(12) W.Kordel, G.Kotthoff, J.Muller (1995) HPLC-screeningmethod for the determination of the adsorption coefficient onsoil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
Додаток
Таблиця 1
Порівняння показників К для ґрунтів та осаду
oc
стічних вод, а також розраховані показники
за методом ВЕРХ-сканування (1), (2)
--------------------------------------------------------------------------
| Речовина | N CAS |log K |log K |Дельта|log K |log K |Дельта|
| | | oc| oc| | oc| oc| |
| | | осаду | ВЕРХ | |ґрунтів| ВЕРХ | |
| | |стічних| | | | | |
| | | вод | | | | | |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Атразин |1912-24-9| 1,66 | 2,14 | 0,48 | 1,81 | 2,20 | 0,39 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Лінурон |330-55-2 | 2,43 | 2,96 | 0,53 | 2,59 | 2,89 | 0,30 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Фентіон |55-38-9 | 3,75 | 3,58 | 0,17 | 3,31 | 3,40 | 0,09 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Монурон |150-68-5 | 1,46 | 2,21 | 0,75 | 1,99 | 2,26 | 0,27 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Фенантрен |85-01-8 | 4,35 | 3,72 | 0,63 | 4,09 | 3,52 | 0,57 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Феніловий ефір |93-99-2 | 3,26 | 3,03 | 0,23 | 2,87 | 2,94 | 0,07 |
|бензойної | | | | | | | |
|кислоти | | | | | | | |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Бензамід |55-21-0 | 1,60 | 1,00 | 0,60 | 1,26 | 1,25 | 0,01 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|4-нітробензамід |619-80-7 | 1,52 | 1,49 | 0,03 | 1,93 | 1,66 | 0,27 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Ацетанілід |103-84-4 | 1,52 | 1,53 | 0,01 | 1,26 | 1,69 | 0,08 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|Анілін |62-53-3 | 1,74 | 1,47 | 0,27 | 2,07 | 1,64 | 0,43 |
|----------------+---------+-------+-------+------+-------+-------+------|
|2,5-дихлоранілін|95-82-9 | 2,45 | 2,59 | 0,14 | 2,55 | 2,58 | 0,03 |
|------------------------------------------------------------------------|
|(1) W.Kordel, D.Hennecke, M.Herrmann, (1997) Application of the |
|HPLC-screening method for the determination of the adsorption |
|coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128. |
|(2) W.Kordel, D.Hennecke, C.Franke, (1997) Determination of the |
|adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. |
|Chemosphere, 35(1/2), p. 107-119. |
--------------------------------------------------------------------------
Таблиця 2
Результати міжлабораторного порівняльного
тестування (11 лабораторій-учасниць), виконаного
для удосконалення та підтвердження ВЕРХ-методу (1)
------------------------------------------------------------------
| Речовина | N CAS | log K | K | log K |
| | | oc | oc | oc |
| | |------------+----------------------|
| | | (ОЕСР 106) | (ВЕРХ-метод) |
|---------------+------------+------------+----------------------|
|Атразин | 1912-24-9 | 1,81 | 78 +- 16 | 1,89 |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Монурон | 150-68-5 | 1,99 | 100 +- 8 | 2,00 |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Тріапентенол | 77608-88-3 | 2,37 | 292 +- 58 | 2,47 |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Лінурон | 330-55-2 | 2,59 | 465 +- 62 | 2,67 |
|---------------+------------+------------+------------+---------|
|Фентіон | 55-38-9 | 3,31 | 2062 +- 648| 3,31 |
|----------------------------------------------------------------|
|(1) W.Kordel, G.Kotthoff, J.Muller (1995) HPLC-screening |
|method for the determination of the adsorption coefficient on |
|soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384. |
------------------------------------------------------------------
Таблиця 3
Рекомендовані еталонні речовини
для методу ВЕРХ-сканування на основі даних
про адсорбцію ґрунтів
------------------------------------------------------------------
| Еталонна | N CAS |log K | Кількість |log S.D.|Джерело|
| речовина | | oc| даних K | | |
| | | | oc | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Ацетанілід | 103-84-4 | 1,25 | 4 | 0,48 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Фенол | 108-95-2 | 1,32 | 4 | 0,70 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|2-нітробензамід | 610-15-1 | 1,45 | 3 | 0,90 | (b) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|N,N- | 611-74-5 | 1,52 | 2 | 0,45 | (a) |
|диметилбензамід | | | | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|4-метилбензамід | 619-55-6 | 1,78 | 3 | 1,76 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Метилбензоат | 93-58-3 | 1,80 | 4 | 1,08 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Атразин |1912-24-9 | 1,81 | 3 | 1,08 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Ізопротурон |34123-59-6| 1,86 | 5 | 1,53 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|3-нітробензамід | 645-09-0 | 1,95 | 3 | 1,31 | (b) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Анілін | 62-53-3 | 2,07 | 4 | 1,73 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|3,5- | 121-81-3 | 2,31 | 3 | 1,27 | (b) |
|динітробензамід | | | | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Карбендазим |10605-21-7| 2,35 | 3 | 1,37 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Триадименол |55219-65-3| 2,40 | 3 | 1,85 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Триазоксид |72459-58-6| 2,44 | 3 | 1,66 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Триазофос |24017-47-8| 2,55 | 3 | 1,78 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Лінурон | 330-55-2 | 2,59 | 3 | 1,97 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Нафтален | 91-20-3 | 2,75 | 4 | 2,20 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Ендосульфан-діол|2157-19-9 | 3,02 | 5 | 2,29 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Метіокарб |2032-65-7 | 3,10 | 4 | 2,39 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Кислотний жовтий|63405-85-6| 3,16 | 4 | 2,83 | (a) |
|219 | | | | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|1,2,3- | 87-61-6 | 3,16 | 4 | 1,40 | (a) |
|трихлоробензен | | | | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|г-ізомер ГХЦГ | 58-89-9 | 3,23 | 5 | 2,94 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Фентіон | 55-38-9 | 3,31 | 3 | 2,49 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Конго червоний |2610-11-9 | 3,43 | 4 | 2,68 | (a) |
|81 | | | | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Піразофос |13457-18-6| 3,65 | 3 | 2,70 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|б-ендосульфан | 959-98-8 | 4,09 | 5 | 3,74 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Диклофоп-метил |51338-27-3| 4,20 | 3 | 3,77 | (c) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Фенантрен | 85-01-8 | 4,09 | 4 | 3,83 | (a) |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|Основний синій |26850-47-5| 4,89 | 4 | 4,46 | (a) |
|41 (змішаний) | | | | | |
| |----------+-------+-----------+--------+-------|
| |12270-13-2| | | | |
|----------------+----------+-------+-----------+--------+-------|
|ДДТ | 50-29-3 | 5,63 | 1 | - | (b) |
|----------------------------------------------------------------|
|(a) W.Kordel, J.Muller (1994). Bestimmung des |
|Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. |
|UBA R & D Report No. 106 01 044 (1994). |
|(b) B.V.Oepen, W.Kordel, W.Klein., (1991) Chemosphere, 22, |
|p. 285-304. |
|(с) Дані отримані під час виробничого процесу. |
------------------------------------------------------------------
С.20. ТЕСТУВАННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ФУНКЦІЇ
ДАФНІЇ МАГНА (DAPHNIA MAGNA)
1. МЕТОД
Цей метод тестування впливу токсичності на репродуктивнуфункцію дублюється з TG 211 ОЕСР (1998).
1.1. ВСТУП
Первинною метою тестування є оцінка впливу хімічних речовинна репродуктивну функцію Daphnia magna.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Материнські особини: самки дафнії, які є в наявності напочаток тестування та репродуктивна функція яких є об'єктомдослідження.
Потомство: молоді особини дафнії, народжені материнськимиособинами у ході тестування.
Найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК): ценайнижча концентрація при тестуванні, за якої речовина маєстатистично значимий вплив на репродуктивну функцію та смертністьматеринських особин (при р < 0,05), у порівнянні з контрольнимзразком, за встановлений час дії такої речовини. Проте всі тестовіконцентрації, які є вищими за НСЕК, повинні мати шкідливий вплив,що дорівнює або вищий за той, який спостерігається при НСЕК. Увипадку, якщо ці дві умови не можуть бути задоволені, маєнадаватися детальне пояснення того, яким чином було обрано НСЕК (атакож КНВЕ).
Концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ): цетестова концентрація, значення якої лежить безпосередньо під НСЕКі яка, в порівнянні з контрольним зразком, не має статистичнозначимого впливу (при р < 0,05) за встановлений час дії.
ЕК : це концентрація тестової речовини, розчиненої у воді, що xмає результатом скорочення репродуктивної функції Daphnia magna нах% за встановлений час дії.
Швидкість експоненціального росту: критерій вимірюваннязростання популяції, що об'єднує коефіцієнт розмноження таповіковий коефіцієнт смертності (20)(21)(22). В популяціях, щознаходяться в положенні рівноваги, вона дорівнює нулю. Длязростаючих популяцій показник є позитивним, а для популяцій,чисельність яких скорочується, він негативний. Зрозуміло, щоостанній не є стійким і в кінцевому рахунку призводить довимирання популяції.
Межа виявлення: це найнижча концентрація, яка може бутивиявлена, але не виражена в кількісній формі.
Межа визначення: це найнижча концентрація, яка може бутивиражена в кількісній формі.
Смертність: особина фіксується як мертва у випадку, якщо вонанерухома, тобто якщо вона не здатна плавати або якщо неспостерігається руху відростків або задньої частини черевцяпротягом 15 секунд після легкого збовтування тестового контейнера.(Якщо використовується інше визначення, воно має наводитися разомз посиланням).
1.3. ПРИНЦИП ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Молоді самки дафнії (материнські особини), що віком менше24 годин на початок тестування, поміщаються в тестову речовину,додану до води згідно діапазону показників концентрації.Тестування триває 21 день. По закінченню тестування оцінюєтьсязагальна кількість живого потомства на одну материнську особину,що залишилася живою на кінець тестування. Це означає, що мальки,народжені дорослими особинами, які померли протягом періодутестування, не включаються до розрахунків. Коефіцієнт розмноженняматеринських особин може виражатися іншими способами (наприклад,кількість живого потомства, народженого особиною за день,починаючи з першого дня, коли було помічено потомство), але їхслід вказувати додатково до загальної кількості мальків,народжених материнською особиною, що залишилася живою на кінецьтестування. Коефіцієнт розмноження особин, що спостерігався утестовій речовині, порівнюється з аналогічним показникомконтрольного зразка (зразків) з метою визначення найнижчоїспостереженої ефективної концентрації (НСЕК) та, відповідно,концентрації, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ). Крімтого, наскільки це можливо, дані аналізуються з застосуваннямрегресійної моделі для оцінки концентрації, що спричинила бзменшення коефіцієнта розмноження на х% (наприклад, ЕК , ЕК або
50 20
ЕК ).
10
Також необхідно вказувати виживаність материнських особин тачас народження першого виводку. Крім того, можуть досліджуватисятакож інші фактори впливу речовини на параметри, такі як зростання(наприклад, довжина) та, можливо, швидкість експоненціальногоросту.
1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ТЕСТОВУ РЕЧОВИНУ
Мають бути доступні результати тестування на гострутоксичність (див. Метод С.2., частина 1), проведеного для Daphniamagna. Результат може бути корисним при відборі відповідногодіапазону тестових показників концентрації у тестуваннірепродуктивної функції. Мають бути відомі розчинність у воді таповерхневе натягнення тестової речовини, а також доступний длязастосування надійний аналітичний метод для розрахунку кількостіречовини у тестових розчинах із вказаною відновною ефективністю тамежа визначення.
Інформація про тестову речовину, яка може бути корисна привстановленні тестових умов, включає структурну формулу, ступіньчистоти речовини, стійкість на світлі, стійкість в умовахтестування, рК , Р та результати тестування на повний біорозпад
a ow
(див. Метод С.4.).
1.5. НАДІЙНІСТЬ ТЕСТУВАННЯ
Для підтвердження надійності тесту в контрольних зразкахмають бути дотримані такі робочі критерії:
- смертність материнських особин (самок дафнії) не перевищує20% на кінець тестування;
- середня чисельність живого потомства, народженаматеринською особиною, що залишилася живою на кінець тестування,становить >= 60.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Прилад
Посуд та інші прилади для проведення тестування, які будутьконтактувати з тестовими розчинами, мають бути виготовлені цілкомзі скла або іншого хімічно інертного матеріалу. Зазвичай у якостіємностей для тестування використовують мензурки.
Крім того, необхідно мати дещо з наступного обладнання:
- оксиметр (з мікроелектродом або іншим відповіднимобладнанням для вимірювання розчиненого кисню у зразках малогооб'єму),
- належний прилад для температурного контролю,
- вимірювач рН,
- обладнання для визначення жорсткості води,
- обладнання для визначення загальної концентраціїорганічного вуглецю (КОВ) у воді або обладнання для визначенняхімічної потреби в кисні (ХПК),
- належний прилад для контролю режиму освітлення тавимірювання інтенсивності світла.
1.6.2. Тестові організми
Вид дафній, що використовується у тестуванні, має назвуDaphnia magna Straus. Можуть також використовуватися інші видидафній, за умови, що вони відповідають встановленим критеріямнадійності (до дафній має відноситися критерій надійності, щостосується репродуктивної функції у контрольних зразках). Увипадку використання інших видів дафній вони мають бути чіткоідентифіковані, а їхнє використання обґрунтоване.
Бажано, щоб клон був ідентифікований шляхом генотипування.Дослідження (1) показало, що репродуктивна функція Клону А (щопоходить з Інституту досліджень з прикладної хімії у Франції) (3)постійно відповідає критерію надійності щодо середньої чисельностіпотомства >= 60 на живу материнську особину у випадку йогокультури в умовах, описаних у цьому методі. Проте використанняінших клонів також можливе за умови, що культура дафній відповідаєкритеріям надійності для тестування.
На початку тестування особини мають бути віком менше 24 дніві не повинні належати до потомства першого виводку. Вони маютьпоходити зі здорового роду (тобто не мати жодних негативних ознак,таких як висока смертність, присутність самців та ефіпіуму,затримок у народженні першого виводку, знебарвлених особин тощо).Дафнії мають утримуватися в умовах культивування (світло,температура, середовище, корм і кількість особин на одиницюоб'єму) подібних до тих, що мають забезпечуватися під час тесту.Якщо середовище для культури дафній, що має забезпечуватися підчас тестування, відрізняється від того, що зазвичайвикористовується у культурі дафній, добре було б включитипереддослідний період акліматизації тривалістю близько 3 тижнів(тобто одне покоління) з метою уникнення стресового навантаженняна материнські особини.
1.6.3. Тестове середовище
Рекомендується використовувати для цього тесту середовищевизначеного складу. Це допоможе уникнути використання додатковихкомпонентів (наприклад, морських водоростей, ґрунтових витяжоктощо), які складно характеризувати, а також підвищить можливостістандартизації між лабораторіями. Встановлено, що середовищаЕлендт М4 (4) та М7 (див. Додаток 1) відповідають цій меті. Протеінші середовища (наприклад, (5) (6)) також прийнятні за умови, щохарактеристики культури дафній відповідають критеріям надійностідля тестування.
Якщо використовуються середовища, що включають невизначенікомпоненти, такі компоненти мають чітко описуватися, при цьому взвіті про тестування має наводитися інформація про склад, зокремащодо вмісту вуглецю, оскільки цей фактор може вплинути напередбачений раціон. Рекомендується визначити загальнуконцентрацію органічного вуглецю (КОВ) та/або хімічну потребу вкисні (ХПК) при приготуванні суміші органічної добавки, а такожзробити розрахунок результуючого впливу на КОВ/ХПК у тестовомусередовищі. Рекомендується, щоб рівні КОВ у середовищі (тобтоперед додаванням водоростей) становили менше 2 мг/л (7).
При тестуванні речовин, що містять метали, важливорозпізнати, що властивості тестового середовища (наприклад,жорсткість, здатність до хелатоутворення) можуть мати відношеннядо токсичності тестової речовини. Внаслідок цього бажано матиповністю визначене середовище. Проте на даний час єдиним повністювизначеним середовищем, яке, як доведено, підходить длядовготривалого культивування Daphnia magna, є Елендт М4, а такожМ7. Обидва типи середовища містять хелатуючий агентетилендіамінтетраоцтову кислоту. Дослідження показали (2), що"очевидна токсичність" кадмію зазвичай нижча у випадку, якщотестування на репродуктивну функцію проводиться у середовищах М4та М7, ніж у середовищах, що не містять ЕДТК. Внаслідок цього М4та М7 не рекомендуються для тестування речовин, що містять метали,а також слід уникати інших середовищ, що містять відомі хелатуючіагенти. Для металовмісних речовин можна порадити використовуватиальтернативне середовище, наприклад, рекомбіновану жорстку пріснуводу АСТМ (7), яка не містить ЕДТК, з додаванням витяжки морськихводоростей (8). Такий комплекс рекомбінованої жорсткої прісноїводи АСТМ та витяжки морських водоростей також підходить длядовготривалої культури та тестування Daphnia magna (2), хоча вінвсе-таки проявляє слабку хелатуючу дію завдяки органічномукомпоненту у доданій витяжці морських водоростів.
На початку та протягом тестування концентрація розчиненогокисню має перевищувати 3 мг/л. Рівень рН має знаходитися в межахдіапазону 6-9, при цьому протягом виконання тесту він не повиненколиватися більш, ніж на 1,5 одиниці. Рекомендується жорсткістьвище 140 мг/л (як СаСО ). Тести на такому рівні та вище вважаються
3
такими, що продемонстрували характеристики репродуктивної функції,
що відповідають критеріям надійності (9) (10).
1.6.4. Тестові розчини
Тестові розчини встановленої концентрації зазвичай готуютьсярозведенням базового розчину. Бажано, щоб базові розчиниготувалися розведенням речовини в тестовому середовищі.
В деяких випадках може вимагатися використання органічнихрозчинників та дисперсантів з метою отримання базового розчинуналежної концентрації, але необхідно докласти всіх зусиль дляуникнення використання таких матеріалів. Прикладами належнихрозчинників є ацетон, етанол, метанол, диметилформамід татриетиленгліколь. Прикладами належних дисперсантів є КремофорRH40, метилцелюлоза 0,01% та НСО-40. У будь-якому випадку, тестоваречовина у тестових розчинах не повинна перевищувати межурозчинності у тестовому середовищі.
Розчинники використовуються для отримання базового розчину,який може бути точно дозований у воді. За рекомендованоїконцентрації розчинника у кінцевому тестовому середовищі (тобто<= 0,1 мл/л) розчинники, перераховані вище, не будуть токсичними іне підвищать ступінь розчинності речовини у воді.
Дисперсанти можуть сприяти точному дозуванню та розсіюванню.За рекомендованої концентрації у кінцевому тестовому середовищі(тобто <= 0,1 мл/л) дисперсанти, перераховані вище, не будутьтоксичними і не підвищать ступінь розчинності речовини у воді.
1.7. ПЛАН ТЕСТУВАННЯ
Обробка ємностей для тестування, а також всі подальшіоперації з ємностями для тестування мають здійснюватися удовільному порядку. Невиконання цієї умови може мати наслідкомпохибки, що могли б тлумачитися як вплив розміру концентрації.Зокрема, якщо маніпуляції з експериментальними одиницямипроводяться в порядку обробки або концентрації, у цьому випадкудеякі фактори, що відносяться до часу, наприклад, втома виконавцяабо інша помилка, можуть призвести до серйозніших наслідків привищих концентраціях. Крім цього, якщо є ознаки того, що результатитестування піддалися впливу початкових умов або станунавколишнього середовища при тестуванні, наприклад, розташування влабораторії, має бути розглянуто питання про блокування тесту.
1.8. ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ
1.8.1. Умови проведення
1.8.1.1. Тривалість
Процес тестування триває 21 день.
1.8.1.2. Наповнення
Материнські особини утримуються окремо, одна особина на однуємність для тестування, з 50-100 мл середовища в кожній ємності.
Іноді можуть бути необхідні більші об'єми з метою дотриманнявимог аналітичного методу, що застосовується для визначенняконцентрації тестової речовини, хоча групування зразків дляхімічного аналізу також допускається. Якщо використовуютьсяоб'єми, вищі за 100 мл, раціон, що надається дафніям, можепотребувати збільшення з метою забезпечення належного рівнядоступності корму та відповідності з критеріями надійності. Длятестування у проточному режимі з технічних причин можуть братисядо уваги альтернативні плани (наприклад, чотири групи з 10 особину більшому об'ємі тестової речовини), але будь-які зміни до планутестування мають вказуватися у звіті.
1.8.1.3. Кількість особин
Для тестування у напівстатичному режимі щонайменше 10 особинутримуються поодинці у кожній із тестових концентрацій тащонайменше 10 особин окремо утримується в контрольних зразках.
Для тестування у проточному режимі встановлено, що належитьвикористовувати 40 особин, розділених на чотири групи по 10 особинна кожну тестову концентрацію (1). Може використовуватися меншакількість тестових організмів, при цьому рекомендується мінімально20 особин на один тип концентрації, що розділені на два чи більшезразків з рівною кількістю особин (наприклад, чотири зразки поп'ять особин у кожному). Зверніть увагу, що у випадку з тестами,де тварини утримуються в групах, буде неможливо виразитикоефіцієнт розмноження як загальну чисельність живого потомства,народженого материнською особиною, що є живою по завершеннютестування, якщо материнські особини помирають. У таких випадкахкоефіцієнт розмноження має виражатися як "загальна чисельністьживого потомства, народженого материнською особиною, що є внаявності на початок тестування".
1.8.1.4. Корм
В умовах тестування у напівстатичному режимі бажано, щоб кормнадавався щоденно, але щонайменше три рази на тиждень (тобтовідповідно до змін середовища). Відхилення від такого режиму(наприклад, в умовах тестування в проточному режимі) маютьвказуватися у звіті.
Протягом тестування раціон материнських особин має складатисяз живих клітин водоростей одного чи більшої кількості наступнихвидів: Chlorella sp, Selenastrum capricornutum (заразPseudokirchneriella subcapitata (11)) та Scenedesmus subspicatus.Передбачений раціон має ґрунтуватися на кількості органічноговуглецю (С), що надається кожній материнській особині. Дослідження(12) показали, що для Daphnia magna кількості корму в діапазоні0,1-0,2 мг С/Daphnia/день достатньо, щоб досягнути рівнярозмноження, який вимагається з метою відповідності критеріямнадійності тестування. Раціон може забезпечуватися або увідповідному розмірі протягом періоду тестування, або, забажанням, може бути надано менший розмір на початку і даліпоступово збільшуватися з урахуванням зростання материнськихособин. Проте і в цьому випадку раціон має залишатися у межахрекомендованого діапазону 0,1-0,2 мг С/Daphnia/день протягомвсього часу виконання тестування.
Якщо для забезпечення встановленого об'єму корму (тобто длязручності, оскільки вимірювання вмісту вуглецю є доситьтрудомістким процесом) застосовуються компоненти-замінники,наприклад, кількість клітин водоростей або поглинання світла,кожною з лабораторій має бути виготовлено власну номограму, щостосується компоненту-замінника вуглецю водоростевої культури(див. Додаток 2 для роз'яснення процесу підготовки номограми).Номограми мають перевірятися принаймні раз на рік та частіше, якщоумови культивування водоростей змінювалися. Встановлено, щосвітлопоглинання є кращим замінником вмісту вуглецю, ніж кількістьклітин (13).
Для мінімізації об'єму середовища культури водоростей, щовводиться в ємності для тестування, слід згодовувати дафніямконцентровану суспензію з водоростей. Концентрація водорості можедосягатися центрифугуванням, після якого проводиться повторнимрозведенням у дистильованій, деіонізованій воді або середовищікультури дафній.
1.8.1.5. Освітлення
16-годинне освітлення з інтенсивністю, що не перевищує -2 -115-20 мкЕ · м · с .
1.8.1.6. Температура
Температура тестового середовища має бути в діапазоні18-22 град.С. Проте у межах одного тесту температура не повинна,по можливості, варіюватися більш ніж на 2 град.С у вказаномудіапазоні (наприклад, 18-20, 19-21 або 20-22 град.С). Може бутинеобхідно використовувати додаткову ємність для тестування з метоюзабезпечення температурного контролю.
1.8.1.7. Аерація
Ємності для проведення тестування не повинні піддаватисяаерації протягом проведення тестування.
1.8.2. Тестова концентрація
Зазвичай має бути передбачено щонайменше п'ять видів тестовоїконцентрації на основі геометричного ряду, коефіцієнт розділенняякого не перевищує 3.2, при цьому слід використовувати відповіднукількість екземплярів для тестової концентрації кожного з видів(див. Розділ 1.8.1.3). Має бути надано пояснення у випадку, якщозастосовується менш, ніж п'ять видів тестових концентрацій.Речовини не слід тестувати за концентрацій вищих, ніж встановленадля них межа розчинності у тестовому середовищі.
При визначенні показників концентрації необхідно пам'ятатипро таке:
Якщо метою є досягнення НСЕК/КНВЕ, найнижча тестоваконцентрація має бути достатньо низькою для того, щоб загальнаплодовитість за такої концентрації не була значно нижчою, ніж уконтрольному зразку. Якщо цього не відбувається, тестування маєбути повторене зі зниженою мінімальною концентрацією.
Якщо метою є досягнення НСЕК/КНВЕ, найвища тестоваконцентрація має бути достатньо високою для того, щоб загальнаплодовитість за такої концентрації була суттєво нижчою, ніж уконтрольному зразку. Якщо цього не відбувається, тестування маєбути повторене зі збільшеною максимальною концентрацією.
Якщо визначається ЕК для впливу на репродуктивну функцію, xбажано, щоб використовувалися концентрації, достатні длявизначення ЕК з належним ступенем вірогідності. У випадку
x
визначення ЕК для впливу на репродуктивну функцію бажано, щоб
50
найвища тестова концентрація була більшою, ніж цей показник ЕК .
50
В іншому випадку, хоча визначити ЕК буде можливо, довірчий
50
інтервал для ЕК буде занадто широким і може виявитися неможливим
50
оцінити на задовільному рівні відповідність підібраної моделі.
Бажано, щоб показники тестових концентрацій не включалибудь-які концентрації, що мають статистично значний вплив натривалість життя дорослої особини, оскільки це змінить характертесту з простого тестування репродуктивної функції на комбінованетестування репродуктивної функції та рівня смертності, що вимагаєбільш комплексного статистичного аналізу.
Попередні відомості про токсичність тестової речовини(наприклад, з тестування на гостру токсичність та/або дослідженняз визначення діапазону доз) можуть допомогти у підборі належнихтестових концентрацій.
У випадку, якщо при приготуванні тестових розчинівзастосовується розчинник або дисперсант (див. Розділ 1.6.4), йогокінцева концентрація в ємностях для тестування не повиннаперевищувати 0,1 мл/л і має бути однаковою в усіх ємностях длятестування.
1.8.3. Контрольні зразки
Крім тестової серії має бути приготовано одну контрольнусерію на основі тестового середовища, а також, за необхідності,контрольну серію, що містить розчинник або дисперсант. У такомувипадку концентрація розчинника або дисперсанта має бути такоюсамою, як та, що застосовується у ємностях із тестовою речовиною.Слід використовувати належну кількість екземплярів (див.Розділ 1.8.1.3).
Загалом, при успішно проведеному тестуванні коефіцієнтваріації навколо середньої чисельності живого потомства,народженого материнською особиною в контрольному зразку (зразках),має становити <= 25% і це має бути вказано в звіті для досліднихзразків з використанням індивідуально утримуваних тварин.
1.8.4. Поновлення тестового середовища
Частота поновлення середовища залежатиме від стійкостітестової речовини, але має проводитися щонайменше тричі натиждень. Якщо з попереднього тестування на стійкість (див.Розділ 1.4) очевидно, що концентрація тестової речовини не єстійкою (тобто знаходиться за межами діапазону 80-120% номінальноївеличини або нижча 80% виміряної первинної концентрації) протягоммаксимального періоду поновлення (тобто 3 дні), необхіднорозглянути можливість частішого поновлення середовища абопроведення тестування у проточному режимі.
Якщо поновлення середовища проводиться під час тестування унапівстатичному режимі, готується друга серія ємностей длятестування і материнські особини пересаджуються до них, наприклад,скляною піпеткою відповідного діаметру. Слід мінімізувати об'ємсередовища, що переноситься разом із дафніями.
1.8.5. Спостереження
Результати спостережень, отримані протягом тестування, маютьфіксуватися у протоколі результатів (див. приклади в Додатках 3 та4). Якщо вимагаються інші вимірювання (див. 1.3 та 1.8.8), можутьбути необхідні додаткові примітки.
1.8.6. Потомство
Бажано, щоб потомство, народжене кожною з материнськихособин, видалялося та перераховувалося щоденно від моменту появипершого виводку з метою попередження споживання ним корму,призначеного для дорослої особини. Для цілей цього методунеобхідно розраховувати лише чисельність живого потомства, алеслід вказувати у звіті наявність недорозвинених яєць або мертвогопотомства.
1.8.7. Рівень смертності
Бажано, щоб рівень смертності серед материнських особинфіксувався щоденно, щонайменше у той самий час, колипідраховується чисельність потомства.
1.8.8. Інші параметри
Хоча метод призначений головним чином для оцінки впливів нарепродуктивну функцію, інші параметри також можливо розраховуватив достатньому об'ємі для проведення статистичного аналізу.Настійно рекомендується проводити вимірювання росту, оскільки ценадає інформацію про можливі сублетальні впливи, що може бутибільш корисним, ніж саме визначення репродуктивної функції;рекомендується вимірювання довжини материнських особин (тобтодовжина тіла, за виключенням анального відростку) по закінченнютестування. Інші параметри, які можуть бути виміряні аборозраховані, включають час народження першого виводку (а такожнаступних виводків), чисельність та розмір особин у виводку наодну дорослу тварину, кількість недорозвинених яєць, наявністьсамців або ефіпіуму та швидкість експоненціального роступопуляції.
1.8.9. Частота аналітичних визначень та вимірювань
Показники концентрації кисню, температури, жорсткості тарівня рН мають вимірюватися щонайменше раз на тиждень, у свіжомута старому середовищах, у контрольних зразках та за найвищоїконцентрації тестової речовини.
Протягом тестування концентрації тестової речовинивстановлюються з рівними проміжками.
При тестуванні в напівстатичному режимі, де очікується, щоконцентрація тестової речовини залишатиметься у межах +- 20% відномінального показника (тобто в межах діапазону 80-120% - див. 1.4та 1.8.4), рекомендується аналізувати щонайменше найвищу танайнижчу тестові концентрації у свіжому розчині, а також під часпоновлення один раз протягом першого тижня тестування (тобтоаналіз має проводитися на зразку з того самого розчину - на щойноприготованому та при поновленні). Далі такі визначення слідповторювати принаймні з тижневим інтервалом.
Для тестування, де очікується, що концентрація тестовоїречовини не залишатиметься у межах +- 20% від номінальногопоказника, необхідно аналізувати всі тестові концентрації, щойноприготовані та поновлені. Проте для таких тестувань, де вимірянапервинна концентрація тестової речовини не знаходиться в діапазоні+- 20% від номінального показника, але можуть бути надані достатнідокази того, первинні концентрації є повторюваними та стійкими(тобто знаходяться в межах діапазону 80-120% первиннихконцентрацій), визначення хімічного складу можуть бути скороченіна 2 та 3 тиждень тестування до вимірювання найвищої та найнижчоїтестових концентрацій. При цьому у всіх випадках проводитивизначення концентрації тестової речовини необхідно лише в одномуз екземплярів ємностей для кожного з видів тестових концентрацій.
У випадку застосування тестування в проточному режиміпідходить принцип взяття проби, подібний до описаного длятестування в напівстатичному режимі (але заміри "старих" розчиніву цьому випадку не виконуються). Проте може бути корисно збільшитикількість взяття проб протягом першого тижня (наприклад, три цикливимірів) для підтвердження того, що тестові концентраціїзалишаються сталими. В тестуванні такого типу витрати розчинниката тестової речовини слід перевіряти щоденно.
Якщо є підтвердження того, що концентрація речовини, щотестується, утримується на задовільному рівні у діапазоні +- 20%від номінальної або виміряної первинної концентрації протягомвсього тестування, в такому випадку результати можуть ґрунтуватисяна номінальному або виміряному первинному показнику. Якщовідхилення від номінальної або виміряної первинної концентраціїстановить більше +- 20%, результати слід виражати часовим зваженимкоефіцієнтом (див. Додаток 5).
2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Метою тестування є визначення впливу тестової речовини назагальну чисельність живого потомства, народженого материнськоюособиною, що залишилася живою на кінець тестування. Загальначисельність живого потомства на материнську особину має бутирозрахована для кожної тестової ємності (тобто для кожногоекземпляра). Якщо протягом тестування у якійсь із ємностейматеринська особина помирає або виявляється, що це самець, утакому випадку цей екземпляр виключається з аналізу. При цьомуаналіз буде проводитися на скороченій кількості екземплярів.
Щоб оцінити НСЕК, а звідси КНВЕ, для впливів хімічноїречовини на репродуктивну функцію, необхідно розрахувати середнєзначення коефіцієнта розмноження серед зразків для кожної зконцентрацій та узагальнене залишкове стандартне відхилення, щоможе бути виконано з застосуванням дисперсійного аналізу. Далісереднє значення кожної концентрації має порівнюватися зконтрольним середнім значенням із застосуванням відповідногометоду множинного порівняння. Можуть бути корисними тести Даннетаабо Вільямса (14)(15)(16)(17). Необхідно перевірити, чипідтримується припущення дисперсійного аналізу про однорідністьдисперсій. Рекомендується, щоб це було виконано в графічній формі,а не шляхом формальної перевірки за критерієм значимості (18); уякості альтернативи можна провести тестування за Бартлеттом. Якщоприпущення не підтверджується, слід розглянути можливістьперетворення даних з метою забезпечення однорідності дисперсій допроведення дисперсійного аналізу, або можливість проведеннязваженого дисперсійного аналізу. Має бути розрахований та вказанийу звіті розмір впливу, можливий для виявлення при використанідисперсійного аналізу (тобто мінімальна значима різниця).
Для оцінки концентрації, що може спричинити 50% скороченнярепродуктивної функції (тобто ЕК ), на підставі даних має бути
50
побудована відповідна крива, наприклад, логістична крива, з
застосуванням статистичного методу, зокрема, методу найменших
квадратів. Крива може бути параметризована таким чином, щоб ЕК
50
та його стандартна похибка могли оцінюватися безпосередньо. Це
значно полегшить розрахунок довірчого інтервалу для ЕК . Слід
50
вказувати двосторонній довірчий інтервал у межах 95% у випадку,
якщо немає обґрунтованих підстав віддати перевагу іншому рівню
довірчого інтервалу. Бажано, щоб процедура підбору за точками
передбачала засіб для оцінки значимості невідповідності. Це може
бути виконано графічно або шляхом ділення залишкової суми
квадратів на значення "невідповідності" та "компоненти дійсної
похибки" та проведення перевірки за критерієм значимості для
невідповідності. Оскільки методи обробки, які дають високу
плодовитість, частіше за все мають вищу дисперсію в численності
народженого потомства, ніж методи обробки, що дають низьку
плодовитість, слід розглянути можливість зважування отриманих
значень з метою відображення різних дисперсій у різних групах
обробки (див. довідкову інформацію пос. 18).
В аналізі даних з тестування за принципом кільцевої проби (2)логістична крива була побудована з використанням наступної моделі,хоча можуть використовуватися й інші відповідні моделі:
c
Y = ------------
x b
1 + (---)
x
0
де:
Y = загальна чисельність потомства на материнську особину, щозалишилася живою по закінченню тестування (розраховано для кожноїємності)
x = концентрація речовини
c = очікувана чисельність потомства, якщо х = 0
x = ЕК у популяції
0 50
b = нахил кривої
Ця модель спрацьовує у більшості ситуацій, але можутьтраплятися тести, для яких вона не підходить. Слід проводитиперевірку надійності моделі, як вказано вище. У деяких випадкахможе бути доцільним використання моделі гормезису, у якій низькіконцентрації дають посилений вплив (19).