- кількість проаналізованих метафаз (дані наводяться окремодля кожної культури),
- середня кількість ОСХ на клітину і на хромосому (данінаводяться окремо для кожної культури),
- критерії для оцінки ОСХ,
- обґрунтування вибору дози,
- співвідношення дози і реакції, у випадку застосування,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.20. РЕЦЕСИВНИЙ ТЕСТ НА ЛЕТАЛЬНІСТЬ, ПОВ'ЯЗАНУ
ЗІ СТАТЕВИМИ ВІДМІННОСТЯМИ, У ДРОЗОФІЛИ ЧОРНОЧЕРЕВОЇ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИПИ МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Рецесивний тест на летальність, пов'язану зі статевимивідмінностями (РЛСВ) у дрозофіли чорночеревої, виявляє випадкимутацій, як точкових, так і невеликих делецій, у зародкових лініяхкомах. Цей тест є аналізом подальшої мутації, що здатний доскринінгу на мутації приблизно у 800 локусах у X-хромосомі, щоявляє собою біля 80% всіх локусів X-хромосоми. X-хромосома являєсобою приблизно одну п'яту частину всього галоїдного геному.
Мутації у X-хромосомі дрозофіли чорночеревої є фенотиповимита виражені у комах чоловічої статі, носіїв мутантного гена. Колимутація є летальною у гемізиготному стані, висновок про їїприсутність робиться, спираючись на відсутність одного класунащадків-самців з двох, які були нормально народженігетерозиготною самицею. РЛСВ-тест користується перевагами,наданими цими фактами, використовуючи особливим чином мічені таупорядковані хромосоми.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Лінії
Можна використовувати самців чітко визначеної лінії дикоготипу та самиць лінії Мюллер-5. Також можна використовувативідповідним чином позначені лінії самиць із множиннимиінвертованими X-хромосомами.
Досліджувана речовина
Досліджувані речовини слід розчинити у воді. Речовини, які єнерозчинними у воді, можна розчинити або усунути за допомогоювідповідного середовища (наприклад, суміші етанолу та Tween-60 або80), потім розбавити водою або фізіологічним розчином передвведенням. Слід уникати диметилсульфоксиду (ДМСО) у якостісередовища.
Кількість тварин
Тест має бути розроблено з урахуванням попередньо визначеноїчутливості та сили впливу. Частота спонтанних мутацій, щоспостерігається у відповідній контрольній групі, дуже впливатимена кількість хромосом, підданих дії речовини, що є об'єктоманалізу.
Маршрут введення
Вводити речовину можна перорально, за допомогою ін'єкції абоз використанням газів і пароподібних речовин. Федінг досліджуваноїречовини може здійснюватися у розчині цукру. За необхідності,речовини можна розчинити у 0,7%-розчині NaCl та вприснути у груднуклітину чи черевну порожнину.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Слід залучати до тестування негативні (за середовищем) тапозитивні контрольні групи. Проте, у випадку наявності відповіднихісторично встановлених даних з контролю, в паралельних контрольнихгрупах потреби немає.
Рівні впливу
Потрібно використовувати три рівні впливу. Для попередньоїоцінки можна використати один рівень впливу досліджуваноїречовини, який є рівнем максимально допустимої концентрації аботаким, що викликає певні ознаки токсичності. Для нетоксичнихречовин слід використовувати вплив максимальної застосовноїконцентрації.
Процедура
Самців дикого типу (віком від 3 до 5 днів) піддають діїдосліджуваної речовини та індивідуально спарюють з надлишкомнезапліднених самиць лінії Мюллер-5 або іншої відповідномаркованої (із множинними інвертованими X-хромосомами) лінії.Самиць замінюють на свіжих незапліднених кожні 2-3 дні, щобохопити весь зародковий цикл клітини. Нащадків цих самиць оцінюютьз точки зору летальних впливів, що відповідають впливам на зрілусперму, сперматиди на середній або пізній стадії, сперматиди наранній стадії, сперматоцити та сперматогонії під час дії речовини.
Гетерозиготні самиці F1 з вищенаведеного схрещування можутьспарюватись індивідуально (тобто, одна самиця на пробірку) з їхбратами. В поколінні F2 кожна культура оцінюється за критеріємвідсутності самців дикого типу. Якщо здається, що культурапоходить від самиці F1, що є носієм летальної батьківськоїX-хромосоми (тобто, не спостерігається самців з хромосомою, щобула піддана дії речовини), дочок цієї самиці з тим самимгенотипом слід протестувати, щоб встановити, чи летальністьповторюється у наступному поколінні.
2. ДАНІ
Дані мають бути внесені в таблицю таким чином, щобвідобразити кількість піддослідних X-хромосом, кількістьбезплідних самців та кількість летальних хромосом для кожноїконцентрації впливу та для кожного періоду спарювання кожногопіддослідного самця. Потрібно повідомляти про кількість скупченьрізних розмірів на самця. Результати потрібно підтверджуватишляхом окремого експерименту.
Для оціночних рецесивних летальних тестів на базі статевихвідмінностей слід використовувати відповідні статистичні методи.Потрібно розглянути і оцінити в певному статистичному ключіутворення скупчень рецесивних летальних генів, що походять відодного самця.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має міститинаступну інформацію:
- лінія: використовувані лінії чи штами, вік комах, кількістьпіддослідних самців, кількість безплідних самців, кількістьутворених культур F2, кількість культур F2 без потомства,кількість хромосом, що є носіями виявленого летального гену укожному зародковому циклі клітини.
- критерії визначення розміру піддослідних груп,
- умови тестування, детальний опис введення речовини таграфік вибірки, рівень введення, дані щодо токсичності, негативних(за середовищем) та позитивних контрольних груп, якщо це єдоцільним,
- критерії для оцінки летальних мутацій,
- співвіднесення дози/реакції, де можливо,
- оцінка даних,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.21. ТЕСТИ IN VITRO НА ТРАНСФОРМАЦІЮ
КЛІТИН ССАВЦІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Системи культур клітин ссавців можна використовувати длявиявлення змін фенотипу in vitro, спричинених хімічнимиречовинами, і пов'язаних зі злоякісною трансформацією in vivo.Широко використовуються такі клітини, як C3H10T1/2, 3T3, SHE,клітини щурів, що досліджують за методом Фішера; дослідженняґрунтуються на змінах морфології клітин, формуванні фокусу абозмінах якірної залежності в напівтвердому агарі. Існують меншшироко використовувані системи для визначення фізіологічних абоморфологічних змін в клітинах внаслідок піддавання впливуканцерогенних хімічних речовин. Жодна з кінцевих точок тесту invitro не має встановленого механістичного зв'язку з раком. Деякі зтестових систем здатні визначати провокуючі пухлини фактори.Цитотоксичність може визначатися за допомогою вимірювання впливудосліджуваного матеріалу на здатність до формування колоній(ефективність клонування) або швидкість росту культур. Вимірюванняцитотоксичності полягає у встановленні того факту, що введеннядосліджуваної хімічної речовини було токсикологічно доцільним, алевоно не може використовуватись для підрахунку трансформації:частота в усіх аналізах з деяких пір може включати подовженуінкубацію та/або повторний посів на чашках.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Клітини
Різноманітність ліній клітин або первинних клітин доступна взалежності від тесту на трансформацію, що використовується.Дослідник має переконатись у тому, що клітини у тесті, щопроводиться, демонструють відповідні зміни фенотипу післяпіддавання їх впливу відомих канцерогенів і що тест, якийпроводиться в лабораторії дослідника, є вагомим та надійним, щодоведено документально.
Середовище
Середовище та умови експерименту повинні відповідати методуаналізу трансформацій, що використовується.
Досліджувана речовина
Досліджувані речовини можуть бути приготовані укультуральному середовищі, розчинені або усунені у відповіднісередовища перед обробкою клітин. Остаточна концентраціясередовища в культуральній системі не повинна впливати нажиттєздатність клітин та їх швидкість росту або ступіньтрансформацій.
Метаболічна активація
Клітини повинні піддаватись впливу досліджуваної речовини якв присутності відповідної системи метаболічної активації, так і заїї відсутності. В якості альтернативи, коли використовуються типиклітин із внутрішньою метаболічною активністю, має бути відомо, щорівень та природа активності відповідає досліджуваному класухімічних речовин.
Умови тестування:
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Позитивні контрольні групи з використанням як сполуки прямоїдії, так і сполуки, що вимагає метаболічної активації, повиннібути включені у кожний експеримент, також потрібно використовуватинегативний контроль за середовищем.
Нижче наведено приклади речовин, що можуть використовуватисядля позитивного контролю:
- Хімічні речовини прямої дії:
- Етилметансульфонат,
- бета-пропіолактон.
- Сполуки, які потребують метаболічної активації:
- 2-ацетиламінофлуорен,
- 4-диметиламіноазобензен,
- 7,12-диметилбензантрацен.
Якщо це є доцільним, потрібне включення додатковогопозитивного контролю для того самого хімічного класу, що йсполука, яка тестується.
Концентрація для впливу
Потрібно використовувати декілька концентрацій досліджуваноїречовини. Ці концентрації мають призводити до токсичних впливів,пов'язаних з концентрацією, найвища концентрація, що спричиняєнизький рівень виживання, а показник виживання при найнижчійконцентрації є приблизно таким самим, як і у негативнійконтрольній групі. Відносно нерозчинні в воді речовини потрібновипробовувати до межі розчинності з використанням відповіднихпроцедур. Для нетоксичних речовин, що вільно розчиняються у воді,найвища концентрація досліджуваної речовини визначається длякожного окремого випадку.
Процедура
Клітини повинні піддаватись впливу на відповідний період часув залежності від системи випробування, що використовується, і вцей період може входити повторне введення дози, якесупроводжується зміною середовища (і, за необхідності,приготуванням свіжої суміші для метаболічної активації), якщоперіод впливу подовжується. Клітини без достатньої внутрішньоїметаболічної активності повинні піддаватись впливу досліджуваноїречовини як в присутності відповідної системи метаболічноїактивації, так і за її відсутності. По закінченні періоду впливу зклітин змивають досліджувану речовину та вирощують культури,забезпечуючи умови, потрібні для появи трансформованого фенотипу,що спостерігається, та визначеного ступеню трансформацій. Всірезультати підтверджуються шляхом незалежного експерименту.
2. ДАНІ
Дані мають бути представлені у формі таблиці і можутьвідображатися у різних формах, в залежності від методу аналізу,який використовується, наприклад, чашкові підрахунки, позитивнічашки або кількість трансформованих клітин. Де це доцільно,виживання виражається у відсотковому співвідношенні контрольнихрівнів, а частота трансформацій - як кількість трансформантів накількість одиниць, що вижили. Дані слід оцінювати, використовуючивідповідний статистичний метод.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має міститинаступну інформацію:
- тип клітин, що використовувались, кількість клітиннихкультур, методи збереження клітинних культур,
- умови тестування: концентрація досліджуваної речовини,використане середовище, тривалість інкубації, тривалість тачастота введення, щільність клітин під час дії речовини, типвикористаної системи екзогенної метаболічної активації, позитивніта негативні контрольні групи, специфікація фенотипу, щоспостерігається, використана система відбору (якщо це єдоцільним), обґрунтування вибору дози,
- методи, використані для підрахунку кількості життєздатнихта трансформованих клітин,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.22. ТЕСТ НА ДОМІНУВАННЯ
ЛЕТАЛЬНИХ НАСЛІДКІВ У ГРИЗУНІВ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Домінування летальних наслідків спричиняє смерть ембріону абозародку. Індукція домінування летальних наслідків через впливхімічної речовини означає, що речовина спричинила пошкодженнязародкової тканини піддослідних видів. Те, що домінуваннялетальних наслідків обумовлено хромосомними пошкодженнями,(структурними та кількісними аномаліями), є загальноприйнятимфактом. Смерть ембріону при введенні речовини самицям також можебути результатом токсичних впливів.
Як правило, самців піддають впливу досліджуваної сполуки, апотім вони спарюються з незаплідненими самицями, яким не вводилиречовину. Різні зародкові цикли клітини можуть досліджуватисьокремо з використанням послідовних інтервалів між спарюваннями.Збільшення кількості мертвих імплантатів на самицю в піддосліднійгрупі по відношенню до мертвих імплантатів на самицю в контрольнійгрупі відображає постімплантаційну втрату. Передімплантаційнавтрата може оцінюватись, засновуючись на підрахунку жовтих тіл абона порівнянні загальної кількості імплантатів на самицю впіддослідній та контрольній групах. Загальне домінування летальнихнаслідків є сукупністю перед- та післяімплантаційних втрат.Підрахунок загального домінування летальних наслідків засновуєтьсяна порівнянні кількості імплантатів на самицю в піддослідній групіпо відношенню до живих імплантатів на самицю у контрольній групі.Зменшення кількості імплантатів у певних інтервалах може бутирезультатом лізису клітин (тобто, сперматоцитів та/абосперматогоніїв).
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Підготовка
Якщо це можливо, досліджувані речовини слід розчинити абодовести до стану суспензії за допомогою ізотонічногофізіологічного розчину. Хімічні речовини, які є нерозчинними уводі, можна розчинити або довести до стану суспензії за допомогоювідповідного середовища. Використане середовище не має яквзаємодіяти з досліджуваною хімічною речовиною, так і спричинятитоксичних впливів. Слід застосовувати свіжі препаратидосліджуваної хімічної речовини.
Умови тестування:
Маршрут введення
Досліджувана сполука, як правило, може вводитися тільки одинраз. Може застосовуватись і повторний графік введення, щозасновується на токсикологічній інформації. Звичайними шляхамивведення є пероральна інтубація або інтраперитонеальна ін'єкція.Можуть бути доцільними інші шляхи введення.
Піддослідні тварини
Дослідження рекомендується проводити на мишах або щурах.Здорових і повністю статевозрілих тварин відбирають навмання ірозподіляють в піддослідну і контрольну групи.
Кількість і стать
Повинна використовуватись достатня кількість піддосліднихсамців, беручи до уваги спонтанні варіації біологічного характеру,що оцінюються. Обрана кількість має ґрунтуватись на заздалегідьвизначеній чутливості до виявлення та силі значущості. Наприклад,у типовому тесті кількість самців у кожній групі в залежності віддози повинна бути достатньою для забезпечення запліднення від30 до 50 самиць за інтервал спарювання.
Використання негативних і позитивних контрольних груп
Як правило, паралельні позитивні та негативні контрольнігрупи (за середовищем) мають входити до складу кожногоексперименту. Якщо прийнятні результати позитивної контрольноїгрупи отримані в результаті раніше проведених у тій самійлабораторії експериментів, ці результати можна використати замістьпаралельної позитивної контрольної групи. Речовини для позитивногоконтролю для демонстрації чутливості до тесту слід використовуватиу відповідному низькому дозуванні (наприклад, ММСвнутрішньобрюшинно, 10 мг/кілограм).
Рівні дозування
Зазвичай, слід використовувати три рівні впливу. Під дієювисокої дози у піддослідних тварин з'являються ознаки токсичностіабо зниженої фертильності. В певних випадках може бути достатньоодноразового введення дози високого рівня.
Тестування на граничний вміст
Нетоксичні речовини повинні випробовуватись у дозі5 мг/кілограм за одне введення або 1 г/кілограм/день,використовуючи повторювані введення.
Процедура
Є доступними декілька графіків введення речовини. Найчастішевикористовується одноразове введення досліджуваної речовини. Можнавикористати інші графіки введення.
Окремі самці послідовно спарюються з однією або двоманезаплідненими самицями, яким не вводили речовину, з відповіднимиінтервалами після введення речовини. Самиць потрібно залишити зсамцями принаймні на час одного естрального циклу або доспарювання, яке визначається наявністю сперми у вагіні або увагінальній пробці.
Кількість спарювань після введення речовини регулюєтьсяграфіком введення та має гарантувати, що з усіх зародкових циклівклітини після введення речовини буде взято зразки.
Самиць знищують у другій половині вагітності, а вміст маткидосліджують на предмет визначення кількості мертвих та живихімплантатів. Можливе проведення дослідження яєчників длявизначення кількості жовтих тіл.
2. ДАНІ
Дані мають бути внесені в таблицю таким чином, щобвідобразити кількість вагітних самців та кількість невагітнихсамиць. Про результати кожного спарювання, включаючи ідентичністькожного самця та самиці, потрібно повідомляти окремо. Щодо кожноїсамиці в тиждень спарювання потрібно фіксувати рівень дозування,отриманий самцями, частоту виявлення живих та мертвих імплантатів.
Підрахунок загального домінантного летального ефектузасновується на порівнянні кількості імплантатів на самицю впіддослідній групі по відношенню до живих імплантатів на самицю вконтрольній групі. Співвідношення кількості мертвих і живихімплантатів в піддослідній групі порівняно з тим самимспіввідношенням у контрольній групі аналізується з метоювизначення постімплантаційних втрат.
Якщо дані фіксуються із зазначенням смертності на ранніх тана пізніх стадіях, це має бути чітко відображено у таблицях. Якщооцінюється передімплантаційна втрата, це має бути відображено узвіті. Передімплантаційна втрата може розраховуватись як різницяміж кількістю жовтих тіл та кількістю імплантатів або як зменшеннясередньої кількості імплантатів на матку в порівнянні з данимиконтрольної групи.
Дані оцінюють, використовуючи відповідні статистичні методи.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУВАННЯ
За можливості звіт про проведення тестування має міститинаступну інформацію:
- біологічні види, штам, вік та вага використовуваних тварин,кількість тварин кожної статі в експериментальній і контрольнійгрупах,
- досліджувана речовина, середовище, досліджені рівнідозування та обґрунтування вибору дози, позитивні та негативніконтрольні групи, дані щодо токсичності,
- шлях та графік введення,
- графік спарювання,
- метод, що використовується для визначення того, щоспарювання вже відбулося,
- час знищення,
- критерії для оцінки домінування летальних наслідків,
- співвідношення дози і реакції, у випадку застосування,
- статистичну оцінку,
- обговорення результатів,
- інтерпретацію результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
B.23. ТЕСТ НА ХРОМОСОМНУ СПЕРМАТОГОНІАЛЬНУ
АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 483, Тест наХромосомну Сперматогоніальну Аберацію Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Метою тесту in vivo на хромосомну сперматогоніальну абераціює визначення тих речовин, які спричиняють структурні хромосомніаберації у сперматогоніальних клітинах ссавців (1)(2)(3).Структурні аберації можуть бути двох типів: хромосомні абохроматидні. При використанні більшості хімічних мутагенівспровоковані аберації належать до хроматидного типу, алетрапляються також аберації хромосомного типу. Цей метод булорозроблено не для вимірювання кількісних аберацій і, зазвичай, вінне використовується з цією метою. Хромосомні мутації та пов'язаніз ними явища є причиною багатьох генетичних хвороб людини.
Цей тест визначає хромосомні явища в сперматогоніальнихзародкових клітинах та, таким чином, очікується, що за допомогоюцього тесту можливо буде передбачити індукцію мутацій зародковихклітин, що передаються у спадок.
Зазвичай, для цього дослідження використовуються гризуни. Цейцитогенетичний тест in vivo визначає хромосомні аберації усперматогоніальних мітозах. Інші цільові клітини не є предметомданого методу.
Для визначення аберацій хроматидного типу усперматогоніальних клітинах, перший мітотичний поділ, щовідбувається після введення речовини, має досліджуватись до того,як ці ураження буде втрачено в процесі подальшого поділу клітин.Додаткову інформацію зі сперматогоніальних стволових клітин,підданих дії речовини, можна отримати шляхом аналізу хромосом уфазі мітозу на аберації хромосомного типу в діакінезі метафази I,коли піддані дії речовини клітини стають сперматоцитами.
Цей тест in vivo призначений виявити, чи мутагени соматичнихклітин також діють на зародкові клітини. Окрім того,сперматогоніальний тест є доцільним для оцінки мутагенної загрози,оскільки він дає змогу розглянути фактори метаболізму in vivo,фармакокінетику та процеси репарації ДНК.
Кількість поколінь сперматогоніїв є присутнім в сім'яниках зіспектром чутливості до впливу хімічних речовин. Таким чином,виявлені аберації являють собою загальну реакціюсперматогоніальних популяцій клітин, підданих дії речовини, здомінуванням більш численних диференційованих сперматогоніальнихклітин. В залежності від їх положення в сім'яниках різні поколіннясперматогоніїв можуть або не можуть стати об'єктом загальногокровообігу через фізичний або фізіологічний бар'єр з клітинСертолі та гемато-тестикулярний бар'єр.
Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивніметаболіти не досягнуть цільової тканини, проведення цьогодослідження не є доцільним.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Аберація хроматидного типу: структурне хромосомнепошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматидабо в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.
Аберація хромосомного типу: структурне хромосомнепошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утвореннірозривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.
Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, і змінімальним порушенням орієнтації хроматид.
Кількісна аберація: зміна кількості хромосом відноснохарактеристик нормальної кількості у використаних тварин.
Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) навідміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).
Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, щовизначається при мікроскопічному дослідженні метафазної стадіїподілу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій,внутрішнього або взаємного обміну.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючивідповідний шлях введення, і знищують у зазначений час післявтручання. Перед знищенням тварин піддають дії речовин, щоспричиняють блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) абоколхіцину). Потім виготовляють хромосомні препарати з зародковихклітин і зафарбовують їх, і метафазні клітини аналізують напредмет хромосомних аберацій.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин
Зазвичай, використовують самців мишей та китайських хом'яків.Проте, можливе використання самців інших придатних біологічнихвидів ссавців. Слід залучити для проведення тестувань лабораторнілінії здорових молодих дорослих тварин, що зазвичайвикористовуються. На початку дослідження коливання ваги тварин маєбути мінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги.
1.4.1.2. Умови утримання і годування
Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі,Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорових молодих дорослих самців призначають в піддосліднугрупу із застосуванням методу випадкового відбору. Клітки повиннірозташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи на їхмісце розташування. Тварини ідентифікуються окремо. Тваринпристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днівдо початку проведення дослідження.
1.4.1.4. Підготовка доз
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або довести достану суспензії за допомогою відповідного розчинника абосередовища і розбавити, якщо це є доцільним, перед обробкоюклітин. Рідкі досліджувані речовини можна ввести безпосередньо аборозбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препаратидосліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності невиявляють прийнятності зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Розчинник/середовище не повинне спричиняти токсичних впливівпри використаному рівні дозування, а також не має бути підозри нахімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною.Якщо використовується не добре відомі розчинники/середовища, їхвключення має підтверджуватись даними, що доводять їхнюсумісність. Рекомендується там, де можливо, використовуватиспочатку водний розчинник/середовище.
1.4.2.2. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (звикористанням розчинника або середовища) мають входити до складукожного тестування. За винятком введення досліджуваної речовини,за тваринами в контрольній групі доглядають так само, як і затваринами піддослідних груп.
Позитивні контрольні групи дають структурні хромосомніаберації in vivo в сперматогоніальних клітинах при введенні урівнях дозування, за яких очікувалося зростання по відношенню довихідних даних, яке можна виявити.
Концентрації для позитивних контрольних груп слід обиратитаким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щоб ідентичністькодованих мікроскопічних препаратів не одразу виявлялася пристроємдля зчитування.
Можливим є варіант введення речовини позитивній контрольнійгрупі іншим шляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потімзразок береться тільки один раз. Окрім того, за наявності, можерозглядатись застосування хімічної речовини, що використовуєтьсядля позитивного контролю з огляду на клас. До речовин дляпозитивного контролю належать:
------------------------------------------------------------------
| Речовина | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4 |
|Циклофосфаміду моногідрат | 6055-19-2 | |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклогексиламін | 108-91-8 | 203-629-0 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мономерний акриламід | 79-06-1 | 201-173-7 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Триетілнемеламін | 51-18-3 | 200-083-5 |
------------------------------------------------------------------
Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинникабо середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що ідосліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відборупроб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіативність іконцентрація клітин з хромосомними абераціями виявлена завдякиісторично встановленим даним з контролю. Окрім того, контрольнігрупи, що не піддавалися впливу досліджуваної речовини, тежповинні використовуватись, якщо немає історично встановлених абоопублікованих даних з контролю, що показують відсутність шкідливихта мутагенних впливів обраного розчинника.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість тварин
Кожна піддослідна і контрольна група має включати щонайменшеп'ять придатних до аналізу самців.
1.5.2. Графік введення
Досліджувані речовини переважно вводяться один раз або двічі(тобто за один або за два прийоми). Досліджувані речовини можутьтакож вводитися розділеною дозою, тобто робиться два введення утой самий день з перервою не більше, ніж у кілька годин, дляполегшення введення великого об'єму речовини. Інший графіквведення має бути науково виправданим.
Для групи з найвищою дозою потрібно два рази брати зразкипісля піддавання дії речовини. Оскільки на кінетику клітинногоциклу може впливати досліджувана речовина, потрібно зробити одинранній і один пізній забір зразків у часовому інтервалі від 24 до48 годин після піддавання дії речовини. У випадку використанняінших, крім найвищого, рівнів дозування, потрібно взяти зразкичерез 24 години або 1,5 тривалості клітинного циклу післяпіддавання дії речовини, якщо інший час забору зразків невважається більш доцільним для виявлення впливів(6).
Додатково можливе використання іншого часу для заборузразків. Наприклад, у випадку використання хімічних речовин, якіможуть викликати уповільнення хромосом, або можуть впливати наS-незалежні ефекти, можливо, буде доцільним інший час заборузразків(1).
Доцільність повторного графіку введення потрібно визначатидля кожного окремого випадку. Після застосування повторногографіку введення, тварин знищують через 24 години (1,5 тривалостіклітинного циклу) після останнього введення речовини. Можливевикористання додаткового забору зразків.
Перед знищенням тваринам вколюється внутрішьобрюшинновідповідна доза речовини, що спричиняє блокування метафази(наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Після того зразки зтварин беруться через відповідні інтервали часу. Для мишей цейінтервал складає приблизно від трьох до п'яти годин, длякитайських хом'яків - від чотирьох до п'яти годин.
1.5.3. Рівень дозування
Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немаєнаявних відповідних даних, воно має проводитися в тій самійлабораторії з використанням тих самих біологічних видів, ліній тарежиму введення, що використовувались у основному дослідженні(7).Якщо проявляється токсичність, для першого часу забору зразкавикористовується три рівні дозування. Ці рівні дозування повинніпокривати діапазон від максимальної до незначної токсичності абоїї відсутності. При подальшому заборі зразків потрібновикористовувати лише найвищу дозу. Найвища доза визначається якдоза, за якої з'являються такі ознаки токсичності, які при вищихрівнях дозування з дотриманням того самого режиму можутьспричинять смерть.
Речовини зі специфічними видами біологічної активності принизьких нетоксичних дозах (такі, як гормони та мітогени) можутьбути винятками з критеріїв встановлення дозування і маютьоцінюватись в окремих випадках. Найвища доза може такожвизначатися як доза, за якої з'являються деякі показникитоксичності у сперматогоніальних клітинах (наприклад, зменшенняспіввідношення сперматогоніальних мітозів у першій та другіймейотичних метафазах; це зменшення не має перевищувати 50%).
1.5.4. Тестування на граничний вміст
Якщо тестування на одному рівні дозування, який становитьщонайменше 2000 мг/кг маси тіла/день з використанням введення заодин раз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимихтоксичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається зогляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, невиникне необхідності в проведенні розгорнутого дослідження звикористанням трьох рівнів дозування. Очікуваний вплив на людинуможе визначати потребу в використанні вищого рівня дозування підчас тестування на граничний вміст.
1.5.5. Призначення доз
Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею,використовуючи зонд для штучного харчування або відповіднуінтубаційну трубку, або шляхом внутрішньобрюшинної ін'єкції. Іншішляхи введення можуть використовуватися, якщо вони є виправданими.Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз з їжею абоін'єкцією, залежить від розміру піддослідної тварини. Об'єм не маєперевищувати 2 мл/100 г маси тіла. Використання об'ємів, більшихза ці, має бути виправданим. За винятком подразнюючих чироз'їдаючих речовин, які, зазвичай, проявляють ускладнені впливипри більшій концентрації, варіативність досліджуваного об'ємупотрібно мінімізувати шляхом пристосування концентрації дозабезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозування.
1.5.6. Підготовка хромосом
Одразу після знищення тварини беруться клітинні суспензії зодного або обох тестів, піддаються впливу гіпотонічного розчину іфіксуються. Потім клітини розподіляються по поверхнімікроскопічних препаратів і зафарбовуються.
1.5.7. Аналіз
Потрібно проаналізувати щонайменше 100 метафаз, що добрерозрослися, на кожну тварину (мінімум 500 метафаз на групу). Їхкількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількістьаберацій. Всі мікроскопічні препарати, включаючи препаратипозитивної та негативної контрольних груп, повинні отриматинезалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедурифіксування часто призводять до розриву метафаз із втратоюхромосом, оцінені клітини повинні містити кількість центромерів,що дорівнює кількості 2n +- 2.
2. ДАНІ
2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Дані по кожній окремій тварині повинні бути представлені увигляді таблиць. Експериментальною одиницею вважається тварина.Для кожної окремої тварини необхідно оцінити кількість клітин зіструктурними хромосомними абераціями і кількість структурнихаберацій. Різні типи структурних хромосомних аберацій повинні бутизаписані з їхніми номерами і частотою аберацій для групи, щопроходила лікування і для контрольної групи. Різниця записуєтьсяокремо, але, як правило, не включається до загальної частотиаберацій.
При виявленні мітозу або мейозу, співвідношення міжсперматогеніальними мітозами і першою та другою мейотичнимиметафазами визначається як значення цитотоксичності для всіхтварин, що проходили лікування і тварин негативної контрольноїгрупи в зразку зі 100 клітин, що діляться, на одну тварину длявизначення можливого цитотоксичного ефекту. При виявленні мітозу,показник мітозу повинен складати принаймні 1 000 клітин на кожнутварину.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Існують декілька критеріїв, що визначають позитивнийрезультат, таких як, збільшення відносної кількості клітин зхромосомною аберацією в залежності від дози, або безпосереднєзбільшення клітин з абераціями в одній дозі під час відборуокремої проби. В першу чергу необхідно врахувати біологічнуактуальність результатів. Статистичні методи можутьвикористовуватись в якості допоміжних методів при оцінюваннірезультатів(8). Статистична значимість не повинна бути єдинимфактором, що визначає позитивний результат. Неоднозначнірезультати необхідно перевірити повторно, бажано за зміненихекспериментальних умов.
Дослідна речовина, для якої результати не відповідаютьвищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьомудосліді.
Не дивлячись на те, що більшість експериментів дає однозначнопозитивні або негативні результати, в незначній кількості випадківотримані дані виключають можливість зробити точний висновок щодоактивності дослідної речовини. Результати можуть залишатисьнеоднозначними або спірними незалежно від кількості повтореньдосліду.
Позитивні результати дослідження сперматогеніальноїхромосомної аберації в живому організмі показують, що досліднаречовина викликає структурні хромосомні аберації в статевихклітинах тварин, що досліджуються. Негативні результати показують,що за даних умов проведення досліду, дослідна речовина не викликаєструктурні хромосомні аберації в статевих клітинах тварин, щодосліджуються.
Вірогідність того, що дослідна речовина або її метаболітидосягнуть цільової тканини має бути обговорена.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕНИЙ ДОСЛІД
Звіт про проведений дослід повинен містити наступнуінформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника,
- розчинність та стабільність дослідної речовини врозчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Піддослідні тварини:
- породи/види, що використовувались,
- кількість і вік тварин,
- джерело, умови проживання, дієта, і т.ін.,
- вага кожної окремої тварини на початку досліду, включаючидіапазон ваги тіла, середнє і стандартне відхилення для кожноїгрупи.
Умови досліду:
- дані дослідження з пошуку діапазону доз, якщо такепроводилось,
- обґрунтування вибору дозування,
- обґрунтування способу вживання,
- опис приготування дослідної речовини,
- опис способу вживання дослідної речовини,
- обґрунтування часу на умертвіння піддослідної тварини,
- перехід від концентрації дослідної речовини для дієти/пиття(ppm) до дійсної дози (мг/кг від ваги тіла/день), якщозастосовується,
- дані щодо якості їжі і пиття,
- детальний опис графіку прийому і відбору зразків,
- метод вимірювання токсичності,
- ідентифікація речовини, що зупиняє метафазу, їїконцентрація і період лікування,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- критерії оцінювання аберацій,
- кількість клітин, що аналізувались по кожній тварині,
- критерії оцінювання результатів як позитивних, негативнихабо неоднозначних.
Результати:
- ознаки токсичності,
- індекс частоти мітозів,
- співвідношення клітин зі сперматогеніальним мітозом допершої і другої мейотичної метафаз,
