Менідія срібляста Menidia beryllina
Шайнер Cymatogaster aggregata
Морський язик Parophrys vetulus
Бичок-рогач Leptocottus armatus
Звичайна трьохголкова колючка Gasterosteus aculeatus
Морський окунь Dicentracus labrax
Верховодка Alburnus alburnus
Збір
Прісноводні види риб, перелічені у таблиці вище, легковирощуються, а також є загальнодоступними впродовж року, в той часяк розповсюдженість морських та естуарних видів обмежуєтьсяпевними країнами. Їх можна вирощувати у рибних фермах талабораторіях, в умовах з контрольованим рівнем паразитів тазбудників хвороб - тоді дослідна тварина буде здоровою і мативизначене походження. Ці види риб є доступними у багатьох частинахсвіту.
Додаток 3
Прогнозування тривалості фаз поглинання та очищення
1. Прогнозування тривалості фази поглинання
Перед виконанням дослідження попереднє значення k , а отже і 2певний відсоток від часу, потрібного для досягнення стабільногостану, можна отримати з емпіричних відношень між k та
2
коефіцієнтом розподілення н-октанолу у воді (Р ) або k та
ow 2
значенням розчинності у воді (s).
-1
Попереднє значення k (день ) можна отримати з наступного 2емпіричного відношення (1):
2
log k = 0,414 log (P ) + 1,47 (r = 0,95) (рівняння 1)
10 2 10 ow
Для ознайомлення з іншими співвідношеннями див. Довідковалітература (2)
У випадку, коли коефіцієнт розподілення (Р ) невідомий, owпопереднє значення можна вирахувати за показником розчинностіречовини у воді:
2
log (P ) = 0,862 log (s) + 0,710 (r = 0,994) (рівняння 2)
10 ow 10
де
s = розчинність (моль/л) : (n=36)
Дане відношення застосовується лише за умови, що значенняlog P знаходиться між 2 та 6,5 (4).
ow
Час, необхідний для досягнення певного відсотку стабільногостану, можна вирахувати шляхом застосування попереднього значенняk , отриманого із загального кінетичного рівняння, яке описує
2
поглинання та очищення (кінетика першого порядку):
dC
f
---- = k · C - k · C
dt 1 w 2 f
або якщо Сw є сталою:
k - k t
1 2
C = ---- · C (1 - e ) (рівняння 3)
f k w
2
Якщо значення стабільного стану є наближеним (t ->нескінченність), рівняння 3 можна спростити (5) (6) до:
k
1
C = ---- · C or C /C = k /k = BCF
f k w f w 1 2
2
Тоді k /k
( C приблизно дорівнюватиме концентрації в рибі у 1 2 w"стабільному стані". (C ))
f,s
Рівняння 3 можна перетворити у:
- k t C - k t
2 f 2
C = C (1 - e ) or ----- = 1 - e (рівняння 4)
f fs C
fs
Рівняння 4 дозволяє передбачити час, необхідний длядосягнення певного відсотку стабільного стану, в той час яквеличина k попередньо підраховується за рівнянням 1 або 2.
2
Орієнтовно, оптимальна тривалість фази поглинання дляотримання статистично прийнятних даних (BCF ) дорівнює часові,
K
протягом якого крива логарифму концентрації дослідної речовини у
рибі, викладена в залежності від лінійного часу, досягає середини,
або 1,6/k , або 80% стабільного стану, але не більше, ніж 3,0/k
2 2
або 95% стабільного стану.
Час досягнення 80% стабільного стану дорівнює (рівняння 4):
- k t
2 80 1,6
0,80 = 1 - e or t = ---- (рівняння 5)
80 k
2
Аналогічно, 95 відсотків стабільного стану дорівнює:
3,0
t = ---- (рівняння 6)
95 k
2
Наприклад, тривалість фази поглинання (up) для дослідноїречовини з log P = 4 становитиме (використовуючи рівняння 1, 5,
ow
6):
-1
log k = - 0,414.(4) + 1,47 k = 0,652 днів
10 2 2
up (80%) = 1,6/0,652, тобто, 2,45 днів (59 годин)
або up (95%) = 3,0/0,652, тобто, 4,60 днів (110 годин)
-5
Аналогічно, для дослідної речовини з s = 10 моль/л(log(s)= - 5,0), тривалість максимуму становитиме (використовуючирівняння 1, 2, 5, 6):
log (P ) = 0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02
10 ow
log K = 0,414 (5,02) + 1,47
10 2
-1
k = 0,246 днів
2
up (80%) = 1,6/0,246, тобто, 6,5 днів (156 годин)
або up (95%) = 3,0/0,246, тобто, 12,2 днів (293 годин)
В якості альтернативи, для підрахування часу досягненняефективного стабільного стану (4) може використовуватись рівняння:
3
t = 6,54 x 10 P + 55,31 (hours)
eq ow
2. Прогнозування тривалості фази очищення
Прогнозування часу, необхідного для зменшення вмістушкідливих речовин у тілі риб до певного відсотку від початковоїконцентрації, може виконуватись за допомогою загального рівняння,що описує абсорбцію та очищення (кінетика першого порядку) (1)(8).
Для фази очищення значення C прирівнюється до нуля. Рівняння wможна спростити:
dC - k t
f 2
----- = - k C or C = C · e
dt 2 f f f,o
де С , o це концентрація на початку фази очищення. Тоді 50% fочищення буде досягнуто протягом часу (t ):
50
C - k t
f 1 2 50 0,693
------ = --- = e or t = -----
C 2 50 k
f,o 2
Аналогічно, 95% очищення буде досягнуто протягом:
3,0
t = -----
95 k
2
Якщо для першого періоду (1,6/k ) необхідно 80% поглинання і 290% виведення під час фази очищення (3,0/k ), тривалість фази
2
очищення буде приблизно вдвічі більшою, ніж фази поглинання.
Проте, важливо зазначити, що описані підрахункивідштовхуються від припущення, що схеми поглинання та очищенняпідпорядковуються кінетиці першого порядку. Якщо встановлено, щокінетика першого порядку не справджується, необхідно застосуватибільш складні моделі (напр. Дов. (1))
Довідкова література (Додатку 3)
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models fordescribing the bioconcentration of organics in fish. Environ.Toxicol. and Chem. 1, pp 309-320.
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparisonof BCF's derived from OECD and ASTM testing methods; I nfluence ofparticulate matter to the bioavailability of chemicals. DanishWater Quality Institute.
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982) Partitioning oforganic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol.16 (1), pp 4-10.
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988) Influence ofpartition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentrationkinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp 701-707.
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B.(1975) Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4),pp 785-792.
(6) Ernst W. (1985) Accumulation in Aquatic organisms. In:Appraisal of tests to predict the environmental behaviour ofchemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and BourdeauP.H. Part 4.4 pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd. N.Y.
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. andSauerhoff M.W. (1977) Guidelines for the optimal design ofexperiments to estimate parameters in first order kinetic models,Can. J. Chem. Eng. 55, pp 614-622.
(8) Kоnemann H. and Van Leeuwen K. (1980) Toxicokinetics infish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes byGuppies. Chemosphere, 9, pp 3-19.
Додаток 4
Теоретичний приклад графіку
відбору проб для дослідження біологічного накопичення
речовин з log P = 4
ow
------------------------------------------------------------------
|Відбір проб | Графік відбору проб | Кількість | Кількість |
| риби |-------------------------| проб води | риби, |
| | Мінімальна | Додаткові | | відібрана |
| | частота | проби | | для проби |
| | (дні) | | | |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| Фаза | -1 | | 2(*) |Додайте |
| поглинання | 0 | | 2 |45-80 рибин |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 1-ша | 0,3 | 0,4 | 2 | 4 |
| | | | (2) | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 2-га | 0,6 | 0,9 | 2 | 4 |
| | | | (2) | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 3-тя | 1,2 | 1,7 | 2 | 4 |
| | | | (2) | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 4-та | 2,4 | 3,3 | 2 | 4 |
| | | | (2) | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 5-та | 4,7 | | 2 | 6 |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| Фаза | | | |Перемістіть |
| очищення | | | |рибу у воду,|
| | | | |що не |
| | | | |містить |
| | | | |дослідної |
| | | | |сполуки |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 6-та | 5,0 | 5,3 | | 4 |
| | | | | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 7-ма | 5,9 | 7,0 | | 4 |
| | | | | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 8-ма | 9,3 | 11,2 | | 4 |
| | | | | (4) |
|------------+------------+------------+------------+------------|
| 9-та | 14,0 | 17,5 | | 6 |
| | | | | (4) |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) Вода для проби береться після проходження щонайменше |
|3 камер. |
|Значення в дужках означають кількість зразків (води, риби), яку |
|необхідно взяти для додаткової проби. |
|Примітка: попереднє значенння k для log P = 4,0 становить |
| 2 ow |
| -1 |
|0,652 днів . Загальна тривалість експерименту |
|дорівнюватиме 3 x up = 3 x 4,6 днів, тобто 14 днів. Для |
|підрахунку значення "up" див. Додаток 3. |
------------------------------------------------------------------
Додаток 5
Визначення моделі
Вважається, що більшість даних про біологічне накопиченняописується з "достатньою" точністю за допомогою простої моделі здвома компонентами/двома параметрами, на що вказує пряма, щонаближається до точок концентрації в рибі під час фази очищення,які наносяться на напівлогарифмічний папір. (У випадках, коли ціточки не можна описати за допомогою прямої, необхіднозастосовувати більш складні моделі, див., наприклад, Spacie таHamelink, Дов. 1 до Додатку 3).
Графічний метод визначення
константи інтенсивності очищення (виведення) k
2
Нанесіть на напівлогарифмічному папері концентрацію дослідноїречовини у кожній пробі риби в залежності від часу відбору проби.Нахил отриманої кривої дорівнюватиме k .
2
ln (C /C )
f1 f2
k = -------------
2 t - t
2 1
Зауважте, що відхилення від прямолінійного графіка можутьвказувати на більш складну схему очищення, ніж та, що підпадає підкінетику першого порядку. Графічний метод може застосовуватись дляопису типів очищення, що відхиляються від кінетики першогопорядку.
Графічний метод для визначення
константи інтенсивності поглинання k
1
Отримавши значення k , підрахуйте k наступним чином:
2 1
C k
f 2
k = ---------------- (рівняння 1)
1 -k t
2
C x (1 - e )
w
Значення C отримується з середньої точки згладженої кривої fпоглинання, побудованої на основі даних шляхом нанесеннялогарифмічного вираження концентрації в залежності від часу (наарифметичній шкалі).
Комп'ютерний метод підрахунку констант інтенсивності
поглинання та очищення (виведення)
Найкращим способом визначення коефіцієнту біологічногонакопичення, а також констант інтенсивності k та k є
1 2
використання нелінійних методів оцінки параметрів на комп'ютері.
Програми знаходять значення k та k після введення набору даних
1 2
про концентрацію впродовж часової послідовності та задання моделі:
k -k t
1 2
C = C · --- x (1 - e ) 0 < t < t (рівняння 2)
f w k c
2
k -k (t - t ) -k t
1 2 c 2
C = C · --- x (e - e ) t > t (рівняння 3)
f w k c
2
де t = час в кінці фази поглинання.
c
Даний підхід дозволяє отримати стандартні значення відхиленняk та k .
1 2
Оскільки значення k , у більшості випадків можна отримати з 2кривої очищення з відносно високою точністю, та оскільки існуєстійка взаємозалежність між значеннями k та k , якщо їх
1 2
підраховувати одночасно, рекомендується спочатку підрахувати k за
2
даними про очищення, а потім - k за даними про поглинання,
2
використовуючи нелінійну регресію.
С.14. ДОСЛІДЖЕННЯ РОСТУ МАЛЬКА
1. МЕТОД
Даний метод дослідження впливу токсичності на ріст єідентичним методу OECD TG 215 (2000).
1.1. ВСТУП
Даний метод дослідження було розроблено з метою оцінкинаслідків продовженого контакту з хімічними елементами для ростумалька. Він ґрунтується на методі, розробленому та перевіреному(1)(2) в Європейському Союзі, для оцінки впливу хімічних елементівна ріст райдужної форелі (Oncorynchus mykiss) в проточному режимі.Допускається використання інших видів риби, за умови наявностідокументально підтвердженого досвіду використання останніх.Наприклад, існує досвід застосування у дослідженнях впливу на рістмалька даніо (Danio rerio)(1) (3)(4) та рисової риби (медака,Oryzias latipes) (5)(6)(7).
----------------
(1) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). Thephylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a modelsystem in developmental biology: an invitation to the comparativemethod. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
Див. також Загальний вступ, Частина С.
1.2. ОЗНАЧЕННЯ
Найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК): найнижчаконцентрація дослідної речовини, при якій спостерігається значнийефект (на рівні p < 0,05) у порівнянні з контролем. Проте всітестові концентрації, які є вищими за НСЕК, повинні мати шкідливийвплив, що дорівнює або вищий за той, який спостерігається приНСЕК.
Концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ):концентрація дослідної речовини, що безпосередньо нижча НСЕК.
EC : у даному методі дослідження є концентрацією дослідної xсполуки, що спричинює відхилення х% швидкості росту риби,порівняно з контролями.
Інтенсивність завантаження: сира вага риби на одиницю об'ємуводи.
Густина завантаження: кількість риби на одиницю об'єму води.
Питомий темп росту особини: відображає темп росту однієїособини відносно її початкової ваги.
Середній питомий темп росту по акваріуму: відображає середнійтемп росту акваріумної популяції за однієї концентрації.
Псевдо питомий темп росту: виражає ріст окремої особини упорівнянні з початковою середньою вагою акваріумної популяції.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЯ
Після зважування мальок риби, що знаходиться у фазіекспоненціального росту, поміщується у дослідні камери іпіддається дії ряду сублетальних концентрацій дослідної речовини,розчиненої у воді, бажано, в проточному режимі або, якщо ценеможливо, у відповідному напівстатичному (статично-відновному)режимі. Тривалість дослідження становить 28 днів. Риба годуєтьсящоденно. Раціон риби залежить від початкової ваги і може повторнорозраховуватись після 14 днів. Після закінчення дослідження рибазважується повторно. Наслідки для темпів росту аналізуються звикористанням регресійної моделі з метою підрахунку концентрації,яка спричинює відхилення темпу росту х%, тобто, EC (напр. EC ,
x 10
EC або EC ). Як варіант, дані можна зіставити з контрольними
20 30
величинами для того, щоб визначити найнижчу спостережену ефективну
концентрацію (НСЕК) та звідси, концентрацію, що не призводить до
видимих ефектів (КНВЕ).
1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДНУ РЕЧОВИНУ
Результати дослідження гострого токсичного впливу (див. МетодДослідження С.1.), бажано, виконаний із застосуванням того ж видуриби, що використовується у даному дослідженні, повинні бути внаявності. Це означає наявність даних про розчинність у воді татиск пари дослідної сполуки, а також надійного аналітичного методудля кількісного визначення речовини у дослідних розчинах з відомоюта задокументованою точністю та межею визначення.
Корисна інформація включає структурну формулу, чистотуречовини, стійкість до дії води та світла, pK , P та результати
a ow
дослідження на повний біологічний розпад.
1.5. ВІРОГІДНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження вважається вірогідним за дотримання наступнихумов:
- смертність в контрольній групі (групах) не повиннаперевищувати 10% на кінець дослідження;
- середня вага риби в контрольній групі (групах) повинназбільшитись достатньо для виявлення мінімального відхилення темпуросту, що вважається суттєвим. Кільцева проба (2) показала, що длярайдужної форелі збільшення середньої ваги риби в контрольнихгрупах повинна становити половину (50%) їх початкової середньоїваги протягом 28 днів; напр. початкова вага: 1 г/риби (= 100%),кінцева вага після 28 днів: >= 1,5 г/риби (>= 150%);
- протягом дослідження концентрація розчиненого кисню неповинна падати нижче 60% від показника насичення повітрям (ASV)
- температура води у дослідних камерах не повиннавідрізнятись більше, ніж на +-1 С у будь-який час протягомдослідження і повинна підтримуватись в межах 2 град.С відінтервалів температури, зазначених для дослідних видів(Додаток 1).
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Апаратні засоби
Звичайне лабораторне обладнання та, зокрема, наступне:
- лічильники кисню та рН;
- обладнання для визначення жорсткості та лужності води;
- відповідне обладнання для контролю температури та, бажано,безперервного моніторингу;
- акваріуми, виготовлені з хімічно інертного матеріалу,достатньої ємності для рекомендованої інтенсивності та густинизавантаження (див. Розділ 1.8.5 та Додаток 1);
- ваги з відповідною точністю (з точністю до 0,5%).
1.6.2. Вода
У якості води для дослідження може використовуватись будь-якавода, у якій дослідний вид може тривалий час жити та рости. Водаповинна бути постійної якості впродовж дослідження. Значення рНповинне знаходитись між 6,5 та 8,5, але під час даного дослідженнявоно не повинне коливатись більше, ніж на +- 0,5 одиниць рН.Рекомендується жорсткість понад 140 мг/л (за CaCO ). З метою
3
уникнення надмірного впливу води для розбавлення на результати
дослідження (напр. через комплексоутворення дослідної сполуки)
через певні інтервали необхідно відбирати проби для аналізу. У
випадку, якщо встановлено, що вода для розбавлення має відносно
постійну якість, приблизно раз у три місяці потрібно визначати
вміст важких металів (напр. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), основних
аніонів та катіонів (напр. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO ), пестицидів
4
(напр. загальний вміст органофосфорних та хлорорганічних
пестицидів), загальний вміст органічного вуглецю та суспендованих
твердих часток. Якщо підтверджено, що якість води залишається
постійною впродовж принаймні року, визначення можна проводити
рідше (напр. раз у шість місяців). Деякі хімічні характеристики
прийнятної води для розбавлення подаються в Додатку 2.
1.6.3. Дослідні розчини
Дослідні розчини з обраними концентраціями готуються шляхомрозбавлення основного розчину.
Бажано готувати основний розчин шляхом звичайногоперемішування або збовтування дослідної речовини у воді длярозбавлення, використовуючи механічні засоби (змішувач абоультразвук). Колонки для насичення (розчинення) можутьвикористовуватись для отримання відповідної концентрації основногорозчину.
У деяких випадках необхідно застосовувати дисперсанти(розчинники) для отримання потрібної концентрації основногорозчину. У якості розчинників можуть використовуватись ацетон,етанол, метанол, диметилсульфоксид, диметилформамід татриетиленгліколь. У якості дисперсантів можуть застосовуватисьCremophor RH40, Tween 80, метилцелюлоза 0,01% та HCO-40. Речовини,що мають здатність до повного біологічного розпаду (напр. ацетон)та/або леткі сполуки повинні використовуватись з обережністю,оскільки можуть спричиняти проблеми під час досліджень упроточному режимі, пов'язані з ростом бактерій. Використаннярозчинника не повинне суттєво впливати на ріст риби або матипомітні негативні наслідки для малька відповідно до показниківконтрольного розчину, що містить лише розчинник.
Під час досліджень у проточному режимі вимагаєтьсявикористання системи, яка постійно розподіляє та розбавляєосновний розчин дослідної сполуки (напр. дозувальний насос,пропорційний дилютер, сатураторна система), для подачі серіїрозчинів у дослідні камери. Швидкість потоку основного розчину таводи для розбавлення повинна перевірятись через певні інтервали,бажано, щодня і не повинна коливатись більше, ніж на 10% впродовждослідження. Як показало кільцеве дослідження (2), достатнячастота оновлення води для райдужної форелі становить шістьлітрів/грам риби/день.
Для випробувань у напівстатичному режимі (режимі оновлення),частота оновлення води залежатиме від стабільності дослідноїречовини, проте, рекомендується здійснювати його щоденно. Якщопопередні випробування стабільності (див. Розділ 1.4) свідчать проте, що концентрація випробувальної субстанції є нестійкою (тобтоза межами 80-120% від номінальної або нижче 80% від виміряноїпочаткової концентрації) протягом періоду оновлення, доцільнорозглянути можливість застосування проточного режиму.
1.6.4. Підбір видів риби
Для даного дослідження рекомендується використовуватирайдужну форель (Oncorhynchus mykiss), оскільки найчастіше укільцевих дослідження використовувався саме цей вид риби (1)(2).Допускається використання інших видів риби, за умови наявностідокументально підтвердженого досвіду використання останніх.Наприклад, існує досвід застосування даніо (Danio rerio) (3)(4) тарисової риби (медака, Oryzias latipes) (5)(6)(7). У такому випадкуобґрунтування підбору виду риб та експериментального методуповинне подаватись у звіті.
1.6.5. Утримання риби
Риба для дослідження відбирається з популяції одного косяку,бажано, одного нересту і утримується протягом принаймні двохтижнів до початку дослідження у воді та освітленні, ідентичнихдослідним. Раціон риби повинен складати мінімум 2% від ваги тіла,але бажано, щоб він складав 4% від ваги тіла на день впродовжпопереднього утримання та дослідження.
Після 48-годинного періоду адаптації фіксується смертність ізастосовуються наступні критерії:
- смертність перевищує 10% популяції протягом семи днів:група не приймається;
- смертність становить від 5% до 10% популяції: сімдодаткових днів відводиться на акліматизацію; якщо протягомнаступних семи днів смертність перевищує 5%, група не приймається;
- смертність нижче 5% популяції протягом семи днів: групаприймається.
Риба не повинна отримувати ліки від хвороб за два тижні додослідження та протягом дослідження.
1.7. ПЛАН ДОСЛІДЖЕННЯ
У "плані дослідження" описується вибір кількості та інтервалуконцентрацій дослідного розчину, кількість акваріумів з кожноюконцентрацією та кількість риби у кожному акваріумі. Теоретично,під час затвердження плану дослідження повинні враховуватись:
- мета дослідження;
- метод статистичного аналізу, що використовуватиметься;
- доступність та вартість засобів, необхідних длядослідження.
Формулювання мети повинне, за можливості, включатистатистичну потужність, з якою необхідно визначити даний обсягвідмінності (напр. в темпах росту), або як варіант, точність, зякою необхідно підрахувати EC (напр. при х = 10, 20 або 30, але
x
бажано, не менше 10). Без цього неможливо чітко встановити обсяг
дослідження.
Важливо усвідомити, що оптимальний план дослідження (той,який дозволяє оптимально використовувати засоби) для одного методустатистичного аналізу, не завжди є оптимальним для іншого. Такимчином, для визначення НСЕК/КНВЕ рекомендується відмінний план відтого, що рекомендується для аналізу за регресією.
У більшості випадків перевага надається використанню аналізуза регресією, в порівнянні з дисперсійним аналізом, через причини,описані Stephan та Rogers (8). Проте, якщо не було підібрано
2
відповідної моделі регресії (r < 0,9), необхідно використовувати
значення КНВЕ/НСЕК.
1.7.1. План для аналізу за регресією
У плані дослідження, що аналізуватиметься за регресією,важливо врахувати наступні пункти:
- Дослідні концентрації розчинів повинні обов'язково включатиконцентрацію впливу (напр. ЕС ) та діапазон концентрацій,
10, 20, 30
за яких вплив дослідної речовини представляє інтерес для
дослідження. Підрахунки концентрацій впливу виконуються з найвищою
точністю, якщо значення концентрації впливу знаходиться посередині
діапазону досліджених концентрацій. Попередній діапазонний тест
може допомогти визначити необхідні концентрації для дослідження.
- З метою забезпечення задовільного статистичногомоделювання, у дослідженні повинен використовуватись щонайменшеодин контрольний акваріум та п'ять додаткових акваріумів з різнимиконцентраціями. Поряд з дослідними резервуарами повинендосліджуватись один контрольний акваріум з найвищою перевіреноюконцентрацією розчинника, якщо останній використовується. (див.Розділи 1.8.3. та 1.8.4.).
- Може використовуватись геометрична або логарифмічнапрогресія (9) (див. Додаток 3). Перевага надається інтерваламконцентрації на основі логарифмічної прогресії.
- Якщо в наявності є більше, ніж шість акваріумів,концентрація у додаткових резервуарах може або дублювати аборозподілятися в межах діапазону концентрацій з метою забезпеченняменших інтервалів між концентраціями.
1.7.2. План для визначення КНВЕ/НСЕК за допомогоюдисперсійного аналізу (ANOVA)
Бажано, щоб кожне значення концентрації дублювалось удодаткових резервуарах, а статистичний аналіз проводився на рівнірезервуару (10). Без додаткових резервуарів неможливо врахуватидисперсію результатів між резервуарами, крім тих, що булиспричинені окремими рибинами. Проте, як показав досвід (11), увипадку, що розглядається, дисперсія між резервуарами єнесуттєвою, в порівнянні з дисперсією всередині резервуару (тобто,між окремими рибинами).
Зазвичай, використовується щонайменше п'ять досліднихконцентрацій у геометричній прогресії, бажано, з фактором, що неперевищує 3,2.
Загалом, під час дослідження з використанням додатковихрезервуарів для дублювання, кількість додаткових контрольнихрезервуарів, а відтак і риби, повинна бути вдвічі більшою, ніжкількість дослідних резервуарів з однаковою концентрацією.(12)(13)(14) І навпаки, за відсутності додаткових резервуарівкількість риби в контрольній групі повинна дорівнювати кількості вкожному резервуарі з певною концентрацією.
Якщо дисперсійний аналіз (ANOVA) здійснюється на рівнірезервуару, а не окремих особин (що вимагало б або маркуванняокремих рибин, або використання показників "псевдо" питомого росту(див. Розділ 2.1.2)), необхідною є достатня кількість резервуарівдля дублювання з метою визначення стандартного відхилення урезервуарах в межах однієї концентрації. Це означає, що ступіньсвободи для похибки під час дисперсійного аналізу становитимепринаймні 5 (10).
Якщо дублюються контрольні розчини, виникає загроза поширеннядисперсії похибки, оскільки її обсяг може збільшуватись разом ізсереднім значенням темпу зростання, що розглядається. Оскількивірогідно, що темп зростання зменшуватиметься в міру збільшенняконцентрації, це призведе до завищеного значення дисперсії.
1.8. ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.8.1. Відбір та зважування риби
На початку дослідження важливо зменшити різницю між вагоюрибин. Прийнятні інтервали ваги для різних видів, щорекомендуються до застосування у даному дослідженні, подаються вДодатку 1. Теоретично, вага окремих рибин в межах групи на початкудослідження не повинна відрізнятись від середнього арифметичногозначення ваги більше, ніж на (10%, у будь-якому випадку різниця неповинна перевищувати 25%. Рекомендується перед початкомдослідження відібрати підгрупу риби для вимірювання середньоїваги.
За 24 години до початку дослідження годування рибиприпиняється. Потім відбираються довільні зразки риби.Використовуючи загальну анестезію (напр. водний розчин 100 мг/лсульфонату метану (MS 222), нейтралізований шляхом додавання двохчастин бікарбонату натрію на одну частину MS 222), необхідновиміряти сиру вагу окремих рибин (після протирання насухо) зточністю, поданою в Додатку 1. Риба, вага якої знаходиться вприйнятних межах, відділяється і потім довільно розподіляється міждослідними ємностями. Фіксується загальна вага риби у кожнійдослідній ємності. Використання анестетиків, а також переміщенняриби (включаючи протирання та зважування) може спричинити стрес тапоранення малька, особливо, дрібних видів. З огляду на це, мальокпотрібно переміщувати з надзвичайною обережністю, з метоюуникнення стресу та поранень дослідних тварин.
У 28-ий день дослідження риба зважується повторно (див.Розділ 1.8.6). Проте, якщо це необхідно для повторногорозрахування раціону, рибу можна зважити у 14-ий день (див.Розділ 1.8.2.3). Інші методи, напр. фотографічний, можутьвикористовуватись для визначення змін розміру риби і подальшогопристосування раціону.
1.8.2. Умови контакту
1.8.2.1. Тривалість
Тривалість дослідження - не менше, ніж 28 днів.
1.8.2.1. Інтенсивність та густина завантаження
Важливо, щоб інтенсивність та густина завантаження булипридатним для видів, що використовуються для дослідження (див.Додаток 1). Якщо густина завантаження є надто високою, надмірнескупчення може призвести до стресу, в результаті якого зменшуєтьсятемп росту та збільшується можливість захворювань. Надто низькагустина завантаження сприяє розвитку територіалізму, що теж можевідбитися на темпах росту. У будь-якому випадку густиназавантаження повинна дозволяти підтримувати значення ASV на рівніщонайменше 60% без аерації. Кільцеве дослідження (2) показало, щодля райдужної форелі прийнятною інтенсивністю завантаження є16 рибин вагою 3-5 г на 40 літрів об'єму.
1.8.2.3. Годування
Рибу необхідно годувати придатним для неї кормом (Додаток 1)в достатньому обсязі для забезпечення прийнятного темпу росту.Необхідно звернути увагу на запобігання збільшення числа бактерійта мутності води. Для райдужної форелі раціон, що складає 4% відваги тіла на день, дозволяє відповідати цим умовам(2)(15)(16)(17). Щоденний раціон можна розділити на дві рівніпорції, які даватимуться рибі з інтервалом у мінімум 5 годин.Раціон розраховується на основі загальної ваги риби у кожнійємності. Якщо риба зважується після 14 днів дослідження, раціонрозраховується повторно. Годування риби припиняється за 24 годинидо зважування.
Залишки їжі та екскременти повинні щоденно видалятись здослідних ємностей шляхом обережного очищення дна кожногорезервуару за допомогою всисної системи.
1.8.2.4. Світло та температура
Температура води та фотоперіод повинні бути придатними длядослідних видів (Додаток 1).
1.8.3. Дослідні розчини
Зазвичай необхідно п'ять розчинів дослідної сполуки з різнимиконцентраціями, незалежно від плану дослідження (див. Розділ1.7.2.). Попередні відомості про токсичність дослідної сполуки(отримані, наприклад, з дослідження на гострий токсичний вплив абоз діапазонних тестів) повинні допомогти підібрати відповіднідослідні концентрації. Якщо використовуються менше п'ятиконцентрацій, необхідно надати роз'яснення. Найвища концентраціядослідної сполуки не повинна перевищувати її межу розчинності уводі.
У випадку використання розчинника для підготовки основногорозчину, його кінцева концентрація не повинна перевищувати0,1 мл/л, також бажано, щоб вона була однаковою у всіх досліднихємностях (див. Розділ 1.6.3). Проте, потрібно намагатись уникативикористання таких речовин.
1.8.4. Контролі
Кількість контролів води для розбавлення залежить від планудослідження (див. Розділи 1.7-1.7.2). Якщо використовуєтьсярозчинник, необхідно включити кількість контролів розчинника, щодорівнює кількості контролів води для розбавлення.
1.8.5. Частота аналітичних визначень та вимірювань
Під час досліджень у проточному режимі значення інтенсивностіпотоку розбавляча та основного розчину токсинів повинніперевірятись через певні інтервали, бажано щоденно, і не повинніколиватись більше, ніж на 10% протягом дослідження. У випадках,коли передбачається, що концентрація дослідної сполуки невідрізнятиметься від номінальних величин більше, ніж на +- 20%(тобто в межах 80-120%; див Розділи 1.6.2 та 1.6.3) рекомендуєтьсяаналізувати принаймні найвищі та найнижчі концентрації на початкудослідження та щотижня протягом дослідження. Якщо очікується, щоколивання концентрації дослідної речовини перевищуватиме +- 20%від номінальної (на основі даних про стабільність дослідноїречовини), необхідно аналізувати всі дослідні концентрації,дотримуючись аналогічного режиму.
