Необхідно використовувати систему динамічної інгаляції звідповідною системою контролю аналітичної концентрації. Длявстановлення відповідної концентрації дії речовини рекомендуєтьсяпроведення контрольного випробування. Потік повітря необхідновідрегулювати таким чином, щоб забезпечити однорідні умови вкамері. Система повинна забезпечувати досягнення необхідних умов внайкоротший можливий строк.
Необхідно виконати вимірювання або моніторинг:
а) темпу зміни повітря (постійного);
b) дійсної концентрації дослідної речовини, виміряної в зонідихання. Впродовж денного періоду експозиції концентрація неповинна відхилятись більше ніж на +- 15% від основного значення.Однак, у випадку пилу і аерозолів цей рівень контролю можевиявитись недосяжним, в цьому випадку приймається більш широкийдіапазон. Впродовж всього періоду дослідження щоденна концентраціяповинна підтримуватись на максимально можливому постійному рівні.Впродовж розробки генераторної системи необхідно провести аналізрозміру часток для встановлення стабільності аерозольноїконцентрації. Впродовж експозиції необхідно проводити аналіз такчасто, як це необхідно для визначення постійності розподілурозміру часток;
(с) температури і вологості;
(d) впродовж подальшої експозиції виконуються огляди з їхсистематичною реєстрацією; окремі записи ведуться для кожноїокремої тварини. Всі тварини оглядаються щодня з записом ознактоксичності, включаючи час їх з'явлення, ступінь і тривалість.Огляди тварин в клітках повинні включати в себе: зміни їх шкіри,очей, слизової оболонки, дихальних шляхів, кровообігу, автономноїі центральної нервової системи, соматомоторних характеристик, атакож схеми поведінки. Необхідно виконувати виміри обсягуспоживання їжі, а також зважування тварин раз на тиждень.Регулярний огляд тварин є необхідним для забезпечення того, щобтварини впродовж досліду не загинули з причин канібалізму,автолізу тканин або зміщення. В кінці дослідного періоду всітварини, що вижили, в групах, що не є сателітними, піддаютьсярозтину. Тварини, що вмирають видаляються з групи і такожпіддаються розтину після настання смерті.
Всі тварини, включаючи тварин з контрольних груп, звичайнопіддаються наступним дослідам:
Звичайно виконуються наступні види огляду, включаючиконтроль:
(а) офтальмологічний огляд з використанням офтальмоскопу абоеквівалентного придатного обладнання здійснюється до початку діїдослідної речовини і після закінчення досліду, бажано для всіхтварин, але принаймні, для групи, що отримувала найвищу дозу і дляконтрольної групи. При виявлені будь-яких змін в очах, необхіднооглянути всіх тварин.
(b) гематологічний огляд, включаючи гематокрит, концентраціюгемоглобіну, кількість еритроцитів, загальну і диференційнукількість лейкоцитів, кількість тромбоцитів і потенціал згортаннякрові: час згортання крові, протромбінів час або тромбопластиновийчас проводиться в кінці дослідного періоду.
(с) Визначення клінічної біохімії крові проводиться в кінцідослідного періоду. При дослідженні розглядаються електролітнийбаланс, вуглеводний обмін речовин, функція печінки і нирок. Навибір того чи іншого досліду впливає визначений спосіб діїдослідної речовини. Пропонується визначити наявність: кальцію,фосфору, хлориду, натрію, калію, глюкози (в період утримання відїжі в залежності від виду тварини), глютамінової пировиноградноїтранзамінази сироватки(1), глютамінової щавелево-уксусноїтранзамінази сироватки(2), орнітин декарбоксилаза, гама глуматилтранспептидаза, азоту сечовини, альбуміну, кретину в крові,загальний об'єм білірубіну і загальний об'єм протеїну сироватки.Крім того, для здійснення відповідного токсикологічного аналізунеобхідно провести аналіз: ліпідів, гормонів, кислотно-лужногобалансу, метагемоглобіну, холінестеразне активності. Додатковіклінічні біохімічні показники можуть бути визначені принеобхідності для продовження дослідження виявленого ефекту.
----------------
(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.
(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.
(d) Звичайно, в проведенні аналізу сечі нема необхідності,окрім випадків, коли проведення такого аналізу рекомендується взв'язку з наявною або очікуваною токсичністю.
Якщо дані основні досліди є недостатніми, необхідно визначитигематологічні і біохімічні параметри до початку дозування.
Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальномузагальному розтину, який включає в себе детальне вивченнязовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудноїі черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки і наднирковізалози повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокромустані для уникнення висихання. Наступні органи і тканини повиннібути законсервовані в найбільш придатному середовищі для можливихзапланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальніушкодження, легені - видаляються неушкодженими, легені зважуютьсяі обробляються фіксатором для збереження структури легень(обприскування фіксатором є ефективною процедурою),назо-фарингальні тканини, мозок, включаючи ділянки спинногомозку/варулієва мосту, мозкову кору, слизові оболонки, щитовиднізалози/пара-щитовидні залози, трахею, легені, серце, аорту, слиннізалози, печінку, селезінку, нирки, надниркові залози, підшлунковізалози, гонади, матки (інші статеві органи), (шкіру), жовчнийміхур (якщо є), стравохід, шлунок, дванадцятипала кишка, тонкакишка, підвздошна кишка, сліпа кишка, товста кишка, пряма кишка,сечовий міхур, лімфатичні вузли (жіночі грудні залози), (стегновамускулатура), периферійні нерви, (очі), грудна кістка з кістковиммозком, (стегно, включаючи суглобну поверхню) і (хребет на трьохрівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому). Тканини,зазначені в дужках, оглядаються тільки при виявлені ознактоксичності, або якщо вони є органами-мішенями.
Гістопатологічні дослідження
(а) Необхідно провести повну гістопатологію дихального трактута інших органів і тканин всіх тварин контрольної групи і групи,що отримувала найбільшу дозу.
(b) Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
(c) Органи-мішені в інших групах дозування повинні бутидосліджені.
(d) Легені тварин в групі в низьким та середнім дозуваннямтакож піддаються гістопатологічному дослідженню; оскільки такедослідження надає можливість якісного оцінювання здоров'я тварин.В наступних гістопатологічних дослідженнях, звичайно, нема потребив цих групах, але вони завжди повинні проводитись на органах, вяких виявлено значне ушкодження в групі, що отримувала найвищудозу.
(е) При використанні сателітної групи гістопатологічнідослідження проводяться на тканинах і органах, що ідентифікованіяк такі, що виявляють ефект в інших піддослідних групах.
2. ДАНІ
Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляєтьсязагальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження,кількість тварин, у яких виявлені ушкодження, тип ушкоджень іпроцентне відношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень.Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичногометоду. Може використовуватись будь-який статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступнуінформацію:
- породи, штам, джерело тварин, що використовувались,оточуючі умови, дієту,
- умови дослідження,
- опис апарату, для розповсюдження речовини: включаючиконструкцію, тип, габарити, джерело повітря, система для генераціїчасток і аерозолів, метод кондиціонування повітря, обробкавідпрацьованого повітря і метод розміщення тварин в досліднихкамерах, якщо вона використовується. Необхідно описати пристрійдля вимірювання температури, вологи, при необхідності,стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.
Дані, що стосуються досліду: повинні бути представлені увигляді таблиці як середні значення і показники змінності(наприклад, стандартне відхилення) і повинні включати в себе:
(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;
(b) температуру і вологість повітря;
(с) номінальну концентрацію (загальний обсяг дослідноїречовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділений наоб'єм повітря);
(d) природу середовища, якщо використовується,
(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;
(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),
- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі іконцентрації,
- відсутність наслідків,
- час умертвіння тварин під час досліджень або інформація проте, чи вижили тварини до часу закінчення досліджень,
- опис наслідків токсичності або інших наслідків,
- час спостерігання кожного аномального прояву і наступнідії,
- дані, що стосуються ваги тіла і харчування,
- результати офтальмологічного досліду,
- застосовані гематологічні дослідження, а також всірезультати,
- види клінічних біохімічних досліджень, а також всі їхрезультати (включаючи результати всіх аналізів сечі),
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних дослідів,
- статистичну обробку результатів, у відповідних випадках,
- аналіз результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
В.30. ТЕСТ НА ХРОНІЧНУ ТОКСИЧНІСТЬ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина звичайно подається впродовж семи днів натиждень відповідним способом, кільком групам піддослідних тварин,одна доза на групу, впродовж більшої частини їх життя. Впродовж іпісля дії дослідної речовини піддослідні тварини щоденнооглядаються на предмет виявлення ознак токсичності.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини знаходяться в умовах проживання і харчування,визначених для дослідження щонайменш впродовж 5 днів до початкудослідження. Перед початком дослідження молоді і здорові тваринивипадково розподіляються за дослідними і контрольними групами.
1.6.2. Умови проведення досліду
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Ідеальним видом тварин є щури.
На основі результатів попередньо проведених дослідів можутьвикористовуватись інші види тварин (гризуни і не гризуни). Вдослідах приймають участь види тварин, що звичайновикористовуються для лабораторних досліджень, дозування повиннопочатись якнайшвидше після припинення лактації.
На початку дослідження розбіжність в вазі не повиннаперевищувати +- 20% середньої ваги. У випадку проведеннясуб-хронічних пероральних досліджень в якості попередніхдосліджень перед тривалими дослідженнями, необхідновикористовувати тварин того самого штаму і джерела.
Кількість і стать
У випадку використання гризунів необхідно використовуватипринаймні 40 тварин (20 самців і 20 самок) для кожного рівня дозиі формування контрольної групи. Самки не повинні бути вагітними ітакими, що раніше не народжували. Якщо планується умертвіннявпродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількістьтварин, що планується вмертвити до закінчення досліду.
У випадку використання видів тварин, що не є гризунами,кількість тварин повинна бути меншою, але не меншою, ніж чотириособини даної статі в даній групі.
1.6.2.3. Рівні доз і частота експозиції
Необхідно застосовувати три рівні доз в доповнення допаралельної контрольної групи. Найвища доза повинна викликативизначені ознаки токсичності, не призводячи до надмірного рівнясмертності.
Найнижча доза не повинна викликати жодних ознак токсичності.
Рівень середньої дози (доз) повинен знаходитись між найвищимі найнижчим рівнем.
При виборі рівнів доз необхідно взяти до уваги даніпопередніх тестувань токсичності і дослідів.
Необхідно застосовувати звичайну денну частоту експозиції.Якщо хімічна речовина подається з питною водою або з їжею,необхідно забезпечити її наявність впродовж тривалого часу.
1.6.2.4. Контрольні групи
Необхідно використовувати контрольну групу, умови утриманняякої не відрізняються від умов утримання тварин в інших групахокрім надання хімічної речовини.
В особливих випадках, наприклад, при інгаляційних дослідах, вяких використовуються аерозолі, або емульгатор, біологічнаактивність яких не охарактеризована при проведенні пероральнихдослідів, необхідно використовувати негативну контрольну групу.Тварини в негативній контрольній групі утримуються в тих самихумовах, що і тварини в дослідних групах, але їм не надаєтьсяжодного препарату або середовища-носія.
1.6.2.5. Спосіб приймання
Застосовуються два основні способи приймання: пероральний таінгаляційний. Вибір способу приймання залежить від фізичних іхімічних характеристик дослідної речовини і можливим способом діїречовини на організм людини.
Використання способу, при якому шкіра піддається дії хімічноїречовини, викликає значні практичні труднощі. Хронічнесистематичне отруєння через шкіру, як правило, може бутипередбачене на підставі результатів інших пероральних дослідів атакож, на підставі знань про тривалу абсорбцію шкірою, якіотримані з попередніх досліджень дії хімічних речовин на шкіру.
1.6.2.6. Пероральні дослідження
Якщо дослідна речовина споживається через шлунково-кишковийтракт, і якщо система травлення є подібною до системи травленнялюдини, бажано використовувати пероральний спосіб прийомуречовини, якщо не існує будь-яких протипоказань. Тварини можутьотримувати дослідну речовину, розчинену в питній воді або вкапсулах. В ідеальному випадку застосовується щоденне дозуваннявпродовж семи днів на тиждень, оскільки дозування впродовж п'ятиднів на тиждень може призвести до одужання тварин або виводутоксичної речовини впродовж періоду, в який не приймаєтьсятоксична речовина, що в свою чергу призведе до неточності воцінюванні результатів. Однак, на підставі, перш за все,практичного досвіду, дозування впродовж п'яти днів на тижденьвважається прийнятним.
1.6.2.7. Інгаляційні дослідження
Оскільки інгаляційні дослідження викликають певні технічніпроблеми, пов'язані з більшою складність в порівнянні з іншимишляхами вживання, в цьому розділі представлено більш детальнийопис способу приймання. Необхідно зауважити, що використаннявнутрішньо-трахеального введення може виявитись прийнятноюальтернативою в окремих ситуаціях.
Довготривалі дослідження розробляються на підставі впливу, щопередбачається на організм людини. Тварини піддаються дії хімічноїречовини або щодня впродовж шести годин після регулюванняконцентрації речовини в камері п'ять днів на тиждень (періодичнадія) або у відповідності до оточуючого середовища впродовж22-24 годин на день впродовж семи днів на тиждень (тривала дія) згодинною перервою щодня, в один і той самий час, для годування іпідготовки камери.
В обох випадках тварини звичайно піддаються сталійконцентрації дослідної речовини. Основною відмінністю міжперіодичною і тривалою дією є те, що в першому випадку тваринимають 17-18 годин для того, щоб одужати від щоденної дії хімічноїречовини, і більш тривалий період під час вихідних днів.
Вибір періодичної або тривалої дії залежить від метидослідження і впливу на людину, який імітується під час досліду.Однак, необхідно врахувати окремі технічні складності. Наприклад,переваги тривалої дії для моделювання умов зовнішнього середовищаможуть компенсуватись необхідністю поїння і годування тварин, атакож необхідність відтворення більш складних (і надійних)аерозолів і випарів, методів генерації і моніторингу.
1.6.2.8. Дослідні камери
Тварини досліджуються з використанням інгаляційних камер, щозабезпечують динамічну циркуляцію повітря при щонайменш 12 змінахповітря на годину з метою забезпечення відповідної кількостікисню, а також рівномірного розподілу повітря з вмістом дослідноїречовини. Конструкція і вигляд контрольних і дослідних камерповинна бути ідентичною для забезпечення рівних умов в усіхаспектах крім дії дослідної речовини. Незначний негативний тисквсередині камери підтримується для уникнення вивільнення дослідноїречовину в зовнішнє середовище. Камери повинні бути влаштованітаким чином, щоб мінімізувати стикання піддослідних тварин. Якправило, для стабілізації повітря в камері, загальна кількістьпіддослідних тварин не повинна перевищувати 5% об'єму дослідноїкамери.
Необхідно виконати виміри або моніторинг наступнихпоказників:
(i) потоку повітря: рівень потоку повітря, що проходить черезкамеру, повинен постійно відстежуватись;
(ii) концентрації: впродовж періоду щоденної дії різницяконцентрації дослідної речовини не повинна перевищувати +- 15%середнього значення;
(iii) температури і вологості: для гризунів температурапідтримується на рівні 22 +- 2 град.С, а вологість всерединікамери 30%-70%, крім випадків, коли для підвішування дослідноїречовини в камері використовується вода. Бажано, щоб обидвапоказника постійно вимірювались;
(iv) вимірювання розміру часток: розподіл розміру частоквизначається в атмосфері камери, де використовуються рідкі аботверді аерозолі. Аерозольні частки повинні мати розмір, що даєможливість піддослідним тваринам їх вдихати. Проби середовищакамери повинні братись з зони дихання тварин. Проби повітряповинні представляти розподіл часток, дії яких піддаються тварини,на підставі отриманих проб повітря гравіметричним способомвизначаються всі підвішені аерозолі, навіть у випадку, колибільшість аерозолів не є придатними для вдихання. Аналіз розміручасток повинен проводитись часто впродовж розробки системигенерації для забезпечення стабільності аерозолю і так часто, якце необхідно впродовж дії речовини для достовірного визначеннярівномірності розподілу часток, дії яких піддаються тварини.
1.6.2.9. Час тривання досліду
Тривалість часу дії дослідної речовини повинна складатищонайменш 12 місяців.
1.6.3. Процедура
Принаймні раз на день необхідно проводити детальний клінічнийогляд. Додаткові огляди проводяться щодня з вжиттям необхіднихзаходів для мінімізації втрати тварин для вивчення, наприклад,розтин і заморожування мертвих тварин та ізоляція і умертвінняслабких тварин або тварин, що знаходяться при смерті. Детальніогляди проводиться на предмет виявлення початку і прогресуваннятоксичного ефекту, а також для мінімізації втрати через хвороби,автоліз або канібалізм.
Клінічні прояви, включаючи неврологічні і окулярні зміни, атакож смертність необхідно реєструвати для всіх тварин. Необхіднотакож реєструвати час початку і прогресування токсичного стану,включаючи пухлини, що підозрюються.
Один раз на тиждень впродовж перших 13 тижнів дослідногоперіоду, а потім через, принаймні, кожні чотири тижні записуєтьсявага тіла кожної тварини. Раціон харчування визначається щотижнявпродовж перших 13 тижнів дослідження, а потім, приблизно, черезтри місяці, окрім випадків, коли стан здоров'я або вага тілавимагають протилежного.
Гематологічне дослідження
Гематологічне дослідження (наприклад, дослідження
гемоглобіну, гематокриту, загальної кількості еритроцитів,
загальної кількості лейкоцитів, тромбоцитів, або інших показників
згортання крові) проводиться через три місяці, потім через шість
місяців, а потім приблизно через кожні шість місяців, а після
закінчення досліджень на зразках крові, взятих від тварин, що не є
гризунами і від 10 щурів обох статей. Якщо можливо, зразки крові
необхідно брати від тих самих щурів в кожний період. Необхідно
взяти зразки до початку досліджень від тварин, що не є гризунами.
Якщо клінічні дослідження вказують на погіршення стануздоров'я тварин під час досліджень, необхідно провести визначеннялейкоцитарної формули уражених тварин.
Визначення лейкоцитарної формули здійснюється на зразках,взятих від тварин в групі з найвищим рівнем дозування іконтрольних групах. Визначення лейкоцитарної формули здійснюєтьсядля наступної групи (груп) тварин з нижчим рівнем дозування тількиу випадку наявності значних розбіжностей між результатами,отриманими в групі з найвищим рівнем дозування і контрольнихгрупах, або у випадку виявлення патологічних ознак.
Аналіз сечі
Для аналізу відбираються проби сечі від тварин, що не єгризунами і від 10 щурів різної статі, якщо можливо, від тих самихщурів в ті самі інтервали часу, що і гематологічні дослідження.Для окремих тварин або для відповідних проб/статей/груп гризуніввизначаються наступні показники:
- вигляд: розміри і вага окремих тварин,
- білок, глюкоза, кетони, прихована кров (напів-кількісно),
- мікроскопія осаду (напів-кількісно).
Клінічна хімія
Через кожні шість місяців і в кінці дослідження відбираютьсязразки крові від всіх тварин, що не є гризунами і від10 щурів/стать всіх груп, з метою виконання досліджень клінічноїхімії, якщо можливо, зразки крові відбираються від тих самих щурівв кожний період. Необхідно взяти зразки крові у тварин, що не єгризунами. Зі зразків готується плазма крові, крім того, необхідновизначити наступні характеристики:
- загальну концентрацію білку,
- концентрацію альбуміну,
- функціональні дослідження печінки (наприклад, дію алкалінфосфатази, дію глютамінової пировиноградної транзамінази(1),глютамінової щавелево-уксусної транзамінази сироватки(2),гамаглуматил транспептидаз, орнітин декарбоксилази,
----------------
(1) Зараз відомий як аланін амінотрансфераза сироватки.
(2) Зараз відомий як аспарат амінотрансфераза сироватки.
- вуглеводний обмін речовин, наприклад, рівень глюкози вкрові, відібраної після утримання від їжі,
- дослідження функції нирок, наприклад, дослідження азотусечовини.
Загальний розтин
Повний загальний розтин здійснюється для всіх тварин,включаючи тих, що вмерли впродовж досліду або були вбиті під час,коли вони знаходились в передсмертному стані. До умертвіннянеобхідно взяти зразки крові у всіх тварин для визначеннялейкоцитарної формули. Всі значно помітні ушкодження, пухлини абоушкодження, що за підозрою є пухлинами, зберігаються. Необхіднодокласти зусиль щодо кореляції основних оглядів за допомогоюмікроскопічних досліджень.
Всі органи і тканини повинні бути законсервовані длягістопатологічних досліджень. Це звичайно стосується наступнихорганів і тканин: мозку(3) (варулієва моста, кори мозку) слизовіоболонки, щитовидні залози/пара-щитовидні залози, зобні тканини(включаючи трахею), серце, аорту, слинні залози, печінку(3),селезінку, нирки, надниркові залози(3), стравохід, шлунок,дванадцятипалу кишку, тонку кишку, підвздошну кишку, сліпу кишку,товсту кишку, пряму кишку, матку, сечовий міхур, лімфатичні вузли,підшлункову залозу, гонади(3), інші статеві органи, жіночі груднізалози, шкіру, мускулатуру, периферійну нервову систему, хребет натрьох рівнях: шийному, середньо-грудному, поперековому, груднукістку з кістковим мозком, стегно (включаючи суглоби) і очі.Заповнення легенів і сечового міхура фіксатором є оптимальнимспособом для збереження цих тканин; заповнення легенів приінгаляційних дослідах є важливим для проведення відповідногогістопатологічного дослідження, необхідно дослідити весь дихальнийтракт, включаючи ніс, глотку і дихальне горло.
----------------
(3) Ці органи від 10 тварин різної статі для кожної групигризунів і тварин, що не є гризунами, плюс щитовидна залоза (зпара-щитовидною залозою) для всіх тварин, що не є гризунами маютьбути зважені.
При проведенні інших клінічних досліджень інформація,отримана після проведення цих процедур, повинна бути доступною домікроскопічного огляду, оскільки вона може виявитись важливою дляпатологоанатома.
Гістопатологія
Всі очевидні зміни, зокрема, новоутворення, а також іншіпатологічні зміни в будь-якому органі повинні досліджуватись підмікроскопом. Зокрема, рекомендується здійснити наступні процедури:
а) мікроскопічне дослідження всіх збережених органів і тканинразом з повним описом всіх виявлених змін:
1) всі мертві або омертвленні під час досліду тварини;
2) всі групи, що отримували найвищу дозу і контрольна група;
b) органи або тканини, що виказують відхилення, які викликаніабо можливо викликані дією дослідної речовини досліджуються такожв групах, що отримували малу дозу;
с) у випадку, коли результати досліджень показують значнезниження тривалості життя тварин, або викликають наслідки, якіможуть впливати на реакцію на токсичність, необхідно дослідитибільш низький рівень дози, як описано вище;
d) інформація, що стосується проявів патологічних змін, щозвичайно з'являються у видів тварин, що досліджуються в тих самихлабораторних умовах, тобто, відсутні значні розбіжності вконтрольних даних для правильного оцінювання значимості змін, щоспостерігаються у піддослідних тварин.
2. ДАНІ
Дані повинні бути зведені в таблицю, в якій представляєтьсязагальна кількість тварин в кожній групі на початку дослідження,кількість тварин, у яких виявлені ушкодження і процентневідношення тварин, у яких виявлено кожний тип ушкоджень.Результати оцінюються у відповідності до прийнятного статистичногометоду. Може використовуватись будь-який прийнятний статистичнийметод.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити, якщо можливо, в собі наступнуінформацію:
- породи, штам, джерело тварин, що використовувались,оточуючі умови, дієту,
- умови дослідження,
Опис апарату, для розповсюдження речовини:
Включаючи конструкцію, тип, габарити, джерело повітря,система для генерації часток і аерозолів, метод кондиціонуванняповітря, обробка відпрацьованого повітря і метод розміщення тваринв дослідних камерах, якщо воно використовується. Необхідно описатипристрій для вимірювання температури, вологи, при необхідності,стабільність концентрації аерозолю або розміру частки.
Дані, що стосуються досліду:
Повинні бути представлені у вигляді таблиці як середнізначення і показники змінності (наприклад, стандартне відхилення)і повинні включати в себе:
(а) обсяг повітряного потоку в інгаляційному обладнанні;
(b) температуру і вологість повітря;
(с) номінальну концентрацію (загальний обсяг дослідноїречовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділений наоб'єм повітря);
(d) природу середовища-носія, якщо використовується,
(e) дійсну концентрацію в дослідній зоні дихання;
(f) середній розмір частки (якщо цього вимагає ситуація),
- рівні доз (включаючи середовище, якщо використовується) іконцентрацію,
- дані щодо токсичної реакції у відповідності до статі ідози,
- відсутність наслідків,
- час смерті тварин підчас досліджень або інформація про те,чи вижили тварини до часу закінчення досліджень,
- опис наслідків токсичності або інших наслідків,
- час спостерігання кожного аномального прояву і наступнідії,
- дані, що стосуються ваги тіла і харчування,
- результати офтальмологічного досліду,
- застосовані гематологічні дослідження, а також всірезультати,
- види клінічних біохімічних досліджень, а також всі їхрезультати (включаючи результати всіх аналізів сечі),
- результати розтину,
- детальний опис гістопатологічних дослідів,
- статистична обробка результатів, у відповідних випадках,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В
В.31. ДОСЛІДЖЕННЯ ДІЇ ТОКСИЧНИХ РЕЧОВИН
НА ПРЕНАТАЛЬНИЙ РОЗВИТОК
1. МЕТОД
Цей метод дослідження є копією OECD TG 414 (2001).
1.1. ВСТУП
Цей метод дослідження токсичності призначений для того, щобнадати загальну інформацію щодо дії дослідної речовини на вагітнихпіддослідних тварин і організми, що розвиваються в утробі; цейдослід може включати в себе оцінювання материнського ефекту, атакож смертності, аномалій або зміни в розвитку плоду.Функціональна недостатність також є важливою частиною дослідження,але не є невід'ємною частиною цього методу. Це дослідження можебути проведене в якості окремого досліду або як додатковедослідження з використанням методу дослідження нейротоксичності.Для отримання інформації щодо дослідження функціональноїнедостатності та інших постнатальних ефектів метод вивченнядвогенераційної репродуктивної токсичності і негативногоневротоксиного впливу на внутрішньоутробний розвиток можевважатись прийнятним.
Цей метод дослідження може вимагати додаткової адаптації вокремих випадках на підставі особливого досвіду, наприклад,психо-хімічних або токсикологічних характеристик дослідноїречовини. Така адаптація є прийнятною, коли обґрунтовані науковідокази підтверджують, що така адаптація призведе до отриманнябільш повних результатів досліду. В такому випадку наукові доказиповинні бути ретельно задокументовані в звіті досліду.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Токсикологія внутрішньоутробного розвитку: дослідженнянегативного впливу на організм, що розвивається, який може матимісце при дії хімічної речовини на організм до зачаття, впродовжпренатального або постнатального розвитку до періоду статевоїзрілості. Основні прояви шкідливого впливу на внутрішньоутробнийрозвиток включають себе: 1) смерть організму, 2) структурніаномалії, 3) зміни в рості організму, 4) функціональнанедостатність. Токсикологія внутрішньоутробного розвитку ранішечасто згадувалась як тератологія.
Шкідливий ефект: будь-які зміни від вихідних даний, пов'язаніз дією речовини, які зменшують здатність організму до виживання,народжування або адаптування до навколишнього середовища. Вконтексті токсикології внутрішньоутробного розвитку в її широкомурозумінні, включає в себе будь-який ефект, що заважає нормальномурозвитку плоду до і після народження.
Зміни розвитку: зміни в органах, вазі або розмірі тілапотомства.
Зміни (аномалії): структурні зміни в розвитку, що включають всебе тератоформи і зміни (28).
Тератоформи/значні аномалії: структурні зміни, що вважаютьсявизначними для тварини (можуть також бути летальними) ітрапляються рідко.
Зміни/незначні аномалії: структурні зміни, що вважаютьсянезначними або не мають визначного ефекту на тварину; можуть бутитранзиторними і можуть зустрічатись відносно часто в контрольнихпопуляціях.
Запліднене яйце: сума дериватів або запліднених яйцеклітин набудь-якій стадії розвитку від запліднення до народження, включаючипоза-зародкові мембрани а також ембріон або плід.
Імплантація (нівація): приєднання зародкового міхура доепітельної вистелки матки, включаючи його проникнення черезепітелій матки в розміщення в ендометрії.
Ембріон: рання стадія або стадія розвитку організму, особливопродукту запліднення яйця, що розвивається, після з'явлення довгоїосі і до утворення всіх основних структур.
Ембріотоксичність: шкідлива дія на нормальну структуру,розвиток, ріст і/або життєздатність ембріону.
Плід: Ненароджений продукт зачаття в пост-ембріонний період.
Фетотоксичність: шкідлива дія на нормальну структуру,розвиток, ріст і/або життєздатність плоду.
Передчасне припинення вагітності: передчасне видалення зматки продукту зачаття: ембріону або нежиттєздатного плоду.
Резорбція: запліднене яйце, імплантоване в матку, що вмерло івсмокталось або всмоктується.
Рання резорбція: очевидна імплантація без ознак утворенняембріону/плоду.
Пізня резорбція: мертвий ембріон або плід з зовнішнімидегенеративними змінами.
NOAEL: є скороченням від поняття, що визначає рівень, приякому не спостерігається шкідливих наслідків, а також є найвищимрівнем дози, при якому не спостерігається шкідливих ефектів, якізалежать від речовини, що подаються.
1.3. ЕТАЛОННА РЕЧОВИНА
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звичайно дослідна речовина подається вагітним тваринампринаймні від часу імплантації до дня, що передує дню умертвіннятварини, який повинен бути якомога ближчим до дня народженняпотомства без ризику втрати даних, отриманих від ранніх родів.Визначений метод не націлений на дослідження виключно періодуорганогенезу (наприклад, 5-15 днів у гризунів і 6-18 днів укролика), але також на наслідки, що виявляються в період, якийпередує імплантації у відповідних випадках, впродовж всьогоперіоду вагітності до останнього дня перед кесаревим розтином. Накороткий термін до кесаревого розтину самки умертвляються, вістматок досліджується, а плоди оцінюються на предмет наявностіочевидних внутрішніх аномалій і змін в м'яких і кісних тканинах.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Вибір видів тварин
Рекомендується здійснення дослідження на найбільш придатнихвидах тварин, а також використання лабораторних видів і штамів, щозвичайно використовуються при дослідженні пренатальноїтоксичності. Бажаною породою гризуна є щур, а серед інших видівтварин, що не є гризунами - кролик. Використання інших видівтварин необхідно обґрунтувати.
1.5.2. Умови утримання і харчування
Температура в дослідних приміщеннях, де здійснюєтьсягодування тварин, повинна складати 22 град.С (+- 3 град.) длягризунів і 18 град.С (+- 3 град.) для кроликів. Хоча відноснавологість повинна складати принаймні 30% і бажано, щоб вона неперевищувала 70% поза часом прибирання приміщення, необхіднослідкувати за тим, щоб її рівень знаходився в межах 50-60%.Освітлення повинно бути штучним, з наступним циклом:12 годин-світло, 12 годин - темно. Для харчування використовуєтьсялабораторний корм з необмеженим доступом до питної води.
Процедура запліднення здійснюється в клітках, спеціальнопризначених для цієї мети. Хоча, бажаним є індивідуальнерозміщення запліднених тварин, їх розміщення невеликими групамитакож є прийнятним.
1.5.3. Підготовка тварин
Необхідно використовувати здорових тварин, що пройшлиакліматизацію в лабораторних умовах впродовж щонайменш, п'яти дніві які не були предметом попередніх експериментальних процедур.Піддослідні тварини повинні бути охарактеризовані за породою,штамом, джерелом, статтю, вагою і/або віком. Тварини в усіхдослідних групах повинні, якщо це можливо, мати однакову вагу івік. Для кожного рівня дози використовуються молоді самки, що ненароджували. Самки спарюються з самцями того самого виду і штаму,схрещування потомства тих самих батьків заборонене. Для гризунівднем 0 в вагітності вважається день, в який спостерігаєтьсявагінальна пробка або сперма; для кроликів днем 0 звичайно є деньспарювання або штучного запліднення, якщо застосовується цятехніка. Запліднені самки повинні бути оцінені для неупередженоговідбору до дослідних груп. Клітки повинні бути облаштовані такимчином, щоб мінімізувати можливий ефект, викликаний розташуваннямклітки. Кожній тварині присвоюється унікальний ідентифікаційнийномер. Запліднені самки повинні бути оцінені для неупередженоговідбору до дослідних груп, і якщо самки запліднювались партіями,тварини з кожної партії повинні бути рівномірно розподілені загрупами. Так само, самки, що запліднені тими самими самцями,повинні рівномірно розподілятись за групами.
1.6. ПРОЦЕДУРА
1.6.1. Кількість і стать тварин
В кожній дослідній і контрольній групі повинна знаходитисьвідповідна кількість самок для отримання приблизно 20 самок змісцями імплантації при розтині. Групи, в який кількість тварин змісцями імплантації складає 16 тварин є неприйнятними. Материнськасмертність не анулює результатів досліду за умови, якщо вона неперевищує приблизно 10%.
1.6.2. Підготовка доз
При використанні середовища-носія або іншої добавки дляполегшення дозування необхідно звернути увагу на наступніхарактеристики: вплив на засвоюваність, розподіл, метаболізм, абоутримання дослідної речовини; вплив на хімічні якості дослідноїречовини, що можуть змінити її токсичні характеристики; і вплив наспоживання їжі або води або харчового статусу тварин.Середовище-носій не повинне ані мати токсичну дію навнутрішньоутробний розвиток, ані впливати на народжуваність.
1.6.3. Дозування
Звичайно, дослідна речовина подається щодня після імплантації(наприклад, 5 днів після спарювання) до дня, що передує дню, вякий здійснюється кесарів розтин. Якщо попередні дослідження, якщовони проводились, не виявляються високої здатності допредімплантаціної втрати, дію дослідної речовини можна продовжитивключаючи весь період вагітності - від спарювання, до дня, в якийпланується умертвіння тварин. Загальновідомим фактом є те, щонеправильне поводження або стрес впродовж періоду вагітності можепризвести до пренатальної втрати. Необхідно берегти тварин віднебажаних стресів, що не пов'язані з процесом дослідження, а такожзі стресом, що походить з зовнішніх джерел, таких як шум.
Використовуються принаймні три рівні доз з одночаснимпоточним контролем. Здорові тварини неупереджено призначаються вконтрольні і дослідні групи. Рівні доз визначаються таким чином,щоб можна було встановити градації токсичного ефекту. Враховуючиобмеження, викликані фізико-хімічною природою і біологічнимефектом дослідної речовини, рівень найвищої дози вибирається зметою викликання деяких ознак негативної дії на внутрішньоутробнийрозвиток і/або токсичного впливу на материнський організм(клінічні ознаки або зменшення ваги тіла), але вибрана доза неповинна призводити до смерті або значних страждань. Принаймні одинсередній рівень дози повинен викликати мінімальний очевиднийтоксичний ефект. Найнижча доза не повинна викликати будь-якихочевидних ознак токсичної дії на материнський організм абовнутрішньоутробний розвиток. Зменшення дозування застосовується зметою демонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня приякому не спостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчійдозі. Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними длявстановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертоїдослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значнихінтервалів (наприклад, з коефіцієнтом більше 10) між дозуваннями.Також метою є встановлення материнського NOAEL, однак досліди, щоне встановлюють такого рівня також є прийнятними(1).
Рівні доз обираються з урахуванням будь-яких наявних данихщодо токсичності, а також додаткової інформації щодо метаболізмуабо токсикокінезу дослідної речовини або пов'язаних матеріалів. Цяінформація також є корисною для демонстрації адекватності режимудозування.
Необхідно використовувати паралельну контрольну групу. Цягрупа піддається дії стимулятора або середовища-носія, якщо длядозування дослідної речовини використовується середовище-носій.Всім групам надається однаковий об'єм дослідної речовини абосередовища-носія. Тварини в контрольній групі (групах) знаходятьсяв тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах. Групи, щопіддаються дії середовища-носія, отримують його в найбільшомуоб'ємі (що використовуються для дослідних груп з найменшим рівнемдозування).
1.6.4. Дослід на граничний вміст
Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних дляцього досліду, не викликає помітних ознак токсичності ні длявагітних тварин, ні для їх потомства, якщо такий ефект неочікується на підставі наявних даних (наприклад, на підставіструктурних або метаболічнно-пов'язаних складових), після чого ввикористанні трьох рівнів дозування може відпасти необхідність.Очікуваний шкідливий вплив на організм людини може бути підставоюдля призначення вищої дози, що приймається перорально, припроведенні досліду на граничний вміст. Для інших типів вживанняречовини, таких як інгаляція або дія на шкіру, фізико-хімічнівластивості дослідної речовини часто можуть визначати і обмежуватимаксимальний рівень використовуваної речовини (наприклад,нанесення речовини на шкіру не повинно викликати значної місцевоїінтоксикації).
1.6.5. Вживання доз
Дослідна речовина або середовище-носій звичайно подаєтьсяперорально або через трубку. Якщо використовується інший спосібвживання, лаборант повинен надати обґрунтування вибору такогоспособу і модифікації, які можуть виявитись необхідними(2)(3)(4).Дослідна речовина подається приблизно в той самий час кожного дня.
Дозування для окремих тварин звичайно призначається напідставі ваги тіла, що була виміряна найпізніше. Однак, необхідновжити заходів обережності при регулюванні доз впродовж останньоготриместру дослідження вагітності. Наявні дані використовуються длявибору доз з метою уникнення материнської інтоксикації. Однак, привиявлені надмірної інтоксикації самок, що піддавались діїдослідної речовини, тварини повинні бути безболісно вбиті. Якщодекілька вагітних тварин виявляють ознаки надмірної інтоксикації,необхідно розглянути можливість ліквідації цієї групи. Якщодослідна речовина подається через зонд, необхідно здійснюватиподачу речовини однією дозою тваринам, що мають шлунковий зонд абокатетер. Максимальний об'єм рідини, що подається за один раззалежить від розміру тварини. Об'єм речовини не повиненперевищувати 1 мл/100 г ваги тіла, окрім випадків використанняводного розчину, де використовується об'єм 2 мл/100 г ваги тіла.Якщо в якості середовища-носія використовується кукурудзяне масло,об'єм не повинен перевищувати 0,4 мл/100 г ваги тіла. Зміни об'ємудослідної речовини повинні бути мінімізовані шляхом регулюванняконцентрації для забезпечення постійного об'єму при всіх рівняхдозування.
1.6.6. Огляд вагітних самок
Необхідно проводити і реєструвати клінічні огляди принаймніраз на день, бажано в один і той самий час кожного дня, приймаючидо уваги піковий період очікуваних ефектів після дозування. Умовитварин необхідно реєструвати, включаючи смертність, передсмертнийстан, відповідні зміни в поведінці, і а також всі ознаки очевидноїінтоксикації.