Хоча ця стратегія досліджень не є складовою частиною методутестування B.5, вона виражає рекомендований підхід до визначеннявластивостей подразнення/роз'їдання ока. Цей підхід являє собою якнайкраще практичне втілення, так і етичний критерій для проведеннявипробувань подразнення/роз'їдання ока in vivo. Метод випробуваннянадає інструкції щодо проведення випробування in vivo і підсумовуєфактори, на які слід звернути увагу перед розглядом такоговипробування. Стратегія послідовних випробувань забезпечує підхідз точки зору вагомих доказів до оцінки існуючих даних щодовластивостей подразнення/роз'їдання ока речовинами і поступовийпідхід до генерації відповідних даних, для яких потрібні додатковідослідження або щодо яких не проводилося досліджень. Стратегіявключає в себе спочатку застосування затверджених і прийнятихвипробувань in vitro або ex vivo, а потім метод випробування B.4,дослідження подразнення/роз'їдання шкіри за специфічнихумов (3)(4).
ОПИС ПОЕТАПНОГО ПІДХОДУ ДО ДОСЛІДЖЕННЯ
Перш ніж проводити випробування як складову частину стратегіїпослідовних випробувань (малюнок), необхідно оцінити всю наявнуінформацію з метою визначення необхідності в випробуванні на оціin vivo. Хоча важливу інформацію можна отримати з оцінки одиничнихпараметрів (наприклад, максимальний pH), необхідно оцінитисукупність наявної інформації. Всі релевантні дані щодо впливівдосліджуваної речовини та її структурних аналогів необхіднооцінювати при прийнятті рішення про вагомість доказів, а такожнеобхідно навести обґрунтування цього рішення. Особливий наголоснеобхідно зробити на існуванні даних про вплив речовини на людинуі на тварину, результатом чого буде проведення дослідженняin vitro або ex vivo. За можливості, слід уникати дослідженькорозійних речовин in vivo. Фактори, що беруться до уваги встратегії випробувань, включають:
Оцінку існуючих даних щодо людини і тварини (Крок 1). Існуючідані щодо людини, наприклад, клінічні та професійні дослідження, атакож судові звіти та/або дані про випробування на тваринах здосліджень ока слід розглядати в першу чергу, тому що вони надаютьінформацію, що стосується безпосередньо впливу на очі. Надалінеобхідно оцінити дані, наявні з досліджень на людях та/аботваринах, що вивчають роз'їдання/подразнення шкіри. Речовини звідомим ступенем роз'їдаючої активності або сильним подразнюючимвпливом на очі не слід ні вводити в очі тваринам, ні наноситиречовини, що мають роз'їдаючий або подразнюючий вплив на шкіру,такі речовини слід вважати роз'їдаючими та/чи подразнюючими.Речовини, щодо яких вже отримано достатньо доказів відсутностіроз'їдання та подразнення в ході попередніх досліджень на оці, непотрібно випробовувати за допомогою досліджень на оці in vivo.
Аналіз відносин структурної активності (ВСА) (Крок 2)Результати випробувань структурно пов'язаних хімікатів маютьрозглядатися за наявності. За наявності достатньої кількості данихщодо досліджень впливу структурно пов'язаних речовин або сумішітаких речовин на людину та/або тварину, що показує їх потенціалроз'їдання/подразнення ока, можна припустити, що досліджуванаречовина спровокує такі самі реакції. В таких випадках немаєнеобхідності у випробуванні речовини. Негативні дані, отримані вході досліджень структурно подібних речовин або суміші такихречовин, не є достатнім доказом відсутностіроз'їдаючої/подразнюючої активності речовини згідно стратегіїпослідовних випробувань. Для визначення потенціалу впливуподразнення та роз'їдання як шкіри, так і очей, слідвикористовувати підходи, затверджені і прийняті ВСА.
Фізико-хімічні властивості та хімічна реактивність (Крок 3).Речовини, що виявляють екстремальний рівень pH, такий як <= 2,0або >= 11,5, можуть мати сильний локальний вплив. Якщоекстремальний рівень pH є підґрунтям для ідентифікації речовини якроз'їдаючої або подразнюючої око, то її кислотний/лужний резерв(здатність до буферизації) також можна брати до уваги (5)(6). Якщоздатність до буферизації дозволяє зробити припущення, що речовинаможе не бути роз'їдаючою для ока, на підтвердження цього необхіднопровести подальші дослідження; перевага надається використаннюзатверджених і прийнятих досліджень in vitro або ex vivo (див.Розділи Крок 5 та 6).
Розгляд іншої існуючої інформації (Крок 4). На цьому етапінеобхідно оцінити всю наявну інформацію щодо системної токсичностічерез шкіру. Гостру шкірну токсичність досліджуваної речовинитакож необхідно брати до уваги. Якщо досліджувана речовинавиявилася дуже токсичною для шкіри, її не потрібно випробовуватина оці. Хоча не обов'язково існує зв'язок між токсичністю дляшкіри та подразненням/роз'їданням ока, можна припустити, що, якщореагент є дуже токсичним для шкіри, він також виявлятиме високутоксичність при введенні в око. Ці дані також необхідно брати доуваги між Кроками 2 та 3.
Результати випробувань in vitro або ex vivo (Кроки 5 та 6).Речовини, які виявили роз'їдаючі або сильні подразнюючівластивості під час випробувань in vitro або ex vivo (7)(8), табули затверджені і прийняті для оцінки саме роз'їдаючоїактивності/подразнення для очей або шкіри, не слід випробувати натваринах. Можна припустити, що досліджувана речовина матимеподібні сильні впливи in vivo. За відсутності затверджених іприйнятих до оцінки досліджень in vitro/ex vivo, слід пропуститиКроки 5 та 6, і переходити одразу до Кроку 7.
Оцінка потенціалу речовини викликати подразнення абороз'їдання (Крок 7). Якщо існує недостатньо доказів, що базуютьсяна вищезазначених дослідженнях, для здійснення підсумковогоаналізу вагомих доказів потенційного подразнюючого/роз'їдаючоговпливу речовини на очі, спочатку слід оцінити потенціалподразнення/роз'їдання шкіри in vivo, використовуючи методвипробування B.4 (4) і супроводжуючий Додаток (9). Якщо виявилося,що речовина спричиняє роз'їдання або сильне подразнення шкіри, їїслід вважати роз'їдаючою і подразнюючою око, якщо інша інформаціяне підтверджує альтернативного висновку. Таким чином, може не бутипотреби в проведенні досліджень на оці in vivo. Якщо речовина не єроз'їдаючою або сильно подразнюючою для шкіри, необхідно здійснитидослідження на оці in vivo.
Випробування in vivo на кроликах (Кроки 8 та 9): Дослідженняна оці in vivo слід починати з використанням однієї тварини. Якщорезультати випробування показують, що речовина є роз'їдаючою абовикликає сильне подразнення ока, подальші дослідженняподразнюваності ока необхідно припинити. Якщо це випробування невиявило роз'їдаючого або сильного подразнюючого ефекту,проводиться підтверджувальне випробування з використанням двохдодаткових тварин.
ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Reportof the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and AcceptanceCriteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held inSolna, Sweden, 22-24 January 1996(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard ClassificationSystem for Human Health and Environmental Effects of ChemicalSubstances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the ChemicalsCommittee and the Working Party on Chemicals, November 1998(http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approachfor Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161-177.
(4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermalirritation/corrosion.
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H.,(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin ofPreparations Containing Acidic or Alkaline Substance WithoutTesting on Animals. Toxicolohy In Vitro, 27, p. 19-26.
(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the EyeIrritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J.Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. andLiebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on invitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by theManagement Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(9) Appendix to Testing method B.4: A Sequential TestingStrategy for Skin Irritation and Corrosion.
Малюнок
ДОСЛІДЖЕННЯ І СТРАТЕГІЯ ОЦІНЮВАННЯ
ПОДРАЗНЕННЯ/РОЗ'ЇДАННЯ ОКА
Вид діяльності Отриманий Висновок
---------------------
1 |Існуючі дані про | Серйозні ушкодження Максимальне граничне значення;
|впливи на очі | очей вважати роз'їдаючою для очей.
|людини та/або | Дослідження непотрібні.
|тварини |
| | Подразнююча для ока Максимальне граничне значення;
| | вважати подразнюючою для очей.
| | Дослідження непотрібні.
| |
| | Не роз'їдає/не Максимальне граничне значення;
| | подразнює око вважати не роз'їдаючою/не
| | подразнюючою для очей.
| | Дослідження не вимагаються.
| |
|Існуючі дані про | Роз'їдає шкіру Припускаємо роз'їдаючу
|роз'їдаючі впливи | активність щодо очей.
|на шкіру людини | Дослідження непотрібні.
|та/або тварини |
| |
|Існуючі дані про | Сильно подразнює Припускаємо подразнюючу
|сильні подразнюючі | шкіру активність щодо очей.
|впливи на шкіру | Дослідження непотрібні.
|людини та/або |
|тварини |
---------------------
|
\/
немає доступної інформації, або
доступна інформація непереконлива
|
|
\/
---------------------
2 |Продемонструвати | Передбачаються Припускаємо роз'їдаючу
|ВСА для | серйозні ушкодження активність щодо очей.
|роз'їдання/ | очей Дослідження непотрібні.
|подразнення очей |
| |
| | Передбачаються Припускаємо подразнюючу
| | подразнення очей. активність щодо очей.
| | Дослідження непотрібні.
| |
| |
|Продемонструвати | Передбачається Припускаємо роз'їдаючу
|ВСА для роз'їдання | роз'їдання шкіри активність щодо очей.
|шкіри | Дослідження непотрібні.
---------------------
\/
Неможливо зробити припущення, або
припущення не є переконливими чи
є негативними
|
\/
---------------------
3 |Виміряти pH | pH <= 2 або >= 11,5 Припускаємо роз'їдаючу
|(здатність до | (з високою здатністю активність щодо очей.
|буферизації, за | до буферизації, Дослідження непотрібні.
|необхідності) | якщо потрібно)
---------------------
|
\/
2 < pH < 11,5, або pH <= 2,0 або >= 11,5
з відсутньою/низькою здатністю до
буферизації, за необхідності
|
|
\/
---------------------
4 |Оцінити системну | Дуже токсична в Речовина була б дуже
|токсичність через | концентраціях, що токсичною для досліджень
|вплив на шкіру | використовувалися б на очах.
--------------------- для досліджень на оці Дослідження непотрібні.
|
\/
Така інформація недоступна,
або речовина не дуже токсичною
|
\/
---------------------
5 |Виконати | Реакція роз'їдання Припускаємо роз'їдаючу
|затверджене і | активність щодо очей.
|прийняте | Дослідження непотрібні.
|дослідження |
|роз'їдання очей in |
|vitro або ex vivo. |
---------------------
|
\/
Речовина не роз'їдаюча, або
затверджені методи досліджень
роз'їдання очей in vitro або
ex vivo не є доступними.
|
|
\/
---------------------
6 |Виконати | Реакція подразнення Припускаємо подразнюючу
|затверджене і | активність щодо очей.
|прийняте | Подальші дослідження
|дослідження | непотрібні
|подразнення очей |
|in vitro або |
|ex vivo. |
---------------------
|
\/
Речовина не подразнююча,
або затверджені методи досліджень
роз'їдання очей in vitro або ex vivo
не є доступними
|
\/
---------------------
7 |Експериментально | Реакція роз'їдання Припускаємо роз'їдаючу
|оцінити потенціал | або сильного активність щодо очей.
|подразнення/ | подразнення Подальші дослідження
|роз'їдання шкіри | непотрібні.
|in vivo (див. метод|
|дослідження В.4, |
|включаючи Додаток) |
---------------------
|
\/
Речовина не є роз'їдаючою
або не викликає сильних
подразнень шкіри
|
\/
---------------------
8 |Виконати початкове | Сильні ушкодження Вважаємо роз'їдаючою
|дослідження на оці | очей для очей. Подальші
|кролика in vivo з | дослідження непотрібні.
|використанням |
|однієї тварини |
---------------------
|
\/
Немає значних ушкоджень
або відсутня реакція
|
|
\/
---------------------
9 |Виконати | Роз'їдаюча або Вважаємо роз'їдаючою
|підтверджувальне | подразнююча. або подразнюючою для очей.
|дослідження з | Подальші дослідження
|використанням | непотрібні.
|однієї або двох |
|додаткових тварин | Не роз'їдаюча або Вважаємо не роз'їдаючою або
--------------------- не подразнююча. не подразнюючою для очей.
Подальші дослідження
непотрібні.
B.6. СЕНСИБІЛІЗАЦІЯ ШКІРИ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Зауваження
Чутливість і можливість проведення досліджень для визначенняможливих сенсибілізаторів людської шкіри вважаються важливими всистемі класифікації токсичності по відношенню до здоров'я людини.
Немає єдиного методу дослідження, який би адекватно визначаввсі речовини з потенціалом сенсибілізації людської шкіри іпідходив би для всіх речовин.
Такі фактори, як фізичні властивості речовини, включаючи їїздатність проникати крізь шкіру, слід враховувати при виборідослідження. Було розроблено два види досліджень з використаннямморських свинок: випробування на тип ад'юванту, під час якогоалергічний стан підсилюється розчиненням чи заміною досліджуваноїречовини на повний ад'ювант Фрейнда (ПАФ), та неад'ювантнівипробування.
Випробування на тип ад'юванту можуть бути більш точними впередбаченні можливого сенсибілізаційного ефекту на шкіру людини,спричиненого речовиною, ніж методи без використання повногоад'юванту Фрейнда, та їм, таким чином, надається перевага.
Тест на максимізацію морських свинок (ТММС) є широковикористовуваним випробуванням на тип ад'юванту. Хоча длявизначення потенціалу речовини викликати реакцію сенсибілізаціїшкіри використовується декілька інших методів, ТММС вважаєтьсякращою ад'ювантною технікою.
За наявності багатьох класів хімічних речовин неад'ювантнівипробування (одним з кращих вважається тест Бюхлера) вважаютьсяменш чутливими.
В певних випадках можуть бути підстави для вибору тестуБюхлера з для місцевого застосування, а не інтрадермальнаін'єкція, що використовується для тесту на максимізацію морськихсвинок. Для використання тесту Бюхлера потрібно надавати науковеобґрунтування.
Тест на максимізацію морських свинок (ТММС) та тест Бюхлераописані в цьому методі. Можливе використання інших методів заумови, якщо вони є затвердженими і науково обґрунтованими.
Якщо в ході офіційно визнаного скринінг-тесту отриманопозитивний результат, досліджувана речовина може бути позначена якпотенційний сенсибілізатор, і проведення подальших випробувань наморських свинках не буде необхідним. Проте, якщо результативипробування негативні, випробування на морських свинках необхіднопроводити, використовуючи процедуру, описану в цьому методідосліджень.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Сенсибілізація шкіри: (алергічний контактний дерматит)імунологічно опосередкована реакція шкіри на речовину. У людиниреакції можуть бути виражені наступним чином: свербінням,еритемою, набряком, папулами, пухирцями, здуттями або поєднаннямцих проявів. У інших біологічних видів реакції можутьвідрізнятися, і може проявитися тільки еритема та набряк.
Піддавання впливу індукції: експериментальне піддаванняоб'єкта впливу досліджуваної речовини з наміром спровокуватинадчутливий стан.
Період індукції: період тривалістю принаймні один тижденьпісля піддавання впливу індукції, впродовж якого може розвиватисянадчутливий стан.
Піддавання впливу провокаційної проби: експериментальнепіддавання попередньо розглянутого об'єкту впливу досліджуваноїречовини після періоду індукції з метою визначення того, чивиникає в об'єкта реакція гіперчутливості.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Чутливість і надійність використаної експериментальноїтехніки слід оцінювати кожні шість місяців шляхом використанняречовин, відомих своїми м'якими або помірними властивостямисенсибілізації шкіри.
Якщо тест проведено правильно, для м'яких/помірнихсенсибілізаторів очікується реакція принаймні 30% при ад'ювантномудослідженні і принаймні 15% при неад'ювантному дослідженні.
Перевага надається наступним речовинам.
--------------------------------------------------------------------------------
|Номери РСХ|Номери ЄРІКХР| Назви ЄРІКХР | Загальноприйняті назви |
|----------+-------------+--------------------------+--------------------------|
| 101-86-0 | 202-983-3 |альфа-гексилсиннамальдегід|альфа-гексилсиннамальдегід|
|----------+-------------+--------------------------+--------------------------|
| 149-30-4 | 205-736-8 | Бензотіазол-2-тіол | каптакс |
| | | (меркатобензотіазол) | |
|----------+-------------+--------------------------+--------------------------|
| 94-09-7 | 202-303-5 | Бензокаїн | норкаїн |
--------------------------------------------------------------------------------
Є обставини, за яких, при умові відповідного обґрунтування,можуть використовуватись інші контрольні речовини, що відповідаютьвищенаведеним критеріям.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЬ
Піддослідні тварини спочатку піддаються впливу досліджуваноїречовини шляхом інтрадермальної ін'єкції та/або епідермальногозастосування (піддавання впливу індукції). Після періодувідпочинку від 10 до 14 днів (періоду індукції), під час якогоможе проявитися імунна реакція, тварині вводиться дозапровокаційної проби. Міра і ступінь реакції шкіри на піддаваннявпливу провокаційної проби у піддослідних тварин порівнюється зреакціями, що виявилися у контрольної групи тварин, що піддавалисясимулятивному лікуванню під час індукції і отримали провокаційнупробу.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕНЬ
Якщо вважається необхідним усунення досліджуваної речовини,це необхідно зробити, використовуючи воду чи відповідний розчинникбез видозмін існуючої реакції або цілісності епідермісу.
1.5.1. Тест на максимізацію морських свинок (ТММС)
1.5.1.1. Підготовка
Здорових молодих дорослих альбіносів морських свинокадаптують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днівперед тестом проведенням тесту. Перед тестом тварин відбираютьметодом рандомізації і призначають в певну групу. Хутро видаляютьшляхом підстригання, гоління або хімічної епіляції, в залежностівід використаного методу дослідження. Необхідно подбати про те,щоб уникнути потертості шкіри. Тварин зважують до початку тесту тапісля його завершення.
1.5.1.2. Умови проведення тесту
1.5.1.2.1. Піддослідні тварини:
Зазвичай використовуються лабораторні види альбіносівморських свинок.
1.5.1.2.2. Кількість і стать
Можливе використання тварин чоловічої та/або жіночої статі.Якщо використовуються тварини жіночої статі, вони мають бути невагітними і такими, що ніколи не народжували.
Використовується мінімум 10 тварин у піддослідній групі іщонайменше п'ять тварин в контрольній групі. Якщо для проведеннятесту було використано менш ніж 20 морських свинок у піддосліднійгрупі і менш ніж 10 - у контрольній, і висновок про те, щодосліджувана речовина є сенсибілізатором, зробити неможливо,наполегливо рекомендується проведення тестування на додатковихтваринах в кількості щонайменше 20 тварин у піддослідній групі і10 - у контрольній.
1.5.1.2.3. Рівні дозування
Концентрація досліджуваної речовини, використаної для кожногопіддавання впливу індукції, має систематично добре переноситися імає бути найвищою для спричинення м'якого або помірногоподразнення шкіри. Концентрація, використана для піддавання впливупровокаційної проби, має складати найвищу дозу, яка не викликаєподразнення. У випадку відсутності іншої інформації відповідніконцентрації слід визначати за допомогою пілотного дослідження звикористанням двох або трьох тварин. З цією метою слід вирішитипитання про використання тварин, які піддавалися впливу ПАФ.
1.5.1.3. Процедура
1.5.1.3.1. Індукція
0-й день - піддослідна група
Робиться три пари інтрадермальних ін'єкцій об'ємом 0,1 мл вплечову зону, очищену від хутра таким чином, що кожна парарозташована по кожній стороні середньої лінії.
Ін'єкція 1: суміш 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/водаабо фізіологічний розчин.
Ін'єкція 2: Досліджувана речовина з відповідним розчинником увибраній концентрації.
Ін'єкція 3: Досліджувана речовина у вибраній концентрації,складеній в пропорції 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/водаабо фізіологічний розчин.
Для ін'єкції 3 розчинні в воді речовини розчиняються у воднійфазі перед змішуванням з ПАФ. Жиророзчинні або нерозчинні речовиниусуваються з ПАФ перед поєднанням з водною фазою. Остаточнаконцентрація досліджуваної речовини повинна дорівнюватиконцентрації, що була використана для ін'єкції 2.
Ін'єкції 1 та 2 робляться поряд одна з одною і якомога ближчедо голови, в той час, як третя робиться біля хвостової частинизони тестування.
0-й день - контрольна група
Робиться три пари інтрадермальних ін'єкцій об'ємом 0,1 мл вту ж саму зону, що й у тварин піддослідної групи.
Ін'єкція 1: суміш 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/водаабо фізіологічний розчин.
Ін'єкція 2: нерозбавлений розчинник.
Ін'єкція 3: 50% розчинника по відношенню ваги до об'єму всуміші 1:1 (в об'ємному співвідношенні) ПАФ/вода або фізіологічнийрозчин.
Дні 5-7 - піддослідна та контрольна групи
Приблизно за 24 години до місцевого застосування індукції,якщо речовина не подразнює шкіру, зона випробувань, післяпідстригання коротко та/або гоління хутра обробляється 0,5 млрозчиненого у вазеліні 10%-го лаурилсульфату соди для створеннямісцевої реакції подразнення.
6-й - 8-й день - піддослідна група
У зоні тестування знову видаляється хутро. Фільтрувальнийпапір (2 х 4 см) повністю заповнюється досліджуваною речовиною звідповідним розчинником і застосовується до зони дослідження, ідалі утримується в контакті за допомогою оклюзійної пов'язкипротягом 48 годин. Вибір розчинника має бути обґрунтованим. Твердіречовини подрібнюються в порошок і поміщаються у відповіднийрозчинник. Рідини можуть застосовуватись нерозбавленими, якщо це єдоцільним.
6-й - 8-й день - контрольна група
У зоні тестування знову видаляється хутро. Розчинникзастосовується подібним чином до зони дослідження, і даліутримується в контакті за допомогою оклюзійної пов'язки протягом48 годин.
1.5.1.3.2. Провокаційна проба
Дні 20-22 - піддослідна та контрольна групи
З боків тварин з піддослідної та контрольної групивидаляється хутро. Латка або камера, наповнена досліджуваноюречовиною, прикладається до одного боку тварини і, якщо потрібно,латка або камера, наповнена тільки розчинником, також можеприкладатися до іншого боку. Латки утримуються в контакті задопомогою оклюзійної пов'язки протягом 24 годин.
1.5.1.3.3. Спостереження і класифікація: піддослідна таконтрольна групи
- приблизно через 21 годину після усунення латки, зонапровокаційної проби очищується і коротко обстригається та/абоголиться, та за необхідності проводиться її епіляція;
- приблизно через три години після цього (приблизно через48 годин від початку проведення провокаційної проби)спостерігається реакція шкіри, яка фіксується згідно зкласифікацією, наведеною у Додатку;
- приблизно через 24 години після цього спостереженняпроводиться наступне спостереження (72 години), яке зновуфіксується.
Схвалюється застосування методу сліпого зчитування даних протварин з піддослідної та контрольної групи.
Якщо необхідно прояснити результати, отримані післяпроведення першої провокаційної проби, можливий варіант проведеннядругої провокаційної проби (так званої повторної проби), занеобхідності, з використанням нової контрольної групи, приблизночерез тиждень після проведення першої проби. Повторна проба такожможе проводитися на первісній контрольній групі.
Всі реакції шкіри і будь-які незвичні відчуття, включаючисистемні реакції, що є результатом індукції і процедури проведенняпровокаційної проби необхідно спостерігати і фіксувати згіднокласифікаційної шкали Магнуссона/Клігмана (див. Додаток). Дляпрояснення сумнівних реакцій можуть проводитися інші процедури,наприклад, гістопатологічне дослідження, вимірювання товщинишкірної складки.
1.5.2. Тест Бюхлера
1.5.2.1. Підготовка
Здорових молодих дорослих альбіносів морських свинокадаптують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днівперед проведенням тесту. Перед проведенням тесту тварин відбираютьметодом рандомізації і призначають в певну групу. Хутро видаляютьшляхом підстригання, гоління або хімічної епіляції, в залежностівід використаного методу дослідження. Необхідно подбати про те,щоб уникнути потертості шкіри. Тварин зважують до початку тесту тапісля його завершення.
1.5.2.2. Умови проведення тесту
1.5.2.2.1. Піддослідні тварини:
Зазвичай використовуються лабораторні види альбіносівморських свинок.
1.5.2.2.2. Кількість і стать
Можливе використання тварин чоловічої та/або жіночої статі.Якщо використовуються тварини жіночої статі, вони мають бути невагітними і такими, що ніколи не народжували.
Використовується мінімум 20 тварин в піддослідній групі іщонайменше 10 тварин в контрольній групі.
1.5.2.2.3. Рівні дозування
Концентрація досліджуваної речовини, використаної для кожногопіддавання впливу індукції, має бути найвищою з можливих для того,щоб викликати м'яке але не надмірне подразнення. Концентрація,використана для піддавання впливу провокаційної проби, маєскладати найвищу не подразнюючу дозу. За необхідності відповіднуконцентрацію можна визначати за допомогою пілотного дослідження звикористанням двох або трьох тварин.
Для розчинних в воді досліджуваних матеріалів слідвикористовувати воду або розбавлений не подразнюючий розчин ПАР вякості розчинника. Для інших досліджуваних матеріалів надаєтьсяперевага використанню 80% етанолу/води для індукції і ацетону дляпровокаційної проби.
1.5.2.3. Процедура
1.5.2.3.1. Індукція
0-й день - піддослідна група
Один бік очищується від хутра (коротко обстригається).Система латок для випробування має бути повністю наповненадосліджуваною речовиною із відповідним розчинником (вибіррозчинника має бути виправданим; рідкі досліджувані речовиниможуть використовуватися нерозбавленими, якщо це є доцільним).
Система латок для випробування прикріплюється до зонидослідження, і далі утримується в контакті за допомогою оклюзійноїлатки або камери та відповідної пов'язки протягом шести годин.
Система латок для випробування повинна бути оклюзійною.Підходить бавовняна підкладка, яка може бути круглою абоквадратною, розміром приблизно 4-6 кв.см. Перевага надаєтьсяпристосуванню для стримування з використанням відповідногофіксатора з метою забезпечення оклюзії. Якщо використовуєтьсяобгортання, є можливість виникнення потреби в додатковому впливі.
0-й день - контрольна група
Один бік очищується від хутра (коротко обстригається). Тількирозчинник застосовується в подібний до використаного дляпіддослідної групи спосіб. Система латок для випробуванняприкріплюється до шкіри за допомогою оклюзійної латки або камерита відповідної пов'язки на шість годин. Якщо є можливістьвиявлення відсутності потреби в симулятивній контрольній групі,можна використати незаражену контрольну групу.
Дні 6-8 та 13-15 - піддослідна та контрольна групи
Те ж саме застосування, як і в 0-й день, проводиться в тій жезоні дослідження (очищеній від хутра, якщо необхідно) того ж плечана 6-8-й день та знову на 13-15-й день.
1.5.2.3.2 Провокаційна проба
Дні 27-29 - піддослідна та контрольна групи
Не використовувані раніше боки тварин з піддослідної таконтрольної групи очищуються від хутра (коротко обстригаються).Оклюзійна латка або камера, що містить відповідну кількістьдосліджуваної речовини у максимальній не подразнюючійконцентрації, прикладається до задніх частин не використовуванихраніше боків тварин з піддослідної та контрольної групи.
При потребі оклюзійна латка або камера тільки з розчинникомприкладається до передніх частин не використовуваних раніше боківтварин з піддослідної та контрольної групи. Латки або камериутримуються в контакті за допомогою відповідної пов'язки протягомшести годин.
1.5.2.3.3. Спостереження і класифікація
- приблизно через 21 годину після усунення латки зонапровокаційної проби очищується від хутра,
- приблизно через три години після цього (приблизно через30 годин від прикладення латки для проведення провокаційної проби)спостерігається реакція шкіри, яка фіксується згідно зкласифікацією, наведеною у Додатку,
- приблизно через 24 години після 30-годинного спостереження(приблизно через 54 години від прикладення латки для проведенняпровокаційної проби) знов спостерігається і фіксується реакціяшкіри.
Заохочується сліпе зчитування даних про тварин з піддослідноїта контрольної групи.
Якщо необхідно з'ясувати результати, отримані післяпроведення першої провокаційної проби, можливий варіант проведеннядругої провокаційної проби (так званої повторної проби), занеобхідності, з використанням нової контрольної групи, приблизночерез тиждень після першої. Повторна проба також може проводитисяна первісній контрольній групі.
Всі реакції шкіри і будь-які незвичні відчуття, включаючисистемні реакції, що є результатом індукції і процедури проведенняпровокаційної проби, потрібно спостерігати і фіксувати згіднокласифікаційної шкали Магнуссона/Клігмана (див. Додаток). Дляз'ясування сумнівних реакцій можуть проводитися інші процедури,наприклад, гістопатологічне дослідження, вимірювання товщинишкірної складки.
2. ДАНІ (ТММС та тест Бюхлера)
Дані повинні бути підсумовані у формі таблиці, де зазначенішкірні реакції кожної тварини при кожному спостереженні.
3. ЗВІТНІСТЬ (ТММС та тест Бюхлера)
Якщо скринінг-аналіз виконано перед проведенням дослідженняна морських свинках, необхідно надати опис або посилання надослідження (наприклад, Тест на набухання вух мишей (ТНВМ)),включаючи докладну інформацію про процедури, разом з отриманимирезультатами щодо досліджуваних і еталонних речовин.
Звіт щодо проведеного дослідження (тммс та тест Бюхлера)
За можливості, звіт щодо проведеного дослідження має міститинаступну інформацію:
Піддослідні тварини:
- використана лінія морських свинок
- кількість, вік і стать тварин
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
- вага кожної тварини на початку дослідження.
Умови проведення дослідження:
- техніка підготовки місця для прикладення латки,
- докладна інформація щодо використаних матеріалів для латокі техніки прикріплення латок,
- результат пілотного дослідження з висновком проконцентрацію речовин для індукції та провокаційної проби, що маютьвикористовуватись для дослідження,
- докладна інформація щодо приготування, прикладення іусунення досліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору розчинника.
- концентрація розчинника і досліджуваної речовини дляіндукції та піддавання впливу провокаційної проби і загальнакількість речовини, застосованої для індукції та провокаційноїпроби.
Результати:
- зведена інформація про результати останньої перевірки начутливість і надійність (див. пункт 1.3), включаючи інформаціющодо речовини, її концентрації та використаного розчинника,
- на кожну тварину, включаючи класифікацію,
- нарративний опис ступеню і природи реакцій, якіспостерігалися,
- будь-які гістопатологічні показники.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
Цей метод аналогічний методу, описаному у ТІ ОЕСР 406.
Додаток
ТАБЛИЦЯ
Класифікаційна шкала Магнуссона/Клігмана
для оцінки реакцій при проведенні дослідження
з використанням латок для провокаційної проби
0 = немає видимих змін
1 = дискретна або фрагментарна еритема
2 = помірна еритема та конфлюентна еритема
3 = гостра еритема та пухлина
B.7. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ
(ЯКА ВВОДИТЬСЯ ПЕРОРАЛЬНО ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина вводиться щоденно пероральним шляхомградуйованими дозами кільком групам піддослідних тварин, одинрівень доз для однієї групи протягом 28 днів. Протягом періодузастосування за тваринами ведеться ретельне щоденне спостереженняз метою виявлення ознак токсичності. Проводиться розтин тварин,які помирають або знищуються під час дослідження, а по завершеннідослідження проводиться знищення тварин, що вижили, і подальший їхрозтин.
Цей метод робить більший наголос на виявленні неврологічноговпливу, як кінцевої мети дослідження, і на потребі ретельнихклінічних спостережень за тваринами з метою отримання якомогабільшої кількості інформації. Метод має визначити хімічніпрепарати з нейротоксичним потенціалом, що надасть підстави дляподальших поглиблених досліджень в цьому напрямку. Окрім того, цейметод може виявити симптоми імунологічних впливів та токсичностіщодо репродуктивних органів.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
Здорових молодих дорослих тварин із застосуванням випадковоговідбору призначають в піддослідну групу. Клітки маютьрозташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їхмісця розташування. Тварини ідентифікуються окремо і поміщаються вклітках щонайменше на 5 днів до початку проведення дослідження зметою їх пристосування до лабораторних умов.
Досліджувана речовина вводиться через зонд, з їжею або питноюводою. Метод перорального введення залежить від мети дослідженнята фізичних/хімічних властивостей речовини.
За необхідності, досліджувана речовина розчиняється увідповідному розчиннику або усувається з його використанням.Рекомендується там, де можливо, використовувати спочатку воднийрозчин/суспензію, потім розглянути варіант використаннярозчину/емульсії олії (наприклад, кукурудзяної олії), далі -можливість розчинення в інших розчинниках. При використаннібудь-якого розчинника, окрім води, слід враховувати токсичніхарактеристики розчинника. Необхідно визначити стабільністьдосліджуваної речовини в розчиннику.
1.4.2. Умови проведення дослідження:
1.4.2.1. Піддослідні тварини:
Перевага при виборі з біологічних видів гризунів надаєтьсящуру, хоча можливе використання інших біологічних видів гризунів.Слід залучити випробувань до дослідження лабораторні лініїздорових молодих дорослих тварин, що зазвичай використовуються.Тварини жіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколине народжували. Дози слід починати давати як можна раніше післязакінчення вигодовування материнським молоком і, в будь-якомувипадку, до того, як тварині виповниться 9 тижнів.
На початку дослідження коливання ваги тварин має бутимінімальним і не перевищувати +- 20% від середньої ваги для кожноїстаті.
Коли дослідження щодо перорального введення повторюваної дозипроводиться як підготовче до тривалого дослідження, переваганадається використанню тварин з однієї лінії і одного походженнядля обох досліджень.
1.4.2.2. Кількість і стать
Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) потрібновикористовувати для кожного рівня доз. Якщо заплановане проміжнезнищення тварин, їх кількість слід збільшити на кількість тварин,яких планується знищити до завершення дослідження.