крім загальної ваги тіла.
За можливості, вміст жиру повинен визначатись з використаннямтого ж біологічного матеріалу, що використовується для визначенняконцентрації дослідної речовини.
1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДНУ РЕЧОВИНУ
Перед виконанням дослідження біологічної концентрації,потрібно отримати наступні дані щодо дослідної речовини:
- розчинність у воді
- коефіцієнт розподілення в октанові-воді P (який також owпозначається K і визначається методом ВЕРХ у Додатку 8)
ow
- гідроліз
- фотоперетворення у воді, що визначається під дією сонячногоабо штучного сонячного опромінювання, а також в умовахопромінювання даного дослідження біологічної концентрації (3)
- поверхневий натяг (напр. для речовин, у яких неможливовизначити log P )
ow
- тиск пари
- повна здатність до біологічного розпаду (за необхідності).
Також необхідними є дані про токсичність для виду риб, щовикористовується, бажано асимптотичне значення LC (напр.
50
незалежне від часу). Повинен вказуватись відповідний аналітичний
метод з відомою точністю, вірогідністю та чутливістю, що
використовується для кількісного визначення дослідної речовини у
дослідному розчині та біологічному матеріалі, а також відомості
про підготовку та зберігання проби. Також повинна зазначатись межа
визначення дослідної речовини у воді та тканині риби. У випадках,
14
коли використовуються мічені радіоізотопи С, повинен вказуватись
відсоток радіоактивності, пов'язаної з домішками.
1.5. ВІРОГІДНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження вважається вірогідним за дотримання наступнихумов:
- коливання температури не перевищує +- 2 град.С;
- концентрація насичення розчиненим киснем не падає нижче60%;
- концентрація дослідної речовини у камерах підтримується вмежах +- 20% від середнього значення величин, отриманих врезультаті вимірювання під час фази поглинання;
- смертність, хвороби або інші негативні наслідки уконтрольній та дослідній групах риб становлять менше, ніж 10% вкінці дослідження; у випадках, коли дослідження триває декількатижнів або місяців, смертність або інші негативні наслідки повинністановити менше, ніж 5% на місяць і не перевищувати 30% в цілому.
1.6. СТАНДАРТНІ СПОЛУКИ
Стандартні сполуки з відомою здатністю до накопичення можутьвикористовуватись для перевірки процедури проведення експерименту,коли це необхідно. Проте, наразі немає можливості порадити жоднихконкретних речовин.
1.7. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.7.1. Прилади
Увагу необхідно звернути на запобігання використання убудь-яких частинах обладнання матеріалів, що мають здатність дорозчинення, сорбування та вилужнення і можуть зашкодити рибі.Можуть використовуватись стандартні резервуари прямокутної абоциліндричної форми, виготовлені з хімічно інертного матеріалу,ємність яких відповідає робочому навантаженню. Використанняпластику необхідно мінімізувати. Бажано використовувати трубки зтефлону(R), нержавіючої сталі або скла. Як показав досвід, дляречовин з високими коефіцієнтами адсорбції, таких як синтетичніперитроїди, може вимагатись силанізоване скло. В таких випадках,обладнання використовується одноразово.
1.7.2. Вода
Як правило, використовується природна вода, отримана знезабрудненого джерела однорідної якості. Якість води длярозбавлення повинна бути достатньою для забезпечення життявідібраного виду риб протягом акліматизації та дослідження безвідхилень поведінки та зовнішнього вигляду. Теоретично, необхідновстановити, що дослідний вид може виживати, рости тарозмножуватись у воді для розбавлення (напр. під час дослідженнялабораторних культур або впливу токсичності на життєвий цикл).Вода повинна бути охарактеризована принаймні за рН, твердістю,загальним вмістом твердих частинок, органічного вуглецю та,бажано, амонію, нітритами та лужністю, а для морських видів - завмістом солі. Параметри, необхідні для оптимальної життєдіяльностіриби є цілком відомими, проте, у Додатку 1 подаються максимальнізначення концентрації ряду параметрів води для дослідження звикористанням прісноводної та морської риби.
Вода повинна мати постійну якість протягом дослідження.Значення рН повинне знаходитись в межах від 6,0 до 8,5, але підчас даного дослідження воно не повинне коливатись більше, ніж на0,5 одиниць рН. З метою уникнення надмірного впливу води длярозбавлення на результати дослідження (напр. комплексоутвореннядослідної сполуки) або негативного впливу на групу риб, черезпевні інтервали необхідно відбирати проби для аналізу. У випадку,якщо встановлено, що вода для розбавлення має відносно постійнуякість, приблизно раз у три місяці потрібно визначати вміст важкихметалів (напр. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), основних аніонів такатіонів (напр. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO ), пестицидів (напр.
4
загальний вміст органофосфорних та хлорорганічних пестицидів),
загальний вміст органічного вуглецю та суспендованих твердих
часток. Якщо підтверджено, що якість води залишається постійною
впродовж принаймні року, визначення можна проводити рідше (напр.
раз у шість місяців).
Вміст природних частинок, а також загальний вміст органічноговуглецю (ЗОВ) у воді для розбавлення повинен бути якомога меншимдля уникнення поглинання дослідної сполуки органічною речовиною,що може зменшити біологічну доступність першої (4). Максимальнимдопустимим значенням є 5 мг/л для твердих частинок (частинок, щозатримуються фільтром з діаметром пори 0,45 мю м) і 2 мг/л дляорганічного вуглецю (див. Додаток 1). За необхідності, водунеобхідно профільтрувати перед використанням. Потрапляння у водуорганічного вуглецю з дослідної риби (виділення) та залишків їжінеобхідно звести до мінімуму. Під час дослідження концентраціяорганічного вуглецю в дослідній ємності не повинна перевищуватиконцентрацію органічного вуглецю, що походить від дослідноїречовини та розчинника, якщо використовується, більше, ніж на10 мг/л (+- 20%).
1.7.3. Дослідні розчини
Готується основний розчин дослідної сполуки з відповідноюконцентрацією. Бажано готувати його шляхом перемішування абозбовтування дослідної речовини у воді для розбавлення. Нерекомендується використовувати розчинники або дисперсанти; проте,у деяких випадках їх доводиться застосовувати для отриманняпотрібної концентрації основного розчину. У якості розчинниківможуть використовуватись етанол, метанол, етилен глікольдиметиловий ефір, диметилформамід та триетилен гліколь. У якостідисперсантів можуть застосовуватись Cremophor RH40, Tween 80,метилцелюлоза 0,01% та HCO-40. Речовини, що мають здатність доповного біологічного розпаду повинні використовуватись зобережністю, оскільки можуть спричиняти проблеми під часдосліджень у проточному режимі, пов'язані з ростом бактерій.Дослідна речовина може містити мічені радіоізотопи і повинна мативисокий ступінь очищення (напр. бажано > 98%).
Під час досліджень у проточному режимі вимагаєтьсявикористання системи, яка постійно розподіляє та розбавляєосновний розчин дослідної сполуки (напр. дозувальний насос,пропорційний дилютер, сатураторна система), для подачі дослідногорозчину в дослідні камери. Бажано щодня здійснювати принаймніп'ять заміщень об'єму рідини у кожній камері. Перевага надаєтьсядослідженням у проточному режимі, але у випадках коли їхпроведення є неможливим (напр. через негативний вплив на дослідніорганізми), допускається застосування напівстатичної методики, заумови дотримання критеріїв вірогідності. Швидкість потокуосновного розчину та води для розбавлення повинна перевірятись за48 годин до початку дослідження і потім щонайменше раз на деньвпродовж дослідження. Перевірка включає визначення швидкостіпотоку в кожній камері та контроль за тим, щоб її коливання неперевищували 20% всередині та між камерами.
1.7.4. Підбір виду риби
Важливими критеріями підбору риби є її доступність,можливість отримати рибу потрібних розмірів та належним чиномутримувати її в лабораторії. Інші критерії включають рекреаційну,комерційну та екологічну важливість, а також відносну чутливість,успішний досвід використання тощо.
Рекомендовані види риб подаються у Додатку 2. Допускаєтьсявикористання інших видів, але тоді може виникнути потреба змінитипорядок дослідження для забезпечення відповідних умов. У такомувипадку обґрунтування підбору виду риб та експериментальногометоду повинне подаватись у звіті.
1.7.5. Утримання риби
Дозвольте косяку риби акліматизуватись протягом принаймнідвох тижнів у воді з температурою, яка використовуватиметься підчас дослідження. Раціон риби повинен бути ідентичним дослідному.
Після 48-годинного періоду адаптації фіксується смертність ізастосовуються наступні критерії:
- смертність перевищує 10% популяції протягом семи днів:група не приймається;
- смертність становить від 5% до 10% популяції: сімдодаткових днів відводиться на акліматизацію; якщо протягомнаступних семи днів смертність перевищує 5%, група не приймається;
- смертність нижче 5% популяції протягом семи днів: групаприймається.
Переконайтесь, що риба не має видимих захворювань тавідхилень. Риба не повинна отримувати ліки від хвороб за два тижнідо дослідження та протягом дослідження.
1.8. ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.8.1. Попереднє дослідження
Попереднє дослідження може виявитись корисним для оптимізаціїумов визначення, напр. підбору концентрації (концентрацій)дослідної речовини, тривалості фаз поглинання та очищення.
1.8.2. Умови контакту
1.8.2.1. Тривалість фази вбирання
Тривалість фази вбирання можна передбачити, використовуючипрактичний досвід (отриманий, наприклад, з попередніх дослідженьабо хімічної речовини, пов'язаної з накопиченням) або певніемпіричні зв'язки, знаючи або розчинність дослідної сполуки уводі, або її коефіцієнт розподілення в октанові-воді (див.Додаток 3).
Фаза вбирання повинна тривати 28 днів, крім випадків, коливстановлено, що рівноваги було досягнуто раніше. Якщо стабільногостану не було досягнуто впродовж 28 днів, фазу вбирання необхіднопродовжити, виконуючи подальші вимірювання, до тих пір, поки небуде досягнуто стабільного стану або протягом 60 днів (залежно відтого, який строк є коротшим).
1.8.2.2. Тривалість фази очищення
Зазвичай, час, що становить половину тривалості фазипоглинання, є достатнім для належного (напр. 95%) зменшення вмістуречовини в організмі (див. пояснення розрахунків у Додатку 3). Увипадку, якщо час, необхідний для виведення 95% речовини, єнепрактично тривалим і, наприклад, вдвічі перевищує нормальнутривалість фази поглинання (більше 56 днів), може встановлюватиськоротший період (доки концентрація дослідної речовини нестановитиме менше, ніж 10% концентрації за стабільного стану).Проте, для речовин, що мають більш складні схеми поглинання таочищення, ніж ті, що представлені однокамерною моделлю риби іпідпорядковуються кінетиці першого порядку, необхідно збільшититривалість фази очищення для визначення констант швидкостівиведення. Проте, тривалість даного періоду може обумовлюватисьчасом, протягом якого концентрація дослідної речовини в рибізалишається над межею аналітичного визначення.
1.8.2.3. Кількість дослідної риби
Підберіть таку кількість риби на один дослідний розчин, щобпринаймні чотири рибини припадали на одну пробу під час кожноговзяття проб. Якщо вимагається більша статистична надійність,необхідно відібрати більше рибин у розрахунку на одну пробу.
Якщо використовується доросла риба, зафіксуйте у звіті їїстать. У випадку, якщо використовується риба обох статей, передпочатком контактної фази потрібно документально підтвердити, щорізниця у вмісті жиру між ними є незначною; може виявитисьнеобхідним об'єднання всієї риби жіночої та чоловічої статей.
Під час будь-якого дослідження відбирається риба приблизнооднакової ваги, таким чином, що вага найменших особин складає неменше, ніж дві третіх ваги найбільших. Вся риба повинна бутиодного покоління та походити з одного джерела. Оскільки вага тавік риби часом суттєво впливають на значення BCF (1), ці відомостіретельно фіксуються. Перед початком дослідження рекомендуєтьсязважити певну кількість риби, взятої з дослідного косяку длявизначення середньої ваги.
1.8.2.4. Завантаження
Великі значення відношення води до риби встановлюються зметою мінімізації зменшення C через додавання риби на початку
w
дослідження, а також для запобігання зменшення концентрації
розчиненого кисню. Важливо, щоб рівень завантаження відповідав
видові риби, що використовується. У будь-якому випадку
рекомендується завантажувати 0,1-1,0 г риби (сира вага) на літр
води на день. Високі рівні завантаження можуть використовуватись,
якщо було підтверджено, що концентрація дослідної сполуки
залишається стабільною у межах (+- 20%, а насичення киснем не
падає нижче 60%.
Під час підбору оптимальних режимів завантаження береться доуваги середовище проживання риби. Наприклад, для донної рибиможуть виявитись необхідними акваріуми з більшою площею днавідносно об'єму води, ніж для морських видів.
1.8.2.5. Годування
Впродовж акліматизації та дослідження раціон риби повиненмати відомий вміст жирів та загальний вміст протеїну, що єдостатніми для підтримання здоров'я та сталої ваги риби. Протягомцього часу риба годується щодня з інтенсивністю приблизно від 1 до2 відсотків від ваги тіла на день; такий режим дозволяєпідтримувати відносно сталу концентрацію жиру в організмі риббільшості видів впродовж дослідження. Кількість корму необхідноперераховувати з періодичністю, наприклад, раз на тиждень, длятого, щоб вага тіла відповідала вмістові жиру. Для здійсненняданого перерахування вага риби у кожній камері визначається завагою особин, відібраних з даної камери для найбільш недавньоїпроби. Не зважуйте рибу, що залишилась у кожній камері.
Залишки їжі та екскременти відкачуються з дослідних камерщодня безпосередньо після годування (після 30-60 хвилин). Впродовждослідження камери підтримуються по можливості чистими з метоюзабезпечення якомога меншої концентрації органічної речовини,оскільки наявність органічного вуглецю може обмежити біологічнудоступність дослідної речовини (1).
Оскільки велика кількість кормів виготовляються з рибноїмуки, їх необхідно проаналізувати на наявність дослідної речовини.Також бажано проаналізувати їх на вміст пестицидів та важкихметалів.
1.8.2.6. Світло та температура
Фотоперіод зазвичай становить від 12 до 16 годин, атемпература (+- 2 град.С) повинна підходити для дослідних видівриби (див. Додаток 2). Тип та характеристики освітлення повиннібути відомими. Необхідно звернути увагу на можливістьфотоперетворення дослідної сполуки в дослідних умовах освітлення.Потрібно дотримуватись належного режиму освітлення для запобіганняконтакту риби з неприродними фотопродуктами. У деяких випадкахможе знадобитись фільтр для захисту від УФ випромінювання нижче290 нм.
1.8.2.7. Дослідні розчини
Риба піддається дії щонайменше двох розчинів дослідноїсполуки у воді в проточному режимі. Зазвичай, вища (або найвища)концентрація дослідної сполуки встановлюється на рівні 1% відгострого асимптотичного значення LC та щонайменше у десять разів
50
перевищує межу визначення у воді за допомогою аналітичного методу,
що застосовується в даному дослідженні.
Найвищу дослідну концентрацію можна також визначити,розділивши значення гострого LC для 96 годин на відповідний
50
показник відношення гострої/хронічної токсичності (відповідні
показники для деяких елементів можуть становити від 3 до 100). За
можливості, підберіть іншу концентрацію (концентрації) таким
чином, щоб вона відрізнялась від описаної вище в 10 разів. Якщо це
неможливо з огляду на значення 1% LC або аналітичну межу,
50
допускається використання меншого дільника, ніж 10, а також
14
розглядається можливість застосування мічених ізотопів С.
Концентрація дослідної сполуки не повинна перевищувати її
розчинність.
У випадках використання розчинників, концентрація не повиннаперевищувати 0,1 мл/л і повинна бути однаковою у всіх досліднихємностях. Частка розчинників у загальному вмісті органічноговуглецю, так само як і частка дослідної речовини, повинні бутивідомими. Проте, потрібно намагатись уникати використання такихречовин.
1.8.2.8. Контрольні розчини
Один контрольний розчин з водою для розбавлення абоконтрольний розчин з розчинником, якщо використовується, повиненаналізуватись разом із розчинами дослідної речовини, якщо буловстановлено, що розчинник не має шкідливого впливу на рибу. Віншому випадку необхідно використовувати обидва контрольнірозчини.
1.8.3. Частота аналізу якості води
Під час дослідження у всіх ємностях необхідно вимірюватизначення розчиненого кисню, ЗОВ, рН та температури. Загальнужорсткість та, якщо потрібно, солоність води необхідно вимірюватиу контрольних розчинах та в ємності з вищою (або найвищою)концентрацією. Вміст розчиненого кисню та солоність, якщовикористовується, необхідно вимірювати щонайменше тричі - напочатку, приблизно в середині та в кінці фази поглинання - та одинраз на тиждень під час фази очищення.
ЗОВ потрібно вимірювати на початку дослідження (за 24 та48 годин до початку фази поглинання) перед завантаженням риби тащонайменше раз на тиждень протягом фаз поглинання та очищення.Температуру необхідно вимірювати щодня, рН - на початку та в кінцікожного періоду, а жорсткість - один раз протягом дослідження.Бажано постійно стежити за температурою у принаймні одній ємності.
1.8.4. Відбір проб, аналіз риби та води
1.8.4.1. План відбору проб води та риби
Проба води з дослідних камер для визначення концентраціїдослідної речовини береться перед зануренням риби, під час фазпоглиння і очищення. Проба води береться як мінімум в той же час,що й проба риби, і перед годівлею риби. Під час фази поглинанняконцентрація дослідної речовини визначається для того, щобперевірити її відповідність критеріям вірогідності.
Проба риби береться щонайменше п'ять разів протягом фазипоглинання і щонайменше чотири рази протягом фази очищення.Оскільки у деяких випадках важко розрахувати достатньо точнезначення BCF за такою кількістю зразків, особливо колизастосовується кінетика, що відрізняється від кінетики першогопорядку, рекомендується збільшити частоту відбору проб протягомобох періодів (див. Додаток 4). Додаткова проба зберігається іаналізується тільки тоді, коли результати першої серії аналізіввиявляться недостатніми для розрахунку BCF з необхідною точністю.
Приклад допустимого плану відбору проб подається у Додатку 4.Інші плани можна легко розрахувати, використовуючи інші допустимізначення P для визначення тривалості контакту для рівня
ow
поглинання 95%.
Відбір проб продовжується під час фази поглинання до моментувстановлення стабільного стану або протягом 28 днів, в залежностівід того, який термін є коротшим. Якщо стабільного стану не будедосягнуто протягом 28 днів, відбір проб продовжується до моментудосягнення стабільного стану або протягом 60 днів, в залежностівід того, який термін є коротшим. Перед початком фази очищеннярибу поміщають у чисті резервуари.
1.8.4.2. Відбір та підготовка проби
Проби води для проведення аналізу отримуються, наприклад,шляхом відкачування за допомогою інертної трубки з центральноїточки дослідної камери. Оскільки фільтрація та центрифугування незавжди відділяють біологічно недоступні частинки дослідноїречовини від тих, які є біологічно доступними (особливо длянадліпофільних елементів з log P > 5) (1)(5), проби можуть не
ow
піддававатися такій обробці.
Натомість, потрібно вжити заходів для підтриманнямаксимальної чистоти баків, а вміст загального органічного вуглецюпотрібно контролювати протягом фази поглинання та фази очищення.
Відповідну кількість риби (зазвичай не менше, ніж чотиририбини) дістають з дослідної камери під час кожного відбору проб.Відібрану рибу швидко промивають водою, насухо витирають, одразуумертвляють найбільш прийнятним та гуманним способом і потімзважують.
Бажано проаналізувати проби риби та води одразу після відборуметою запобігти розпаду або іншим втратам, і розрахувати приблизнуінтенсивність поглинання і очищення, в процесі дослідження. Швидкевиконання аналізу також дозволяє уникнути затримки у розрахунку,коли досягнуто стабілізації.
У випадку пізнішого виконання аналізу проби зберігаютьсявідповідним способом. Перед початком дослідження потрібно отриматиінформацію про спосіб зберігання, що застосовується для певноїдослідної речовини - наприклад, глибоке замороження, зберіганняпри 4 град.С, тривалість зберігання, витягнення тощо.
1.8.4.3. Якість аналітичного методу
Оскільки уся процедура визначається головним чином точністю,правильністю і чутливістю аналітичного методу, якийвикористовується для дослідної речовини, перевіртеекспериментально, чи правильність і відтворюваність хімічногоаналізу, а також відновлення дослідної речовини з води і риби,відповідають обраному методу. Перевірте також, чи досліднаречовина не виявляється у розбавленій воді, що використовується.
За необхідності, значення С і C , отримані в результаті w fдослідження, коректуються для приведення у відповідність зпоказниками відновлення та початковими величинами еталоннихрозчинів. Протягом дослідження з пробами води та риби потрібнообходитися таким чином, щоб мінімізувати забруднення та втрати(напр. через адсорбцію або прилад для взяття проби).
1.8.4.4. Аналіз проб риби
Якщо у дослідженні використовуються матеріали, позначенірадіоактивним ізотопом, можна проводити аналіз на наявністьабсолютного радіоактивного ізотопу (тобто початкової сполуки таметаболітів), або проба може бути очищена, для окремого аналізувихідної сполуки. Також, метаболіти можна характеризувати або устабільному стані, або в кінці фази поглинання, залежно від того,який термін є коротшим. Якщо BCF загальних радіоактивних залишківстановить >= 1000%, бажано, а для деяких видів хімікатів, таких якпестициди, переконливо рекомендується виявити і розрахуватикількість продуктів розпаду, що становлять >= 10% загальнихзалишків у тканинах риби у стабільному стані. Якщо продуктирозпаду, що становлять >= 10% від загальних радіоактивних залишківу тканинах риби виявлено і розраховано, рекомендується такожвиявити і розрахувати кількість продуктів розпаду в досліднійводі.
Концентрація дослідної речовини зазвичай визначається длякожної окремо зваженої риби. Якщо це є неможливим, можна провестиоб'єднання проб під час кожного відбору проб, але об'єднаннязначно обмежує статистичні методики, які можуть бути застосованіпри обробці даних. Якщо вимагається застосовувати певнустатистичну методику з визначеною потужністю, кількість рибипотрібно підігнати під потрібний порядок об'єднання та статистичнупотужність (6)(7).
BCF потрібно виражати як функцію загальної повної ваги риби,а для ліпофільних речовин, у вигляді функції ліпідного вмісту.Ліпідний вміст риби за можливості визначається для кожногоокремого відбору проб. Для визначення ліпідного вмісту потрібновикористовувати відповідні методи (посилання 8 і Додаток 3). Методекстракції за допомогою хлороформу/метанолу рекомендується уякості стандартного методу (9). Різні методи дають неоднаковізначення (10), тому важливо давати детальний опис методу, щовикористовується. За можливості, аналіз ліпіду потрібно проводитина тій самій вибірці, що використовується для виявлення дослідноїречовини, оскільки досить часто ліпіди потрібно вилучати з вибіркиперед тим, як проводити хроматографічний аналіз. Вміст ліпіду врибі (мг/кг сухої ваги) в кінці експерименту не повиненвідрізнятися від початкового більше, ніж на 25%. Потрібно такожвказувати у звіті відсоток сухої речовини в тканині для того, щобдозволити перетворення концентрації речовини із значеннявиміряного на основі сирої ваги у значення виміряне на основісухої ваги.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Криву поглинання дослідної речовини отримують шляхомграфічного зображення її концентрації в/на поверхні риби (або уокремих тканинах) у фазі поглинання в залежності від часу наарифметичній шкалі. Якщо крива досягає рівня (точки) стабілізації,тобто стає приблизно асимптотичною на осі часу, стабільний станBCF вираховується за формулою:
ss
C за стабільного стану (середнє значення)
f
------------------------------------------
C за стабільного стану (середнє значення)
w
C як стала - стан
f
_____________________________
C як стала - стан (значення)
w
Якщо не досягається стабільний стан, можна вирахувати BCF з ssдостатньою точністю для оцінки ризику у стабільному стані прирівновазі 80% (1,6/k ) або 95% (3,0/k ).
2 2
Також коефіцієнт концентрації (BCF ) визначається як kспіввідношення k /k , двох кінетичних сталих першого порядку.
1 2
Стала (k ) швидкості очищення як правило вираховується за кривою
2
очищення (тобто, графік спаду концентрації дослідної речовини у
рибі в залежності від часу). Тоді стала швидкості поглинання (k )
1
вираховується за допомогою k і величини С , яка виводиться за
2 f
кривою поглинання (див. також Додаток 5). Найкращим методом для
отримання BCF та констант інтенсивності, k і k є використання
k 1 2
оцінки нелінійних параметрів на комп'ютері (11). В іншому випадку,
для вирахування k і k можна застосовувати графічні методи. Якщо
1 2
крива очищення очевидно не є кривою першого порядку, потрібно
використовувати більш складні моделі (див. посилання у Додатку 3)
і звернутись за допомогою до спеціаліста з біостатистики.
2.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати потрібно пояснювати, з обережністю за концентраціїдосліджуваних речовин, що наближаються до межі виявленняаналітичного методу.
Точно визначені криві поглинання і продуктів виведення єпоказником хорошої якості даних про накопичення. Коливання сталихпоглинання/очищення між двома дослідними концентраціями не повинніперевищувати 20%. Виявлені значні відхилення у швидкостіпоглинання/очищення між двома дослідними концентраціями повинніфіксуватися із зазначенням можливих пояснень. Загалом, довірчамежа BCFs добре спланованого дослідження дорівнює приблизно+- 20%.
3. ЗВІТНІСТЬ
Звіт про дослідження повинен містити наступну інформацію:
3.1. ДОСЛІДНА РЕЧОВИНА:
- фізична природа і, за необхідності, фізико-хімічнівластивості;
- дані про хімічну ідентифікацію (включаючи, за наявності,вміст органічного вуглецю);
- якщо речовина мічена радіоактивними ізотопами, точнерозміщення мічених атомів і відсоток радіоактивності, пов'язаноїіз забрудненням.
3.2. ДОСЛІДНІ ВИДИ:
- наукова назва, вид, джерело, будь-який вид попередньоїобробки, адаптація, вік, градація розмірів тощо.
3.3. УМОВИ ДОСЛІДЖЕННЯ:
- використовувана методика дослідження (наприклад, поточні інапівстатичні режими),
- тип та особливості освітлення та фотоперіод(и),
- планування дослідження (наприклад, кількість і розмірдослідних камер, швидкість заміщення об'єму води, кількістьповторних досліджень, кількість риби у дублюючих пробах, кількістьдослідних концентрацій, тривалість фаз поглинання та очищення,частота взяття проб риби і води,
- методика підготовки основних розчинів і частота оновлення(розчинний агент, при використанні необхідно зазначати йогоконцентрацію і вплив на вміст органічного вуглецю у досліднійводі),
- номінальні дослідні концентрації, середні значеннявиміряних величин, і їх стандартне відхилення в дослідних камерах,метод, за допомогою якого визначаються ці дані,
- джерело води для розбавлення, опис будь-якого видупопередньої обробки, результати будь-якого прояву здатності рибидо проживання у воді та властивості води: pH, жорсткість,температура, концентрація розчиненого кисню, рівні залишковогохлору (у випадку проведення вимірювань), загальний органічнийвуглець, зважені тверді частинки, мінералізація дослідногосередовища (за необхідності) та інші виконані вимірювання,
- якість води у дослідних камерах, pH, жорсткість, ЗОВ,температура і концентрація розчиненого кисню,
- детальна інформація про годування (наприклад, вид корму,постачальник, склад - принаймні вміст ліпідів і білків, якщоможливо, кількість корму та частота годування),
- інформація про обробку риби та проб води, включаючи деталіпідготовки, зберігання, вилучення і аналітичні методи (і точність)для дослідної речовини і вмісту ліпідів (у випадку проведеннявимірювань).
3.4. РЕЗУЛЬТАТИ:
- результати будь-яких проведених раніше досліджень;
- смертність риби в еталонних розчинах та кожній досліднійкамері, а також будь-які помічені відхилення поведінки;
- вміст ліпідів у рибі (якщо визначається у процесідослідження);
- криві (що включають усі виміряні дані), які показуютьпоглинання і очищення дослідних хімікатів у рибі, час досягненнястабільного стану;
- C і C (зі стандартним відхиленням та інтервалами, за f wнеобхідності) під час кожного відбору проби (C , виражене у мю/g
f
ваги у вологому стані (ppm) від ваги всього тіла або окремих
тканин, наприклад, ліпідів, і C у мю g/ml (ppm). C для еталонних
w w
груп (також потрібно зазначати фонові значення);
- коефіцієнт біологічного накопичення у стабільному стані(BCF ) і/або кінетичний коефіцієнт накопичення (BCF ) та довірчі
ss K
межі для констант швидкості поглинання та очищення (виведення)
(виражаються відносно маси тіла та загального вмісту ліпідів, якщо
вони вимірювалися у організмах тварин або окремих тканинах),
границі довірчого інтервалу і стандартні відхилення і методи
аналізу розрахунку/даних кожної дослідної речовини, яка
використовувалась;
- якщо використовуються речовини, мічені радіоактивнимиізотопами, і якщо це необхідно, можуть бути представлені дані пронакопичення виявлених метаболітів;
- усі відхилення, помічені під час дослідженні, будь-яківідхилення від описаних процедур та інша інформація;
результати "не виявлено за даної межі виявлення" необхіднозвести до мінімуму шляхом попередньої розробки методу таекспериментального планування, оскільки такі результати не можутьбути використані для розрахунків констант інтенсивності.
4. ДОВІДКОВА ЛІТЕРАТУРА
(1) Connell D.W. (1988) Bioaccumulation behaviour ofpersistent chemicals with aquatic organisms. Rev.Environ.Contam.Toxicol.102, p. 117-156.
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993) Nonlineardependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partitioncoefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, p. 29-390.
(3) OECD, Paris (1996) Direct Phototransformation ofchemicals in water. Environmental Health and Safety GuidanceDocument Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
(4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparisonof bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testingmethods;influence of particulate organic matter to thebioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water QualityInitiative Technical Support Document for the Procedure toDetermine Bioaccumulation Factors. July 1994.
(6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision.Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville,MD 20852, July 1975.
(7) US EPA (1974). Section 5, A(1) Analysis of Human orAnimal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Humanand Environmental Samples, Thompson J.F.(ed.) Research TrianglePark , N. C. 27711.
(8) Compaan H. (1980) in С The determination of the possibleeffects of chemicals and wastes on the aquatic environment:degradation, toxicity, bioaccumulation ТCh.2.3, Part II.Government Publishing Office, The Hague, The Netherlands.
(9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, p. 1099-1105.
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. andPruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods fornormalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10,p. 1431-1436.
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish:theflow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Finalreport March 1987. Authors: P.Kristensen and N.Nyholm.
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988) Standard Practice forconducting Bioconcentration Tests with Fishes and SaltwaterBivalve Molluscs.
Додаток 1
Хімічні характеристики
прийнятної води для розбавлення
------------------------------------------------------------------
| | Речовина |Граничний вміст|
|--+---------------------------------------------+---------------|
|1 |Тверді частки | 5 мг/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|2 |Загальний вміст органічного вуглецю | 2 мг/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|3 |Неіонізований аміак | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|4 |Залишковий хлор | 10 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|5 |Загальний вміст фосфорорганічних пестицидів | 50 нг/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|6 |Загальний вміст хлорорганічних пестицидів та | 50 нг/л |
| |поліхлорованих біфенілів | |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|7 |Загальний вміст органічного хлору | 25 нг/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|8 |Алюміній | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|9 |Арсеній | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|10|Хром | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|11|Кобальт | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|12|Мідь | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|13|Залізо | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|14|Свинець | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|15|Нікель | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|16|Цинк | 1 мю г/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|17|Кадмій | 100 нг/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|18|Меркурій | 100 нг/л |
|--+---------------------------------------------+---------------|
|19|Срібло | 100 нг/л |
------------------------------------------------------------------
Додаток 2
Види риб, рекомендовані для проведення перевірки
------------------------------------------------------------------
| | Рекомендовані види | Рекомендований | Рекомендована |
| | |інтервал температури| загальна довжина |
| | | для проведення |піддослідної тварини|
| | | перевірки (С) | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|1|Danio rerio(1) | 20-25 | |
| |(Костисті, Коропові)| | |
| |(Hamilton-Buchanan) | | |
| |Риба-зебра | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|2|Pimephales promelas | 20-25 | |
| |(Костисті, Коропові)| | |
| |(Rafinesque) | | |
| |Чорний товстоголов | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|3|Cyprinus carpio | 20-25 | |
| |(Костисті, Коропові)| | |
| |Короп звичайний | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|4|Oryzias latipes | 20-25 | |
| |(Костисті, | | |
| |Пецилієві) | | |
| |(Temminck and | | |
| |Schlegel) | | |
| |Рисова риба | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|5|Poecilia reticulata | 20-25 | |
| |(Костисті, | | |
| |Пецилієві) (Peters) | | |
| |Гуппі | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|6|Lepomis macrochirus | 20-25 | |
| |(Костисті, | | |
| |Центрархові) | | |
| |(Rafinesque) | | |
| |Сонячна риба | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|7|Oncorhynchus mykiss | 13-17 | |
| |(Костисті, Лососеві)| | |
| |(Walbaum) | | |
| |Радужна форель | | |
|-+--------------------+--------------------+--------------------|
|8|Gasterosteus | 18-20 | |
| |aculeatus (Костисті,| | |
| |Колючкові) | | |
| |(Linnaeus) Звичайна | | |
| |трьохголкова колючка| | |
|----------------------------------------------------------------|
| (1) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, |
| Series B., Vol. 252, p. 231. |
------------------------------------------------------------------
В різних країнах використовувались різні види морських таестуарних риб, серед яких:
Плямистий горбиль Leiostomus xanthurus
Ципринодон варіативний Cyprinodon variegatus
