозується в реальнихумовах. Після 0-ого, 7-ого, 14-ого і 28-ого дня інкубації, проби зобробленим та контрольним ґрунтами змішують з глюкозою, після чогопротягом 12 годин вимірюють частоту дихання, спричиненогоглюкозою. Частота дихання виражається як вивільнений діоксидвуглецю (мг діоксиду вуглецю/кг сухого ґрунту/год) або спожитийкисень (мк кисню/кг ґрунту/год). Середня частота дихання в пробахобробленого ґрунту порівнюється з рівнем в контрольній пробі, іпідраховується процентне відхилення дослідної проби відконтрольної. Всі дослідження тривають щонайменше 28 днів. Якщо на28-ий день різниця між обробленим і контрольним ґрунтами дорівнюєабо більша за 25%, вимірювання тривають з двотижневим інтерваломмаксимум 100 днів. Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, рядконцентрацій досліджуваної речовини додається до проб ґрунтів, ічастота дихання, викликаного глюкозою, вимірюється через 28 днів(тобто середнє число об'єму утвореного діоксиду вуглецю чиспожитого кисню). Результати досліджень ряду концентраційаналізуються з використанням регресивної моделі, і розраховуютьсяпоказники ефективної концентрації (тобто EK , EK і/чи EK ).
50 25 10
Див. ВИЗНАЧЕННЯ.
1.5. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Оцінювання результатів дослідження агрохімічних речовинбазується на відносно невеликій різниці (тобто середнє значення:+- 25%) між вивільненим діоксидом вуглецю чи спожитим киснем вдослідній і контрольній пробах, отже, значні коливання в повторнихконтрольних пробах можуть привести до неправильних результатів.Тому різниця між однаковими контрольними пробами має бути меншою,ніж +- 15%.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Обладнання
Використовуються контейнери, зроблені з хімічно інертногоматеріалу. Вони повинні мати ємність, яка відповідає методу, щовикористовується для інкубації ґрунтів, тобто інкубацію великимипартіями чи серією ґрунтових проб (див. Розділ 1.7.1.2). Необхідномінімізувати втрату води та забезпечити умови для газового обмінупротягом дослідження (наприклад, контейнери можна покрити пористоюполіетиленовою плівкою). Коли досліджуються леткі речовини,необхідно використовувати ущільнюванні та газонепроникніконтейнери. Вони мають бути такого розміру, щоб одна чверть об'ємубула заповнена пробою ґрунту.
Для визначення дихання, спричиненого глюкозою, необхідніінкубаційні системи та інструменти для вимірювання утвореногодіоксиду вуглецю чи спожитого кисню. Приклади таких систем таінструментів можна знайти в літературі (8)(9)(10)(11).
1.6.2. Добір і кількість ґрунту
Використовується один і той самий ґрунт. Рекомендованіхарактеристики ґрунту є такими:
- вміст піску: не менше, ніж 50% і не більше, ніж 75%,
- pH: 5,5-7,5,
- вміст органічного вуглецю: 0,5-1,5%,
- необхідно виміряти мікробну біомасу (12)(13) і вміствуглецю у ній має бути принаймні 1% від загальної кількостіґрунтового органічного вуглецю.
У більшості випадків ґрунт із такими характеристиками - ценайгірший ґрунт, оскільки адсорбція досліджуваної речовини ємінімальною, а її вплив на мікрофлору - максимальний. Відповідно,дослідження інших ґрунтів є загалом непотрібним. Однак за деякихобставин, наприклад, коли досліджувану речовину частовикористовують на певному виді ґрунту (кислотні лісові ґрунти), чидля електростатично заряджених хімічних речовин, воно може бутинеобхідним для заміни додаткового ґрунту.
1.6.3. Збирання і зберігання проб ґрунту
1.6.3.1. Збирання
Необхідно зібрати детальну інформацію про історію території,звідки буде забраний досліджуваний ґрунт. Вона має охоплювати такідеталі, як місце розташування, рослинний покрив, дати обробленняпродукцією для захисту сільськогосподарських культур, обробленняорганічними й неорганічними добривами, додавання біологічнихречовин чи випадкове забруднення. Місце, обране для забору ґрунту,має бути придатним для довгострокового використання. Підходятьпостійні пасовища, поля з щорічними зерновими культурами (крімкукурудзи) чи поля, добре удобрювані сидератом. Обране місцезабору проб не має бути оброблене продукцією для захистусільськогосподарських культур щонайменше за рік до відбору. Такожза півроку до відбору не має використовуватись органічне добриво.Використання мінерального добрива можливе лише тоді, коливідповідно до потреб культур і ґрунту, проби не можуть бутивідібрані, поки не мине принаймні три місяці після удобрювання. Неможна використовувати ґрунт, який оброблявся добривом з біоциднимвпливом (наприклад, ціанамід кальцію).
Не можна відбирати проби протягом чи одразу післядовготривалих (більше 30 днів) засух чи повеней. Із зораногоґрунту проби забираються з глибини 0-20 см. З пасовища чи іншихґрунтів, де земля не ореться протягом довгого часу (принаймніпротягом одного вегетаційного періоду), глибина забору може бутитрохи більшою за 20 см (напр., 25 см). Проби ґрунту перевозяться уконтейнерах за температури, яка гарантує, що початкові властивостіґрунту не будуть докорінно змінені.
1.6.3.2. Зберігання
Краще використовувати свіже забрані у реальних умовах ґрунти.Якщо не можна уникнути зберігання в лабораторії, то ґрунти требазберігати в темному місці за температури 4 +- 2 град.C максимумпротягом трьох місяців. Під час зберігання необхідно дотримуватисьаеробних умов. Якщо ґрунти забираються з території, де вонизамерзають щонайменше на три місяці в рік, то їх можна зберігатипротягом півроку за температури мінус 18 град.C. Мікробну біомасувідданих на зберігання ґрунтів вимірюють перед кожнимекспериментом, і вуглець у біомасі повинен складати принаймні 1%від загального вмісту органічного вуглецю у ґрунті (див.Розділ 1.6.2).
1.6.4. Оброблення та підготовка ґрунту до дослідження
1.6.4.1. Попередня інкубація
Якщо ґрунт використовується не одразу після відбору (див.Розділи 1.6.4.2 і 1.7.1.3), рекомендується провести попереднюінкубацію на період від 2 до 28 днів. Температура та вологістьґрунту під час попередньої інкубації мають бути такими ж як іпротягом дослідження (див. Розділи 1.6.4.2 і 1.7.1.3).
1.6.4.2. Фізично-хімічні властивості
Руками ґрунт очищується від великих предметів (наприклад,каміння, частин рослин тощо), а тоді вологим просівається крізьсито без значного висушування до часточок, розмір яких менше абодорівнює 2 мм. Вміст вологи у пробі ґрунту повинен регулюватись задопомогою дистильованої чи деіонізованої води так, щоб рівеньвологи був від 40% до 60% максимальної вологомісткості.
1.6.5. Підготовка досліджуваної речовини для обробленняґрунту
Досліджувана речовина зазвичай наноситься за допомогою носія.Носієм може бути вода (для водорозчинних речовин) або інертнетверде тіло, наприклад, дрібний кварцовий пісок (розмір часточок:0,1-0,5 мм). Краще не використовувати інші рідкі носії (наприклад,такі органічні розчинники, як ацетон, хлороформ), оскільки вониможуть нанести шкоду мікрофлорі. Якщо носієм є пісок, його можнапокрити досліджуваною речовиною, яка розчинилась чи випала в осаду відповідному розчиннику. У такому випадку необхідно випаруватирозчинник перед обробленням ґрунту. Для оптимального розподілудосліджуваної речовини у ґрунті рекомендується співвідношення 10 гпіску на кілограм ґрунту (суха вага). Контрольні пробиобробляються такою ж кількістю води та/чи кварцового піску.
Коли досліджуються леткі речовини, необхідно уникати втратпід час оброблення і забезпечити їх однорідний розподіл у ґрунті(наприклад, досліджувана речовина упорскується у ґрунт у декількохмісцях).
1.6.6. Досліджувані концентрації
Якщо досліджується продукція для захисту
сільськогосподарських культур чи інші хімічні речовини з
прогнозованою концентрацією у навколишньому середовищі, необхідно
мати принаймні дві концентрації. Нижча концентрація повинна
відповідати максимальній кількості речовин у ґрунті за реальних
умов, а вища концентрація має у декілька разів перевищувати нижчу.
Концентрації досліджуваної речовини, які додаються у ґрунт,
визначаються за такими уніфікованими показниками: глибина забору -
5 см, щільність ґрунту - 1,5. Для агрохімічних речовин, які
наносяться безпосередньо на ґрунт, рекомендовані досліджувані
концентрації - це Прогнозована концентрація в навколишньому
середовищі (РЕС) і концентрація, більша її у 5 разів. Речовини, що
наносяться на ґрунти декілька разів за сезон, повинні
досліджуватись за допомогою концентрацій, які є добутками РЕС на
максимально прогнозовану кількість нанесень. Однак, найвища
досліджувана концентрація не має перевищувати десять максимальних
об'ємів нанесеної речовини за один раз.
Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, застосовуєтьсягеометрична прогресія принаймні п'яти концентрацій. Досліджуваніконцентрації мають охоплювати область, необхідну для визначенняпоказників ефективної концентрації.
1.7. ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.7.1. Умови впливу
1.7.1.1. Перемішування і контроль
Якщо досліджуються агрохімічні речовини, ґрунт ділиться натри рівні порції. Дві порції перемішуються з носієм, який міститьречовину, а остання перемішується з носієм без речовини(контрольна проба). Рекомендується мати щонайменше три повторніпроби до кожної дослідної і контрольної проб. Якщо досліджуютьсянеагрохімічні речовини, ґрунт ділиться на шість рівних порцій.П'ять порцій перемішуються з носієм, який містить речовину, аостання перемішується з носієм без речовини (контрольна проба).Рекомендується мати щонайменше три повторні проби до кожноїдослідної і контрольної проб. Важливо забезпечити одноріднийрозподіл досліджуваної речовини у дослідних пробах ґрунту. Під часперемішування необхідно уникати ущільнення ґрунту чи перетворенняйого на грудку.
1.7.1.2. Інкубація проб ґрунту
Інкубацію проб ґрунту можна провести двома способами: яквелику партію дослідних і контрольних проб чи як ряд окремих іоднакових за розміром підвибірок кожної дослідної і контрольноїпроб ґрунту. Однак, коли досліджуються леткі речовини, дослідженняпроводиться лише з рядом окремих підвибірок. Коли ґрунтиінкубуються у великій партії, треба підготувати багато обробленогой необробленого ґрунту, а підвибірки, які мають аналізуватись,беруться за необхідності в процесі дослідження. Кількістьпідготованих початкових дослідних і контрольних проб залежить відрозміру підвибірок, кількості повторних проб для аналізу тапрогнозованого максимального часу отримання вибірки. Ґрунти, якіінкубуються у великій партії, необхідно ретельно перемішати передпідвибіркою. Коли ґрунти інкубуються як ряд окремих проб ґрунту,кожна партія обробленого й необробленого ґрунту ділиться нанеобхідну кількість підвибірок, які використовуються занеобхідності. У дослідженнях, де прогнозується більше двох заборіввибірок, необхідно підготувати достатню кількість підвибірок, щобїх вистачило на всі повторні проби і всі забори вибірок.Щонайменше три повторні проби досліджуваного ґрунту повинніінкубуватись за аеробних умов (див. Розділ 1.7.1.1). Протягом усіхдосліджень необхідно використовувати відповідні контейнери здостатнім повітряним прошарком, щоб запобігти утворенню анаеробнихумов. Коли досліджуються леткі речовини, дослідження проводитьсялише з рядом окремих підвибірок.
1.7.1.3. Умови і тривалість дослідження
Дослідження проводиться у темному місці за кімнатноїтемператури 20 +- 2 град.C. Вміст вологи у пробах ґрунту протягомдослідження повинен підтримуватись на рівні 40-60% відмаксимальної вологомісткості ґрунту (див. Розділ 1.6.4.2) звідхиленням +- 5%. За необхідності можна додати дистильовану,деіонізовану воду.
Мінімальна тривалість досліджень становить 28 днів. Якщодосліджуються агрохімічні речовини, в дослідних та контрольнихпробах порівнюється кількість вивільненого діоксиду вуглецю чиспожитого кисню. Якщо ці показники на 28-ий день відрізняютьсябільш, ніж на 25%, випробовування продовжується, доки різниця недорівнюватиме або буде меншою за 25%, чи максимум протягом100 днів. Якщо досліджуються неагрохімічні речовини,випробовування закінчується після 28 днів. На 28-ий деньвизначається кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитогокисню в дослідних та контрольних пробах ґрунту і розраховуютьсяпоказники ефективної концентрації.
1.7.2. Вибірка та аналіз ґрунтів
1.7.2.1. Розклад відбору проб
Якщо досліджуються агрохімічні речовини, проби ґрунтіваналізують на дихання, спричинене глюкозою на 0-ий, 7-ий, 14-ий та28-ий день. Якщо дослідження тривале, подальші вимірюваннянеобхідно робити через кожні два тижні після 28-денного терміну.
Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, використовуютьщонайменше 5 концентрацій, а проби ґрунтів аналізують на частотудихання, спричинене глюкозою, на початку (день 0) та наприкінцітестування (28 днів). Якщо необхідно, можна зробити проміжнівимірювання, наприклад, на сьомий день. Дані, які отримали у28-й день, використовують для визначення величини ефективноїконцентрації для хімічної речовини. Якщо вимагається, то можнавикористати дані, отримані зі зразка нульового дня, для визначенняпочаткової кількості метаболічно активної мікробної біомаси уґрунті про початкову кількість нітрату у ґрунті (12).
1.7.2.2. Вимірювання частоти дихання, спричиненого глюкозою
Частота дихання, спричиненого глюкозою, в кожній дослідній таконтрольній повторній пробі визначається в однаковий час вибірки.Проби ґрунту перемішуються з достатньою кількістю глюкози, щобвиявити негайну максимальну дихальну реакцію. Кількість глюкози,необхідної, щоб викликати максимальну дихальну реакцію у даномуґрунті, можна визначити за допомогою попереднього дослідження звикористанням ряду концентрацій глюкози (14). Для піщаних ґрунтівз 0,5-1,5% вмістом органічного вуглецю достатньо від 2 000 мг до4 000 мг глюкози на кг сухої ваги ґрунту. Глюкозу можна перемолотидо стану пудри разом із чистим кварцовим піском (10 г піску/кгсухої ваги ґрунту) і рівномірно перемішати з ґрунтом.
Проби ґрунту з глюкозою інкубуються у відповідному приладі,який може вимірювати частоту дихання постійно, кожну годину, кожнідві години (див. Розділ 1.6.1) за температури 20 +- 2 град.C.Кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого киснювимірюється постійно протягом 12 годин, і вимірювання повиннірозпочатися якнайшвидше, тобто протягом однієї чи двох годин післядодавання глюкози. Протягом 12 годин вимірюється загальнакількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню івизначається середня частота дихання.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Якщо досліджуються агрохімічні речовини, необхідно записуватикількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитого кисню в усіхповторних пробах ґрунту, а середні значення усіх повторних пробподати у формі таблиці. Результати необхідно визначити завідповідними і загальноприйнятими статистичними методами (напр.,F-критерій, 5% рівня значущості). Частота дихання, спричиненогоглюкозою, виражається в мг діоксиду вуглецю/кг сухої вагиґрунту/день чи мг кисню/кг сухої ваги ґрунту/день. Середній рівеньутворення діоксиду вуглецю чи середній рівень споживання кисню вкожній дослідній пробі порівнюється з рівнем у контрольній пробі,і підраховується процент відхилення від останньої.
Якщо досліджуються неагрохімічні речовини, необхідновизначити кількість вивільненого діоксиду вуглецю чи спожитогокисню в усіх повторних пробах, і побудувати криву залежностідоза-ефект для визначення величин ефективної концентрації. Частотадихання, спричиненого глюкозою, (тобто мг діоксиду вуглецю/кгсухої ваги ґрунту/день чи мг кисню/кг сухої ваги ґрунту/день),який виявлено в дослідних пробах після 28 днів, порівнюється зкількістю у контрольних пробах. За допомогою цих даних визначаютьпроцентні показники пригнічення для кожної дослідної концентрації.Ці процентні співвідношення показують залежність від концентрації,а потім за допомогою статичних методів розраховуються величиниефективної концентрації. Довірчі границі (p = 0,95) длярозрахованої ефективної концентрації також визначаються задопомогою стандартних методів (15)(16)(17).
2.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Коли визначені результати досліджень з агрохімічнимиречовинами, а різниця між співвідношенням частоти дихання нижньоїпроби (тобто максимально очікувана концентрація) та контрольноїпроби дорівнює або менше 25% у будь-який час вибірки після 28-огодня, продукт реакції можна оцінити як такий, що не маєдовгострокового впливу на трансформацію вуглецю в ґрунтах. Коливизначаються результати досліджень неагрохімічних речовин, товикористовують показники ефективної концентрації EK , EK та/чи
50 25
EK .
10
3. ЗВІТУВАННЯ
ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про дослідження повинен містити наступні дані:
Повна інформація про ґрунт, що використовується, включаючи:
- географічні координати місця (широта, довгота),
- дані про історію місця (тобто, рослинний покрив, обробказасобами для захисту врожаїв, внесення добрив, випадки забрудненнятощо),
- історія використання (напр. сільськогосподарські землі,ліси тощо),