- глибина відбору проб (см),
- вміст піску/мулу/глини (% від сухої ваги),
- рН (у воді),
- вміст органічного вуглецю (% від сухої ваги),
- вміст азоту (% від сухої ваги),
- ємність катіонного обміну (ммоль/кг),
- початкова мікробна біомаса у процентах від загальноговмісту органічного вуглецю,
- посилання на методи, що використовувались для визначеннякожного параметру,
- вся інформація про збирання та зберігання проб ґрунту,
- відомості про попереднє витримування ґрунту, якщовідбувалось.
Дослідна речовина:
- фізична природа та, якщо потрібно, фізико-хімічнівластивості,
- дані про хімічну ідентифікацію, включаючи, якщо потрібно,структурну формулу, чистоту (тобто, процентний вміст активноїречовини для засобів для захисту врожаїв), вміст азоту.
Умови дослідження:
- відомості про меліорацію органічними субстратами,
- кількість концентрацій дослідної речовини та, якщопотрібно, обґрунтування обраних концентрацій,
- дані про введення дослідної речовини у ґрунт,
- температура витримування,
- вміст вологи у ґрунті на початку та під час дослідження,
- метод витримування ґрунту, що використовувався (тобто, чиґрунт витримувався в одному контейнері, чи розділявся на окреміпідпроби),
- кількість дублюючих проб,
- час відбору проб.
Результати:
- метод та обладнання, що використовувались для вимірюванняінтенсивності дихання,
- табличні дані, що включають окремі та середні значеннякількості кисню чи вуглекислого газу,
- розбіжності між дублюючими дослідними та контрольнимипробами,
- пояснення виправлень у розрахунках, якщо робились,
- процентне коливання інтенсивності глюкозного дихання підчас кожного періоду відбору проб, та, якщо застосовується,значення EC з довірчою межею 95%, інші значення EC (тобто EC
50 x 25
або EC ) з довірчими інтервалами та графік кривої дози-реакції,
10
- статистична обробка результатів, якщо застосовувалась,
- будь-яка інформація та спостереження, що можуть допомогти упоясненні результатів.
4. ПЕРЕЛІК ДОВІДКОВОЇ ЛІТЕРАТУРИ
(1) EPPO, (1994) Decision-Making Scheme for the EnvironmentalRisk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: SoilMicroflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
(2) BBA, (1990) Effects on the Activity of the SoilMicroflora. BBA Guidelines for the Official Testing of PlantProtection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
(3) EPA, (1987) Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act TestGuidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
(4) SETAC-Europe, (1995) Procedures for assessing theenvironmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch,Pub. SETAC-Europe, Brussels.
(5) OECD, (1995) Final Report of the OECD Workshop onSelection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January1995.
(6) ISO 10381-6, (1993) Soil quality - Sampling. Guidance onthe collection, handling and storage of soil for the assessment ofaerobic microbial processes in the laboratory.
(7) Anderson, J.P.E., (1987) Handling and Storage of Soilsfor Pesticide Experiments, in 'Pesticide Effects on SoilMicroflora'. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
(8) Anderson, J.P.E., (1982) Soil Respiration, in 'Methods ofSoil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties'.Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R.Keeney. 41: 831-871.
(9) ISO 11266-1, (1993) Soil Quality - Guidance on LaboratoryTests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
(10) ISO 14239, (1997E) Soil Quality - Laboratory incubationsystems for measuring the mineralisation of organic chemicals insoil under aerobic conditions. 31.5.2008 EN Official Journal ofthe European Union L 142/707
(11) Heinemeye r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik,G., (1989) Soil microbial biomass and respiration measurements; anautomated technique based on infrared gas analyses. Plant andSoil, 116: 77-81.
(12) ISO 14240-1, (1997) Soil quality - Determination of soilmicrobial biomass - Part 1: Substrateinduced respiration method.
(13) ISO 14240-2, (1997) Soil quality - Determination of soilmicrobial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.
(14) Malkomes, H.-P., (1986) Einflu von Glukosemenge auf dieReaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden GegenberPflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide.(Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on theEffect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicideas an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd.,Braunschweig, 38: 113-120.
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplifiedmethod of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. andExper. Ther., 96, 99-113.
(16) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed.,Cambridge, London and New-York.
(17) Finney D.J., (1978) Statistical Methods in biologicalAssay. Griffin, Weycombe, UK.
C.23. АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ ПЕРЕТВОРЕННЯ В ГРУНТІ
1. МЕТОД
Даний метод є ідентичним методу OECD TG 307 (2002).
1.1. ВСТУП
Даний метод базується на існуючих посібниках(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Описаний далі метод було розробленодля оцінки аеробних та анаеробних перетворень хімічних елементів уґрунті. Метою дослідів є визначення (i) інтенсивності перетвореннядослідної речовини та (ii) природи та інтенсивності накопичення тавиведення продуктів перетворення, які можуть впливати на рослинита ґрунтові організми. Такі дослідження повинні застосовуватись дохімічних речовин, які безпосередньо вводяться в ґрунт, або можутьпотрапити в ґрунтове середовище. Результати таких дослідженьможуть також використовуватись для складання протоколів проведенняаналізів та відбору проб для відповідних польових досліджень.
Аеробні та анаеробні дослідження одного типу ґрунту зазвичайдозволяють оцінити шляхи перетворення (8)(10)(11). Інтенсивністьперетворення необхідно визначати у принаймні трьох додатковихґрунтах (8)(10).
Під час Семінару ОЕСР з питань підбору ґрунтів та осадовихпорід, що відбувся в Бельджирате, Італія у 1995 році (10) булозокрема погоджено кількість та типи ґрунтів для використання уданому дослідженні. Типи ґрунтів повинні відтворювати навколишніумови того місця, де можуть використовуватись або утилізуватисьхімічні речовини. Наприклад, хімічні речовини, що можутьутилізуватись на території від субтропічних до тропічнихкліматичних зон, повинні досліджуватись за допомогою ґрунтів типуFerrasol або Nitosol (за системою Продовольчої тасільськогосподарської організації ООН (FAO)). Під час Семінарубули також запропоновані вказівки щодо збору, обробки тазберігання зразків ґрунту, на основі Посібника ISO (15).Використання суглинку (рисового ґрунту) також розглядається уданому методі.
1.2. ОЗНАЧЕННЯ
Дослідна речовина: будь-яка речовина, що може бути якпочатковою, так і відповідним продуктом розпаду.
Продукти розпаду: будь-які сполуки, що утворюються внаслідокбіотичних або абіотичних реакцій перетворення дослідної сполуки,включаючи СО та продукти зв'язаних залишків.
2
Зв'язані залишки: "Зв'язані залишки" є сполуками в ґрунті,рослинах чи тваринах, що залишаються у ґрунтовій основі у форміпочаткової речовини або її метаболіту (метаболітів) чи продуктіврозпаду, після екстрагування. Метод, що використовується дляекстрагування, не повинен суттєво впливати на компоненти чиструктуру основи. Природа зв'язку може бути частково встановленаметодом екстрагування зі зміною ґрунтової основи або використанняскладних аналітичних методик. На сьогоднішній день таким чиномбули визначені ковалентні йонні та адсорбційні зв'язки, а такожзахоплення. Загалом, утворення зв'язаних залишків суттєво зменшуєбіологічну доступність та сприйнятливість.
Аеробне перетворення: реакції, що відбуваються за присутностімолекулярного кисню (14).
Анаеробне перетворення: реакції, що відбуваються завідсутності молекулярного кисню (14).
Ґрунт: суміш мінеральних та органічних компонентів, населенадрібними (у більшості, мікроскопічними) організмами. Органічнікомпоненти містять сполуки з високим вмістом вуглецю та нітрогенута високими молекулярними масами. Ґрунт можна обробляти у двохстанах:
(а) з непорушеною структурою, тобто такою, що утворилася зчасом у характерних шарах багатьох видів ґрунту;
(b) з порушеною структурою, тобто такою, що спостерігаєтьсяна території орних земель або коли проби для даного методувідбираються шляхом викопування;
Мінералізація: повний розпад органічної сполуки на СО та Н О 2 2у аеробних умовах та СН , СО та Н О в анаеробних. В контексті
4 2 2
14
даного методу, якщо використовуються мічені ізотопи С,
мінералізація означає активний розпад, під час якого мічений атом
14
вуглецю окислюється з утворенням відповідної кількості СО (14).
2
Період напіврозпаду: t час, протягом якого відбувається 0,5перетворення 50% дослідної сполуки, за умови що перетворення можнаописати за допомогою кінетики першого порядку; це значення незалежить від концентрації.
DT (Час зникнення 50): це час, протягом якого концентрація 50дослідної речовини зменшується на 50%; дане значення відрізняєтьсявід періоду напіврозпаду t , якщо перетворення не
0,5
підпорядковується кінетиці першого порядку.
DT (Час зникнення 75): це час, протягом якого концентрація 75дослідної речовини зменшується на 75%.
DT (Час зникнення 90): це час, протягом якого концентрація 90дослідної речовини зменшується на 90%.
1.3. КОНТРОЛЬНІ РЕЧОВИНИ
Контрольні речовини потрібно використовувати для опису та/абовизначення продуктів перетворення за допомогою спектрографії абохроматографії.
1.4. СФЕРА ЗАСТОСУВАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Даний метод застосовується для всіх хімічних речовин (щомістять або не містять мічені ізотопи), для яких створено належнийаналітичний метод з достатньою чутливістю та точністю. Вінзастосовується для слаболетких, нелетких, розчинних та нерозчинниху воді сполук. Дослідження не можна застосовувати для сполук, щомають високу леткість у ґрунті (напр. засобів для окурювання,органічних розчинників), і які тому не можуть утримуватись вґрунті в умовах даного дослідження.
1.5. ІНФОРМАЦІЯ ПРО РЕЧОВИНУ
Для вимірювання інтенсивності перетворення можутьвикористовуватись дослідні речовини, що містять або не містятьмічені ізотопи. Мічені речовини потрібні для дослідження шляхуперетворення і для встановлення балансу мас. Рекомендується
14
використовувати мічені атоми С, хоча використання інших
13 15 3 32
ізотопів, таких як С, N, H, P, теж може бути корисним.
Наскільки це можливо, мітка повинна розміщуватись у найбільш
стабільній частині (частинах) молекули(1). Чистота дослідної
речовини повинна становити не менше, ніж 95%.
----------------
(1) Наприклад, якщо речовина має одне кільце, вимагаєтьсямаркувати його; якщо ж речовина має два або більше кілець,необхідно провести окремі дослідження для визначення перетвореннякожного міченого кільця і для отримання більш докладної інформаціїпро утворення продуктів перетворення.
Перед виконанням дослідження аеробного та анаеробногоперетворення у ґрунті, необхідно отримати такі дані про досліднуречовину:
(а) розчинність у воді (Метод А.6);
(b) розчинність в органічних розчинниках;
(с) тиск пари (Метод А.4) та константа закону Генрі;
(d) коефіцієнт розподілу в н-октанолі/воді (Метод А.8);
(e) хімічна стабільність в темряві (гідроліз) (Метод С.7);
(f) рК , якщо молекула схильна до приєднання та відриву aпротонів (Посібник ОЕСР 112) (16).
Також може бути корисною інформація про токсичність дослідноїречовини для ґрунтових мікроорганізмів (методи дослідження С.21 таС.22) (16).
В наявності також повинні бути аналітичні методи (включаючиметоди екстрагування та очищення) для кількісного визначення таідентифікації дослідної речовини.
1.6. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Зразки ґрунту обробляються дослідною сполукою і витримуютьсяу темряві у колбах того ж типу, що використовуються длябіологічного визначення, або у проточних системах, в лабораторнихумовах, що контролюються (при постійній температурі та вологостіґрунту). Після відповідних інтервалів часу, проби ґрунтудістаються та аналізуються на вміст початкової сполуки тапродуктів перетворення. Леткі продукти також збираються дляаналізу за допомогою відповідних пристроїв. За допомогою речовин,
14
що містять мічені ізотопи С, можна визначити різні ступені
14
мінералізації дослідної речовини, шляхом затримки атомів СО , а
2
також встановити баланс мас, включаючи формування зв'язаних
залишків у ґрунті.
1.7. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
1.7.1. Відновлення
Аналіз принаймні двох проб одразу після додавання дослідноїсполуки дає перші свідчення про повторюваність аналітичного методута про однорідність застосування процедури для дослідної речовини.Значення відновлення для подальших фаз досліду подаються завідповідними значеннями балансу мас. Показники відновлення дляречовин, що містять мічені ізотопи повинні знаходитись в межах від90% до 100%, а для речовин, що не містять останніх - в межах від70% до 110% (3).
1.7.2. Повторюваність та чутливість аналітичного методу
Повторюваність аналітичного методу (не враховуючиефективності першого аналізу) під час кількісного визначеннядослідної сполуки та продуктів розпаду можна перевірити задопомогою повторного аналізу одного зразка ґрунту, витриманогопротягом достатнього часу для утворення продуктів розпаду.
Межа визначення аналітичного методу (LOD) для дослідноїсполуки та продуктів розпаду повинна щонайменше становити
-1
0,01 мг · кг грунту (дослідної сполуки) або 1% від дози, що
застосовується, залежно від того, яке значення є нижчим. Також
необхідно вказати межу кількісного визначення (LOQ).
1.7.3. Точність даних про перетворення
Аналіз концентрації дослідної сполуки за регресією взалежності від часу дозволяє отримати відповідні дані провірогідність кривої перетворення та дозволяє підрахувати довірчімежі для періодів напіврозпаду (у випадку кінетики псевдо-першогопорядку) або значення DT та, якщо потрібно, значення DT та
50 75
DT .
90
1.8. ОПИС МЕТОДУ
1.8.1. Обладнання та хімічні реагенти
Ґрунт витримується у статичних закритих або прийнятнихпроточних системах (7)(17). Приклади прийнятного обладнанняпроточного типу та колба для біологічного визначення зображені намалюнках 1 та 2 відповідно. Обидві зазначені системи длявитримування мають переваги та обмеження (7)(17).
Використовується звичайне лабораторне обладнання, зокрема,наступне:
- аналітичні прилади, зокрема, обладнання для газорідинної,високоефективної рідинної та тонкошарової хроматографії, а такожсистеми для виявлення та аналізу речовин, що містять або немістять мічені ізотопи, або системи для методу зворотногорозбавлення ізотопів,
- прилади для ідентифікації (напр. МС, ГХ-МС, ВЕРХ-МС, ЯМРтощо),
- рідкий сцинтилятор,
- окисник для згорання радіоактивних речовин,
- центрифуга,
- прилади для екстрагування (напр. центрифужні пробірки дляхолодного екстрагування або екстрактор Сокслета)
- обладнання для концентрування розчинів та екстрактів (напр.роторний випарювач),
- водна баня,
- механічний пристрій для змішування (напр. змішувач длятіста або барабанний змішувач).
Хімічні реагенти, що використовуються, можуть включати:
-3
- NaOH, аналітичної якості, 2 моль · дм , або іншийпридатний луг (напр. KOH або етаноламін),
-3
- H SO , аналітичної якості, 0,05 моль · дм ,
2 4
- етилен гліколь, аналітичної якості,
- твердий абсорбент, такий як натрове вапно або поліуретановізаглушки,
- органічні розчинники, аналітичної якості, такі як ацетон,метанол тощо,
- рідина для сцинтиляції.
1.8.2. Застосування дослідної речовини
Перед додаванням до ґрунту для кращого розповсюдженнядослідну сполуку необхідно розчинити у воді (дейонізованій абодистильованій) або за необхідності, у мінімальних кількостяхацетону або інших органічних розчинників (6), у яких досліднасполука залишається достатньо стабільною та розчинною. Проте,обрана кількість розчинника не повинна суттєво впливати намікробну активність у ґрунті (див. Розділи 1.5 та 1.9.2-1.9.3).Бажано уникати використання розчинників, що гальмують діяльністьмікробів, таких як хлороформ, дихлорметан або інші галогенізованірозчинники.
Дослідна речовина може також додаватись у твердому вигляді,напр. перемішуватися з кварцовим піском або у складі висушеної тастерилізованої підпроби дослідного ґрунту. Якщо використовуєтьсярозчинник, йому необхідно дозволити випаруватись перед тим, якоброблену дослідною речовиною підпробу буде додано до основноїнестерильної проби.
Якщо досліджуються звичайні хімічні сполуки, що потрапляють вґрунт через осад стічних вод або в результаті використання усільському господарстві, дослідну речовину потрібно спочаткудодати до осаду, а потім ввести у зразок ґрунту. (див.Розділи 1.9.2 та 1.9.3).
Використання вказаних продуктів не є строго визначеним,проте, для дослідних речовин з низькою розчинністю використаннязазначених речовин може бути прийнятним варіантом.
1.8.3. Ґрунти
1.8.3.1. Вибір ґрунту
Для визначення шляхів перетворення можуть використовуватисьхарактерні ґрунти; піщаний суглинок, мулистий суглинок або глинаабо глинистий пісок (відповідно до класифікації FAO та USDA (18)),що мають рекомендований рівень рН 5,5-8,0, вміст органічноговуглецю 0,5-0,2% та частку мікробної біомаси принаймні 1% відзагального вмісту органічного вуглецю (10).
Для дослідження інтенсивності перетворення потрібновикористовувати принаймні ще три додаткових зразки, що єпоказовими для відповідного ряду ґрунтів. Зразки повиннівідрізнятись за вмістом органічного вуглецю, рівнем рН, вмістомглини та мікробної біомаси (10).
Усі ґрунти потрібно охарактеризувати принаймні за структурою(% піску, % мулу %, % глини) (відповідно до класифікації FAO таUSDA (18)), рН, ємністю катіонного обміну, вмістом органічноговуглецю, загальною густиною, здатністю до затримання вологи (1) тамікробною біомасою (тільки для аеробного дослідження). Додатковаінформація про властивості ґрунту може бути корисною під часпояснення результатів. Для визначення властивостей ґрунту можутьвикористовуватись методи, запропоновані у довідковій літературі(19)(20)(21)(22)(23). Мікробну біомасу потрібно визначати методомвимірювання субстратного дихання (SIR) (25)(26) або іншимиметодами (20).
----------------
(1) Здатність до затримання вологи може вимірюватись якнормальна вологоємність, вологоутримувальна здатність абоводоструменевий тиск (pF). Детальніше у Додатку 1. У звітіпотрібно вказати, чи здатність до затримки води та загальнагустина вимірювались у зразках з непорушеною чи порушеноюструктурою.
1.8.3.2. Збирання, обробка та зберігання ґрунтів
В наявності повинна бути докладна інформація про історіюмісця, звідки відбирається проби ґрунту. Вона повинна включатиточне розташування, рослинний покрив, дані про обробку хімікатами,органічними та неорганічними добривами, додавання біологічнихматеріалів чи інші види забруднення. У випадку, якщо ґрунтиоброблялись дослідною сполукою або її структурними аналогамипротягом останніх чотирьох років, зразок не можна використовуватидля дослідження перетворення (10)(15).
Ґрунт повинен бути свіже зібраним з поля (з горизонту А абоверхнього шару товщиною 20 см) і містити таку кількість вологи, щосприяє просіюванню. Для ґрунтів крім суглинку необхідно уникативідбору проб під час або безпосередньо після тривалих періодів(> 30 днів) засухи, заморозків або повені (14). Зразки необхіднотранспортувати таким чином, щоб мінімізувати зміни у вмісті вологиу ґрунті, та зберігати у темряві з вільним доступом повітря,наскільки це можливо. Загалом, для таких цілей підходить нещільнозав'язаний поліетиленовий мішок.
Обробку ґрунту необхідно провести якомога швидше післяотримання проби. Рослинність, крупнішу ґрунтову фауну та камінцінеобхідно видалити перед пропусканням ґрунту крізь сито з вічком2 мм для усунення дрібного каміння, часток рослин та фауни. Передпросіюванням необхідно запобігати надмірного висушування таподрібнення ґрунту (15).
У випадках, коли відбір зразків у полі ускладнюється в зимовупору року (ґрунт заморожений або покритий снігом), їх можнаотримати з ґрунту, що зберігався у теплиці під шаром рослинності(напр. злакових або злаково-бобових рослин). Суттєва переваганадається дослідженню ґрунтів, свіже зібраних з польових ділянок,але якщо зібраний та оброблений ґрунт доводиться зберігати переддослідженням, умови зберігання повинні бути придатними, азберігання тривати лише протягом певного часу (не більше, ніж3 місяці при температурі (4 +- 2 град.С) для підтриманняжиттєдіяльності мікроорганізмів(1). Детальні вказівки щодозбирання, обробки та зберігання ґрунтів для використання удослідах на біологічне перетворення можна знайти у(8)(10)(15)(26)(27).
----------------
(1) Як показали останні дослідження, ґрунти з помірнихтемпературних зон можуть також зберігатись при температурі- 20 град.C протягом більше, ніж трьох місяців, без суттєвої шкодидля мікроорганізмів.
Перед використанням обробленого ґрунту в даному дослідженні,його необхідно попередньо витримати протягом достатнього часу дляпроростання та видалення насіння і для повторного встановленнярівноваги мікробного метаболізму після переходу від умовзберігання до умов витримування. Загалом, період попередньоговитримування протягом від двох до 28 днів при температурі тавологості, що наближаються до дослідних, вважається прийнятним.Загальний час зберігання та попереднього витримування не повиненперевищувати 3 місяці.
1.9. ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.9.1. Дослідні умови
1.9.1.1. Дослідна температура
Впродовж усього періоду дослідження ґрунти повиннізберігатись у темряві при постійній температурі, яка є характерноюдля місця, де відбуватиметься використання або утилізація. Дляусіх дослідних речовин, що можуть потрапити в ґрунт у зонах зпомірним кліматом рекомендується температура 20 +- 2 град.С.Температуру необхідно контролювати.
Для хімічних речовин, що застосовуються або утилізуються взонах з холоднішим кліматом (напр. у північних країнах протягомосінньо-зимового періоду), необхідно ввести додаткові зразкиґрунту, які витримуються при нижчих температурах (напр.10 +- 2 град.С).
1.9.1.2. Вміст вологи
Для досліджень перетворення у аеробних умовах, вміст вологи уґрунті(2) повинен бути встановлений та підтримуватись на рівні pFміж 2,0 та 2,5 (3). Вміст вологи виражається у масі води,поділеній на масу сухого ґрунту, і повинна постійно контролюватись(напр. раз у 2 тижні) шляхом зважування колби для витримування ікомпенсування втрат вологи додаванням води (бажано, стерилізованоїта фільтрованої проточної води). Необхідно звернути увагу на те,щоб за можливості зменшити втрати дослідної сполуки та/абопродуктів перетворення через випаровування та/або фоторозпад (якщовідбувається) під час додавання вологи.
----------------
(2) Для підтримання потрібного рівня аерації та живленняґрунтової мікрофлори, ґрунти не повинні бути ані надто вологими,ані надто сухими. Вміст вологи, що рекомендується для оптимальногоросту мікроорганізмів становить від 40-60% вологоутримувальноїздатності (WHC) та від 0,1-0,33 бар (6). Останній діапазондорівнює діапазону pF 2,0-2,5. Типовий вміст вологи у різнихґрунтах подається в Додатку 2.
Для дослідження перетворення в анаеробних умовах чисуглинках, ґрунт насичується водою шляхом затоплення.
1.9.1.3. Аеробні умови витримування
У проточних системах аеробні умови підтримуються шляхомперіодичного промивання або безперервного вентилювання зволоженимповітрям. У колбах для біологічного визначення обмін повітряпідтримується дифузією.
1.9.1.4. Стерильні умови витримування
Для того, щоб отримати дані про відповідність абіотичногоперетворення дослідної сполуки, зразки ґрунту можна стерилізувати(для інформації про методи стерилізації див. 16 та 29), оброблятистерильною дослідною речовиною (напр. шляхом подачі розчину крізьфільтр для стерилізації) та провітрювати стерильним зволоженимповітрям, як зазначено у Розділі 1.9.1.6.
1.9.1.5. Анаеробні умови витримування
Для встановлення та підтримання анаеробних умов, зразокґрунту після обробки дослідною речовиною та витримування ваеробних умовах протягом 30 днів або одного періоду напіврозпаду,або DT50 (залежно від того, який період коротший) затоплюєтьсяводою (шар води 1-3 см), а система для витримування продуваєтьсяінертним газом (напр. нітрогеном або аргоном)(1). Дослідна системаповинна дозволяти вимірювати рівень рН, концентрацію кисню,окислювально-відновлювальний потенціал та мати пристрої длязатримки летких сполук. Система з використанням колби длябіологічного визначення повинна бути ізольованою для запобіганняпотрапляння повітря через дифузію.
----------------
(1) Аеробні умови превалюють у поверхневих та навітьпідповерхневих шарах ґрунту, за результатами дослідного проекту,профінансованого ЄС (K. Takagi et al. (1992). Microbial diversityand activity in subsoil: Methods, field site, seasonal variationin subsoil temperatures and oxygen contens. Proc. Internat. Symp.Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August1992, Sigtuna, Sweden). Анаеробні умови можуть виникати періодичнопід час повені, після сильних злив або в результаті затопленнярисових полів.
1.9.1.6. Умови витримування для суглинків
Для вивчення перетворення у суглинкових (рисових) ґрунтах,ґрунт затоплюється шаром води товщиною приблизно 1-5 см а досліднаречовина вводиться у водну фазу (9). Рекомендується глибина ґрунтупринаймні 5 см. Система провітрюється аналогічно до аеробних умов.Необхідно контролювати та фіксувати рівень рН, концентрацію киснюта окисно-відновний потенціал водного шару. Попередній періодвитримування перед початком дослідження перетворення повиненстановити не менше, ніж два тижні (див. Розділ 1.8.3.2).
1.9.1.7. Тривалість дослідження
Зазвичай, тривалість дослідження інтенсивності та шляхівперетворення не повинна перевищувати 120 днів(2) (3)(6)(8),оскільки після цього періоду в лабораторній системі, ізольованійвід природного відновлення, очікується спад активності ґрунтовихмікроорганізмів. За необхідності охарактеризувати розкладаннядослідної сполуки, а також утворення та розкладання основнихпродуктів перетворення, дослідження можна продовжити (напр. на 6або 12 місяців) (8). Збільшення періодів витримування повиннеобґрунтовуватись у звіті про дослідження та супроводжуватисьвимірюваннями біомаси на початку та в кінці витримування.
----------------
(2) Аеробні дослідження можуть бути припинені задовго дозакінчення терміну 120 днів, за умови що кінцевий шляхперетворення та кінцева мінералізація були чітко встановлені.Дослідження можна припинити після закінчення 120 днів або коливідбулось перетворення щонайменше 90% дослідної сполуки, але лишеза умови що утворилось мінімум 5% CO .
2
1.9.2. Виконання дослідження
Приблизно від 50 до 200 грамів ґрунту (сухої ваги)поміщуються у кожну колбу для витримування (див. Малюнки 1 та 2 уДодатку 3) і обробляються дослідною речовиною відповідно до одногоз методів, описаних у Розділі 1.8.2. У випадку використанняорганічних розчинників для введення дослідної речовини, їхнеобхідно видалити з ґрунту шляхом випарювання. Потім ґрунтпотрібно ретельно перемішати лопаткою, або струшуючи колбу. Якщодослідження проводиться в умовах для суглинку, воду та ґрунтнеобхідно ретельно змішати після введення дослідної речовини.Маленькі аліквоти (напр. 1 г) обробленого ґрунту потрібнопроаналізувати на наявність дослідної речовини з метою перевіркирівномірності розподілення останньої. Інший можливий метод поданодалі.
Інтенсивність обробки ґрунту повинна відповідати найвищійконцентрації застосування засобу для захисту врожаю, вказаній вінструкції з використання, та глибині рівномірного розподіленняречовини в польових умовах (напр. верхній шар ґрунту, товщиною10 см(3)). Наприклад, для сполук, що наносяться на листя або наґрунт без введення, глибина, що використовуватиметься дляобчислення кількості дослідної сполуки, яку потрібно додати укожну колбу, становитиме 2,5 см. Для сполук, що вводяться в ґрунт,відповідна глибина береться з інструкції з використання. Длязвичайних хімічних сполук інтенсивність введення обчислюється наоснові найбільш типового шляху потрапляння в ґрунт; наприклад,якщо сполука найчастіше потрапляє в ґрунт через стічний осад, їїнеобхідно ввести в осад, встановивши концентрацію, щовідповідатиме її звичайній концентрації в осаді, а потім додатиосад до ґрунту в кількості, що відображає нормальний вміст осаду вґрунті.
----------------
(3) Початкову концентрацію на одиницю площі можна підрахуватиза наступним рівнянням:
6
A (kg/ha) · 10 (mg/kg)
C = (mg/kg ) = ----------------------------------
soil soil 4 2 3
l(m) · 10 (m /ha) · d (kg /m )
soil
-1
C = Початкова концентрація в ґрунті (мг·кг )
soil
-1
A = Інтенсивність введення (кг·га ); l = товщина шару ґрунту -3в польових умовах (м); d = загальна густина ґрунту (кг·м ).
-1
Як показує практика, інтенсивність завантаження 1 кг·га дає -3концентрацію в ґрунті приблизно 1 кг·м на 10-сантиметровий шар
-3
ґрунту (якщо допустити, що загальна густина становить 1 г·см ).
Якщо така концентрація є недостатньою для визначення основнихпродуктів перетворення, корисними можуть виявитись додатковізразки ґрунту з вищою інтенсивністю обробки, проте, необхідноуникати концентрацій, що впливають на функції мікроорганізмів уґрунті (див. Розділи 1.5 та 1.8.2).
Як варіант, більша кількість ґрунту (тобто, 1-2 кг) можепіддаватись обробці дослідною сполукою, ретельно перемішуватись увідповідному приладі для змішування, а потім розбиватись на меншічастини від 20 до 200 г і поміщуватись у колби для витримування(за допомогою, наприклад, розщеплювача для проб). Малі аліквоти(напр. 1 г) обробленого ґрунту повинні аналізуватись на наявністьдослідної речовини з метою перевірки рівномірності розподілення.Такій процедурі надається перевага, оскільки вона забезпечує більшрівномірне розподілення дослідної речовини у ґрунті.
Крім того, необроблені зразки ґрунту витримуються в умовах(аеробних), ідентичних тим, у яких перебувають зразки, обробленідослідною речовиною. Вони використовуються для вимірювання біомасипід час та в кінці дослідження.
У випадку, якщо дослідна речовина вводиться у зразки,розчинені в органічному розчиннику (розчинниках), зразки ґрунту,оброблені такою ж кількістю розчинника, витримуються в умовах(аеробних), ідентичних тим, у яких перебувають зразки, обробленідослідною речовиною. Ці зразки використовуються для вимірюваннябіомаси на початку, під час та в кінці дослідження, з метоювизначення впливу розчинника на мікробну біомасу.
Колби з обробленим ґрунтом приєднуються до проточної системи,показаною на Малюнку 1, або закриваються абсорбційною колонкою,зображеною на Малюнку 2 (див. Додаток 3).
1.9.3. Відбір проб та вимірювання
Через встановлені інтервали часу проби ґрунту екстрагуються здодаткових колб за допомогою розчинників з різною полярністю таперевіряються на вміст дослідної речовини та/або продуктіврозпаду. Добре розрахований план дослідження повинен передбачатидостатню кількість колб, таким чином, щоб дозволити використаннядвох колб під час кожного відбору проб. Абсорбційні розчини татверді абсорбенти також дістаються через різні інтервали часу (разу 7 днів протягом першого місяця та раз у 17 днів пізніше) напочатку та під час кожного витримування і перевіряються на вмістлетких сполук. Крім проби ґрунту, що перевіряється одразу післявведення (нульова проба), потрібно встановити ще п'ять періодіввідбору проб. Інтервали часу повинні давати змогу визначити схемурозкладання дослідної сполуки та схеми утворення та розкладанняпродуктів перетворення (напр. 0, 1, 3, 7 день; 2, 3 тижні; 1, 2, 3місяці тощо).
У випадку використання дослідних речовин, що містять мічені 14ізотопи С, залишкова радіоактивність визначається шляхомспалювання, і для кожного періоду відбору проб розраховуєтьсябаланс мас.
У випадку анаеробного або суглинкового витримування, ґрунт тавода можуть або розділятись перед екстрагуванням та перевіркою,або аналізуватись разом на наявність дослідної сполуки абопродуктів перетворення.
1.9.4. Додаткові дослідження
Дослідження в аеробному нестерильному режимі з додатковимизначеннями температури та вологості ґрунту можуть бути кориснимидля оцінки впливу температури та вологості на інтенсивністьперетворення дослідної речовини та/або її похідних в ґрунті.
Можна спробувати виконати подальший аналіз залишковоїрадіоактивності, використовуючи, наприклад, метод суперкритичноїфлюїдної екстракції.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Кількість дослідної сполуки, продуктів розпаду, летких сполук(обов'язково у відсотках), а також залишкових продуктів повиннаподаватись у відсотках від початкової введеної концентрації і, де
-1
потрібно, у мг·кг ґрунту (сухої ваги) для кожного періоду
відбору проб. Графік концентрації дослідної сполуки в залежності
від часу дозволяє підрахувати період її піврозпаду перетворення
або DT .
50
Основні продукти перетворення потрібно ідентифікувати, а їхконцентрації нанести в залежності від часу для відображенняінтенсивності їх утворення та розкладання. Основним продуктомрозпаду вважається будь-яка сполука, кількість якої перевищує 10%від введеної дози у будь-який час протягом дослідження.
Затримані леткі речовини свідчать про здатність довипаровування дослідної речовини або її похідних у ґрунті.
Більш точні значення періодів напіврозпаду або DT та, якщо 50застосовуються, DT та DT отримуються шляхом виконання
75 90
розрахунків за відповідною кінетичною моделлю. Період піврозпаду
та DT повинні фіксуватись у звіті, так само як опис моделі, що
50
використовується, кінетичний порядок та коефіцієнт визначення
2
(r ). Перевага надається кінетиці першого порядку до тих пір, поки
2
r < 0,7. За можливості, розрахунки повинні також виконуватись для
основних продуктів перетворення. Приклади відповідних моделей
описуються в посиланнях 31-35.
У випадку, якщо дослідження виконуються при різнихтемпературах, інтенсивність перетворення повинна описуватись якфункція температури в межах дослідного діапазону, використовуючизалежність Ареніуса, що має такий вигляд:
-B/T B
k = A · e or ln k = 1nA - ---
T
де ln A та В - константи регресії, отримані з вільного члената кута нахилу кривої найбільшої відповідності, побудованої залінійною регресією ln k в залежності від 1/Т, k - константаінтенсивності за температури Т і Т - температура в Кельвінах.Необхідно звернути увагу на те, що рівняння Ареніуса справджуєтьсялише для певного діапазону температури, у випадку, якщоперетворення зумовлюється дією мікроорганізмів.
2.2. ОЦІНКА ТА ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Хоча дослідження виконується в лабораторних умовах, йогорезультати дозволяють оцінювати інтенсивність перетвореннядослідної сполуки, а також інтенсивність утворення та розкладанняїї похідних у польових умовах (36)(37).
Дослідження шляхів перетворення сполуки дає інформацію проте, яких структурних змін зазнає дослідна речовина у ґрунті піддією хімічних та мікробних реакцій.
3. ЗВІТУВАННЯ
ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про дослідження повинен включати наступні дані:
Дослідна речовина:
- загальна назва, хімічна назва, номер CAS, структурнаформула (розташування міток, якщо використовуються мічені ізотопи)та відповідні фізико-хімічні властивості (див. Розділ 1.5),
- чистота (домішки) дослідної речовини,
- радіохімічна чистота мічених елементів та питомарадіоактивність (якщо використовується).
Стандартні речовини
- хімічна назва та структура стандартних речовин, щовикористовуються для аналізу та/або визначення продуктівперетворення.
Дослідні ґрунти
- відомості про місце відбору зразків,
- дату і процедуру відбору зразків ґрунту,
- характеристики ґрунту, такі як рН, вміст органічноговуглецю, структура (% піску, % мулу, % глини), здатність докатіонового обміну, об'ємна густину, властивості щодо утриманнявологи і мікробна біомаса,
- довжина складування ґрунту і умови складування (якщо вінскладується).
Умови досліду:
- дати проведення дослідів,
- об'єм дослідної речовини, що використовувалась,
- розчини, що використовувались і метод застосуваннядослідної речовини,
- вага ґрунту, що піддавався початковій обробці і з якоговідбирались зразки в кожний з визначених періодів для аналізу,
- опис інкубаційної системи, що використовувалась,
- рівні потоку повітря (тільки для повітря, що проходилочерез систему),
- температура експериментальної настройки,
- вміст вологи в ґрунті впродовж інкубації,
- об'єм мікробної біомаси на початку, впродовж і післязавершення аеробних дослідів,
- концентрація рН, кисню і окисно-відновлюваного потенціалуна початку, впродовж і після завершення анаеробних дослідів ідослідів на рисовому полі,
- метод (методи) добування,
- метод кількісного аналізу та ідентифікації дослідноїречовини і основних продуктів трансформації в ґрунті таабсорбуючих матеріалах,
- кількість повторів і контролів.
Результати:
- результати визначення мікробної активності,
- повторюваність і чутливість аналітичних методів, щовикористовувались,
- ступінь відновлення (% значення для досліду зазначені всекції 1.7.1),
- таблиці результатів, виражених у вигляді % від застосованої -1початкової дози, якщо необхідно, як мг·кг ґрунту (на підставіваги в сухому стані),
- баланс мас впродовж і після закінчення дослідів,
- характеристика невід'ємної (прив'язаної) радіоактивностіабо залишків в ґрунті,
