- докладна інформація щодо складу дослідноїречовини/приготування їжі, прийнята концентрація, стабільність іоднорідність приготування,
- докладна інформація щодо подачі дослідної речовини,
- дійсна доза (мг/кг вага тіла/день), показник конверсіїїжа/питна вода концентрації дослідної речовини (ppm) до дійсноїдози, якщо застосовується,
- докладна інформація щодо якості їжі і води.
2.2.4. Результати:
- вага тіла і зміна ваги тіла,
- споживання їжі і пиття, якщо застосовується,
- реакція на отруєння згідно зі статтю і рівнем дози,включаючи ознаки отруєння,
- характер, ступінь і час тривання клінічних ознак(виліковний або невиліковний стан),
- результати офтальмологічного досліду,
- оцінка сенсорних характеристик або стискання і моторниххарактеристик (якщо можна оцінити),
- гематологічні дослідження з відповідними допусками рівнів,
- біохімічні клінічні дослідження з відповідними допускамирівнів,
- остаточна вага тіла, вага органів і пропорції вагиорган/тіло,
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних результатів,
- дані, що стосуються засвоєння, якщо доступні,
- статистична обробка результатів, де необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment ofNeurotixicity Associated with Exposure to Chemicals. EnvironmentalHealth Criteria Document No. 60.
(2) Tupper, D.E., Wallace R.B. (1980). Utility of theNeurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40,pp. 999-1003.
(3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use inIndustrial Toxicology. J.Toxicol. Envorin. Health, 9, pp. 691-704.
(4) Moser, V.C, Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). RatStrain and Stock Comparisons Using a Functional ObservationalBattery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl.Pharmacol., 108, pp. 267-283.
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T, (1979). AMethod for Routine Assessment of Fore-and Hind-limb grip Strengthof Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, pp. 233-236.
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W.,Reiter L.W., Tilson H. A., MacPhail R.C. (1991). InterlaboratoryComparison of Motor Activity Experiments: Implication forNeurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13,pp. 599-609.
(7) Weingard K., Brown G., Hall R. Et al. (1996)."Harmonisation of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity andSafety Studies", Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198-201.
В.27. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ: 90-ДЕННЕ
ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
НЕ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження субхронічної токсичності пероральнимшляхом є копією OECD TG 409 (1998).
1.1. ВСТУП
При дослідженні і оцінюванні характеристик токсичностіхімічної речовини визначення субхронічної токсичності пероральнимшляхом при вживанні повторних доз проводиться після отриманняпопередньої інформації щодо токсичності в результаті 28-деннихдосліджень гострої або хронічної токсичності. В результаті90-денного дослідження отримують інформацію щодо можливоїнебезпеки для здоров'я, яка, очевидно, може виникнути післяповторного прийому препарату впродовж тривалого часу, який включаєв себе момент припинення лактації і зростання до зрілості.Дослідження надає інформацію щодо основних токсичних ефектів,визначає органи-мішені і можливість акумуляції, а також надаєможливість оцінити рівень дози препарату, що може викликатиприхований побічний ефект, що в свою чергу може бути використанодля вибору рівнів доз для тривалих досліджень і для визначеннякритеріїв безпеки для людини.
Це дослідження надає можливість визначити негативні наслідкипри дії хімічного препарату у тварин, що не належать до гризунів,цей метод використовується тільки:
- у випадку, коли результати, отримані в інших дослідах,вимагають пояснення/характеристики для іншого виду тварин, що не єгризунами, або
- у випадку, коли токсикологічні дослідження показують, щовикористання цього виду тварин, що не є гризунами, є найбільшоптимальним вибором серед лабораторних тварин, або
- у випадку, коли інші відповідні причини доводятьнеобхідність використання тварин, що не є гризунами.
Також дивіться Загальний вступ, частина В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Доза: є кількістю речовини, що подається. Доза виражається вмасі (г, мг), або як вага дослідної речовини на одиницю маси тілатварини, що досліджується (наприклад, мг/кг), або як стала харчоваконцентрація (ppm).
Дозування: є загальним поняттям, що включає в себе дозу,частоту її вживання і час приймання дози.
NOAEL: є скороченням від поняття, що визначає рівень, приякому не спостерігається шкідливих наслідків, а також є найвищимрівнем дози, при якому не спостерігається шкідливих ефектів, якізалежать від речовини, що подаються.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина приймається перорально щодня мірнимидозами окремими групами піддослідних тварин, один рівень дози нагрупу впродовж 90 днів. Впродовж періоду приймання речовини затваринами здійснюється ретельний нагляд на предмет виявлення ознакотруєння. Проводиться розтин тварини, що помирають, або якихвбивають впродовж тестування, після завершення досліду тварин, щовижили, також вбивають, після чого проводиться їх розтин.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Вибір видів тварин
Звичайно, при дослідженні тварин, що не є гризунами,використовують собак певної породи: часто використовуються гончісобаки. Також можуть використовуватись інші види тварин,наприклад, свині, малі свині. Використання приматів нерекомендується, а якщо вони використовуються, то їх використаннянеобхідно обґрунтувати. Для дослідів відбираються молоді здоровітварини, у випадку використання собак, бажано використовуватитварин від чотирьох до шести місяців, але не старше дев'ятимісяців. Якщо це дослідження передує довгостроковому дослідженнюхронічної токсичності, в обох дослідах необхідно використовуватиті самі види/породи тварин.
1.4.2. Підготовка тварин
Для проведення попередніх експериментальних процедурнеобхідно використовувати здорових молодих тварин, що пройшлиакліматизацію в лабораторних умовах. Тривалість акліматизаціїзалежить від відібраних видів тварин і їхнього джерела.Рекомендованим періодом є щонайменш п'ять днів для собак і свинейвищезазначених порід, взятих з постійних колоній і щонайменш дватижні для тварин з зовнішніх джерел. Піддослідні тварини повиннібути охарактеризовані за породою, штамом, джерелом, статтю, вагоюі/або віком. Тварини повинні бути випадково відібрані дляконтрольних і дослідних груп. Клітки повинні бути розташованітаким чином, щоб мінімізувати можливі ефекти, викликанірозташуванням клітки. Кожній тварині присвоюється унікальнийідентифікаційний номер.
1.4.3. Підготовка доз
Дослідна речовина подається з їжею, питтям, через зонд або вкапсулах. Метод перорального вживання залежить від метидослідження і фізико-хімічних властивостей дослідного матеріалу.
При необхідності дослідна речовина розчиняється абопідвішується у відповідному середовищі. Рекомендується заможливістю спочатку розглянути можливість використання водногорозчину/суспензії, потім олійного розчину/емульсії (наприклад, вкукурудзяній олії), а потім використання розчинів в іншихсередовищах. Для всіх середовищ, крім води, необхідно визначититоксичні характеристики. Необхідно визначити стабільністьдослідної речовини в умовах вживання.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Принаймні вісім тварин (4 самці і 4 самки) необхідновикористовувати для кожного рівня дози. Якщо планується умертвіннявпродовж досліду, кількість необхідно збільшити на таку кількістьтварин, щоб забезпечити відповідну якість оцінювання токсичногоефекту. Спираючись на попередній досвід про хімічні і близькі доних речовини необхідно розглянути можливість включення додатковоїсателітної групи кількістю вісім (по чотири кожної статі) дляконтрольної групи і групи, що отримує найвищу дозу з метою наглядупісля досліду на предмет реверсивності або тривалості будь-якихтоксичних наслідків. Час такого нагляду встановлюється увідповідності до виявлених наслідків.
1.5.2. Рівні доз
Використовуються принаймні три рівні доз з одночаснимпоточним контролем, окрім випадку проведення досліду на граничнийвміст (див. 1.5.3). Рівні доз визначаються на підставі повторноїдози, або на підставі досліджень діапазону, а також повиннівраховувати всі існуючі токсикологічні і токсикоз-кінетичні дані,доступні щодо існуючої речовини або пов'язаних з нею матеріалів.Враховуючи обмеження, викликані фізико-хімічною природою ібіологічним ефектом дослідної речовини, рівень найвищої дозивибирається з метою викликання токсичних проявів, але вибрана дозане повинна призводити до смерті або значних ушкоджень. Зменшеннядозування застосовується з метою демонстрації реакції, пов'язаноїз дозуванням і рівня при якому не спостерігається шкідливихнаслідків (NOAEL) при найнижчій дозі. Двократні або чотирикратніінтервали є оптимальними для встановлення рівнів дозування, щознижуються, а введення четвертої дослідної групи є частонеобхідним при використанні дуже значних інтервалів (наприклад,більше ніж коефіцієнт 6-10) між дозуваннями.
Контрольною групою повинна бути група, яка не піддається діїпрепарату, або яка піддається дії середовища, якщо для вживаннядослідної речовини використовується середовище. Тварини вконтрольній групі поза часом ненадання їм дослідної речовинизнаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах.Якщо використовується середовище-носій, контрольна група повиннаотримати його в максимально можливому об'ємі. Якщо досліднаречовина подається з харчуванням і призводить до зменшенняраціону, контрольна група з харчової пари може бути корисною прирозрізненні між зменшенням, що викликане смаком і зменшенням,викликаним токсикологічними змінами в моделі дослідження.
Наступні характеристики середовища-носія та інших добавокповинні розглядатись як відповідні: вплив на засвоюваність,розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив нахімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичніхарактеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчовогостатусу тварин.
1.5.3. Дослід на граничний вміст
Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних дляцього досліду призводить до непомітного шкідливого ефекту, а такожякщо наявність токсичності не очікується на підставі даних щодоструктурно-пов'язаних речовин, в проведенні повного дослідженнятрьох рівнів доз нема необхідності. Дослід на граничний вмістзастосовується за винятком ситуацій, коли небезпека для людейвикликає потребу застосування вищого рівня дози.
1.5.4. Вживання доз
Тваринам надається дослідна речовина через сім днів кожноготижня впродовж 90 днів. Кожний інший спосіб дозування, наприклад,п'ять днів на тиждень вимагає обґрунтування. Якщо досліднаречовина подається через зонд, процедура виконується поданнямодиничної дози з використанням трубки або катетера. Максимальнийоб'єм рідини, що надається за один раз, залежить від розмірупіддослідної тварини. Звичайно об'єм повинен бути мінімальноможливим. За виключенням речовин, що викликають подразнення абокорозію, які звичайно викликають загострення при більш значнихконцентраціях, необхідно мінімізувати змінність об'єму дослідноїречовини шляхом регулювання концентрації для того, щоб забезпечитипостійність об'єму на всіх рівнях дозування.
Для речовин, які подаються з їжею або питною водою, важливозабезпечити, щоб об'єм дослідної речовини не перешкоджавнормальному харчуванню або водному балансу. Якщо дослідна речовинаподається з їжею - застосовується або постійна концентрація в їжі(ppm), або постійний рівень дози відносно маси тіла тварини; якщозастосовуються альтернативні варіанти, це повинно бути зазначеноокремо. Для речовин, які подаються через зонд або в капсулах, дозаповинна подаватись кожного дня в той самий час і регулюватисьтаким чином, щоб забезпечити постійний рівень дозування відносномаси тіла тварини. При проведенні попереднього 90-денногодослідження перед дослідженням хронічної токсичності, в обохвипадках повинна застосовуватись та сама дієта.
1.5.2. Огляди
Період нагляду повинен складати щонайменш 90 днів. Для тваринв сателітній групі складається графік оглядів, при цьому увідповідний період тварини не піддаються дії препарату длявиявлення їхньої стійкості до токсичного ефекту або здатностівідновлюватись після нього.
Загальні клінічні огляди проводяться принаймні раз на день,бажано в один і той самий час, приймаючи до уваги піковий періодочікуваного ефекту після дозування. Клінічний стан твариннеобхідно реєструвати. Принаймні два рази на день, звичайно, напочатку і в кінці кожного дня всі тварини оглядаються на предметклінічних проявів і смертності.
Принаймні раз перед першим проявом (в межах порівняння) іодин раз на тиждень після цього всі тварини повинні пройтиретельне клінічне обстеження. Ці обстеження проводяться за межамиклітки, де живе тварина, бажано в стандартному місці і в один ітой самий час. Необхідно докласти зусиль для мінімізації зміниумов, в яких проводиться огляд. Ознаки токсикації повинні бутиретельно записані, включаючи час прояву ознаку, ступінь ітривалість. Огляди повинні включати в себе огляд на предмет змінишкіри, хутра, очей, слизистих оболонок, наявність секреції іекскрецій, а також автономної активності (наприклад, очі, щосльозяться, пілоерекція, зміна розміру зіниць, зміна дихання), алене обмежуватись ними. Необхідно також зареєструвати такі прояви,як: зміна ходи, постави і реакції на догляд, а також наявністьклонічних або тонічних рухів, стереотипної поведінки (надмірневмивання, повторюваний рух по колу).
Офтальмологічні дослідження за допомогою офтальмоскопу абоподібного приладу повинно здійснюватись перед вживанням доздосліджуваної речовини і після закінчення дослідів, найкраще длявсіх тварин, але принаймні в групі з високим рівнем дозування і вконтрольній групі. При виявленні змін в очах, необхідно повторнодослідити всіх тварин.
1.5.5.1. Вага тіла і споживання їжі/води
Всіх тварин зважують принаймні раз на тиждень. Оцінюванняоб'єму споживання їжі проводиться принаймні раз на тиждень. Якщодослідна речовина приймається з водою, також принаймні раз натиждень необхідно оцінити об'єм споживання води. Споживання водитакож приймається до уваги при дослідах, де речовина подається зїжею або через зонд, впродовж яких режим прийому води може бутизмінено.
1.5.5.2. Гематологія і клінічна біохімія
Зразки крові відбираються з зазначеного місця і зберігаються,якщо це необхідно, у відповідних умовах. На кінець дослідногоперіоду зразки збираються до або в процесі процедури дляумертвіння тварин.
Гематологія, включаючи гематокрит, концентрацію гемоглобіну,кількість еритроцитів, загальну і диференційну кількістьлейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортання крові: часзгортання крові, протромбінів час або тромбопластиновий час,повинна бути досліджена на початку дослідження, а потім щомісяцяабо всередині дослідного періоду і в кінці дослідного періоду.
Визначення клінічної біохімії для основних дослідженьтоксичних наслідків в тканинах, а саме, дія на нирки і внутрішніоргани, проводиться на пробах крові тварин, отриманих на початкудосліду, після щомісячних досліджень і в кінці дослідного періоду.При дослідженні розглядаються електролітний баланс, вуглеводнийобмін речовин, функція печінки і нирок. На вибір того чи іншогодосліду впливає визначений спосіб дії дослідної речовини. Твариниповинні утримуватись від вживання їжі до відбору проб крові.
Пропонується визначити наявність: кальцію, фосфору, хлориду,натрію, калію, глюкози, що міститься в організмі до вживання їжі,аланін амінотрансфераза, аспартат амінотрансфераза, орнітиндекарбоксилаза, гама глуматил транспептидаза ісорбітолдегідрогеназа, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові,загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.
Аналіз сечі необхідно провести на початку, в середини і вкінці досліду, сеча відбирається у відповідності до визначеногографіку. В результаті такого аналізу оцінюється: зовнішній вигляд,об'єм, осмолялність або питома густина, рН, наявність білку,глюкози і крові, кров'яних клітин. Додаткові параметри можутьтакож бути визначені при необхідності для продовження дослідженнявиявленого ефекту.
Крім того, необхідно взяти до уваги результати дослідів щодовизначення ознак загального ушкодження тканин. Крім того, дляздійснення відповідного токсикологічного аналізу необхіднопровести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужного балансу,метагемоглобіну, холінестеразне інгібірування. Додаткові клінічнібіохімічні показники можуть бути визначені при необхідності дляпродовження дослідження виявленого ефекту.
Взагалі необхідно застосовувати гнучкий підхід в залежностівід видів тварин і ефекту від даної речовини, що виявляється і/абопередбачається.
1.5.5.3. Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальномузагальному розтину, який включає в себе детальне вивченнязовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудноїі черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки, наднирковізалози, яєчка, придатки, матку, яєчники, зобну залозу, селезінку,мозок і серце всіх тварин (крім тих, які вмирають і/або буливипадково вбиті) необхідно обробити клейкою тканиною, після цьоговони повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокромустані для уникнення висихання.
Наступні тканини повинні бути законсервовані в найбільшпридатному середовищі, що є придатним для тканин обох типів ізапланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальніушкодження, мозок (всі репрезентативні ділянки, включаючи півкуліголовного мозку і спинний мозок/варулієв міст), хребет (на трьохрівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому), слизовіоболонки, очі, щитовидні залози, пара-щитовидні залози, зобнізалози, стравохід, слинні залози, шлунок, великий і малий кишечник(включаючи Пейерові бляшки), печінку, жовчний міхур, підшлунковузалозу, нирки, печінкову залозу, селезінку , серце, трахею ілегені, аорту, гонади, матки, інші статеві органи, жіночі груднізалози, простату, сечовий міхур, лімфатичні вузли (бажано одинлімфатичний вузол, що покриває шлях прийому препарату, а другийвузол такий, що знаходиться на відстані від шляху прийомупрепарату для, того, щоб прослідкувати систематичний вплив),периферійний нерв (сідничний або тибіальний) бажано якнайближче дом'язу, ділянку кісткового мозку (і/або свіжий аспірат кістковогомозку) і шкіру. Клінічні та інші результати можуть викликатинеобхідність дослідження додаткових тканин. Також повинні бутизбережені будь-які органи, що можуть вважатись органами-мішенямина підставі відомих властивостей дослідної речовини.
1.5.5.4. Гістопатологія
Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів ітканин всіх тварин контрольної групи і групи, що отримуваланайбільшу дозу. Ці дослідження проводяться для тварин всіх іншихгруп дозування при наявності змін в групі, що отримувала найбільшудозу, пов'язаних з дією препарату.
Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
При використанні сателітної групи проводиться гістопатологіяна тканинах і органах, визначених, як такі, що реагують, в групах,що приймали препарат.
2. ДАНІ І ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі даніповинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальнакількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількістьтварин, що вмерли під час досліду або кількість тварин, якихбезболісно умертвили, а також час, впродовж якого настала смертьабо безболісне умертвіння, кількість тварин, що має ознакиотруєння, опис ознак отруєння, що спостерігаються, включаючи часпояви, тривалість, ступінь тяжкості кожного токсичного випадку,кількість тварин, у яких виявлено патологічні зміни, типпатологічних змін і відсоток тварин, що складає кожний типпатологічних змін.
В окремих випадках кількісні результати повинні оцінюватисьвідповідними і загальноприйнятими статистичними методами.Статистичні методи і данні, що піддаються аналізу, повиннівибиратись під час приготування проекту досліджень.
2.2. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:
2.2.1. Речовина, що вживається при дослідженні:
- фізичний характер, чистота і фізико-хімічні властивості,
- ідентифікаційні дані,
- середовище (якщо застосовується): обґрунтування виборусередовища, якщо відрізняється від води.
2.2.2. Види тварин, що використовуються при дослідженні:
- породи і штам, що використовувались,
- кількість, вік і стать тварин,
- джерело, умови проживання, харчування і т.ін.,
- вага кожної тварини на початку дослідження.
2.2.3. Умови дослідження:
- раціональне обґрунтування вибраного рівня дозування,
- докладна інформація щодо складу дослідноїречовини/приготування їжі, прийнята концентрація, стабільність іоднорідність приготування,
- докладна інформація щодо подачі дослідної речовини,
- дійсна доза (мг/кг вага тіла/день), показник конверсіїїжа/питна вода концентрації дослідної речовини (ppm) до дійсноїдози, якщо застосовується,
- докладна інформація щодо якості їжі і води.
2.2.4. Результати:
- вага тіла і зміна ваги тіла,
- споживання їжі і пиття, якщо застосовується,
- реакція на отруєння згідно зі статтю і рівнем дози,включаючи ознаки отруєння,
- характер, ступінь і час тривання клінічних ознак(виліковний або невиліковний стан),
- результати офтальмологічного досліду,
- гематологічні дослідження з відповідними допусками рівнів,
- біохімічні клінічні дослідження з відповідними допускамирівнів,
- остаточна вага тіла, вага органів і пропорції вагиорган/тіло,
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних результатів,
- дані, що стосуються засвоєння, якщо доступні,
- статистична обробка результатів, де необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки.
В.28. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ДЕРМАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ
ДЕРМАЛЬНОЮ ДОЗОЮ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина щоденно наноситься на шкіру рівномірнимидозами декільком групам піддослідних тварин, одна доза на групувпродовж 90 днів. В період приймання дози тварини піддаютьсящоденному огляду з метою виявлення ознак токсичності. Тварини, щопомирають впродовж досліду піддаються розтину, а після закінченнядосліду тварини, що залишились, умертвляються і також піддаютьсярозтину.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування,визначених для дослідження щонайменш впродовж п'яти днів допочатку дослідження. Перед початком дослідження молоді і здоровітварини випадково розподіляються за дослідними і контрольнимигрупами. До початку досліду шерсть піддослідних тваринпідстригається в потиличній зоні тулуба. Можна застосуватигоління, але воно повинно бути виконано за 24 години передпочатком досліду. Наступна стрижка або гоління виконується, якправило, через тиждень. Під час стрижки або гоління необхіднозважати на те, щоб не пошкодити шкіру. Необхідно очистити не менше10% поверхні шкіри для випробування дослідної речовини. Необхідновзяти до уваги масу тварин під час прийняття рішення щодо поверхнішкіри, яка очищується, а також щодо поверхні її покриття.Досліджуючи тверді речовини, які можуть витертись в окремихвипадках, дослідну речовину необхідно змочити водою або увідповідному середовищі, щоб забезпечити відповідний контакт зішкірою. Рідкі дослідні речовини, як правило, застосовуються внерозчиненому вигляді. Звичайно речовина наноситься від п'яти досеми днів на тиждень.
1.6.2. Умови проведення досліду
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Можна використовувати дорослих щурів, кроликів або морськихсвинок. На початку дослідження розбіжність в вазі не повиннаперевищувати +- 20% середньої ваги. У випадку проведеннясуб-хронічних досліджень в якості попередніх досліджень передтривалими дослідженнями, не обхідно використовувати тварин тогосамого штаму і джерела.
1.6.2.2. Кількість і стать
Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) зі здоровою шкіроюнеобхідно використовувати для кожного рівня дози. Самки не повиннібути вагітними і не повинні бути такими, що народжували раніше.Якщо планується умертвіння впродовж досліду, кількість необхіднозбільшити на кількість тварин, що планується вмертвити дозакінчення досліду. Сателітна група кількістю 20 тварин (по10 тварин кожної статі) може піддаватись дії підвищеної дозивпродовж 90 днів з подальшим оглядом на предмет відновлення,стійкості, або запізненого прояву наслідків токсичності через28 днів після виконання процедур досліду.
1.6.2.3. Рівні доз
Використовуються принаймні три рівні доз разом з контрольноюдозою або контролем середовища, якщо воно застосовується. Часекспозиції речовини повинен дорівнювати принаймні шести годинамщоденно. Речовину необхідно застосовувати в той самий час кожногодня, а кількість речовини, що застосовується регулюється увідповідності до інтервалів часу (тижневих або двотижневих) дляпідтримання однакового рівня дозування у відповідності до маситіла тварини. Крім дії дослідною речовиною, тварини в контрольнійгрупі знаходяться в тих самих умовах, що і тварини в досліднихгрупах. Якщо для полегшення дозування використовуєтьсясередовище-носій, контрольна група, що приймає його, отримує такесаме дозування, що і дослідні групи і таку саму дозу, що і група,яка отримує найбільшу дозу. Найвища доза повинна викликатитоксичний ефект, але не призводити (або призводити до незначних)летальних наслідків. Найнижчий рівень дози не повинен викликатиочевидних проявів токсичності. У випадку оцінювання впливу налюдину, найнижчий рівень повинен перевищувати рівень, щозастосовується для людини. В ідеальному випадку середній рівеньдози повинен викликати мінімальний очевидний токсичний ефект. Привикористанні декількох середніх доз, рівні доз повинні визначатисьтаким чином, щоб забезпечити градацію токсичних ефектів. В групах,що отримують низьку і середню дозу і в контрольній групі рівеньлетальних випадків повинен бути низьким для можливості якісноїоцінки результатів.
Якщо застосування дослідної речовини призводить до значнихподразнень шкіри, необхідно зменшити концентрацію, що можепризвести до зниження або зникнення інших токсичних ефектів вгрупі, що приймає найвищу дозу. Якщо шкіра отримує новеушкодження, може виникнути необхідність в завершені поточнихдослідів і початку дослідів при більш низькій концентрації.
1.6.3. Дослід на граничний вміст
Якщо в результаті попереднього тестування при Рівні доз,еквівалентному 1 000 мг/кг або при вищому рівні, яке проводилось взв'язку з можливою дією на організм людини, не було виявленотоксичного ефекту, наступні дослідження можуть виявитисьнепотрібними.
1.6.4. Період нагляду
Піддослідні тварини повинні щодня піддаватись огляду з метоювиявлення ознак токсичності. Необхідно записувати час смерті, часпояви і зникнення ознак токсичності.
1.6.5. Процедура
Тварини розміщуються в окремих клітках. Тварини піддаютьсядії дослідної речовини в ідеальному випадку впродовж 90 днів7 днів на тиждень.
Для тварин в будь-якій сателітній групі складається графікоглядів, якого слід дотримуватись впродовж наступних 28 днів, непіддаючи тварин дії дослідної речовини для визначення відновленняабо не відновлення після токсичного ефекту. Час експозиції повиненскладати шість годин на день.
Дослідна речовина рівномірно розподіляється на ділянці шкіри,що складає приблизно 10% від загальної площі тіла. Звисокотоксичними речовинами площа поверхні повинна бути меншою,але вони повинна бути покрита, якщо це можливо, тонкою рівномірноюплівкою.
Під час експозиції дослідна речовина входить в контакт зішкірою за допомогою марлі і тасьми, що не викликає подразнень.Наступне досліджуване місце повинно бути накрито відповідним чиномз метою утримання марлі і дослідної речовини і для того, щобтварини не були здатні проковтнути дослідну речовину. З метоюуникнення проковтування дослідної речовини можна застосуватиспеціальні засоби безпеки, але утримання тварин в повнійнерухомості не рекомендується.
Після закінчення часу експозиції решту дослідної речовинислід усунути, у випадку, коли це можливо - за допомогою води абоіншого методу для очищення шкіри.
Всі тварини повинні піддаватись щоденному огляду, а проявитоксичності повинні реєструватись, включаючи час їх з'явлення,ступінь і час тривання. При огляді тварин в клітках необхідновиявляти зміни, що з'явились на їхній шкірі і хутрі, зміни в очахі слизовій оболонці, а також зміни дихальної системи, кровообігу,автономної і центральної нервової системи, соматомоторноїактивності і схеми поведінки. Щотижня необхідно проводитиоцінювання обсягу харчування і зважування тварин. Регулярний оглядтварин є необхідним для забезпечення того, щоб тварини впродовждосліду не загинули з причин канібалізму, автолізу тканин абозміщення. В кінці дослідного періоду всі тварини, що вижили, вгрупах, що не є сателітними, піддаються розтину. Тварини, щовмирають видаляються з групи і також піддаються розтину.
Звичайно виконуються наступні види огляду, включаючиконтроль:
(а) офтальмологічний огляд з використанням офтальмоскопу абоеквівалентного придатного обладнання здійснюється до нанесеннядослідної речовини і після закінчення досліду, бажано для всіхтварин, але принаймні, для групи, що отримувала найвищу дозу і дляконтрольної групи. При виявлені будь-яких змін в очах, необхіднооглянути всіх тварин.
(b) гематологічний огляд, включаючи гематокрит, концентраціюгемоглобіну, кількість еритроцитів, загальну і диференційнукількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортаннякрові: час згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновийчас проводиться в кінці дослідного періоду.
(с) Визначення клінічної біохімії крові проводиться в кінцідослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітнийбаланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. Навибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб діїдослідної речовини. Тварини повинні утримуватись від вживання їжідо відбору проб крові. Пропонується визначити наявність: кальцію,фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози (в період утримання відїжі в залежності від виду тварини), глютамінової пировиноградноїтранзамінази сироватки(1), глютамінової щавелево-уксусноїтранзамінази сироватки(2), орнітин декарбоксилаза, гама глуматилтранспептидаза, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові,загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізунеобхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужногобалансу, метагемоглобіну, холінестеразне активності. Додатковіклінічні біохімічні показники можуть бути визначені принеобхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.
----------------
(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.
(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.
(d) Звичайно, в проведені аналізу сечі нема необхідності,окрім випадків, коли проведення такого аналізу рекомендується взв'язку з наявною або очікуваною токсичністю.
Якщо історичні вихідні дані не відповідають вимогам,необхідно звернути увагу на те, чи є необхідність до початкудозування у визначенні параметрів гемулогічної і клінічноїбіохімії;
Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальномузагальному розтину, який включає в себе детальне вивченнязовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудноїі черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки і наднирковізалози повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокромустані для уникнення висихання. Наступні органи і тканини повиннібути законсервовані в найбільш придатному середовищі для можливихзапланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальніушкодження, мозок, включаючи ділянки спинного мозку/варулієвамоста, слизові оболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози,будь-які зобні тканини, (трахею) легені, серце, аорту, слиннізалози, печінку, селезінку, нирки, надниркові залози, підшлунковізалози, гонади, матки, інші статеві органи, жовчний міхур (якщоє), стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонка кишка,підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка, сечовийміхур, лімфатичні вузли (жіночі грудні залози), (стегновамускулатура), периферійні нерви, (очі) (грудна кістка з кістковиммозком) (стегно, включаючи суглобну поверхню), (хребет на трьохрівнях: шийному, середньогрудному і поперековому), і (сльозовазалоза, пальпебральна частина якої розташована під верхнімзовнішнім краєм орбіти). Тканини, зазначені в дужках, оглядаютьсятільки при виявлені ознак токсичності, або якщо вони єорганами-мішенями.
Гістопатологічні дослідження
(а) Необхідно провести повну гістопатологію нормальної ідосліджуваної ділянки шкіри, а також органів і тканин тваринконтрольної групи і групи, що отримувала найбільшу дозу.
(b) Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
(c) Органи-мішені в інших групах дозування повинні бутидосліджені.
(d) При використанні щурів, легені тварин в групах, щоотримували середню і низьку дози піддаються гістопатологічномудослідженню для виявлення інфекції, оскільки це дозволяє якіснооцінити стан тварин. В наступних гістопатологічних дослідженнях,звичайно, нема потреби в цих групах, але вони завжди повинніпроводитись на органах, в яких виявлено значне ушкодження в групі,що отримувала найвищу дозу.
(е) При використанні сателітної групи гістопатологічнідослідження проводяться на тканинах і органах, що ідентифікованіяк такі, що виявляють ефект в інших піддослідних групах.
2. ДАНІ
2.1. ДАНІ
Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі даніповинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальнакількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількістьтварин, у яких виявлені ушкодження, тип ушкоджень і процентневідношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень.Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичногометоду. Може використовуватись будь-який статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:
- породи, штам, джерело тварин, що використовувались,оточуючі умови, дієту,
- умови дослідження,
- рівень дози (включаючи середовище-носія, якщовикористовується) і концентрацію,
- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі ідозування,
- рівень, при якому відсутній ефект, якщо можливо,
- час смерті впродовж дослідження і факт виживання тварин дозакінчення досліду,
- опис токсичного або інших ефектів,
- час тривалості кожного аномального прояву і їхніхнаслідків,
- відсутність наслідків,
- дані, що стосуються маси тіла і спожитої їжі,
- висновки офтальмологічних досліджень,
- види і всі результати гематологічного досліду,
- види клінічних і біохімічних досліджень, а також всі їхрезультати (включаючи результати всіх аналізів сечі),
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних дослідів,
- статистична обробка результатів, якщо можливо,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В
В.29. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ
ПРИ ВДИХАННІ: 90-ДЕННЕ ДОСЛІДЖЕННЯ З ПОВТОРЮВАНОЮ
ДОЗОЮ ДЛЯ ВДИХАННЯ НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Декілька груп піддослідних тварин піддаються щоденній діїдослідної речовини в мірних дозах впродовж визначеного часу, одинвид концентрації вживається в даній групі впродовж 90 днів. Увипадку використання середовища-носія з метою отриманнявідповідної концентрації дослідної речовини в повітрі, необхідновикористовувати контрольну групу для оцінювання середовища-носія.В період приймання дози тварини піддаються щоденному огляду зметою виявлення ознак токсичності. Тварини, що помирають впродовждосліду піддаються розтину, а після закінчення досліду тварини, щозалишились, умертвляються і також піддаються розтину.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування,визначених для дослідження щонайменш впродовж 5 днів до початкудослідження. Перед початком дослідження молоді і здорові тваринивипадково розподіляються за дослідними і контрольними групами. Принеобхідності до дослідної речовини може бути додано відповіднесередовище-носія для отримання необхідної концентрації речовини вповітрі. У випадку вживання будь-якого середовища-носія або іншихдобавок для полегшення введення дози, необхідно упевнитись, щовони не викликають жодних токсичних наслідків. Базові дані можутьвикористовуватись у відповідності до потреб.
1.6.2. Умови проведення досліду
1.6.2.1. Піддослідні тварини
У випадку відсутності протипоказань бажано використовуватищурів. Необхідно використовувати види молодих здорових тварин, якізвичайно використовуються для лабораторних дослідів. На початкудослідження розбіжність в вазі не повинна перевищувати +- 20%середньої ваги. У випадку проведення суб-хронічних досліджень вякості попередніх досліджень перед тривалими дослідженнями,необхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.
1.6.2.2. Кількість і стать
Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) піддаються діїкожної концентрації речовини. Самки не повинні бути вагітними і неповинні бути такими, що народжували раніше. Якщо плануєтьсяумертвіння впродовж досліду, кількість необхідно збільшити накількість тварин, що планується вмертвити до закінчення досліду.Сателітна група кількістю 20 тварин (по 10 тварин кожної статі)може піддаватись дії підвищеної дози впродовж 90 днів з подальшимоглядом на предмет відновлення, стійкості, або запізненого проявунаслідків токсичності через 28 днів після виконання процедурдосліду.
1.6.2.3. Концентрація
У випадку використання середовища-носія вимагаються принаймнітри рівні концентрації, для контрольної групи і контрольної групидля оцінювання середовища-носія (з концентрацією середовища-носія,що відповідає концентрації при найбільшій дозі). За виняткомзастосування дослідної речовини тварини з контрольної групиповинні знаходитись в таких самих умовах, що і тварини з дослідноїгрупи. Найвища концентрація повинна викликати токсичні наслідки,але не викликати або викликати незначну кількість летальнихвипадків. У випадку оцінювання впливу на людину, найнижчий рівеньповинен перевищувати рівень, що застосовується для людини. Відеальному випадку середній рівень дози повинен викликатимінімальний очевидний токсичний ефект. При використанні декількохсередніх доз, рівні доз повинні визначатись таким чином, щобзабезпечити градацію токсичних ефектів. В групах, що отримуютьнизьку і середню дозу і в контрольній групі рівень летальнихвипадків повинен бути низьким для можливості якісної оцінкирезультатів.
1.6.2.4. Час експозиції
Денна норма часу експозиції повинна складати декілька годинпісля врівноваження концентрації в комірках. Інші часові рамкитривалості експозиції можуть застосовуватись з метою виконанняособливих вимог.
1.6.2.5. Обладнання
Тварини досліджуються з використанням інгаляційногообладнання, розробленого з метою підтримки динамічної циркуляціїповітря при щонайменш 12 змінах повітря на годину з метоюзабезпечення відповідної кількості кисню, а також рівномірногорозподілу повітря з вмістом дослідної речовини. У випадкузастосування камери, її проект повинен мінімізувати стиканняпіддослідних тварин, а також мінімізувати їх контакт з дослідноюречовиною шляхом інгаляції. Як правило, для стабілізації повітря вкамері, загальна кількість піддослідних тварин не повиннаперевищувати 5% об'єму дослідної камери. Можуть використовуватисьорально-назальні, головні камери, а також камери для всього тіла;використання перших двох типів камер мінімізує можливість прийомудослідної речовини іншими шляхами.
1.6.2.6. Період нагляду
Піддослідні тварини повинні щодня піддаватись огляду з метоювиявлення ознак токсичності під час всього періоду дослідження, атакож періоду регенерації. Необхідно записувати час смерті, часпояви і зникнення ознак токсичності.
1.6.3. Процедура
Тварини піддаються дії дослідної речовини щодня, від п'яти досеми днів на тиждень впродовж 90 днів. Для тварин в будь-якійсателітній групі складається графік оглядів, якого сліддотримуватись впродовж наступних 28 днів, не піддаючи тварин діїдослідної речовини для визначення відновлення або не відновленняпісля токсичного ефекту. Температура, при якій проводиться дослідповинна підтримуватись на рівні 22 +- 3 град.С. В ідеальномувипадку, рівень відносної вологості повинен підтримуватись в межах30%-70%, але в окремих випадках (наприклад, використовуванняаерозолів) цей рівень не застосовується. Під час дії речовини їжаі вода не приймаються.
