50
кожну партію активованого мулу для перевірки мулу на наявність
надчутливості.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Інтенсивність дихання активованого мулу, до якого доданостандартний об'єм синтетичних стічних вод, вимірюють післяконтакту, що триває 30 хвилин або три години, або ж через обидвапроміжки часу. Інтенсивність дихання того самого активованого мулуза різної концентрацій досліджуваної речовини чи за іншиханалогічних умов також підлягає вимірюванню. Пригнічуючий впливдосліджуваної речовини при конкретній концентрації подається увідсотках від середнього значення інтенсивності дихання у двохконтрольних групах. Значення ЕК вираховують з результатів
50
аналізу різних концентрацій.
1.5. КРИТЕРІІ ЯКОСТІ
Результати дослідження вважаються дійсними, якщо:
- значення інтенсивності дихання у двох контрольних групахвідрізняються у межах 15%,
- значення ЕК для 3,5-дихлорфенолу (через 30 хвилин та/чи 50три години) знаходяться у прийнятному діапазоні від 5 до30 мг/літр.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Реагенти
1.6.1.1. Розчини досліджуваної речовини
Розчини досліджуваної речовини готують безпосередньо напочатку дослідження, використовуючи резервний розчин. Концентраціярезервного розчину 0,5 г/літр вважається прийнятною за умовдотримання процедури, описаної нижче.
1.6.1.2. Розчин контрольної речовини
Розчин 5,5-дихлорфенолу можна приготувати шляхом розчинення0,5 г 3,5-дихлорфенолу у 10 мл 1 М NaOH, розбавивши отриманийрозчин дистильованою водою приблизно до 30 мл, додаючи зпомішуванням 0,5 М H SO до моменту початку осідання - потрібно
2 4
приблизно 8 мл 0,5 М H SO - і зрештою розбавити суміш
2 4
дистильованою водою до об'єму 1 літр. Коефіцієнт рН при цьому
повинен бути 7-8.
Синтетичні стічні води
Суміш синтетичних стічних вод готують розчиненням наступноїкількості речовин у одному літрі води:
- 16 г пептону,
- 11 г м'ясного екстракту
- 3 г сечовини,
- 0,7 г NaCl,
- 0,4 г CaCl 2H O,
2 2
- 0,2 г MgSO .7H O
4 2
- 2,8 г K HPO .
2 4
Примітка 1: вказані штучні стоки є стократною концентрацієюрозчинів, описаних у Технічному Звіті OECP "Запропоновані методивизначення здатності до біологічного розпаду поверхнево активнихречовин, що використовуються у синтетичних миючих засобах"(11 червня 1976 року) з додаванням гідрофосфату дикалію.
Примітка 2: якщо приготоване середовище не використовуєтьсяодразу, його необхідно зберігати у темному приміщенні притемпературі 0-4 град.С, протягом не більше одного тижня, в умовах,що не призводять до змін у його складі. Перед зберіганнямсередовище можна стерилізувати, або ж додавати м'ясний екстракт тапептон безпосередньо перед проведенням дослідження. Передвикористанням його необхідно ретельно перемішати та встановитипотрібний рівень рН.
1.6.2. Апаратні засоби
Вимірювальні прилади: дотримання певних вимог до дизайну невимагається. Проте, над рідиною повинен бути вільний простір, азонд повинен щільно прилягати до шийки вимірювальної колби.
Використовується звичайне лабораторне обладнання, зокрема:
- вимірювальні прилади,
- прилад для аерації,
- електрод для вимірювання рН та вимірювальне обладнання,
- електрод для вимірювання О .
2
1.6.3. Підготовка інокулянту
Активований мул, отриманий з установки для очищення стічнихвод, переважно, побутового походження, використовується удослідженні у якості мікробного інокулянту.
За необхідності, після отримання мулу лабораторією, великічастинки можна усунути шляхом відстоювання протягом короткого часу(напр. 15 хвилин) та використання зібраного верхнього шарудрібніших твердих частинок. Як варіант, мул можна перемішати задопомогою блендера протягом кількох секунд.
Крім того, якщо вважається, що у мулі присутні гальмівнісполуки, його необхідно промити водою з-під крана або ізотонічнимрозчином. Після центрифугування збирається супернатант. (процедураповторюється тричі).
Невелику кількість мулу зважують та висушують. З цьогозначення можна вивести кількість вологого мулу, яку необхідносуспендувати у воді для отримання інтервалу загальної кількостітвердих частинок, суспендованих у стічній рідині, між 2 і 4г/літр. За такого рівня, концентрація у дослідному середовищіколивається від 0,8 до 1,6 г/літр, за умови, що виконуєтьсяпроцедура, рекомендована нижче.
Якщо немає можливості використати мул у день збору, докожного літру активованого мулу, підготованого, як описано вище,додається 50 мл штучних стоків; отриманий розчин необхіднопровітрювати протягом ночі при температурі 20 +- 2 град.С тапротягом дня до моменту використання. Перед використаннямперевіряється рН і за необхідності, встановлюється на рівні рН6-8. Загальна кількість твердих частинок, суспендованих у стічнійрідині, визначається, як описано у попередньому абзаці.
Якщо вимагається, щоб та ж сама порція мулу використовуваласьпротягом кількох днів (максимум чотири дні), 50 мл штучних стоківповинні додаватись на літр мулу в кінці кожного робочого дня.
1.6.4. Виконання дослідження
Тривалість/час контакту: 30 хвилин та/або три години,
протягом яких відбувається аерація
Вода: Питна вода (дехлорована,
якщо потрібно)
Подача повітря: Чисте, безмасляне повітря. Потік
повітря 0,5-1 літр/хв.
Вимірювальні прилади: Колба з пласким дном, подібна до
склянки БПК
Лічильник кисню: Відповідний електрод для
вимірювання кисню, з самописним
приладом
Живильний розчин: Штучні стоки (див. вище)
Дослідна речовина: Дослідний розчин готується
безпосередньо перед початком
дослідження
Контрольна речовина: напр. 3,5-дихлорфенол (щонайменше
три розчини з різними
концентраціями)
Еталонні розчини: Інокульовані проби без додавання
дослідної речовини
Температура: 20 +- 2 град.С
Можлива процедура, що може застосовуватись як дляконтрольної, так і для дослідної речовини, з тригодинним часомконтакту подається нижче:
Використовуються декілька ємностей (напр. однолітрові хімічнісклянки).
Повинні використовуватись щонайменше п'ять розчинів зконцентраціями, що відрізняються на сталу величину, яка бажано неповинна перевищувати 3,2.
В час "0" 16 мл живильних штучних стоків розбавляються водоюдо 300 мл. Додаються 200 мл мікробного інокулянту і весь розчин(500 мл) виливається у першу ємність (перший контрольний розчинС ).
1
Дослідні ємності потрібно постійно провітрювати таким чином,щоб кількість розчиненого О не була меншою, ніж 2,5 мг/літр і щоб
2
безпосередньо перед вимірюванням інтенсивності дихання,
концентрація О була на рівні 6,5 мг/літр.
2
В час "15 хвилин" (інтервал 15 хвилин є умовним, протезручним) зазначена вище процедура повторюється, проте до 16 млштучних стоків додаються 100 мл основного розчину дослідноїречовини, потім отримана суміш заповнюється водою до 300 мл тамікробним інокулянтом до 500 мл. Після цього розчин виливається удругу ємність і провітрюється, як вказано вище. Процедураповторюється з інтервалом у 15 хвилин, з різними об'ємамиосновного розчину дослідної речовини, в результаті чого отримуєморяд ємностей з різними концентраціями дослідної речовини. В кінціготується ще один еталонний розчин.
Після трьох годин фіксується рівень рН, і ретельноперемішаний вміст першої ємності виливається у вимірювальнийприлад, інтенсивність дихання вимірюється за період до 10 хвилин.
Процедура визначення застосовується до вмісту кожної ємностітаким чином, щоб час контакту для кожної ємності становив тригодини.
Дія контрольної речовини досліджується на кожній порціїмікробного інокулянту таким же чином.
Інші умови (напр. більше, ніж один лічильник кисню) можутьвимагатись у випадку, якщо вимірювання здійснюються після30 хвилин контакту.
Якщо потрібно виміряти хімічне поглинання кисню, додатковоготуються ємності, що містять дослідну речовину, штучні стоки таводу, але не містять активованого мулу. Поглинання киснювимірюється і фіксується після аерації протягом 30 хвилин та/аботрьох годин (час контакту).
2. ДАНІ ТА ОЦІНКА
Інтенсивність дихання обраховується за кривою самописцяприблизно між 6,5 мг О /літр та 2,5 мг О /літр або за 10-хвилинний
2 2
період, коли інтенсивність дихання є низькою. Відрізок кривої, за
яким обраховується інтенсивність дихання повинен бути лінійним.
У випадку, коли значення інтенсивності дихання двох еталоннихрозчинів відрізняються більше, ніж на 15% або значення ЕС (після
50
30 хвилин та/або трьох годин) контрольної речовини виходить за
допустимі межі (від 5 до 10 мг/л для 3,5 дихлорфенолу) дослідження
вважається недійсним, і його необхідно повторити.
Для кожного розчину з певною концентрацією вираховуєтьсявідсоток інгібування (див. 1.2). Відсоток інгібування накладаєтьсяна значення концентрації на нормальному (або імовірнісному)логарифмічному папері і звідси виводиться значення ЕС .
50
Довірчий інтервал 95% для значень ЕС можна визначити 50стандартним способом.
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
За можливості, звіт про дослідження повинен включатинаступне:
- дослідна речовина: дані про хімічну ідентифікацію,
- дослідна система: джерело, концентрація та попередняобробка активованого мулу,
- умови дослідження:
* рН реакційної суміші перед вимірюванням інтенсивностідихання
* температура, за якої відбувалось дослідження
* тривалість дослідження
* контрольна речовина та отримане для неї значення ЕС
50
* абіотичне поглинання кисню (якщо спостерігалось).
- результати:
* усі дані вимірювань
* крива інгібування та метод обрахунку ЕС
50
* значення ЕС50 та, якщо можливо, довірчі межі 95%, ЕС та 20ЕС ,
80
* всі спостереження та будь-які відхилення, що могли вплинутина результати дослідження.
3.2. ПОЯСНЕННЯ ДАНИХ
Значення ЕС повинне розглядатись лише як приблизний 50показник токсичного впливу дослідної речовини на активований мулабо мікроорганізми у стічних водах, оскільки складнівзаємозв'язки, що існують у довкіллі, не можуть бути точновідтворені в лабораторних умовах. Крім того, дослідна речовина, щоможе мати інгібувальний вплив на окислення аміаку, може такожспричиняти нетипові криві інгібування. Відповідно, такі кривінеобхідно аналізувати з обережністю.
4. ДОВІДКОВА ЛІТЕРАТУРА
(1) Міжнародний Стандарт ISO 8192-1986.
(2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, C. 165.
(3) Brown, D., Hitz, H.R., Schaefer, L., Chemosphere 10,1981, C. 245.
(4) ETAD (Екологічна і токсикологічна асоціація виробництвабарвників та органічних пігментів), Рекомендований метод N 103,також описаний у:
(5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, С. 80.
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, С. 247.
(7) ОЕСР, Париж, 1981, Принципи досліджень 209, Рішення РадиС(84) 30 остаточне.
С.12 БІОЛОГІЧНИЙ РОЗПАД МОДИФІКОВАНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ НБАМ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Метою даного методу є оцінка потенційної граничної здатностідо біологічного розпаду розчинних у воді, нелетких органічнихречовин під дією відносно високих концентрацій мікроорганізміввпродовж тривалого інтервалу часу. Життєздатність мікроорганізмівпротягом цього часу підтримується шляхом щоденного додаваннявідстояних стоків для живлення (Стоки для використання протягомвихідних днів можуть зберігатись при температурі 4 град.С. Такожможна використовувати штучні стоки отримані з перевірки навідповідність технічним умовам ОЕСР.)
Можливим є фізико-хімічне поглинання суспендованих твердихчасток, його необхідно враховувати під час пояснення результатів.
З огляду на тривалий час відстоювання рідкої фази (36 годин)та періодичне додавання поживних речовин, дослідження не відтворюєумов, які мають місце в установках для очищення стічних вод.Результати, отримані з використанням різних дослідних речовин,вказують на те, що дане дослідження має високий потенціал длябіологічного розпаду.
Умови даного дослідження є вкрай сприятливими для проведеннявідбору та/або адаптації мікроорганізмів, що мають здатність дорозчеплення дослідної сполуки. (Дану процедуру можна такожзастосовувати для отримання акліматизованого інокулянту длявикористання у інших дослідженнях.)
У даному методі для оцінки граничної здатності добіологічного розпаду дослідних речовин використовується міраконцентрації розчиненого органічного вуглецю (РОВ). Визначення РОВбажано здійснювати після закислення та очищення, а не за різницеюС - С .
загальний органічний
Одночасне використання конкретних аналітичних методів можедати змогу оцінити первинний розпад речовини (зникнення початковоїхімічної структури).
Метод може застосовуватись лише для органічних досліднихречовин, які за концентрацій, що використовуються в дослідженні:
- є розчинними у воді (мінімум 20 мг розчиненого органічноговуглецю на літр),
- мають незначний тиск пари
- не гальмують розвиток бактерій
- мають незначний ступінь поглинання дослідною системою
- не втрачаються у дослідному розчині через омилення.
Вміст органічного вуглецю у дослідній речовині повинен бутивстановлений.
Інформація про відносне співвідношення основних компонентівдослідної речовини буде корисною під час пояснення отриманихрезультатів, особливо, коли вони низькі або граничні.
Інформація про токсичність мікроорганізмів, що містяться вречовині, може бути корисною під час пояснення низьких результатівта підбору потрібної дослідної концентрації.
1.2. ОЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
С = концентрація дослідної сполуки, що дорівнює концентрації Торганічного вуглецю, наявного чи доданого до відстояних стоків напочатку аерації (мг/літр),
С = концентрація розчиненого органічного вуглецю, виявленого tу надмуловій рідині дослідної речовини в кінці аерації (мг/літр),
С = концентрація розчиненого органічного вуглецю, виявленого су надмуловій рідині еталонної речовини в кінці аерації (мг/літр).
Біологічний розпад у даному методі визначається як зникненняорганічного вуглецю. Біологічний розпад може бути виражений як:
1. Процент видалення D кількості речовини, що додається daщоденно:
C - (C - C )
T T C
D = --------------- x 100 (1)
da C
T
де
D = розпад/кількість речовини, що додається щоденно
da
2. Процент видалення D кількості речовини, наявної на ssdпочатку кожного дня:
2C + C - C - C + 3C
T ti ci t(i+1) c(i+1)
D = ------------------------------------ x 100 (2(a))
ssd 2C + C + C
T ti ci
2С - 2(C - C )
T t c
приблизно ---------------- x 100 (2(b))
2C + (C - C )
T t c
де
D = розпад/кількість речовини, наявної на початку дня;
ssd
індекси і та (і+1) позначають день проведення вимірювань.
Рівняння 2(а) рекомендується застосовувати, коли елюат РОВщоденно змінюється, в той час як рівняння 2(b) можезастосовуватись, коли елюат залишається відносно стабільним.
1.3. КОНТРОЛЬНІ РЕЧОВИНИ
У деяких випадках, коли досліджуються нові речовини,доцільним є використання контрольних речовин; проте жодноїконкретної речовини тут не зазначається.
Дані для багатьох сполук, оцінених шляхом кільцевої пробиподаються (див. Додаток 1) переважно з метою забезпеченняперіодичного калібрування методу та для зіставлення результатів увипадках, коли застосовується інший метод.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Активований мул, добутий з установки для очищення стоків,поміщується в блок для напівбезперервного активованого мулу(НБАМ). Додається дослідна сполука та побутові стоки, сумішпровітрюється протягом 23 годин. Після цього аерація припиняється,мул повинен осісти, а надмулову рідину необхідно видалити.
Мул, що залишається у камері для аерації, перемішується знаступною аліквотою дослідної сполуки та стоків, і циклповторюється.
Біологічний розпад встановлюється шляхом визначення вмістурозчиненого органічного вуглецю в надмуловій рідині. Це значенняпорівнюється із значенням, встановленим для стічної рідини,отриманої з контрольної пробірки, заповненої лише відстоянимистоками.
Використання конкретного аналітичного методу дає змогувиміряти зміни концентрації первинної молекули, пов'язані збіологічним розпадом (первинна здатність до біологічного розпаду).
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Відтворюваність даного методу, що базується на видаленнірозчиненого органічного вуглецю, досі не встановлено. (Щодопервинного біологічного розпаду, точні дані отримуються дляречовин, що мають значний рівень розпаду).
Чутливість даного методу переважно визначається мінливістюконтрольної проби і меншою мірою, точністю визначення розчиненогоорганічного вуглецю та рівнем вмісту дослідної сполуки у стічнійрідині на початку кожного циклу.
1.6. ОПИС ПРОЦЕДУРИ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Приготування
Може використовуватись достатня кількість чистих блоків дляаерації, або ж фірмовий блок НБАМ ємністю 1,5 літра, патрубки дляпідведення повітря (Малюнок 1) приєднуються для кожної дослідноїречовини та еталонних розчинів. Стиснене повітря, що подається ублоки, очищене за допомогою ватного фільтра, не повинне міститиорганічного вуглецю і повинне попередньо насичуватись водою длязменшення втрат через випаровування.
Зразок мулової суміші, що містить від 1 до 4 г суспендованихтвердих часток на літр, отримується із станції аерації стічних водактивованим мулом, що обробляє переважно побутові стоки. Приблизно150 мл мулової суміші необхідно для кожного аераційного блоку.
Основні розчини дослідної речовини готуються у дистильованійводі; зазвичай вимагається концентрація 400 мг/літр, щовизначається за органічним вуглецем і дає концентрацію дослідноїсполуки 20 мг вуглецю/літр на початку кожного аераційного циклу,якщо не відбувається біологічного розпаду.
Можливим є застосування вищих концентрацій, за відповідноїтоксичності мікроорганізмів.
Вимірюється вміст органічного вуглецю.
1.6.2. Дослідні умови
Дослідження повинне відбуватись при температурі від 20 до25 град.С.
Використовується висока концентрація мікроорганізмів (від 1до 4 г/літр суспендованих твердих часток), час ефективноговідстоювання становить 36 годин. Вуглецева речовина у стокахактивно окислюється, зазвичай, протягом восьми годин після початкукожного аераційного циклу. Після цього мул дихає ендогенновпродовж решти періоду аерації, і впродовж цього часу єдинимдоступним субстратом залишається лише дослідна сполука, аж покивона також повністю не метаболізується. Вказані властивості упоєднанні із щоденною інокуляцією проби, коли побутові стокивикористовуються у якості середовища, забезпечують сприятливіумови як для акліматизації, так і для стрімкого зниженнябіологічного розпаду.
1.6.3. Виконання дослідження
Зразок мулової суміші отримується з відповідної станціїаерації стічних вод активованим мулом, що обробляє переважнопобутові стоки, або з лабораторної установки і живиться киснем довикористання у лабораторії. Кожен аераційний блок, включаючи блокз еталонними розчинами, заповнюється 150 мл мулової суміші (якщовикористовується фірмовий блок НБАМ, вказані об'єми необхіднопомножити на 10), і починається аерація. Після 23 годин аераціяприпиняється і мулові дають можливість осісти протягом 45 хвилин.По черзі відкриваються крани кожної посудини, і зливаються 100 млнадмулової рідини. Зразок відстояних побутових стоків отримуєтьсябезпосередньо перед використанням, і 100 мл додаються до мулу, щозалишається у кожному аераційному блоці. Аерація починаєтьсязнову. На цій стадії дослідна сполука не додається, у блокищоденно подаються лише побутові стоки до тих пір, поки післявідстоювання не буде отримано прозору надмулову рідину. Зазвичайце займає до двох тижнів, протягом цього часу показник розчиненогоорганічного вуглецю в кінці кожного аераційного циклу наближаєтьсядо сталого значення.
В кінці цього періоду відстояний мул з окремих блоківзмішується, і в кожний блок додається 50 мл отриманого змішаногомулу.
95 мл відстояних стоків і 5 мл води додаються у еталонніблоки, 95 мл відстояних стоків і 5 мл відповідного основногорозчину дослідної сполуки (400 мг/літр) додаються у дослідніблоки. Аерація починається знову і продовжується 23 години. Потіммулові дають можливість осісти протягом 45 хвилин, відділяєтьсясупернатант, і у ньому аналізується вміст розчиненого органічноговуглецю.
Описана процедура періодичного наповнення повторюєтьсящоденно впродовж дослідження.
Перед відстоюванням може виникнути потреба прочистити стінкиблоків для того, щоб запобігти накопиченню твердих часток надрівнем рідини. Для кожного блоку використовується окрема щітка абошкребок для запобігання перехресного забруднення.
Теоретично, вміст розчиненого органічного вуглецю усупернатанті необхідно визначати щоденно, проте менша частотапроведення аналізів є припустимою. Перед аналізом стічні рідинипропускаються крізь промиті мембранні фільтри з порою 0,45 мю мабо центрифугуються. Використання мембранних фільтрівдопускається, якщо встановлено, що вони не випускають атоміввуглецю і не вбирають речовину під час фільтрації. Температурапроби у центрифузі не повинна перевищувати 40 град.С.
Тривалість дослідження для сполук, які не піддаються абовиявляють слабку здатність до біологічного розпаду, невизначено,але досвід свідчить про те, що загалом вона повинна становити12 тижнів і не перевищувати 26 тижнів.
2. ДАНІ ТА ОЦІНКА
Будується залежність вмісту розчиненого вуглецю в надмуловихрідинах у дослідних та еталонних блоках від часу.
В процесі біологічного розпаду рівень вмісту в досліднихречовинах наближатиметься до рівня в еталонах. Як тільки трипослідовні вимірювання дають сталу різницю між двома рівнями,виконується необхідна для статистичної обробки даних кількістьподальших вимірювань і вираховується відсоток біологічного розпадудослідної сполуки (D або D , див. 1.2).
da ssd
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про дослідження повинен за можливості включати наступне:
- всю інформацію про тип стоків, тип блоків, щозастосовувався, та результати експерименту, що стосуютьсядослідної речовини, стандартної речовини, якщо використовувалась,та холостої проби,
- температура,
- крива видалення з поясненням, спосіб підрахунків (див 1.2),
- дата і місце збору активованого мулу та стоків, станадаптації, концентрація тощо,
- наукове обґрунтування будь-яких змін процедури дослідження,
- дата і підпис.
3.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Оскільки речовина, що досліджується за допомогою даногометоду, не повністю піддається біологічному розпаду, будь-якевидалення РОВ шляхом лише біологічного розпаду відбуваєтьсяпоступово протягом декількох днів або тижнів, крім випадків, колиакліматизація відбувається раптово, на що вказує різке зникненняпротягом кількох тижнів.
Проте, часом значну роль відіграє фізико-хімічне поглинання;воно супроводжується повним або частковим видаленням доданого РОВна початковій фазі дослідження. Подальший розвиток залежить відтаких факторів, як рівні поглинання та концентрації суспендованихтвердих часток у забракованому елюаті. Зазвичай різниця міжконцентраціями РОВ у надмулових рідинах еталону та дослідноїречовини поступово збільшується порівняно з початковим значенням ізберігається на досягнутому рівні до кінця експерименту, поки небуде проведено акліматизацію.
У випадку, коли потрібно відокремити біологічний розпад (абочастковий біологічний розпад) від поглинання, необхідними єдодаткові дослідження. Їх можна провести багатьма способами, аленайбільш переконливим є використання надмулової рідини або мулу вякості інокулянту в дослідженні з базовою множиною (бажано, вспірометричному дослідженні).
Дослідні сполуки, що виявляють під час даного дослідженнявисокий рівень неабсорбційного видалення РОВ, повинні вважатисяпотенційно здатними до біологічного розпаду. Часткове,неабсорбційне видалення вказує на те, що хімічна речовинапринаймні піддається певному біологічному розпаду.
Відсутність або низький рівень видалення РОВ можеспричинюватись гальмуванням мікроорганізмів дослідною речовиною,на це також вказує лізис та втрата мулу з утворенням мутногосупернатанту. Дослідження необхідно повторити з нижчоюконцентрацією дослідної речовини.
Використання конкретного аналітичного методу або дослідної 14речовини, міченої за С, дозволяє досягнути кращої чутливості. У
14 14
випадку використання дослідної сполуки з С, відновлення СО
2
свідчить про те, що відбувся біологічний розпад.
Якщо результати подаються стосовно первинного біологічногорозпаду, необхідно за можливості надати пояснення щодо змінихімічної будови, яка призводить до втрати чутливості до початковоїдослідної сполуки.
Необхідно надати підтвердження аналітичного методу, а такожреакцію на середовище холостого досліду.
4. ДОВІДКОВА ЛІТЕРАТУРА
(1) ОЕСР, Париж, 1981, Вказівки з проведення досліджень302 А, Рішення Ради С(81) 30 остаточне.
Додаток 1
Дослідження НБАМ: приклад формулювання результатів
------------------------------------------------------------------
| Речовина | С |C - C | Відсоток | Тривалість |
| | T | t c | біологічного | дослідження |
| |(мг/л) | (мг/л) | розпаду, D | (дні) |
| | | | da | |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
| 4-ацетил | 17,2 | 2,0 | 85 | 40 |
| амінобензол | | | | |
| сульфонат | | | | |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
| Тетра пропілен | 17,3 | 8,4 | 51,4 | 40 |
| бензол сульфонат | | | | |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
| 4-нітрофенол | 16,9 | 0,8 | 95,3 | 40 |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
| Діетиленгліколь | 16,5 | 0,2 | 98,8 | 40 |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
| Анілін | 16,9 | 1,7 | 95,9 | 40 |
|------------------+-------+--------+--------------+-------------|
|Циклопентан тетра | 17,9 | 3,2 | 81,1 | 120 |
| карбоксилат | | | | |
------------------------------------------------------------------
Додаток 2
Зразок приладу для дослідження
Малюнок 1
С.13. БІОЛОГІЧНЕ НАКОПИЧЕННЯ: ДОСЛІДЖЕННЯ НА РИБІ
У ПРОТОЧНОМУ РЕЖИМІ
1. МЕТОД
Даний метод біологічного накопичення є ідентичним методу OECDTG 305 (1996).
1.1. ВСТУП
Цей метод описує порядок оцінки потенційної здатності речовиндо накопичення в організмі риб у проточних умовах. Хоча проточнірежими дослідження рекомендуються, допускається використаннянапівстатичних режимів за умови відповідності критеріямвалідності.
У цьому методі подаються необхідні відомості для проведеннядослідження, одночасно, відповідний простір надається дляпристосування схеми досліду до умов окремих лабораторій тамінливих характеристик дослідних речовин. Описана схема найбільшточно використовується для стабільних органічних речовин зкоефіцієнтами розподілення октанолу/води (log P ) між 1,5 та 6,0
ow
(1), але також може застосовуватись до надліпофільних речовин (з
log P > 6,0). Попереднє значення коефіцієнта біологічного
ow
накопичення (BCF), який часом позначається як KB, таких
надліпофільних речовин буде вірогідно вищим, ніж значення
коефіцієнта біологічного накопичення у стабільному стані (BCF ),
SS
який очікується отримати в результаті лабораторних досліджень.
Попереднє значення коефіцієнта біологічного накопичення для
органічних речовин з log P до 9 можна отримати, використовуючи
ow
рівняння Бінштейна та ін. (2). Параметри, що характеризують
потенціал біологічного накопичення включають константу
інтенсивності поглинання (k ), константу інтенсивності очищення
1
(k ) та BCF .
2 SS
Використання мічених радіоізотопів може полегшити аналіззразків води та риби і може використовуватись для визначеннядоцільності проведення ідентифікації та кількісного визначенняпродуктів розпаду. У випадку, якщо вимірюється загальна кількістьрадіоактивних залишків (напр. методом спалювання або збільшеннярозчинності тканин), BCF базується на початковій сполуці,будь-яких утриманих метаболітах, а також асимільованому вуглецю.Таким чином, значення BCF, отримані від аналізу загального вмістурадіоактивних залишків, не можна безпосередньо порівнювати з BCF,виведеним лише за хімічним аналізом окремих елементів початковоїсполуки.
Очисні процедури можуть проводитись під час дослідження задопомогою мічених радіоізотопів з метою визначення BCF започатковою сполукою, основні метаболіти можуть характеризуватись,якщо це вважається необхідним. Також можливим є поєднаннядослідження метаболізму риб та дослідження біологічноїконцентрації шляхом аналізу та ідентифікації залишків у тканинах.
1.2. ОЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Біологічна концентрація/Біологічне накопичення це збільшенняконцентрації дослідної речовини в організмі або на його поверхні(або в окремих його тканинах), пов'язане із збільшеннямконцентрації дослідної сполуки в оточуючому середовищі.
Коефіцієнт біологічної концентрації (BCF або K ) у будь-який Bчас впродовж фази поглинання даного дослідження є концентрацієюдослідної сполуки в організмі риби, на його поверхні або в окремихтканинах (C , мю г/г (частинок на мільйон)), поділеною на
f
концентрацію хімічної сполуки в оточуючому середовищі.
(C , мю г/мл (чнм)).
w
Коефіцієнт біологічної концентрації у стабільному стані(BCF or K ) не зазнає суттєвих змін впродовж тривалого інтервалу
ss B
часу, протягом якого концентрація дослідної речовини в оточуючому
середовищі залишається постійною.
Плато або стабільна фаза досягається на графіку залежностіконцентрації дослідної речовини у рибі (C ) від часу, коли крива
f
стає паралельною до осі часу, і результати трьох послідовних
аналізів C , виконаних на пробах, взятих з інтервалом принаймні у
f
два дні, не відрізняються один від одного більше, ніж на +- 20%, і
між трьома періодами вибірки не було зафіксовано суттєвої різниці.
Коли досліджується об'єднана проба, вимагаються щонайменше п'ять
послідовних аналізів. Для дослідних речовин, які повільно
поглинаються, інтервали повинні складати сім днів.
Коефіцієнти біологічної концентрації, що підраховуютьсябезпосередньо за кінетичними константами швидкості (k /k ),
1 2
позначаються терміном "коефіцієнт кінетичної концентрації", BCFK.
Коефіцієнт розподілу в октанолі-воді (P ) є співвідношенням owміж розчинністю хімічної сполуки в н-октанолі та у воді в станірівноваги (Метод А.8), також позначається K . Логарифм P
ow ow
використовується в якості показника здатності сполуки до
біологічного накопичення у водних організмах.
Час контакту або фаза поглинання це час, протягом якого рибапіддається дії дослідної сполуки.
Константа інтенсивності поглинання (k ) є чисельною 1величиною, що визначає швидкість збільшення концентрації дослідноїречовини в організмі або на поверхні дослідної риби (або в окремихтканинах), під час її контакту з дослідною сполукою (k
1
-1
виражається у днях ).
Пост-контакт або фаза очищення (виведення) це час післяпереміщення риби із середовища з дослідною речовиною, всередовище, яке не містить її, протягом якого досліджуєтьсяочищення дослідної риби (або окремих її тканин) від речовини (абозагальний обсяг виведення).
Константа інтенсивності очищення (виведення) це чисельнавеличина, що визначає швидкість зменшення концентрації дослідноїсполуки у дослідній рибі (або окремих тканинах) після переміщенняриби із середовища з дослідною речовиною, в середовище, яке не
-1
містить її (k виражається у днях ).
2
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження складається з двох фаз: контакт (поглинання) тапост-контакт (виведення). Під час фази поглинання окремі групи рибодного виду поміщують у принаймні два розчини з різнимиконцентраціями дослідної речовини. Після цього їх переміщують усередовище, що не містить дослідної речовини для проведення фазиочищення. Фаза очищення є обов'язковою, крім випадків, колипоглинання речовини під час фази поглинання було незначним (напр.BCF менше 10). Протягом обох фаз постійно відстежуєтьсяконцентрація дослідної речовини в організмі чи на поверхні риби(або в окремих тканинах). Крім двох дослідних груп, контрольнагрупа риби утримується в ідентичних умовах, за виняткомвідсутності дослідної сполуки, з метою встановлення зв'язку міжможливими негативними наслідками, поміченими під час дослідженнябіологічної концентрації, та відповідною контрольною групою, атакож визначення фонової концентрації дослідної речовини.
Фаза поглинання триває 28 днів, крім випадків, коливстановлено, що рівноваги було досягнуто раніше. Тривалість фазивбирання та часу встановлення стабільного стану можна передбачитиза допомогою рівняння у Додатку 3. Після цього починається фазаочищення, під час якої риба переміщується у іншу чисту ємність, ваналогічне середовище, але без дослідної речовини. За можливості,коефіцієнт біологічного накопичення підраховується і як відношення(BCF ) концентрації у рибі (C ) та у воді (C ) за видимого
ss f w
стабільного стану, і як кінетичний коефіцієнт біологічної
концентрації, BCF , що дорівнює відношенню між константами
K
інтенсивності поглинання (k ) та очищення (k ), передбачаючи
1 2
здійснення кінетики першого порядку. Якщо кінетика першого порядку
не здійснюється, необхідно застосовувати складніші моделі
визначення (Додаток 5).
Якщо стабільного стану не вдалося досягнути впродовж 28 днів,фазу поглинання необхідно продовжувати, поки його не будедосягнуто, або протягом 60 днів; після цього починається фазаочищення.
Константа інтенсивності поглинання, константа (або константи,якщо використовуються більш складні моделі) інтенсивності очищення(виведення), коефіцієнт біологічної концентрації, та заможливості, довірчі межі кожного з цих параметрів підраховуютьсяза моделлю, яка найкраще описує концентрації дослідної речовини урибі та воді.
BCF виражається як функція загальної сирої ваги риби. Проте,у певних випадках можна використовувати окремі тканини та органи(напр., м'язи, печінка), якщо риба достатньо велика або її можнарозділити на їстівну (філе) та неїстівну (тельбухи) частини.Оскільки для багатьох органічних речовин існує чітка залежністьміж здатністю до біологічної концентрації та ліпофільністю,отримане значення біологічної концентрації таких сполук такожвідповідно залежить від вмісту жиру в рибі та. Таким чином, зметою зменшення коливань результатів для речовин з високоюліпофільністю (тобто, з log P > 3), значення біологічної
ow
концентрації повинне виражатись у співвідношенні до вмісту жиру,
