1.6.7. Вага тіла і споживання їжі
Тварини зважуються в день 0 вагітності або не пізніше, ніж на3 день настання вагітності, якщо тварини, що були заплідненіодночасно надані зовнішнім селекціонером, в перший день дозування,принаймні кожні три дні впродовж періоду дозування і в деньзапланованого умертвіння.
Об'єм спожитої їжі реєструється кожні три дні, такареєстрація повинна співпадати з днями, в які визначається вагатіла тварин.
1.6.8. Огляд трупу, що піддавався розтину
Самки умертвляються за один день до очікуваного дня родів.Самки, що виявляють ознаки переривання вагітності або передчасногонародження до запланованого умертвіння умертвляються і піддаютьсядетальному макроскопічному огляду.
Під час ліквідації або смерті впродовж досліду самкипіддається макроскопічному огляду на предмет виявлення будь-якихструктурних аномалій або патологічних змін. Оцінка самок прикесаревому розтині і наступному аналізі плоду бажано проводити безотримання інформації щодо піддослідної групи з метою уникненняупередженого ставлення.
1.6.9. Огляд вмісту матки
Негайно після ліквідації або якнайшвидше після смерті маткиповинні бути видалені для підтвердження стану вагітності у тварин.Матки, що не мають ознак вагітності, піддаються подальшому огляду(наприклад, методом обробки сульфідом амонію, методом Залевськогоабо будь-яким альтернативним методом для кроликів) дляпідтвердження відсутності вагітності(5).
Матки, що мають ознаки вагітності, включаючи шийку, повиннібути зважені. Вага маток з ознаками вагітності не визначається утварин, що померли впродовж досліду.
Для вагітних тварин визначається кількість жовтих тіл.
Вміст маток необхідно оглянути на предмет виявлення мертвихембріонів або плодів, а також життєздатних плодів. Ступіньрезорбції описується для оцінки відносного часу смертізаплідненого яйця (Дивіться розділ 1.2.).
1.6.10. Огляд плодів
Необхідно визначити стать і вагу кожного плоду.
Кожний плід повинен бути оглянутий на предмет виявленнязовнішніх змін(6).
Плоди повинні бути оглянуті на предмет виявлення змін вм'яких або кісткових тканинах (наприклад, зміни, тератоформи абоаномалії)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24). Категоризація зміни плодів є бажаною але необов'язковою.
Після здійснення категоризації необхідно чітко визначитикожну категорію. Особливу увагу необхідно приділити статевимшляхам. Які оглядаються на предмет змін в розвитку.
Для гризунів половина посліду повинна бути підготовлена іоглянута на предмет скелетних змін. Залишок послідупідготовлюється для огляду на предмет змін в м'яких тканинах задопомогою прийнятих або прийнятних методів серійного розтину аботехнік детального загального розтину.
Для тварин, що не є гризунами, наприклад, для кроликів,необхідно оглянути всі плоди на предмет виявлення як скелетнихзмін, так і змін в м'яких тканинах. Тіла цих плодів оцінюються задопомогою детального розтину на предмет виявлення змін в м'якихтканинах, який може включати в себе процедури для подальшогооцінювання внутрішньої серцевої структури(25). Голови половиниплодів, що оглянути вищезазначеним способом, відтинаються іоглядаються на предмет виявлення змін в м'яких тканинах (включаючиочі, мозок, носові порожнини і язик) з використанням стандартнихметодів серійного розтину(26) або еквівалентного методу. Тіла цихплодів і неушкоджені плоди, що залишились, препаруються іоглядаються на предмет виявлення скелетних змін з використаннямтих самих методів, що використовуються для гризунів.
2. ДАНІ
2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Данні записуються окремо для самок і для їх потомства ізводяться в таблицю, в якій показується для кожної дослідної групиі для кожної генерації кількість тварин на початку дослідження,кількість тварин, що вмерли впродовж дослідження або вбитих зпричин гуманності час смерті або безболісного умертвіння,кількість вагітних самок, кількість тварин, що виявляють ознакиінтоксикації, опис ознак інтоксикації, що спостерігаються,включаючи час появи ознак, тривалість ознак, і ступінь кожноготоксичного ефекту, тип огляду ембріону/плоду і всі відповіднідані, що стосуються посліду.
Числові результати оцінюються відповідним статистичнимметодом, використовуючи послід як одиницю для аналізу даних.Необхідно використовувати загально прийнятий статистичний метод;статистичні методи відбираються у відповідності до видудослідження і повинні бути обґрунтовані. Дані щодо тварин, які невижили до запланованого умертвіння також мають бути повідомлені.Ці дані можуть бути включені для отримання групового середньогозначення, коли це необхідно. Актуальність даних, отриманих відтаких тварин, і як наслідок, їх включення або виключення згрупового середнього значення оцінюється і обґрунтовується вкожному окремому випадку.
2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати, отримані в ході дослідження дії токсичних речовинна пренатальний розвиток оцінюються на підставі виявленого ефекту.Оцінювання включає в себе наступну інформацію:
- результати дослідження материнського організму, а такожембріонів/плодів, включаючи оцінку наявності або відсутностіреакції на дію дослідної речовини на тварин а також розповсюдженняі ступінь виявленого ефекту,
- критерії, що використовуються для категоризації змінзовнішньої поверхні плоду, м'яких тканин і скелету, у випадку,коли проводилась категоризація,
- якщо необхідно, дані історичного контролю для покращенняінтерпретації результатів дослідження,
- цифри, що використовуються у підрахунках, всі процентнівідношення і коефіцієнти,
- адекватний статистичний аналіз результатів досліду, якщонеобхідно, який може включати в себе інформацію щодо методуаналізу для того, щоб незалежний експерт/статистик мав змогуповторно оцінити і переконструювати аналіз.
При отриманні результатів, що свідчать про відсутністьбудь-якого токсичного ефекту необхідно передбачити проведенняподальших досліджень для встановлення засвоєння і біологічноїдоступності дослідної речовини.
2.3. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Дослідження дії токсичних речовин на пренатальний розвитокнадають результати щодо ефекту від повторної дії дослідноїречовини на організм вагітних самок і на внутрішньо маточнийрозвиток їхнього потомства. Результати досліду інтерпретуютьсяразом з результатами, отриманими в ході субхронічних,репродуктивних і токсикокінетичних та інших досліджень. Оскількинаголос робиться як на питаннях загальної інтоксикації впоказниках інтоксикації материнського організму, так і на питанняхшкідливої дії на внутрішньоутробний розвиток, результати дослідудозволяють в певній мірі визначити різницю між шкідливою дією навнутрішньоутробний розвиток при відсутності загальної інтоксикаціїі дією, що проявляється при певних рівнях токсичності, що є такожшкідливими для материнського організму(27).
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформаціюпро:
Дослідну речовину:
- фізичну природу, і якщо необхідно, фізико-хімічнівластивості,
- ідентифікацію, включаючи номер CAS, якщо вінвідомий/визначений,
- чистоту.
Середовище-носій (якщо використовувалось)
- обґрунтування вибору середовища-носія, якщо відрізняєтьсявід води.
Піддослідні тварини:
- вид і штам, що використовувався,
- кількість і вік тварин,
- джерело, навколишні умови, харчування і т.ін.,
- індивідуальна маса тіла тварин на початку дослідження.
Умови дослідження:
- раціональне обґрунтування рівня доз,
- детальний опис формули дослідної речовини/приготування їжі,концентрація, стабільність і однорідність препарату,
- деталі, що стосуються подання дослідної речовини,
- у відповідних випадках перелік концентрацій дослідноїречовини в їжі/питній воді (ppm) на окрему дозу мг/кг маситіла/день,
- умови навколишнього середовища,
- деталі якості їжі і води.
Результати:
Дані щодо реакції на дію дослідної речовини на материнськийорганізм, включаючи без обмежень:
- кількість тварин на початку досліду, кількість тварин, щовижили, кількість вагітних тварин, кількість перериваньвагітності, кількість тварин, що народили раніше визначеного часу,
- день смерті впродовж дослідження або факт виживання твариндо кінця дослідження,
- дані щодо тварин, які не дожили до запланованого умертвіннязаписуються, але не включаються до статистичного порівняння груп,
- день спостерігання кожного аномального клінічного прояву ійого подальший розвиток,
- вага тіла, зміна ваги тіла і вага вагітної матки, включаючив деяких випадках зміну ваги тіла, скоректовану на вагу вагітноїматки,
- об'єм спожитої їжі, і об'єм спожитої води, якщо вінвизначається,
- результати розтину, включаючи вагу матки,
- необхідно включити в звіт значення NOAEL стосовно ефектівна материнський організм і на внутрішньоутробний розвиток.
Критичні точки внутрішньоутробного розвитку за дозами дляпосліду з імплантами, включаючи:
- кількість жовтих тіл,
- кількість імплантацій, кількість і відсоток мертвих плодіві резорбцій,
- кількість і відсоток до- і після- імплантаційних втрат.
Критичні точки внутрішньоутробного розвитку за дозами дляпосліду з живими плодами, включаючи:
- кількість і відсоток живого потомства,
- відношення між статями,
- вага тіла плоду, бажано за кожною статтю окремо і разом,
- зовнішні тератоформи, тератоформи м'яких тканин і скелету,а також інші відповідні зміни,
- критерії для категоризації, якщо необхідно,
- загальна кількість і відсоток плодів і посліду з зовнішнімизмінами, змінами в м'яких тканинах або скелеті, а також типи іпоказники індивідуальних аномалій, та інших відповідних змін.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Kavlock R.J. et al., (1996) A Simulation of the Influenceof Study Design on the Estimation of Benchmark Doses forDevelopmental Toxicity. Risk Analysis 16; p. 399-410.
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z., (1990) Proceedings of theWorkshop on the Acceptability and Interpretation of DermalDevelopmental Toxicity Studies. Fundamental and Applied Toxicology14; p. 386-398.
(3) Wong, B.A. et al., (1997) Developing SpecializedInhalation Exposure Systems to Address Toxicological Problems.CIIT Activities 17; p. 1-8.
(4) US Environmental Protection Agency, (1985) SubpartE-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4359: InhalationDevelopmental Toxicity Study.
(5) Salewski, E., (1964) Faerbermethode zum MakroskopischenNachweis von Implantation Stellen am Uterusder Ratte.Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und ExperimentalePathologie. 247, 367.
(6) Edwards, J.A., (1968) The external Development of theRabbit and Rat Embryo. In Advances of Teratology. D.H.M. Woolam(ed) Vol. 3. Academic Press, NY.
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage andBone in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin RedS.Congenial Anomalies 16, p. 171-173.
(8) Igarashi, E. Et al., (1992) Frequency Of SpontaneousAxial Skeletal Variations Detected by the Double StainingTechnique For Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.Congenial Anomalies 32, p. 381-391.
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development FollowingHeat Exposure in the Rat. Teratology, 47 p. 229-242.
(10) Marr, M.C. et al. (1998) Comparison of Single and DoubleStaining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects ofEthylene Glycol (EG) in CD Rats. Teratology 37; 476.
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method forDetecting Malformations in Rat Foetuses. Journal of Morphology,127, p. 291-306.
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ssIndicative of Foetal Maturity. Teratology, 11 p. 313-320.
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbits inTeratogenicity Studies. Toxicology and Applied Pharmacology, 9,p. 398-408.
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviationsin Rats: Malformations or Variations & Teratology, 8, p. 309-316.
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD(Spargue-Dawlery) Rat Skeleton after Maternal Exposure to theEthylene Glycol. Teratology, 46, p. 169-181.
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for ratFoetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton andHistological Study of Viscera. Supplement to the TeratologyWorkshop Manual, p. 163-173.
(17) Spark, C. And Dawson, A.B. (1928) The Order and Time ofappearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbsof the Albino Rat, with Special Reference to the PossibleInfluence of the Sex Factor. American Journal of Anatomy, 41,p. 411-445.
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements inRapid Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method forFetal Bone. Stain Technology, 39, p. 61-63.
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate ofOssification of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus Skeleton.American Journal of Anatomy, 36, p. 313-355.
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh VisceralExamination of Rat and Rabbit Foetuses Used in TeratogenicityTesting. Teratogenesis, Carciinogenesis, and Mutagenesis, 4,p. 181-188.
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957) The Genesisof the Rat Skeleton. Thomas, Springfield, IL
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations inTeratology. In Teratology: Principles and Techniques, Wilson J.G.and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL,p. 251-277.
(23) Wilson J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977) Handbook ofTeratology, Vol. 4. Plenum, NY.
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone StainingTechniques in the Evaluation of the Pesticide Teratogenicity. ActaVet. Acad. Sci. Hung, 28, p. 233-239.
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterationsin Mammalian Foetuses. Teratology, 9, p. 37-38.
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennet (1977) A DissectingProcedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit FoetalHead. In: Methods in Prenatal Toxicology Neubert, D., Merker, H.J.and Kwasingroch, T.E. (eds.). University of Chicago, Chicago, IL,p. 126-144.
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines forDevelopmental Toxicity Risk Assessment. Federal Register, 56,p. 63798-63826.
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of DevelopmentalAbnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Teratology,55, p. 249-292.
В.32. ТЕСТ-проба на канцерогенність
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина звичайно подається сім днів на тижденьвідповідним шляхом декільком групам піддослідних тварин, одна дозаподається кожній групі впродовж більшої частини життя тварин.Впродовж і після дії дослідної речовини дослідні твариниоглядаються щодня на предмет виявлення інтоксикації, зокрема, напредмет виявлення пухлин.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тварини розміщуються у відповідних умовах проживання іхарчування впродовж, принаймні, п'яти днів до початку дослідження.До початку дослідження молоді здорові тварини неупередженовибираються до дослідних і контрольних груп.
1.6.1. Піддослідні тварини
На підставі результатів попередніх досліджень, можутьвикористовуватись різні види тварин (гризуни і не гризуни). Додослідів залучаються тварини, що звичайно використовуються під часлабораторних дослідів, дозування починається якнайшвидше післяприпинення лактації.
На початку досліду розбіжність в вазі тварин не повиннаперевищувати +- 20% від середнього значення. При проведеннісубхронічного перорального дослідження в якості попередньогодослідження перед довгостроковим дослідженням в обох випадкахнеобхідно використовувати ті самі види/штами.
1.6.2. Кількість і стать
Для гризунів вибирається принаймні 100 тварин (50 самок і50 самців) для кожного рівня дозування і для контрольної групи.Самки повинні бути такими, що не народжували раніше і не євагітними. Якщо впродовж досліду планується умертвіння тварин,кількість тварин повинна бути збільшена на кількість тварин, якупланується умертвити до закінчення дослідження.
1.6.3. Рівні доз і частота експозиції
Крім контрольної групи необхідно використовувати принаймнітри групи з різними рівнями дозування. В групі з найвищим рівнемдозування мають бути виявлені ознаки мінімальної інтоксикації,такі як незначне уповільнення збільшення маси тіла (менше ніж10%), без значної зміни звичайної тривалості життя через іншіпричини, ніж наявність пухлин.
Найнижчий рівень не повинен впливати на нормальний ріст,розвиток і тривалість життя тварини або викликати будь-які проявиінтоксикації. Взагалі цей рівень, повинен бути на 10% нижчим зависокий рівень дозування.
Рівень середньої дози повинен знаходитись між високим інизьким рівнями.
При виборі рівня дози до уваги приймаються дані, отримані зпопередніх тестів і досліджень токсичності.
Дослідну речовину, як правило, надають кожного дня.
Якщо хімічна речовина подається з питною водою, абозмішується з їжею, вона повинна бути постійно доступною.
1.6.4. Контроль
Необхідно використовувати паралельну контрольну групу, умовиутримання якої не відрізняються від умов утримання тварин в іншихгрупах окрім надання хімічної речовини.
В особливих випадках, наприклад, при інгаляційних дослідах, вяких використовуються аерозолі, або емульгатор, біологічнаактивність яких не охарактеризована при проведенні пероральнихдослідів, необхідно використовувати негативну контрольну групу.
1.6.5. Спосіб приймання
Застосовуються три основні способи приймання: пероральний,дермальний та інгаляційний. Вибір способу приймання залежить відфізичних і хімічних характеристик дослідної речовини і можливимспособом дії речовини на організм людини.
1.6.5.1. Пероральні дослідження
Якщо дослідна речовина споживається через шлунково-кишковийтракт, і якщо система травлення є подібною до системи травленнялюдини, бажано використовувати пероральний спосіб прийомуречовини, якщо не існує будь-яких протипоказань. Тварини можутьотримувати дослідну речовину, розчинену в питній воді або вкапсулах.
В ідеальному випадку застосовується щоденне дозуваннявпродовж семи днів на тиждень, оскільки дозування впродовж п'ятиднів на тиждень може призвести до одужання тварин або виводутоксичної речовини впродовж періоду, в який не приймаєтьсятоксична речовина, що в свою чергу призведе до неточності воцінюванні результатів. Однак, на підставі, перш за все,практичного досвіду, дозування впродовж п'яти днів на тижденьвважається прийнятним.
1.6.5.2. Дермальні дослідження
Нанесення речовини на шкіру може використовуватись дляімітації основного шляху потрапляння речовини в організм людини ів якості моделювання системи ураження шкіри.
1.6.2.3. Інгаляційні дослідження
Оскільки інгаляційні дослідження викликають певні технічніпроблеми, пов'язані з більшою складність в порівнянні з іншимишляхами вживання, в цьому розділі представлено більш детальнийопис способу приймання. Необхідно зауважити, що використаннявнутрішньо-трахеального введення може виявитись прийнятноюальтернативою в окремих ситуаціях.
Довготривалі дослідження розробляються на підставі впливу, щопередбачається на організм людини. Тварини піддаються дії хімічноїречовини або щодня впродовж шести годин після регулюванняконцентрації речовини в камері п'ять днів на тиждень (періодичнадія), або у відповідності до оточуючого середовища впродовж22-24 годин на день впродовж семи днів на тиждень (тривала дія) згодинною перервою щодня, в один і той самий час, для годування іпідготовки камери. В обох випадках тварини звичайно піддаютьсясталій концентрації дослідної речовини. Основною відмінністю міжперіодичною і тривалою дією є те, що в першому випадку тваринимають 17-18 годин для того, щоб одужати від щоденної дії хімічноїречовини, і більш тривалий період під час вихідних днів.
Вибір періодичної або тривалої дії залежить від метидослідження і впливу на людину, який імітується під час досліду.Однак, необхідно врахувати окремі технічні складності. Наприклад,переваги тривалої дії для моделювання умов зовнішнього середовищаможуть компенсуватись необхідністю поїння і годування тварин, атакож необхідність відтворення більш складних (і надійних)аерозолів і випарів, методів генерації і моніторингу.
1.6.6. Дослідні камери
Тварини досліджуються з використанням інгаляційних камер, щозабезпечують динамічну циркуляцію повітря при щонайменш 12 змінахповітря на годину з метою забезпечення відповідної кількостікисню, а також рівномірного розподілу повітря з вмістом дослідноїречовини. Конструкція і вигляд контрольних і дослідних камерповинна бути ідентичною для забезпечення рівних умов в усіхаспектах крім дії дослідної речовини. Незначний негативний тисквсередині камери підтримується для уникнення вивільнення дослідноїречовину в зовнішнє середовище. Камери повинні бути влаштованітаким чином, щоб мінімізувати стикання піддослідних тварин. Якправило, для стабілізації повітря в камері, загальна кількістьпіддослідних тварин не повинна перевищувати 5% об'єму дослідноїкамери.
Необхідно виконати виміри або моніторинг наступнихпоказників:
(i) потоку повітря: рівень потоку повітря, що проходить черезкамеру, повинен постійно відстежуватись;
(ii) концентрації: впродовж періоду щоденної дії різницяконцентрації дослідної речовини не повинна перевищувати +- 15%середнього значення. Впродовж всього періоду дослідження необхіднопідтримувати постійну концентрацію кожного дня;
(iii) температури і вологості: для гризунів температурапідтримується на рівні 22 +- 2 град.С, а вологість всерединікамери 30%-70%, крім випадків, коли для підвішування дослідноїречовини в камері використовується вода, Бажано, щоб обидвапоказника постійно вимірювались;
(iv) вимірювання розміру часток: розподіл розміру частоквизначається в атмосфері камери, де використовуються рідкі аботверді аерозолі. Аерозольні частки повинні мати розмір, що даєможливість піддослідним тваринам їх вдихати. Проби середовищакамери повинні братись з зони дихання тварин. Проби повітряповинні представляти розподіл часток, дії яких піддаються тварини,на підставі отриманих проб повітря гравіметричним способомвизначаються всі підвішені аерозолі, навіть у випадку, колибільшість аерозолів не є придатними для вдихання. Аналіз розміручасток повинен проводитись часто впродовж розробки системигенерації для забезпечення стабільності аерозолю і так часто, якце необхідно впродовж дії речовини для достовірного визначеннярівномірності розподілу часток, дії яких піддаються тварини.
1.6.7. Час тривання досліду
Тривалість досліду на канцерогенність складає основну частинужиття піддослідних тварин. Припинення досліду відбувається на18 місяць для мишей і хом'яків і на 24 місяць для щурів; однак,для окремих видів тварин, що мають більш тривалий період життяі/або низький рівень спонтанних пухлин, припинення досліду втакому випадку здійснюється на 24 місяць для мишей і хом'яків і на30 місяць для щурів. Крім того, припинення такого подовженогодосліду є прийнятним у випадку, коли кількість тварин, що вижили,в групі з найнижчим дозуванням або в контрольній групі досягає25%. При припиненні досліду, при якому спостерігається великарізниця в результатах за окремими статями, тварини кожної статіоцінюються окремо. Якщо тільки група з найвищим рівнем дозуваннявмирає достроково через очевидні ознаки інтоксикації, це неповинно впливати на час припинення досліду, за умови, що проявиінтоксикації не викликають проблем в інших групах. Для того, щобнегативні результати досліду були прийнятними, не більше 10%кожної групи може бути втрачено під час експерименту черезавтоліз, канібалізм або проблеми в управлінні, відсоток тварин, щовижили, є не меншим за 50% на 18 місяць для мишей і хом'яків і на24 місяць для щурів.
1.6.8. Процедура
1.6.8.1. Огляди
Щоденні огляди в клітках повинні включати в себе огляди змінв шкірі і хутрі, очах і слизових оболонках, а також в дихальнихсистемах, системах кровообігу, автономній і центральній нервовійсистемі, схемі соматомоторної активності і поведінки.
Регулярні огляди тварин є необхідними для уникнення,наскільки це можливо, втрати тварин впродовж досліду через такіпричини як канібалізм, автоліз тканин або зміщення. Тварини, щовмирають, умертвляються і піддаються розтину.
Клінічні прояви, а також смертність необхідно реєструвати длявсіх тварин. Особливу увагу необхідно звернути на розвиток пухлин:реєструється час початку формування пухлини; розташування,розміри, вигляд і прогресування кожної пухлини, що є значнопомітною або відчутною на дотик.
Оцінка обсягу їжі, що споживається (об'єму води, щоспоживається, коли дослідна речовина подається з питною водою)здійснюється щотижнево впродовж перших 13 тижнів досліду, а потімприблизно через кожні три місяці, окрім випадків, коли станздоров'я або зміни ваги тіла вимагають протилежного.
Вага тіла кожної тварини записується окремо один раз на деньвпродовж перших 13 тижнів періоду дослідження і принаймні один разна чотири тижні після цього.
1.6.8.2. Клінічні дослідження
Гематологія
У випадку, коли в результаті огляду в клітках виявленопогіршення здоров'я тварин впродовж досліду, необхідно здійснитивизначення лейкоцитарної формули крові уражених тварин.
На 12 місяць, 18 місяць і до безболісного вбивання тварин утварин береться мазок крові. Визначається лейкоцитарна формулакрові на пробах крові тварин з групи з високим рівнем дози і вконтрольних групах. Визначення лейкоцитарної формули здійснюєтьсядля груп з нижчими рівнями дозування, якщо дані, зокрема, дані,отримані до вбивання тварин, або дані, отримані в результатіпатологічного дослідження вказують на таку необхідність.
Загальний розтин
Повний загальний розтин здійснюється для всіх тварин,включаючи тих, що вмерли впродовж досліду або були вбиті під час,коли вони знаходились в передсмертному стані. Всі значно помітніпухлини, ушкодження або ушкодження, що за підозрою є пухлинами,зберігаються.
Наступні органи і тканини повинні бути законсервовані увідповідному середовищі для можливого наступногогістопатологічного дослідження: мозок (включаючи ділянки варулієвамоста, кори мозку) слизові оболонки, щитовиднізалози/пара-щитовидні залози, зобні тканини, трахея і легені,серце, аорта, слинні залози, печінка, селезінка, нирки, наднирковізалози, підшлункова залоза, гонади, матка, інші статеві органи,шкіра, стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонка кишка,підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка, сечовийміхур, лімфатичний вузол, жіночі грудні залози, стегно,мускулатуру, периферійну нервову систему, грудну кістку зкістковим мозком, стегно (включаючи суглоби), хребет на трьохрівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому, очі.
Заповнення легенів і сечового міхура фіксатором є оптимальнимспособом для збереження цих тканин; заповнення легенів приінгаляційних дослідах є важливим для проведення відповідногогістопатологічного дослідження. При інгаляційних дослідахнеобхідно зберегти весь дихальний тракт, включаючи ніс, глотку ідихальне горло.
Гістопатологія
(а) Необхідно провести повну гістопатологію всіх органів ітканин всіх тварин, що вмерли або були вбиті впродовж досліду івсіх тварин в контрольних групах і групах з високим рівнемдозуванням;
(b) Всі значно помітні пухлини або ушкодження, що можуть бутипухлинами, повинні бути досліджені під мікроскопом в усіх групахтварин,
с) Якщо наявні значні розбіжності в частоті неопластичнихушкоджень в групах тварин з високим рівнем дозування і контрольнихгрупах, необхідно провести гістопатологію окремих органів аботканин в інших групах,
(d) Якщо виживання в групі з високим рівнем дозування єзначно нижчим ніж в контрольній групі, необхідно повністюдослідити групи з нижчим рівнем дозування,
(е) Якщо є очевидні докази в групі з високим рівнем дозуваннянаявності токсичного або іншого ефекту, що можуть вплинути нанеопластичну реакцію, необхідно повністю дослідити групи з нижчимрівнем дозування.
2. ДАНІ
Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляєтьсязагальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження,кількість тварин, у яких впродовж досліду виявлені пухлини, часвиявлення пухлини і кількість тварин, у яких виявлено пухлинипісля їх умертвіння. Результати оцінюються у відповідності доприйнятного статистичного методу. Може використовуватись будь-якийвизнаний статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступнуінформацію:
- породи, штам, джерело тварин, що використовувались,оточуючі умови, дієту,
- умови дослідження:
3.1.1. Опис апарату, для розповсюдження речовини:
включаючи конструкцію, тип, габарити, джерело повітря,систему для генерації часток і аерозолів, метод кондиціонуванняповітря, обробки відпрацьованого повітря і метод розміщення тваринв дослідних камерах, якщо вона використовується. Необхідно описатипристрій для вимірювання температури, вологи, при необхідності,стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.
3.1.2. Дані, що стосуються дії речовини:
повинні бути представлені у вигляді таблиці як середнізначення і показники змінності (наприклад, стандартне відхилення)і повинні включати в себе:
(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;
(b) температуру і вологість повітря;
(с) номінальну концентрацію (загальний обсяг дослідноїречовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділений наоб'єм повітря);
(d) природу середовища, якщо використовується,
(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;
(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),
- рівні доз (включаючи середовище, якщо використовується) іконцентрації,
- частоту появи пухлин за статтю, дозою і типом пухлини,
- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин доумертвіння,
- дані щодо реакцію на токсичність за статтю і дозою,
- опис наслідків токсичності або інших наслідків,
- час спостерігання кожного аномального прояву і наступнідії,
- час виявлення кожного аномального прояву і подальші дії,
- дані щодо харчування і ваги тіла,
- виконані гематологічні досліди і всі результати,
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних дослідів,
- статистичну обробку результатів з описом використанихметодів,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В
В.33. КОМБІНОВАНИЙ ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ
ТОКСИЧНІСТЬ/КАНЦЕРОГЕННІСТЬ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Метою комбінованого тесту на хронічну
токсичність/канцерогенність є визначення хронічного і
канцерогенного ефекту дослідної речовини на ссавців під час
довготривалої дії.
З цією метою до тесту канцерогенності залучається однасателітна група, що отримує дослідну речовину і контрольнасателітна група. Під час тесту на кенцерогенність доза, щовикористовується для сателітної групи може бути вищою, ніж та, щовикористовується для групи з високою дозою. Тварини під час тестуна кенцерогенність оглядаються на предмет виявлення загальноїінтоксикації а також на канцерогенну реакцію. Тварини всателітній, групі, що отримує дослідну речовину, оглядаються напредмет виявлення загальної інтоксикації.
Дослідна речовина звичайно подається сім днів на тижденьвідповідним шляхом декільком групам піддослідних тварин, одна дозана групу впродовж більшої частини життя тварин. Впродовж і післязакінчення дії тестової речовини, піддослідні тварини оглядаютьсящодня на предмет виявлення ознак інтоксикації і розвитку пухлин.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тварини розміщуються у відповідних умовах проживання іхарчування впродовж, принаймні, п'яти днів до початку дослідження.До початку дослідження молоді здорові тварини неупередженовибираються до дослідних і контрольних груп.
1.6.1. Піддослідні тварини
Для досліду бажано використовувати щурів. На підставірезультатів попередніх досліджень, можуть використовуватись іншівиди тварин (гризуни і не гризуни). До дослідів залучаютьсятварини, що звичайно використовуються під час лабораторнихдослідів, дозування починається якнайшвидше після припиненнялактації.
На початку досліду розбіжність в вазі тварин не повиннаперевищувати +- 20% від середнього значення. При проведеннясубхронічного перорального дослідження в якості попередньогодослідження перед довгостроковим дослідженням в обох випадкахнеобхідно використовувати ті самі види/штами.
1.6.2. Кількість і стать
Для гризунів вибирається принаймні 100 тварин (50 самок і50 самців) для кожного рівня дозування і для контрольної групи.Самки повинні бути таким, що не народжували раніше і не євагітними. Якщо впродовж досліду планується умертвіння тварин,кількість тварин повинна бути збільшена на кількість тварин, якупланується умертвити до закінчення дослідження.
Сателітна група (групи), що піддаються дії речовини, дляоцінки наявності іншої патології крім пухлин повинна складати20 тварин кожної статі, а сателітна контрольна група повиннаскладатись з 10 тварин кожної статі.
1.6.3. Рівні доз і частота експозиції
З метою проведення тесту на канцерогенність крім контрольноїгрупи необхідно використовувати принаймні три групи з різнимирівнями дозування. В групі з найвищим рівнем дозування мають бутивиявлені ознаки мінімальної інтоксикації, такі як незначнеуповільнення збільшення маси тіла (менше ніж 10%) без значноїзміни звичайної тривалості життя через інші причини, ніж наявністьпухлин.
Найнижчий рівень не повинен впливати на нормальний ріст,розвиток і тривалість життя тварини або викликати будь-які проявиінтоксикації. Взагалі цей рівень, повинен бути на 10% нижчим зависокий рівень дозування.
Рівень середньої дози повинен знаходитись між високим інизьким рівнями.
При виборі рівня дози до уваги приймаються дані, отримані зпопередніх тестів і досліджень токсичності.
З метою проведення тестування хронічної токсичності до тестузалучаються додаткові групи, що отримує дослідну речовину іпаралельна контрольна сателітна група. Висока доза для тварин всателітній групі, що отримує дослідну речовину, повинна викликатиявні ознаки інтоксикації.
Дослідну речовину, як правило, надають кожного дня.
Якщо хімічна речовина подається з питною водою, абозмішується з їжею, вона повинна бути постійно доступною.
1.6.4. Контроль
Необхідно використовувати паралельну контрольну групу, умовиутримання якої не відрізняються від умов утримання тварин в іншихгрупах окрім надання хімічної речовини.
В особливих випадках, наприклад, при інгаляційних дослідах, вяких використовуються аерозолі, або емульгатор, біологічнаактивність яких не охарактеризована при проведенні пероральнихдослідів, необхідно використовувати контрольну групу, що непіддається дії середовища-носія.
1.6.5. Спосіб приймання
Застосовуються три основні способи приймання: пероральний,дермальний та інгаляційний. Вибір способу приймання залежить відфізичних і хімічних характеристик дослідної речовини і можливимспособом дії речовини на організм людини.
1.6.5.1. Пероральні дослідження
Якщо дослідна речовина споживається через шлунково-кишковийтракт, і якщо система травлення є подібною до системи травленнялюдини, бажано використовувати пероральний спосіб прийомуречовини, якщо не існує будь-яких протипоказань. Тварини можутьотримувати дослідну речовину, розчинену в питній воді або вкапсулах.
В ідеальному випадку застосовується щоденне дозуваннявпродовж семи днів на тиждень, оскільки дозування впродовж п'ятиднів на тиждень може призвести до одужання тварин або виводутоксичної речовини впродовж періоду, в який не приймаєтьсятоксична речовина, що в свою чергу призведе до неточності воцінюванні результатів. Однак, на підставі, перш за все,практичного досвіду, дозування впродовж п'яти днів на тижденьвважається прийнятним.
1.6.5.2. Дермальні дослідження
Нанесення речовини на шкіру може використовуватись дляімітації основного шляху потрапляння речовини в організм людини ів якості моделювання системи ураження шкіри.
1.6.5.3. Інгаляційні дослідження
Оскільки інгаляційні дослідження викликають певні технічніпроблеми, пов'язані з більшою складність в порівнянні з іншимишляхами вживання, в цьому розділі представлено більш детальнийопис способу приймання. Необхідно зауважити, що використаннявнутрішньо-трахеального введення може виявитись прийнятноюальтернативою в окремих ситуаціях.
Довготривалі дослідження розробляються на підставі впливу, щопередбачається на організм людини. Тварини піддаються дії хімічноїречовини або щодня впродовж шести годин після регулюванняконцентрації речовини в камері п'ять днів на тиждень (періодичнадія), або у відповідності до оточуючого середовища впродовж22-24 годин на день впродовж семи днів на тиждень (тривала дія) згодинною перервою щодня, в один і той самий час, для годування іпідготовки камери. В обох випадках тварини звичайно піддаютьсясталій концентрації дослідної речовини. Основною відмінністю міжперіодичною і тривалою дією є те, що в першому випадку тваринимають 17-18 годин для того, щоб одужати від щоденної дії хімічноїречовини, і більш тривалий період під час вихідних днів.
Вибір періодичної або тривалої дії залежить від метидослідження і впливу на людину, який імітується під час досліду.Однак, необхідно врахувати окремі технічні складності. Наприклад,переваги тривалої дії для моделювання умов зовнішнього середовищаможуть компенсуватись необхідністю поїння і годування тварин, атакож необхідність відтворення більш складних (і надійних)аерозолів і випарів, методів генерації і моніторингу.
1.6.6. Дослідні камери
Тварини досліджуються з використанням інгаляційних камер, щозабезпечують динамічну циркуляцію повітря при щонайменш 12 змінахповітря на годину з метою забезпечення відповідної кількостікисню, а також рівномірного розподілу повітря з вмістом дослідноїречовини. Конструкція і вигляд контрольних і дослідних камерповинна бути ідентичною для забезпечення рівних умов в усіхаспектах крім дії дослідної речовини. Незначний негативний тисквсередині камери підтримується для уникнення вивільнення дослідноїречовину в зовнішнє середовище. Камери повинні бути влаштованітаким чином, щоб мінімізувати стикання піддослідних тварин. Якправило, для стабілізації повітря в камері, загальна кількістьпіддослідних тварин не повинна перевищувати 5% об'єму дослідноїкамери.
Необхідно виконати виміри або моніторинг наступнихпоказників:
(i) потоку повітря: рівень потоку повітря, що проходить черезкамеру, повинен постійно відстежуватись;
(ii) концентрації: впродовж періоду щоденної дії різницяконцентрації дослідної речовини не повинна перевищувати +- 15%середнього значення. Впродовж всього періоду дослідження необхіднопідтримувати постійну концентрацію кожного дня;
(iii) температури і вологості: для гризунів температурапідтримується на рівні 22 +- 2 град.С, а вологість всерединікамери 30%-70%, крім випадків, коли для підвішування дослідноїречовини в камері використовується вода. Бажано, щоб обидвапоказника постійно вимірювались;
(iv) вимірювання розміру часток: розподіл розміру частоквизначається в атмосфері камери, де використовуються рідкі аботверді аерозолі. Аерозольні частки повинні мати розмір, що даєможливість піддослідним тваринам їх вдихати. Проби середовищакамери повинні братись з зони дихання тварин. Проби повітряповинні представляти розподіл часток, дії яких піддаються тварини,на підставі отриманих проб повітря гравіметричним способомвизначаються всі підвішені аерозолі, навіть у випадку, колибільшість аерозолів не є придатними для вдихання. Аналіз розміручасток повинен проводитись часто впродовж розробки системигенерації для забезпечення стабільності аерозолю і так часто, якце необхідно впродовж дії речовини для достовірного визначеннярівномірності розподілу часток, дії яких піддаються тварини.