------------------------------------------------------------------
----------------
(*) Додайте невеличкий кристал тимолу чи аналогічноїречовини, щоб запобігти росту плісняви.
С. СОРЕНСЕН
Боратні суміші СОРЕНСЕНА
------------------------------------------------------------------
| Склад | Соренсен | Вальбум, рН при |
|---------------------| 18 град.С|-------------------------------|
| Бура, мл |HCl/NaOH, | | | | |
| | мл | | | | |
|----------------------------------------------------------------|
| 0,05 M бури + 0,1 NHCl |
|----------------------------------------------------------------|
|5,25 |4,75 |7,62 |7,64 |7,55 |7,47 |
|5,50 |4,50 |7,94 |7,98 |7,86 |7,76 |
|5,75 |4,25 |8,14 |8,17 |8,06 |7,95 |
|6,00 |4,00 |8,29 |8,32 |8,19 |8,08 |
|6,50 |3,50 |8,51 |8,54 |8,40 |8,28 |
|7,00 |3,00 |8,08 |8,72 |8,56 |8,40 |
|7,50 |2,50 |8,80 |8,84 |8,67 |8,50 |
|8,00 |2,00 |8,91 |8,96 |8,77 |8,59 |
|8,50 |1,50 |9,01 |9,06 |8,86 |8,67 |
|9,00 |1,00 |9,09 |9,14 |8,94 |8,74 |
|9,50 |0,50 |9,17 |9,22 |9,01 |8,80 |
|10,00 |0,00 |9,24 |9,30 |9,08 |8,86 |
|----------------------------------------------------------------|
| 0,05 M бури + 0,1 NNaOH |
|----------------------------------------------------------------|
|10,0 |0,0 |9,24 |9,30 |9,08 |8,86 |
|9,0 |1,0 |9,36 |9,42 |9,18 |8,94 |
|8,0 |2,0 |9,50 |9,57 |9,30 |9,02 |
|7,0 |3,0 |9,68 |9,76 |9,44 |9,12 |
|6,0 |4,0 |9,97 |10,06 |9,67 |9,28 |
------------------------------------------------------------------
Фосфатні суміші СОРЕНСЕНА
------------------------------------------------------------------
| Склад | рН |
|----------------------------------------------------------------|
| 0,0667 M монокалійортофосфату + 0,0667 М динатрійфосфату |
| при 20 град.C |
|----------------------------------------------------------------|
|99,2 мл KH PO + 0,8 мл Na HPO | 5,0 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|98,4 мл KH PO + 1,6 мл Na HPO | 5,2 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|97,3 мл KH PO + 2,7 мл Na HPO | 5,4 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|95,5 мл KH PO + 4,5 мл Na HPO | 5,6 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|92,8 мл KH PO + 7,2 мл Na HPO | 5,8 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|88,9 мл KH PO + 11,1 мл Na HPO | 6,0 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|83,0 мл KH PO + 17,0 мл Na HPO | 6,2 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|75,4 мл KH PO + 24,6 мл Na HPO | 6,4 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|65,3 мл KH PO + 34,7 мл Na HPO | 6,6 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|53,4 мл KH PO + 46,6 мл Na HPO | 6,8 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|41,3 мл KH PO + 58,7 мл Na HPO | 7,0 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|29,6 мл KH PO + 70,4 мл Na HPO | 7,2 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|19,7 мл KH PO + 80,3 мл Na HPO | 7,4 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|12,8 мл KH PO + 87,2 мл Na HPO | 7,6 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|7,4 мл KH PO + 92,6 мл Na HPO | 7,8 |
| 2 4 2 4 | |
|--------------------------------------------+-------------------|
|3,7 мл KH PO + 96,3 мл Na HPO | 8,0 |
| 2 4 2 4 | |
------------------------------------------------------------------
С.8. ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ ДОЩОВИХ ЧЕРВ'ЯКІВ
ТЕСТУВАННЯ ШТУЧНОГО ГРУНТУ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
У цьому лабораторному тесті, досліджувану речовину додають доштучного ґрунту, у який на 14 днів поміщають черв'яків. Позакінченню цього періоду (за бажанням через 7 днів) вивчаютьвбивчий вплив речовини на дощових черв'яків. Тест надає можливістьу відносно короткі терміни провести перевірку впливу хімічнихречовин, що потрапляють до організму черв'яків через шкіру та зїжею.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
ЛК : концентрація речовини, що вбиває 50 відсотків 50піддослідних тварин під час періоду тестування.
1.3. ЕТАЛОННА РЕЧОВИНА
Еталонну речовину періодично використовують для демонстраціїтого, що чутливість тестової системи не зазнала суттєвих змін.
Хімічно чистий хлорацетамід рекомендовано до використання вякості еталонної речовини.
1.4. ПРИНЦИП ДОСЛІДЖЕННЯ
Якість різних ґрунтів може відрізнятися, тож для цьогодослідження використано ретельно визначений штучний суглинковийґрунт. Дорослі дощові черв'яки виду Eisenia foetida (див. приміткуу Додатку) утримуються у визначеному штучному ґрунті, якийобробляють різними концентраціями досліджуваної речовини. Вмістконтейнерів розсипають на лотках на 14 днів (за бажанням на7 днів) після початку тестування, а потім виконують підрахунокчерв'яків, що виживають при застосуванні кожної з концентрацій.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Цей тест сплановано таким чином, щоб він було максимальновідтворюваним у тому, що стосується субстрату та організмів,використаних у ньому. Смертність у контрольних групах не повиннаперевищувати 10 відсотків, інакше тест вважатиметься недійсним.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Матеріали
1.6.1.1. Субстрат для проведення тесту
Визначений штучний ґрунт використовують у якості основногосубстрату для тестування.
(а) основний субстрат (відсоткове співвідношення, подане длясухої ваги)
- 10 відсотків сфагнумового торфу (із коефіцієнтом рНнайбільш наближеним до 5,5-6,0, без видимих решток рослин тасильно подрібнений),
- 20 відсотків каолінітової глини, що містить більш ніж50 відсотків каолініту,
- близько 69 відсотків промислового кварцового піску (щоздебільшого складається з дрібного піску розміром від 0,05 до0,2 мм). Якщо речовина недостатньо розсіюється у воді, 10 грамівпіску на один контейнер слід тримати напоготові для пізнішогозмішування з досліджуваною речовиною.
- близько 1 відсотка пилоподібного карбонату кальцію (CaCO ), 3хімічно чистого, який додають для доведення значення рН до6,0 +/- 0,5.
(b) Субстрат для проведення тесту
Цей субстрат складається з основного субстрату, досліджуваноїречовини та деіонізованої води.
Вміст води становить від 25 до 42 відсотків від сухої вагиосновного субстрату. Вміст води у субстраті визначаєтьсявисушуванням проби до постійної ваги при 105 градусах за Цельсієм.Основним критерієм є те, що штучний ґрунт має бути зволоженим дотакого стану, щоб у ньому не було стоячої води. Змішувати потрібноретельно, щоб досягнути рівномірного розподілу досліджуваноїречовини та субстрату. Спосіб, яким досліджувану речовину додавалидо субстрату, потрібно вказатиу звіті.
(c) Контрольний субстрат
Контрольний субстрат складається з основного субстрату таводи. Якщо використовуються які-небудь домішки, додатковаконтрольна група має містити ту ж саму кількість домішок.
1.6.1.2. Контейнери
Використовуються скляні контейнери місткістю близько 1 літра(що добре закриваються пластиковими кришками, тарілками, чипластиковою плівкою з вентиляційними отворами), наповнені об'ємомвологого чи контрольного субстрату, який є еквівалентним500 грамам сухої ваги субстрату.
1.6.2. Умови тестування
Контейнери утримують у камерах штучного клімату притемпературі 20 +/- 2 градуси за Цельсієм з постійним освітленням.Інтенсивність світла має складати від 400 до 800 люкс.
Період тестування становить 14 днів, але смертність можна забажанням оцінювати вже через 7 днів після початку дослідження.
1.6.3. Процедура проведення тесту
Концентрації
Концентрації досліджуваної речовини визначають як відношенняваги речовини до сухої ваги основного субстрату (мг/кг).
Тест діапазонів
Спектр концентрацій, які спричиняють смертність від 0 до 100відсотків можна визначити тестом діапазонів, що надасть інформаціюпро спектр концентрацій для використання у визначальному тесті.
Речовину необхідно протестувати у наступних концентраціях:1000, 100, 10, 1, та 0,1 мг речовини на кілограм субстрату,використаного для проведення тесту (суха вага).
Якщо потрібно провести повний визначальний тест, тодостатньою кількістю для проведення тесту діапазонів буде однадослідна група на кожну концентрацію речовини та одна контрольнагрупа, не оброблена речовиною, по 10 черв'яків кожна.
Проведення остаточного тесту
Результати проведення тесту діапазонів використовують длявибору принаймні п'яти концентрацій у геометричній прогресії, щопокривають собою спектр від 0 до 100 відсотків смертності тавідрізняються постійним коефіцієнтом, що не перевищує 1,8.
Тестування з використанням геометричних прогресійконцентрації мають дозволити здійснення якомога точнішоговизначення ЛК та її довірчих меж.
50
Під час проведення остаточного тестування використовуютьпринаймні 4 дослідних групи на кожну концентрацію та 4 необроблених речовиною контрольних групи, по 10 черв'яків у кожнійгрупі. Результати цих додаткових партій подаються як середнєзначення та стандартне відхилення.
Коли дві послідовні концентрації при коефіцієнті 1,8 даютьлише 0 та 100 відсотків смертності, ці два значеннявідповідатимуть межам діапазону, що визначає величину ЛК .
50
Суміш основного дослідного субстрату та досліджуваноїречовини
За можливості, дослідний субстрат не повинен мати у своємускладі жодних домішок, окрім води. Зразу ж після початкутестування, емульсію чи дисперсію досліджуваної речовини удеіонізованій воді чи іншому розчиннику змішують із основнимдослідним субстратом, або ж рівним шаром розпилюють на нього уформі дрібного хроматографічного чи іншого спрею.
Якщо досліджувана речовина не розчиняється у воді, тоді їїможна розчинити у якомога меншій кількості відповідногоорганічного розчинника (наприклад, гексану, ацетону чихлороформу).
Лише домішки, які легко переходять у леткий стан, можнавикористовувати для розчинення, розсіювання чи емульгаціїдосліджуваної речовини. Піддослідний субстрат слід провентилюватиперед використанням. Кількість випаруваної води необхіднозамінити. Контрольна група має містити ту ж кількість будь-якоїдомішки.
Якщо досліджувана речовина не піддається розчиненню,дисперсії чи емульгації органічними розчинниками, 10 грамів сумішідрібного кварцового піску та кількість досліджуваної речовини, щоє необхідною для обробки 500 грамів сухої ваги штучного ґрунту,змішують з 490 грамами сухої ваги дослідного субстрату.
Для кожної дослідної групи, певна кількість вологогодослідного субстрату, еквівалентну 500 грамам сухої ваги, кладутьдо кожного скляного контейнера, і поміщають на поверхню дослідногосубстрату 10 дощових черв'яків, яких перед цим тримали протягом24 годин в аналогічному вологому основному субстраті, а потімобмили водою, з наступним збором надлишку води фільтрованимпапером перед поміщенням їх на дослідний субстрат.
Контейнери покривають перфорованими пластиковими кришками,тарілками чи плівкою, щоб запобігти висиханню субстрату, івитримують за визначених умов дослідження протягом 14 днів.
Оцінку необхідно проводити через 14 днів (по бажанню через7 днів) після початку тестування. Субстрат розміщують рівномірнимшаром на лотку зі скла чи нержавіючої сталі. Потім оглядаютьдощових черв'яків і визначають кількість живих черв'яків. Черв'якивважаються мертвими, якщо вони не реагують на легке механічнеподразнення передньої частини тіла.
Коли огляд проводять через 7 днів, контейнер знову наповнюютьсубстратом і дощові черв'яки, що вижили, поміщаються на поверхнютого самого дослідного субстрату.
1.6.4. Піддослідні організми
В якості піддослідних організмів використовують дорослихособин Eisenia foetida (див. Примітку у Додатку), принаймнідвохмісячного віку з пояском, вологою вагою від 300 до 600 мг(див. Особливості розведення у Додатку).
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА ТА ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Концентрацію речовини, використаної у тесті, вказують у звітівідносно відповідних процентних співвідношень мертвих дощовихчерв'яків.
Коли дані є адекватними, значення ЛК та довірчі межі 50(р = 0,05) слід визначати з використанням стандартних методів(див. Літчфілд та Вілкоксон, 1949, для інформації проеквівалентний метод.) ЛК потрібно вказувати у міліграмах
50
досліджуваної речовини на кілограм дослідного субстрату (суха
вага).
У тих випадках, коли падіння кривої концентрації занадтокруте для обрахунку ЛК , графічної оцінки значення ЛК буде
50
достатньо.
Коли дві послідовні концентрації з коефіцієнтом 1.8 даютьлише 0 та 100 відсотків смертності, ці два значення вважаютьдостатніми, для визначення діапазону значень, на які припадаєЛК .
50
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ТЕСТУВАННЯ
Звіт про тестування має, за можливості, містити наступнуінформацію:
- підтвердження того, що дослідження проведено увідповідності з вищевказаними критеріями якості,
- виконане дослідження (дослідження діапазонів та остаточнетестування),
- точний опис умов проведення тесту чи підтвердження того, щотест було проведено у відповідності з методом; потрібно вказати набудь-які відхилення, якщо такі мали місце,
- точний опис того, як саме досліджувана речовина змішуваласяіз основним дослідним субстратом,
- інформація про піддослідні організми (вид, вік, середня,мінімальна та максимальна вага, умови утримання та розведення,постачальник),
- метод, використаний для визначення ЛК ,
50
- результати дослідження, усіма включаючи всі дані, щовикористовувалися,
- опис зафіксованих симптомів чи змін у поведінціпіддослідних організмів,
- смертність у контрольних групах,
- ЛК чи найвища концентрація для організмів, що не 50викликала смертності, та найнижча досліджувана концентрація, щовикликала смертність у 100 відсотків, за 14 днів (за бажанням,7 днів) після початку дослідження проведення тестування,
- Креслення/графік кривої концентрації/реакції,
- Результати, отримані при використанні еталонної речовини,чи у зв'язку з проведенням даного тесту чи у зв'язку ізпопередніми заходами контролю якості.
4. ПОСИЛАННЯ
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of theCouncil C(81)30 final.
2) Edwards, C.A. and Lofty, J.R., 1977, Biology ofEarthworms, Chapman and Hall, London, p. 331.
3) Bouche.M.B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie etSystematique, Institut National de la Recherche Agronomique,p. 671.
4) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method ofevaluation dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap.,vol. 96, 1949, p. 99.
5) Commission of the European Communities, Development of astandardised laboratory method forassessing the toxicity ofchemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.
6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur land- undForstwirtschaft, Berlin, 1984 p., Verfahrens-vorschlag'Toxizitatstest am Regenwurm Eisenia foetida in kunstlichemBoden', in: Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
Додаток
Розведення та утримання черв'яків перед дослідженням
Для розведення тварин, від 30 до 50 дорослих черв'яківпоміщають у розплідник зі свіжим субстратом на 14 днів. Ці тваринипотім можуть бути використані для розмноження подальших партій.Дощові черв'яки, що виводяться з коконів, використовують длядослідів, коли вони досягають дорослого віку (при описаних умовахчерез два або три місяці).
Умови утримання та розведення.
Камера штучного клімату: температура 20 +/- градусів заЦельсієм, бажано з постійним освітленням (інтенсивністю від 400 до800 люкс).
Розплідники: підходящі неглибокі контейнери об'ємом від 10 до20 літрів.
Субстрат: Eisenia foetida можна розводити у екскрементахрізноманітних тварин. Рекомендовано використовувати у якостісередовища для розведення суміш з 50 відсотків об'єму торфу та50 відсотків коров'ячого чи кінського гною. Середовище повинномати коефіцієнт рН від 6 до 7 (його регулюють карбонатом кальцію)та невисоку іонну провідність (менш ніж 6 мкСм чи 0,5 відсоткаконцентрації солі).
Субстрат повинен бути вологим, але не занадто зволоженим.
Також можна використовувати інші успішні процедури, окрімвищевказаних.
Примітка: Eisenia foetida існує у двох різновидах, які деякітаксономісти підрозділяють у два види (Буше, 1972). Морфологічновони схожі, але один з них, Eisenia foetida foetida, зазвичай маєпоперечні полоси чи лінії на сегментах тіла, а інший, Eiseniafoetida andrei, таких ліній не має і також відрізняєтьсярізноманітними відтінками червонястого кольору тіла. Поможливості, слід завжди намагатися використовувати вид Eiseniafoetida Andrei. Можна також використовувати інші види, занаявності необхідної розробленої методології досліджень.
С.9. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ
ТЕСТ ЗАН-ВЕЛЛЕНСА
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Метою цього методу є оцінка потенційної повної біологічноїдеструкції водорозчинних, нелетких органічних речовин під дієювідносно високих концентрацій мікроорганізмів у статичному тесті.
Може відбуватися фізико-хімічне всмоктування твердих речовину суспензії, і це необхідно враховувати при інтерпретаціїрезультатів (3.2).
Досліджувані речовини використовуються у концентраціях, щоспіввідносяться зі значеннями коефіцієнту РОВ у діапазоні від50 до 400 мг/літр або зі значеннями коефіцієнту ХПК у діапазонівід 100 до 1000 мг/літр (РОВ = розчинений органічний вуглець;ХПК = хімічна потреба у кисні). Ці відносно високі концентраціїмають певну перевагу в аналітичній надійності. Сполуки, що маютьтоксичні властивості, можуть затримувати чи уповільнювати процесдеструкції.
У даному методі, вимірювання концентрації РОВ чи ХПКвикористовують для оцінки повної біологічної деструкціїдосліджуваної речовини.
Одночасне використання конкретного аналітичного методу можедозволити оцінку першочергової біологічної деструкції речовини(зникнення первинної хімічної структури речовини).
Метод може застосовуватися лише для тих органічнихдосліджуваних речовин, які, у концентрації, використаній утестуванні:
- розчиняються у воді в умовах проведення тесту,
- мають настільки мале значення тиску пари, яким можназнехтувати в умовах проведення тесту,
- не стримують розвиток бактерій,
- всмоктуються досліджуваною системою лише до певної межі,
- не втрачаються з досліджуваної речовини черезпіноутворення.
Інформація про відповідні пропорції основних компонентівдосліджуваного матеріалу може бути корисною для інтерпретаціїотриманих результатів, особливо у тих випадках, коли результати єнизькими чи мінімальними.
Також бажано мати інформацію про токсичність даної речовинидля мікроорганізмів для вірної інтерпретації низьких результатівта відбору відповідних концентрацій, використаних у дослідженні.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ ВИМІРЮВАННЯ
Об'єм досягнутої деструкції по закінченню тестуваннявідображається як "біологічна деструкція у тесті Зан-Велленса":
(C - C )
T B
D (%) = (1 - ----------) x 100
T (C - C )
A BA
Де:
D = біологічна деструкція (%) за період часу Т,
T
C = значення РОВ (або ХПК) досліджуваної суміші, виміряне за Aтри голини після початку тестування (мг/л) (РОВ = розчиненийорганічний вуглець, ХПК = хімічна потреба в кисні),
C = значення РОВ чи ХПК досліджуваної суміші на момент Tвзяття проби (мг/л),
C = значення РОВ чи ХПК холостої проби на момент взяття Bпроби (мг/л),
C = значення РОВ чи ХПК холостої проби, виміряне за три BAгодини після початку тестування (мг/л).
Ступінь деструкції округляють до найближчого з цілихвідсоткових значень.
Відсоткове значення деструкції виражають як відсотковий змістРОВ (або ХПК), який видалено з досліджуваної речовини.
Різниця між значеннями, виміряними через три години, тавирахуваними, чи бажано виміряними початковими значеннями моженадати корисну інформацію щодо видалення речовини (див. пункт 3.2,Інтерпретація результатів).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
У деяких випадках, коли проводиться дослідження новоїречовини, використання еталонних речовин є доцільним. Проте, покищо неможливо рекомендувати використання якихось конкретновизначених еталонних речовин.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Активований мул, мінеральні поживні речовини та досліджуванийматеріал, як єдине джерело вуглецю, у водному розчині разомпоміщають до скляного контейнера об'ємом від одного до чотирьохлітрів, обладнаного мішалкою та аератором. Суміш перемішують тазбагачують киснем при температурі від 20 до 25 градусів заЦельсієм при розсіяному освітленні або у темному приміщенніпротягом періоду часу до 28 діб. Процес деструкції відслідковуютьшляхом визначення значень РОВ (або ХПК) профільтрованого розчину,щоденно чи за придатних регулярних часових проміжків.Співвідношення значення видаленого РОВ (або ХПК) після кожногопроміжку до значення, зафіксованого за три години після початкутесту, виражають як відсотковий вміст біологічної деструкції, якийслугує для вимірювання ступеню біологічної деструкції на даниймомент часу. Результат відображають графічно залежно від часу, щоминув, і таким чином, отримують криву біологічної деградації.
Коли застосовується конкретний аналітичний метод, зміни уконцентрації первинної молекули, пов'язані з біологічноюдеструкцією, також можна виміряти (здатність до первинноїбіологічної деструкції).
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Відтворюваність даного тесту повністю задовольняється укільцевому дослідженні.
Чутливість методу визначається здебільшого мінливістюхолостої проби і, меншою мірою, точністю визначення розчиненогоорганічного вуглецю та рівнем досліджуваної сполуки у водномурозчині.
1.6. ОПИС ПРОЦЕДУРИ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Приготування
1.6.1.1. Реагенти
Вода для тесту: питна вода із вмістом органічного вуглецюменше ніж 5 мг/літр. Сумарна концентрація іонів кальцію та магніюне повинна перевищувати 2,7 ммоль/літр; інакше слід розбавлятиводу відповідною кількістю деіонізованої чи дистильованої води.
Сірчана кислота, аналітичний реагент (A.P.) 50 г/л
Розчин їдкого натру (A.P.) 40 г/л
Розчин мінеральної поживної речовини: розчинити
в одному літрі деіонізованої води:
Хлористий амоній, NH Cl, (A.P.) 38,5 г
4
дигідрогенфрсфатнатрію NaH PO .2H O, (A.P.) 33,4 г
2 4 2
дигідрогенфосфат калію KH PO , (A.P.) 8,5 г
2 4
дикаліймоногідрофосфат K HPO (A.P.) 21,75 г
2 4
Суміш слугує одночасно поживною речовиною та буферноюсистемою.
1.6.1.2. Апаратура
- Скляні контейнери об'ємом від одного до чотирьох літрів(наприклад, циліндричні контейнери).
- Мішалка зі скляним чи металічним змішувачем зі штангоювідповідної довжини (він повинен обертатися на відстані від 5 до10 см від дна контейнера). Замість нього можна використовуватимагнітний змішувач зі штоком довжиною від 7 до 10 см.
- Скляна трубка із внутрішнім діаметром від 2 до 4 мм дляподачі повітря. Отвір трубки повинен знаходитися на висотіприблизно 1 см від дна контейнера.
- Центрифуга (біля 3 550 g).
- Вимірювач рН.
- Прилад вимірювання вмісту розчиненого кисню.
- Паперові фільтри.
- Апарат мембранної фільтрації.
- Мембранні фільтри з розміром вічка 0.45 мкм. Такі фільтривважаються придатними для проведення тесту, якщо вони гарантованоне вивільняють вуглець і не всмоктують речовину на стадіїфільтрації.
- Обладнання для визначення вмісту органічного вуглецю тахімічної потреби в кисні.
1.6.1.3. Підготовка інокуляту
Активний мул зі станції біологічної очистки омивають(повторним) центрифугуванням чи відстоюванням у дослідній воді(див. вище).
Активний мул має бути у стані, придатному для проведеннятесту. Такий тип мулу можна отримати з належно працюючої станціїочистки каналізаційних вод. Щоб отримати якомога більше видів чиштамів бактерій, можна змішати інокулят, отриманий з різних джерел(наприклад, різних очисних станцій, екстрактів ґрунту, річковоїводи тощо). Отриману суміш обробляють як вказано вище.
Для перевірки діяльності активного мулу див. розділ "Контрольфункціональності" нижче.
1.6.1.4. Підготовка досліджуваних розчинів
До дослідного контейнера поміщають 500 мл дослідної води,2,5 мл/літр розчин мінеральної поживної речовини та активний мул уоб'ємі співвідношення від 0,2 до 1,0 г/літр сухої речовини укінцевій суміші. Потім додають достатню кількість запасногорозчину речовини, що досліджується, так щоб досягнути концентраціїРОВ у кінцевій суміші на рівні від 50 до 400 мг/літр. Відповіднізначення ХПК становлять від 100 до 1000 мг/літр. З'єднують розчинз водою, доводячи сумарний об'єм до величини від одного дочотирьох літрів. Сумарний об'єм, якого потрібно досягти, залежитьвід кількості проб, які потрібно взяти для визначення РОВ чи ХПК,та об'ємів, необхідних для здійснення аналітичних процедур.
Зазвичай об'єм у два літри вважається задовільним. Принаймніодин контрольний контейнер (холоста проба) досліджуєтьсяпаралельно з кожною серією тестів; він містить лише активний мулта розчин мінеральної поживної речовини, поєднаний з дослідноюводою так, щоб досягти того ж сумарного об'єму, що і в досліднихконтейнерах.
1.6.2. Проведення тесту
Вміст дослідних контейнерів перемішують магнітнимизмішувачами чи гребними гвинтами за умов розсіяного освітлення чиу темному приміщенні при температурі від 20 до 25 градусів заЦельсієм. Збагачення киснем виконують за допомогою стислогоповітря, очищеного ватним фільтром та, за необхідності, задопомогою промивної склянки. Потрібно потурбуватися про те, щобактивний мул не осідав, а концентрація кисню не падала нижче2 мг/літр.
Коефіцієнт рН слід перевіряти через регулярні проміжки часу(наприклад, щодня) та за необхідності коригувати його значення,щоб вони залишалися у діапазоні від 7 до 8.
Втрати від випаровування компенсують безпосередньо передкожним забором проби шляхом додавання потрібного об'ємудеіонізованої чи дистильованої води. Не зайвим буде відмітитирівень рідини на стінці контейнера перед початком проведеннятесту. Нові відмітки роблять після кожного забору проби (беззбагачення киснем та перемішування). Перші проби завжди беруть затри години після початку проведення тесту, щоб виявитивсмоктування досліджуваного матеріалу активним мулом.
Після руйнування досліджуваного матеріалу проводятьвизначення РОВ чи ХПК, щоденно чи з іншим регулярним інтерваломчасу. Проби, взяті з дослідного контейнера та контрольногоконтейнера, фільтрують через ретельно промитий паперовий фільтр.Перші 5 мл фільтрату досліджуваного розчину відкидають. Частиниосаду мулу, що погано піддаються фільтрації, можна попередньовидалити шляхом центрифугування протягом 10 хвилин. Визначення РОВчи ХПК проводять щонайменше у два заходи. Період дослідження можетривати до 28 днів.
Примітка: проби, що залишилися мутними, профільтровують задопомогою мембранних фільтрів. Ці фільтри не повинні виділяти чивсмоктувати будь-який органічний матеріал.
Контроль функціональності активного мулу
Контейнер, що містить відому речовину, потрібно досліджуватипаралельно з кожною серією дослідження, щоб перевіритифункціональну здатність активного мулу. Діетиленгліколь вважаєтьсяпридатною речовиною для такої перевірки.
Адаптація
Якщо аналізи проводяться через відносно невеликі проміжкичасу (наприклад щоденно), адаптацію можна легко помітити з кривоїдеструкції (див. Малюнок 2). Тому дослідження не варто розпочинатинаприкінці робочого тижня.
Якщо адаптація відбувається наприкінці періоду дослідження,його можна продовжити доти, доки не закінчиться деструкція.
Примітка: якщо потрібно дізнатися більше про поведінкуадаптованого мулу, той же активний мул ще раз піддають дії того ждосліджуваного матеріалу згідно з наступною процедурою:
Вимкнути змішувач та аератор і дозволити мулу осісти.Відцідити надосадову рідину, довести об'єм мулу до двох літрів,розбавивши його водою для досліду, перемішувати 15 хвилин і зновудати осісти. Після повторного зціджування надосадової рідини,використати залишок мулу для повторення дослідження з тим жематеріалом згідно пунктів 1.6.1.4 та 1.6.2, наведених вище.Активний мул можна також відділити шляхом центрифугування (замістьвідстоювання).
Адаптований мул можна змішати зі свіжим мулом до концентраціївід 0,2 до 1 г сухої ваги на літр рідини.
Аналітичні засоби
Зазвичай проби фільтрують через ретельно промиті паперовіфільтри (промивання слід здійснювати деіонізованою водою).
Проби, що залишилися мутними, фільтрують через мембранніфільтри (0,45 мкм).
Концентрацію РОВ визначають двічі з фільтрату проб (причомуперші 5 мл відкидають і не використовують) за допомогоюінструментарію ТПК. Якщо фільтрат не можна проаналізувати того ждня, його потрібно зберігати в холодильнику до наступного дня; нерекомендовано зберігати його протягом довшого періоду часу.
Концентрація ХПК визначається з фільтрату проби за допомогоюустановки для аналізу ХПК за процедурою, описаною у посиланні (2)нижче.
2. ДАНІ ТА ЇХ ОЦІНКА
Концентрації РОВ та/чи ХПК визначають принаймні двічі зівзятих проб, як вказано вище у пункті 1.6.2. Деструкцію за періодчасу Т вираховують за формулою (наведеною з визначеннями)пункту 1.2 вище.
Ступінь деградації округлюють до найближчого цілого значенняу відсотках. Об'єм деструкції, отриманий наприкінці дослідження,вказують у звіті як "біологічну деструкцію в тесті Зан-Велленса."
Примітка: якщо повної деструкції було досягнуто до закінченнячасу дослідження, і цей результат підтверджено повторним аналізомнаступного дня, таке дослідження можна вважати завершеним.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про дослідження повинен, по можливості, міститиінформацію про:
- початкову концентрацію речовини,
- всю іншу інформацію та експериментальні результати, щостосуються досліджуваної речовини, еталонної речовини (якщо таказастосовувалася) та холостої проби,
- концентрація за три години після початку дослідження,
- біологічна деструкція; крива з описом,
- час та місце взяття проби піддослідних організмів, станадаптації, концентрація, використана у дослідженні тощо,
- наукове обґрунтування будь-яких змін під час проведеннядослідження.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Видалення РОВ (ХПК), що поступово відбувається протягом днівчи тижнів, вказує на те, що досліджувана речовина піддаєтьсяпроцесу біологічної деструкції.
Проте у деяких випадках фізико-хімічна адсорбція можевідігравати певну роль, і на це вказують, коли з самого початкувиявлено повне чи часткове видалення, протягом перших трьох годин,а різниця між контрольною та досліджуваною надосадовими рідинамизнаходиться на надзвичайно низькому рівні.
Необхідно провести подальші дослідження, якщо потрібнорозмежувати біологічну деструкцію (чи часткову біологічнудеструкцію) та адсорбцію.
Це можна зробити кількома шляхами, але найбільш переконливимє використання надосадової рідини чи мулу в якості інокуляту длябазового дослідження (бажано спірометричного дослідження).
Досліджувані речовини, що дають високий відсотокнеадсорбційного видалення РОВ (ХПК) у даному дослідженні, слідвважати потенційно придатними для біологічної деструкції.Часткове, неадсорбційне видалення вказує на те, що ця хімічнаречовина принаймні має певну придатність до біологічноїдеструкції. Низьке або взагалі нульове видалення РОВ (ХПК) можебути пов'язаним з пригніченням діяльності мікроорганізмів даноюречовиною, і це також можна виявити шляхом лізису та втрати мулу,який продукує мутну надосадову рідину. Дослідження необхідноповторити з використанням нижчої концентрації досліджуваноїречовини.
Використання типоспецифічного аналітичного методу чи14
С-міченої досліджуваної речовини може допомогти в досягненні
14
вищої чутливості дослідження. У випадку з С досліджуваною
14
сполукою, видалення СО підтвердить факт біологічної деструкції.
2
Коли результати виражають шляхом ступеню первинноїбіологічної деструкції, необхідно, по можливості, надати поясненнязмін хімічної структури, що призводять до втрати реакціїпочаткової досліджуваної речовини.
Підтвердження дійсності аналітичного методу потрібно надаватиразом з реакцією, отриманою у досліджуваному середовищі холостоїпроби.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of theCouncil C(81) 30 final.
(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand,Commission Directive 84/449/EEC, (OJ L251,19.9.1984, p. 1).
Додаток
ПРИКЛАД ОЦІНКИ
Органічна сполука: 4-етоксилобензоїдна кислота
Теоретична досліджувана
концентрація: 600 мг\л
Теоретичний РОВ: 390 мг\л
Інокулят: станція очистки
каналізаційних вод
Концентрація: 1 г сухої речовини/літр
Стан адаптації: не адаптований
Аналіз: визначення РОВ
Об'єм проби: 3 мл
Контрольна речовина: діетиленгліколь
Токсичність сполуки: токсичний вплив відсутній
для концентрації нижче
1000 мг/л
Використане дослідження: дослідження бродильних
пробірок
----------------------------------------------------------------------
| Час | Контрольна речовина | Досліджувана речовина |
|дослідження|--------------------------------+-----------------------|
| |Холоста|РОВ |РОВ |Деструкція|ХПК |ХПК |Деструкція|
| |проба |(1) |чистий,|% |(1) |чистий|% |
| |РОВ(1) |мг\л |мг\л | |мг\л |мг\л | |
| |мг\л | | | | | | |
|-----------+-------+-----+-------+----------+-----+------+----------|
|0 |- |- |300,0 |- |- |390,0 |- |
