- тип і кількість аберацій, представлених окремо по кожнійтварині,
- загальна кількість аберацій на групу,
- кількість клітин з абераціями на групу,
- залежність реакції від дози, якщо можливо,
- статистичний аналіз, якщо є,
- дані паралельних негативних контрольних групп,
- історично встановлені дані негативних контрольних груп здіапазонами, середніми показниками та стандартними відхиленнями,
- дані паралельних позитивних контрольних груп,
- зміни в плоїдності, якщо вони помітні.
Обговорення результатів,
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Adler, I.D. (1986) Clastrogenic Potential in MouseSpermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-CycleSpecifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals,Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C.,Lambert, B. And Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477-484.
(2) Adler, I.D. (1984) Cytogenetic tests in Mammals. In:Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed.S.Vennit andJ.M.Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275-306.
(3) Evans, E.P., Breckon, G. And Ford, C.E., (1964) AnAir-Drying Method for Meotic Preparations from Mammalian Testes.Cytogenetics and Cell Genetics, 3, p. 289-294.
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A.Gagtehouse, D.G. andHenderson, L., (1990) In Vivo Cytogenic Assays, In: D.J.Kirkland(Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures.UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report.Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York,Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115-141.
(5) Yamamoto, K. And Kikuchi, Y., (1978) A New Method forPreparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. MutationRes., 52, p. 207-209.
(6) Adler, I.D. , Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J.,Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuye, T. and Tanka N., (1914)International Workshop on Standardization of Genotoxicity TestProcedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian GermCell Tests., Mutation Res., 312, p. 313-318.
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A.,Doe, J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson Walker, G.,Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992) Report ofBritish Toxicology Society/UK Environmental Mutagen SocietyWorking group: Dose setting: In Vivo Mutagenicity Assays.Mutagenesis, 7, p. 313-319.
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlet, G.E.,Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage,J.R.K., (1989) Statistical Analysis of In Vivo Cytogenic AssaysIn: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of MutagenicityTest Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for MutagenicityTesting, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge,New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.
В.24. КРАПЕЛЬНИЙ ТЕСТ НА ПІДДОСЛІДНИХ МИШАХ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Цей вид тестування належить до тестування in vivo, при якомуна мишей, що виношують ембріонів діють хімічними речовинами.Цільові клітини в ембріонах, що розвиваються є меланобластами, ацільові гени є генами, що відповідають за пігментацію шерстітварини. Ембріони, що розвиваються, є гетерозиготними для окремоїкількості генів, що відповідають за колір шерсті тварини. Мутаціяв домінантну алель або втрата домінантної алелі (в різнихгенетичних випадках) такого гену в меланобласті призводить довираження рецесивного фенотипу в похідних клітинах, завдяки чомувиникають плями відмінного кольору на шерсті піддослідної миші.Кількість потомства з такими плямами і мутації записуються, а їхнячастота порівнюється з потомством, отриманим від ембріонів, щопіддавались виключно дії розчину. Крапельний тест на піддосліднихмишах визначає очікувану соматичну мутацію в фетальних клітинах.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Якщо це можливо, дослідні речовини розчиняються абосуспендуються в ізотонічному розчині. Хімічні речовини, що нерозчиняються в воді розчиняються або суспендуються у відповідномусередовищі. Середовище, що використовується, не повинно нівзаємодіяти з дослідним хімікатом, ні викликати токсичний ефект.Необхідно використовувати свіжі препарати дослідного хімікату.
Піддослідні тварини
Миші штаму Т (нон-агуті, а/а4 шиншилового офарблення, з ch chчервоними очима, c p/c p4 коричневі, b/b; димчасті, з короткимивухами, d se/d se; зі строкатими плямами, s/s) схрещувались або змишами штаму НТ (безбарвні, нон-агуті, брахіоподи, ра а br/pa abp; сірі пухнасті миші, ln fz/ln fz; з перламутровим офарбленнямре/ре), або з C5BL (нон-агуті а/а). Інші види схрещування, такі яксхрещування NMRI (нон-агуті, а/аж альбіноси, с/с) з DBA(нон-агуті, а/а; коричневі b/b; безбарвні d/d) можутьздійснюватись за умови, що в результаті від них буде отриманопотомство нон-агуті.
Кількість і стать
Відповідні жіночі особини проходили процедуру для народженняними відповідної кількості життєздатного потомства для кожногорівня дозування. Відповідний розмір зразка визначався за кількістюплям, що спостерігались у мишей, що проходили процедуру і занабором контрольних даних. Негативні результати вважалисьприйнятними тільки за умови, якщо було оцінено принаймні300 особин потомства, отриманого від жіночих особин, що отрималинайвищу дозу.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Необхідно надати дані щодо паралельної контрольної групимишей, що піддавалися дії середовища (негативний контроль). Можутьбути використані історично встановлені дані контрольної групи тієїж лабораторії для підвищення результатів тесту за умови, що цідані є гомогенними. Дані, отримані щодо позитивної контрольноїгрупи, в тій самій лабораторії, в результаті приймання хімічноїречовини, яка відома як така, що викликає мутагенність, надаються,якщо не виявлено мутагенності дослідної речовини.
Спосіб приймання
Звичайним способом приймання є пероральна інтубація абоінттраперітонеальна ін'єкція для вагітних жіночих особин. В разінеобхідності застосовується приймання шляхом інгаляції або іншимспособом.
Рівні доз
Застосовується щонайменш два рівні дозування, включаючи один,що виявляє ознаки токсичності або зменшення розміру посліду. Длянетоксичних хімікатів використовується максимальна можлива доза.
Процедура
Звичайно препарат приймається один раз на 8, 9 або 10 деньвагітності, рахуючи з дня, в який вперше було помічено вагінальнупробку. Ці дні відповідають дням 7,25, 8,25 і 9,25 після зачаття.В ці дні допускається прийом наступних доз.
Аналіз
Потомству присвоюються коди і проводиться його оцінювання напредмет наявності плям в період між третім і четвертим тижнемпісля народження. Розрізняють три класи плям:
(а) білі плями розміром 5 мм середньо-черевної лінії, які,можливо є наслідком умертвіння клітин (WMVS);
b) жовті, подібні до агуті цятки, що виступають на сосках,статевих органах, горлі, в пахвовій та паховій зонах, а також взоні середини лоба, які, можливо, є наслідком різниці (MDS); атакож
с) забарвлені і білі плями, безсистемно розташовані нашерсті, які, можливо, є наслідком соматичних мутацій (RS).
Всі три класи зареєстровані як результати, але тількиостанній RS має генетичну придатність. Проблему розрізнення MDS іRS можна розв'язати шляхом дослідження проб шерсті підфлуоресцентним мікроскопом.
Слід відзначити очевидні морфологічні відхилення, щопроявляються у потомства.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТИ З ДОСЛІДЖЕНЬ
Звіт з досліджень повинен, якщо це можливо, містити в собінаступну інформацію:
- штами, що використовувались при схрещуванні,
- середня кількість вагітних самок в дослідній групі іконтрольних групах,
- середня кількість посліду в дослідній групі і контрольнихгрупах на момент народження, а також після закінчення годування,
- об'єм дози (доз) дослідної хімічної речовини,
- розчинник, що використовувався,
- день вагітності, в який було дано дослідну речовину,
- спосіб приймання дослідної речовини,
- загальна кількість потомства, що досліджується з WMVS, MDSі RS в дослідній групі і контрольних групах,
- значні морфологічні відхилення,
- зв'язок між рівнем дози і реакцією особин з RS, якщо цеможливо,
- статистичний аналіз,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів,
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
В.25. СПАДКОВА ТРАНСЛОКАЦІЯ У МИШЕЙ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, частина В
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутня.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідження спадкової транслокації у мишей показуютьструктурні і кількісні хромосомні зміни в зародкових клітинахссавців, що регенеровані в першим поколінні потомства. Типивиявлених хромосомних змін є двосторонньою транслокацією, а такожу випадку потомства жіночої статі - втратою хромосоми Х. Носіїтранслокації і самки генотипу ХО показують знижену плідність, якавикористовується при відборі потомства F з метою здійснення
1
цитогенетичного аналізу. Повна безплідність є наслідком
транслокацій певного типу (хромосом Х-аутосом і типу c-t).
Транслокації спостерігаються в мейотичних клітинах в діакінезі
метафази I у чоловічих особин, також F , самців або чоловічого
1
потомства самок F . Самки генотипу ХО цитогенічно ідентифікуються
1
завдяки наявності тільки 39 хромосом в клітинах кісткового мозку,
що проходять стадію мітозу.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Дослідну речовину розчиняють в ізотонічному розчині солі.Хімічні речовини, що не розчиняються в воді розчиняються абосуспендуються у відповідному середовищі. Необхідно використовуватисвіжі препарати дослідного хімікату. Якщо середовищевикористовується щоб полегшити введення дози, воно не повинно нівзаємодіяти з дослідною сполукою, ні викликати токсичний ефект.
Спосіб приймання
Звичайним способом приймання є пероральна інтубація абоінттраперітонеальна ін'єкція. В разі необхідності застосовуєтьсяприймання речовини іншим способом.
Піддослідні тварини
З метою полегшення годування і цитологічної верифікації цейдослід проводиться на мишах. Вимоги щодо штаму мишей відсутні.Однак, середня кількість посліду повинна бути більшою за вісімособин і бути відносно постійним.
Необхідно використовувати здорових, статево зрілих тварин.
Кількість тварин
Необхідна кількість тварин залежить від частоти спонтаннихтранслокацій, а також мінімального ступеню індукцій, необхідногодля позитивного результату.
Дослідження звичайно проводиться шляхом аналізу потомствасамців F . Необхідно дослідити принаймні 500 самців потомства F в
1 1
даній групі дозування. У випадку включення самок потомства F
1
необхідно 300 самців і 300 самок.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Необхідно забезпечити доступ до даних, що отримані зпаралельних і базових контрольних груп. У випадку доступностірезультатів позитивної контрольної групи, що отримані в результатіостанніх дослідів в тій самій лабораторії, ці результати можназастосовувати замість паралельної позитивної контрольної групи.
Рівні доз
Досліджується один рівень дози, як правило, найвищий рівеньдози, що пов'язаний з мінімальним проявом токсичності, але не маєвпливу на репродуктивну поведінку або виживання. Для встановленнязв'язку між дозою і реакцією необхідно вживання двох додатковихменших доз. Для нетоксичних хімічних речовин використовуєтьсямаксимальна прийнятна доза.
Процедура
Впливання дослідною речовиною і спарювання
Вимагаються дві гармонограми приймання речовини. Найчастішевикористовується одноразовий прийом дослідної речовини. Такожможна застосовувати прийом дослідної речовини сім днів на тижденьвпродовж близько 35 днів. Кількість спарювань після закінченняприйому речовини регулюється гармонограмою досліджень з метоюгарантованого отримання проб з усіх фаз зародкової клітини. Післязакінчення періоду спарювання самок необхідно помістити в окреміклітки. У випадку початку родів у самок необхідно зареєструватидату, кількість посліду, а також стать потомства. Все потомство,що містить в собі особини самців відзвичаюється від ссання, апотомство, що містить жіночі особини відкидається, окрім випадків,коли воно використовується в дослідженні.
Дослідження транслокації гетерозиготності
Застосовується один з двох можливих методів:
- дослідження плідності потомства F з наступної верифікацією 1можливих носіїв транслокації через проведення цитогенічниханалізів,
- цитогенічні аналізи всього чоловічого потомства F без 1попередньої селекції шляхом дослідження плідності.
а) Дослідження плідності
Змінена плідність особини F може бути підтверджена на 1підставі спостереження розмірів потомства і/або аналізу наявностісамок-маток.
Необхідно визначити критерії для встановлення нормальної ізниженої плідності штаму мишей, що використовуються в досліді.
Дослідження кількості посліду: самці F , призначені для 1дослідження розміщуються в клітках окремо від самок або з тогосамого експерименту, або з колонії. Клітки оглядаються щоденнопочинаючи з 18 дня після спарювання. Кількість посліду, а такожстать потомства F записується після народження, наступні посліди
2
відкидаються. У випадку дослідження жіночого потомства F
1
потомство F малих послідів зберігається з метою проведення
2
подальших дослідів. Жіночі носії транслокації перевіряються за
допомогою аналізів транслокацій у їхнього чоловічого потомства.
Самки ХО розпізнаються за зміною відношення показника статі у
їхнього потомства з 1:1 на 1:2 чоловічих особин до жіночих. В
наступній процедурі звичайні тварини F відсторонюються від
1
подальших досліджень, якщо перший послід F досяг або перебільшив
2
встановлену кількість; в зворотному випадку досліджується другий
або третій послід F .
2
Тварини F , яких не можна віднести до звичайних тварин після 1закінчення дослідження трьох послідів F або піддаються подальшому
2
дослідженню шляхом аналізу вмісту утроби, або безпосередньо
піддаються цитогенічному аналізу.
Аналіз вмісту утроби: Зниження розміру посліду з носіямитранслокації викликане зародковою смертю, так, що високий рівеньмертвих імплантів є проявом наявності транслокації у тварин, щодосліджуються. Кожний досліджуваний самець F використовується для
1
запліднення двох або трьох самок. Факт зачаття встановлюється
шляхом щоденного ранкового контролю вагінальних пробок. Жіночі
особини умертвляються на 14-16 день, після чого реєструється
наявність живих і мертвих імплантів в їхніх утробах.
b) Цитогенічний аналіз
Препарати з яєчок готуються за допомогою техніки сушенняповітрям. Носії транслокації розпізнаються за наявністюполівалентних конфігурацій в діакінезі метафази І в основнихсперматоцитах. Дослідження принаймні двох клітин з полівалентнимизв'язками є підставою для підтвердження того факту, що тваринимають носій транслокації.
Всіх самців F необхідно піддати цитогенічному аналізу, якщо 1не проводилось жодної селекції під час розмноження. Необхідно підмікроскопом позначити мінімум 25 клітин діакінезу метафази Iданого самця. Аналіз мітотичних метафаз в сперматогоніях вкістковому мозку вимагається у самців F з малими яєчками і
1
дефектом мейозу до діакінезу, або у самок з підозрою на наявність
генотипу ХО. Наявність незвичайно довгої і/або короткої хромосоми
в кожній з 10 клітин є доказом особливої чоловічої стерильної
транслокації (c-t типу). Деякі транслокації Х-аутосом, що
викликають чоловічу стерильність можуть бути виявлені тільки
шляхом бендингового аналізу мітотичних хромосом. Наявність
39 хромосом в усіх 10 мітозах є доказом стану ХО у жіночих особин.
2. ДАНІ
Дані необхідно представити в формі таблиці.
При кожному спарюванні необхідно реєструвати середній розмірпосліду, а також статеве співвідношення в потомстві, що походить збатьківської пари при народженні і в період, коли тваринивідзвичаюються від ссання.
Для оцінювання плідності тварин F представляються середні 1кількості потомства, що походить від звичайного спарювання, атакож кількість живих і неживих імплантів від кожного спарюванняособин F , де зареєстровано наявність носіїв транслокації. З метою
1
виконання аналізу вмісту утроби необхідно зареєструвати середню
кількість живих і мертвих імплантів потомства, що походить від
звичайного спарювання, а також докладні кількості живих і неживих
імплантів для кожного потомства, де зареєстровано наявність носіїв
транслокації.
Для виконання цитогенічного аналізу діакінезу метафази I,кількість полівалентних конфігурацій, також реєструється загальнакількість спарювань і тривалість спарювання.
Відносно безплідних особин F необхідно зареєструвати 1загальну кількість спарювань, а також час спарювання. Необхіднонадати вагу яєчок, а також детальний опис результатівцитогенічного аналізу.
Відносно самок ХО реєструється середня кількість посліду,статеве співвідношення потомства F , а також результати
2
цитогенічного аналізу.
Якщо можливо, потомство F з носіями транслокації піддаються 1попередній селекції шляхом дослідження плідності, таблиці повиннімістити в собі інформацію, скільки з цих транслокацій булопідтверджено як гетерозиготні транслокації.
Необхідно зареєструвати дані негативних і позитивнихдосліджень контрольних груп.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТИ З ДОСЛІДЖЕНЬ
Звіт з досліджень повинен, якщо це можливо, містити в собінаступну інформацію:
- штами мишей, вік тварин, вага тварин, що досліджуються,
- кількість батьківських тварин кожної статі в групі, щодосліджується і в контрольних групах,
- умови дослідження, докладний опис дослідження, дози,розчинники, план спарювання,
- кількість і стать потомства даної самки, кількість і статьпотомства, що вигодовувалось для аналізу транслокації,
- час і критерії транслокаційного аналізу,
- кількість, а також докладний опис носіїв транслокації,включаючи дані, що стосуються розмноження і дані, що стосуютьсявмісту утроби у відповідних випадках,
- цитогенічні процедури і деталі мікроскопіного аналізу,найкраще надати разом зі знімками,
- статистичний аналіз,
- аналіз результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. АНАЛІЗ ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, частина В
В.26. ТЕСТ НА СУБХРОНІЧНУ ПЕРОРАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ ПРИ ПОВТОРЮВАНІЙ ДОЗІ: 90-ДЕННЕ
ДОСЛІДЖЕННЯ ПЕРОРАЛЬНОЇ ТОКСИЧНОСТІ
НА ПРИКЛАДІ ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження субхронічної токсичності пероральнимшляхом є копією OECD TG 408 (1998).
1.1. ВСТУП
При дослідженні і оцінюванні характеристик токсичностіхімічної речовини визначення субхронічної токсичності пероральнимшляхом при вживанні повторних доз проводиться після отриманняпопередньої інформації щодо токсичності в результаті 28-деннихдосліджень гострої або хронічної токсичності. В результаті90-денного дослідження отримують інформацію щодо можливоїнебезпеки для здоров'я, яка, очевидно, може виникнути післяповторного прийому препарату впродовж тривалого часу, який включаєв себе момент припинення лактації і зростання до зрілості.Дослідження надає інформацію щодо основних токсичних ефектів,визначає органи-мішені і можливість акумуляції, а також надаєможливість оцінити рівень дози препарату, що може викликатиприхований побічний ефект, що в свою чергу може бути використанодля вибору рівнів доз для тривалих досліджень і для визначеннякритеріїв безпеки для людини.
Цей метод робить особливий наголос на неврологічному аспектіі описує вплив на імунологічну і дітородну систему. Також сліднаголосити на необхідності ретельного клінічного нагляду затваринами для отримання щонайповнішої інформації. Це дослідженняповинно надати можливість визначити хімічні речовини, які єпотенціальними чинниками нейротоксичного або імунологічногоефекту, або можуть впливати на дітородні органи, що може викликатинеобхідність подальшого більш глибокого дослідження.
Також дивіться Загальний вступ, частина В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Доза: є кількість речовини, що подається. Доза виражається вмасі (г, мг), або як вага дослідної речовини на одиницю маси тілатварини, що досліджується (наприклад, мг/кг), або як стала харчоваконцентрація (ppm).
Дозування: є загальним поняттям, що включає в себе дозу,частоту її вживання і час приймання дози.
NOAEL: є скороченням від поняття, що визначає рівень, приякому не спостерігається шкідливих наслідків, а також є найвищимрівнем дози, при якому не спостерігається шкідливих ефектів, якізалежать від речовини, що подаються.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина приймається перорально щодня мірнимидозами окремими групами піддослідних тварин, один рівень дози нагрупу впродовж 90 днів. Впродовж періоду приймання речовини затваринами здійснюється ретельний нагляд на предмет виявлення ознактоксичності. Проводиться розтин тварини, що помирають, або якихвбивають впродовж тестування, після завершення досліду тварин, щовижили, також вбивають, після чого проводиться їх розтин.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка тварин
Необхідно використовувати здорових тварин, що пройшлиакліматизацію в лабораторних умовах впродовж щонайменш, п'яти дніві які не були предметом попередніх експериментальних процедур.Піддослідні тварини повинні бути охарактеризовані за породою,штамом, джерелом, статтю, вагою і/або віком. Тварини повинні бутивипадково відібрані для контрольних і дослідних груп. Кліткиповинні бути розташовані таким чином, щоб мінімізувати можливіефекти, викликані розташуванням клітки. Кожній твариніприсвоюється унікальний ідентифікаційний номер.
1.4.2. Підготовка доз
Дослідна речовина подається через зонд або з їжею чи питтям.Метод перорального вживання залежить від мети дослідження іфізичних/хімічних властивостей дослідного матеріалу.
При необхідності дослідна речовина розчиняється абопідвішується у відповідному середовищі. Рекомендується заможливістю спочатку розглянути можливість використання водногорозчину/суспензії, потім олійного розчину/емульсії (наприклад, вкукурудзяній олії), а потім використання розчинів в іншихсередовищах. Для всіх середовищ, крім води, необхідно визначититоксичні характеристики. Необхідно визначити стабільністьдослідної речовини в умовах вживання.
1.4.3. Умови проведення досліду
1.4.3.1. Піддослідні тварини
Рекомендується використовувати щурів, але також придатними єінші породи гризунів, наприклад, миші. Необхідно використовуватиштами здорових дорослих тварин, що звичайно використовуються влабораторних дослідах. Вік самки повинен складати менше одногороку, вони не повинні бути вагітними. Дозування повиннорозпочатись якнайшвидше після припинення лактації, в кожномувипадку до досягнення віку дев'яти тижнів. На початку дослідженнязміна ваги тварин повинна бути мінімальною і не перевищувати+- 20% середньої ваги для кожної статі. У випадку, колидослідження проводяться в якості попередніх досліджень передвивченням хронічної довготривалої токсичності, для обох дослідженьнеобхідно використовувати тварин того самого штаму і джерела.
1.4.3.2. Кількість і стать
Принаймні 20 тварин (10 самців і 10 самок) необхідновикористовувати для кожного рівня дози. Якщо планується умертвіннявпродовж досліду, кількість необхідно збільшити на кількістьтварин, що планується вмертвити до закінчення дослідження.Спираючись на попередній досвід про хімічні і близькі до нихречовини необхідно розглянути можливість включення додатковоїсателітної групи кількістю 10 тварин (по 5 кожної статі) дляконтрольної групи і групи, що отримує найвищу дозу з метою наглядупісля досліду на предмет реверсивності або тривалості будь-якихтоксичних наслідків. Час такого нагляду встановлюється увідповідності до виявлених наслідків.
1.4.3.3. Рівні доз
Використовуються принаймні три рівні доз з одночаснимпоточним контролем, окрім випадку проведення досліду на граничнийвміст (див. 1.4.3.4.). Рівні доз визначаються на підставіповторної дози, або на підставі досліджень діапазону, а такожповинні враховувати всі існуючі токсикологічні ітоксикоз-кінетичні дані, доступні щодо існуючої речовини абопов'язаних з нею матеріалів. Враховуючи обмеження, викликаніфізико-хімічною природою і біологічним ефектом дослідної речовини,рівень найвищої дози вибирається з метою викликання токсичнихпроявів, але вибрана доза не повинна призводити до смерті абозначних ушкоджень. Зменшення дозування застосовується з метоюдемонстрації реакції, пов'язаної з дозуванням і рівня при якому неспостерігається шкідливих наслідків (NOAEL) при найнижчій дозі.Двократні або чотирикратні інтервали є оптимальними длявстановлення рівнів дозування, що знижуються, а введення четвертоїдослідної групи є часто необхідним при використанні дуже значнихінтервалів (наприклад, більше ніж коефіцієнт 6-10) міждозуваннями.
Контрольною групою повинна бути група, яка не піддається діїпрепарату, або яка піддається дії середовища, якщо для вживаннядослідної речовини використовується середовище. Тварини вконтрольній групі поза часом ненадання їм дослідної речовинизнаходяться в тих самих умовах, що і тварини в дослідних групах.Якщо використовується середовище-носій, контрольна група повиннаотримати його в максимально можливому об'ємі. Якщо досліднаречовина подається з харчуванням і призводить до зменшенняраціону, контрольна група з харчової пари може бути корисною прирозрізненні між зменшенням, що викликане смаком і зменшенням,викликаним токсикологічними змінами в моделі дослідження.
Наступні характеристики середовища-носія та інших добавокповинні розглядатись як відповідні: вплив на засвоюваність,розподіл, метаболізм, або утримання дослідної речовини; вплив нахімічні якості дослідної речовини, що можуть змінити її токсичніхарактеристики; і вплив на споживання їжі або води або харчовогостатусу тварин.
1.4.3.4. Дослід на граничний вміст
Якщо тестування при одному Рівні доз, еквівалентному1 000 мг/кг маси тіла/день при використанні процедур, описаних дляцього досліду призводить до непомітного шкідливого ефекту, а такожякщо наявність токсичності не очікується на підставі даних щодоструктурно-пов'язаних речовин, в проведенні повного дослідженнятрьох рівнів доз нема необхідності. Дослід на граничний вмістзастосовується за винятком ситуацій, коли небезпека для людейвикликає потребу застосування вищого рівня дози.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Вживання доз
Тваринам надається дослідна речовина через сім днів кожноготижня впродовж 90 днів. Кожний інший спосіб дозування, наприклад,п'ять днів на тиждень вимагає обґрунтування. Якщо досліднаречовина подається через зонд, процедура виконується поданнямодиничної дози з використанням трубки або катетера. Максимальнийоб'єм рідини, що надається за один раз, залежить від розмірупіддослідної тварини. Об'єм не повинен перевищувати 1 мл/100 гмаси тіла, окрім випадків використання водного розчину, при якихвикористовуються водні розчини з пропорцією 2 мл/100 г маси тіла.За виключенням речовин, що викликають подразнення або корозію, якізвичайно викликають загострення при більш значних концентраціях,необхідно мінімізувати змінність об'єму дослідної речовини шляхомрегулювання концентрації для того, щоб забезпечити постійністьоб'єму на всіх рівнях дозування.
Для речовин, які подаються з їжею або питною водою, важливозабезпечити, щоб об'єм дослідної речовини не перешкоджавнормальному харчуванню або водному балансу. Якщо дослідна речовинаподається з їжею - застосовується або постійна концентрація в їжі(ppm), або постійний рівень дози відносно маси тіла тварини; якщозастосовуються альтернативні варіанти, це повинно бути зазначеноокремо. Для речовин, які подаються через зонд, доза повиннаподаватись кожного дня в той самий час і регулюватись таким чином,щоб забезпечити постійний рівень дозування відносно маси тілатварини. При проведенні попереднього 90-денного дослідження переддослідженням токсичності, в обох випадках повинна застосовуватисьта сама дієта.
1.5.2. Огляди
Період нагляду повинен складати щонайменш 90 днів. Для тваринв сателітній групі складається графік оглядів, при цьому увідповідний період тварини не піддаються дії препарату длявиявлення їхньої стійкості до токсичного ефекту або здатностівідновлюватись після нього.
Загальні клінічні огляди проводяться принаймні раз на день,бажано в один і той самий час, приймаючи до уваги піковий періодочікуваного ефекту після дозування. Клінічний стан твариннеобхідно реєструвати. Принаймні два рази на день, звичайно, напочатку і в кінці кожного дня всі тварини оглядаються на предметклінічних проявів і смертності.
Принаймні раз перед першим проявом (в межах порівняння) іодин раз на тиждень після цього всі тварини повинні пройтиретельне клінічне обстеження. Ці обстеження проводяться за межамиклітки, де живе тварина, бажано в стандартному місці і в один ітой самий час. Результати повинні бути ретельно записані, бажановикористовувати систему балів, створену лабораторією, якапроводить тестування. Необхідно докласти зусиль для забезпеченнямінімальних змін умов огляду. Виявлені прояви повинні включати всебе зміну шкіри, хутра, очей, слизистих оболонок, наявністьсекреції і екскрецій, а також автономної активності (наприклад,очі, що сльозяться, пілоерекція, зміна розміру зіниць, змінадихання), але не обмежуватись ними. Необхідно також зареєструватитакі прояви, як: зміна ходи, постави і реакції на догляд, а такожнаявність клонічних або тонічних рухів, стереотипної поведінки(надмірне вмивання, повторюваний рух по колу) або аномальноїповедінки (наприклад, нанесення собі ушкоджень, рух задомнаперед) (1).
Офтальмологічні дослідження за допомогою офтальмоскопу абоподібного приладу повинно здійснюватись перед вживанням доздосліджуваної речовини і після закінчення дослідів, найкраще длявсіх тварин, але принаймні в групі з високим рівнем дозування і вконтрольній групі. При виявленні змін в очах, необхідно повторнодослідити всіх тварин.
До завершення періоду дії, але в жодному випадку не ранішеніж на 11 тиждень необхідно провести дослідження сенсорноїреактивності на різні типи дії(1) (наприклад, слухова, візуальна іпропріоцептивна дія) (2), (3), (4), також необхідно провестиоцінку сили стискання і оцінку моторної діяльності (6). Наступнідеталі процедур, які можуть бути проведені після цього описані увідповідних посиланнях. Однак, можуть бути використані такожальтернативні процедури.
Функціональні спостереження, що повинні бути проведені докінця досліду можуть бути опущені, якщо дані, отримані на основіфункціональних спостережень при проведенні інших дослідів іщоденних клінічних оглядів не виявляють функціонального дефіциту.
В окремих випадках функціональні огляди також можуть бутиопущені для груп, що проявляють ознаки токсичності в ступеню, щоможе значно вплинути на результати функціонального досліду.
1.5.2.1. Вага тіла і споживання їжі/води
Всіх тварин зважують принаймні раз на тиждень. Оцінюванняоб'єму споживання їжі проводиться принаймні раз на тиждень. Якщодослідна речовина приймається з водою, також принаймні раз натиждень необхідно оцінити об'єм споживання води. Споживання водитакож приймається до уваги при дослідах, де речовина подається зїжею або через зонд, впродовж яких режим прийому води може бутизмінено.
1.5.1.1. Гематологія і клінічна біохімія
Зразки крові відбираються з зазначеного місця і зберігаються,якщо це необхідно, у відповідних умовах. На кінець дослідногоперіоду зразки збираються до або в процесі процедури дляумертвіння тварин.
Необхідно виконати наступні гематологічні дослідження в кінцідослідного періоду після того, як зібрані проміжні проби крові:гематокрит, концентрація гемоглобіну, кількість еритроцитів,загальна і диференційна кількість лейкоцитів, кількістьтромбоцитів і час/потенціал згортання крові.
На пробах крові кожної тварини необхідно провести визначенняклінічної біохімії для основних досліджень токсичних наслідків втканинах, а саме має бути визначена: дія на нирки і внутрішніоргани, ця процедура проводиться також перед або в процесіумертвіння тварин (відділення від тих, що помирають і/або вбиті впродовж досліду). Подібно до гематологічних досліджень може бутивиконано відбір проб в ході досліджень для проведення клінічнихбіохімічних дослідів. Рекомендується утримування тварин впродовжночі до відбору проб крові (1). При аналізі в плазмі або сироватцінеобхідно визначити наявність: натрію, калію, глюкози, загальнийобсяг холестерину, сечовини, азоту сечовини крові, креатиніну,загальний обсяг протеїну і альбуміну, а також два або більшеензими, що вказують на печінково-клітковий ефект (такі як аланінамінотрансфераза, аспартат амінотрансфераза, алкалін фосфатаза,гама глуматил транспептидаза і сорбітолдегідрогеназа). Також можебути проведено оцінювання кількості додаткових ензимів(печінкового або іншого походження) і жовчних кислот, в результатіякого в окремих випадках можна отримати корисну інформацію.
----------------
(1) Для проведення окремих досліджень сироватки і плазми,особливо на предмет наявності глюкози, бажано утримання тварин відїжі впродовж ночі. Основною причиною такого утримання є те, щорозбіжність результатів, отриманих при неутриманні тварин від їжі,може приховати ефект, що важко виявити і таким чином, створититруднощі при інтерпретації результатів. З іншого боку, утриманнявід їжі впродовж ночі може вплинути на загальний метаболізм тварині, зокрема, при поданні дослідної речовини з харчуванням, можезмінити щоденний вплив дослідної речовини. При застосуванніутримання від їжі впродовж ночі, необхідно виконати клінічнібіохімічні дослідження після проведення функціонального огляду.
Факультативно можна провести аналіз сечі, яка відбирається увідповідності до визначеного графіку, впродовж останнього тижнядослідження, в результаті такого аналізу оцінюється: зовнішнійвигляд, об'єм, осмолялність або питома густина, рН, наявністьбілку, глюкози і крові, кров'яних клітин.
Також до уваги приймаються результати дослідження станусироватки на предмет виявлення загальних ушкоджень шкіри. Іншіречовини повинні бути визначені, якщо відомі властивості речовиниможуть або існують підозри, що вони можуть впливати на метаболізм,такими речовинами є: кальцій, фосфор, тривалі тригліцериди,специфічні гормони, метагемоглобін і холінестраза. Наявність цихречовин визначається для хімікатів окремих класів або в кожномуконкретному випадку.
Взагалі необхідно застосовувати гнучкий підхід в залежностівід порід і ефекту від даної речовини, що виявляється і/абопередбачається.
Якщо історичні вихідні дані не відповідають вимогам,необхідно звернути увагу на те, чи є необхідність до початкудозування у визначенні гематологічних змінних і змінних клінічноїбіохімії; взагалі не рекомендується отримання цих даних до початкудослідження (7).
1.5.2.3. Загальний розтин
Всі піддослідні тварини підлягають повному детальномузагальному розтину, який включає в себе детальне вивченнязовнішньої поверхні тіла, всіх отворів, а також черепної, грудноїі черепної порожнин і їхнього вмісту. Печінку, нирки, наднирковізалози, яєчка, придатки, матку, яєчники, зобну залозу, селезінку,мозок і серце всіх тварин (крім тих, які вмирають і/або буливипадково вбиті) необхідно обробити клейкою тканиною, після цьоговони повинні якнайшвидше після розтину бути зважені в мокромустані для уникнення висихання.
Наступні тканини повинні бути законсервовані в найбільшпридатному середовищі, що є придатним для тканин обох типів ізапланованих чергових гістопатологічних досліджень: всі загальніушкодження, мозок (всі репрезентативні ділянки, включаючи півкуліголовного мозку і спинний мозок/варулієв міст), хребет (на трьохрівнях: шийному, середньо-грудному і поперековому), слизовіоболонки, щитовидні залози, паращитовидні залози, зобні залози,стравохід, слинні залози, шлунок, великий и малий кишечник(включаючи Пейерові бляшки), печінку, підшлункову залозу, нирки,надпечінкову залозу, селезінку, серце, трахею і легені(законсервовані шляхом наповнення фіксатором і занурення), аорту,гонади, матки, інші статеві органи, жіночі грудні залози,простату, сечовий міхур, жовчний міхур (миша), лімфатичні вузли(бажано один лімфатичний вузол, що покриває шлях прийомупрепарату, а другий вузол такий, що знаходиться на відстані відшляху прийому препарату для, того, щоб послідкувати систематичнийвплив), периферійний нерв (сідничний або тибіальний) бажаноякнайближче до м'язу, ділянку кісткового мозку (і/або свіжийаспірат кісткового мозку), шкіру, очі (якщо спостерігались змінивпродовж офтальмологічного дослідження). Клінічні та іншірезультати можуть викликати необхідність дослідження додатковихтканин. Також повинні бути збережені будь-які органи, що можутьвважатись органами-мішенями на підставі відомих властивостейдослідної речовини.
1.5.2.4. Гістопатологія
Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів ітканин всіх тварин контрольної групи і групи, що отримуваланайбільшу дозу. Ці дослідження проводяться для тварин всіх іншихгруп дозування при наявності змін в групі, що отримувала найбільшудозу, пов'язаних з дією препарату.
Всі значні ушкодження повинні бути досліджені.
При використанні сателітної групи проводиться гістопатологіяна тканинах і органах, визначених, як такі, що реагують, в групах,що приймали препарат.
2. ДАНІ І ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Необхідно представити індивідуальні дані. Додатково всі даніповинні бути зведені в таблицю, в якій представляється загальнакількість тварин в кожній групі на початку дослідження, кількістьтварин, що вмерли під час досліду або кількість тварин, якихбезболісно умертвили, а також час, впродовж якого настала смертьабо безболісне умертвіння, кількість тварин, що має ознакиотруєння, опис ознак отруєння, що спостерігаються, включаючи часпояви, тривалість, ступінь тяжкості кожного токсичного випадку,кількість тварин, у яких виявлено патологічні зміни, типпатологічних змін і відсоток тварин, що складає кожний типпатологічних змін.
В окремих випадках кількісні результати повинні оцінюватисьвідповідними і загальноприйнятими статистичними методами.Статистичні методи і данні, що піддаються аналізу, повиннівибиратись під час приготування проекту досліджень.
2.1.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну інформацію:
2.2.1. Речовина, що вживається при дослідженні:
- фізичний характер, чистота і фізико-хімічні властивості,
- ідентифікаційні дані,
- середовище (якщо застосовується): обґрунтування виборусередовища, якщо відрізняється від води.
2.2.2. Види тварин, що використовуються при дослідженні:
- породи і штам, що використовувались,
- кількість, вік і стать тварин,
- джерело, умови проживання, харчування і т.ін.,
- вага кожної тварини на початку дослідження.
2.2.3. Умови дослідження:
- раціональне обґрунтування вибраного рівня дозування,