Окрім того, супутній групі з 10 тварин (по 5 тварин кожноїстаті) може вводитися найвища доза протягом 28 днів, а такожпроводяться спостереження щодо зворотності, витривалості абовідстроченої ймовірності токсичного впливу впродовж 14 днів післявведення речовини. Також використовується супутня група з10 контрольних тварин (по 5 тварин кожної статі).
1.4.2.3. Рівень дозування
Зазвичай слід використовувати три піддослідних і однуконтрольну групу. За винятком введення досліджуваної речовини, затваринами в контрольній групі доглядають так само, як і затваринами піддослідної групи. Якщо при введенні досліджуваноїречовини використовується розчинник, контрольна група маєотримувати розчинник в максимальному об'ємі, що використовувався.
Якщо згідно з оцінками або іншими даними не очікується ефектувід дози в 1000 мг/кг маси тіла/на день, можливе проведеннядослідження на граничний вміст. Якщо немає наявних відповіднихданих, можливе проведення дальнометричного дослідження з метоювизначення використовуваних доз.
Рівні дозування слід добирати, враховуючи будь які існуючінаявні дані про токсичність та (токсико-) кінетичні дані щододосліджуваної речовини або пов'язаних з нею матеріалів. Найвищудозу слід обирати з метою стимуляції токсичних впливів, але несмерті або сильних страждань. Надалі потрібно обрати низхіднупослідовність рівнів дозування з метою виявлення будь-якоїреакції, пов'язаної з дозуванням, та шкідливі для здоров'я впливи,що не спостерігалися, при застосуванні найнижчого рівня дозування.Часто оптимальним є використання від 2 до 4 інтервалів длявстановлення низхідних рівнів дозування, і часто надаєтьсяперевага додаванню четвертої піддослідної групи передвикористанням дуже великих інтервалів (наприклад, більше, ніжфактор 10) між введенням доз.
Для речовин, які вводяться з їжею або питною водою, важливозабезпечити, щоб введена кількість досліджуваної речовини невпливала на звичайний процес харчування або водний баланс. Колидосліджувана речовина вводиться з їжею, можливе використання абопостійної концентрації їжі (в мільйонних долях), або постійногорівня дозування відповідно до ваги тварини, при використанніальтернативних варіантів їх потрібно вказати. Коли досліджуванаречовина вводиться з їжею, дозу слід вводити в один і той самийчас кожного дня, і, якщо потрібно, вивірити умови для підтриманняпостійного рівня дозування відповідно до ваги тварини.
Коли дослідження щодо введення повторюваної дози проводитьсяяк підготовче до тривалого дослідження, для обох досліджень слідвикористовувати однакове харчування.
1.4.2.4. Випробування на граничний вміст
Якщо випробування на одному рівні дозування, який становитьщонайменше 1000 мг/кг маси тіла/на день або, для введення з їжеюабо питною водою, еквівалентне співвідношення з їжею або питноюводою (що засновується на визначеннях маси тіла) при використанніпроцедур, визначених для цього дослідження, не спричиняє токсичнихвпливів, і якщо токсичність не передбачається з огляду на даніщодо структурно подібних речовин, то можливо, не виникненеобхідності в проведенні розширеного дослідження з використаннямтрьох рівнів дозування. Випробування на граничний вмістзастосовується у всіх випадках, крім тих, де вплив на людинувизначає потребу в використанні вищого рівня дозування.
1.4.2.5. Період спостереження
Період спостереження має тривати 28 днів. Тваринам у супутнійгрупі, призначеним для подальшого спостереження, не слід нічоговводити щонайменше протягом 14 днів для визначення відстроченоговпливу, витривалості чи відновлення після токсичних впливів.
1.4.3. Процедура
Досліджувана речовина вводиться тваринам щоденно протягом28 днів, введення речовини в режимі 5 днів на тиждень має бутивиправданим. Коли досліджувана речовина вводиться з їжею, їїпотрібно вводити тварині однією дозою, використовуючи зонд дляштучного харчування або відповідну інтубаційну трубку.Максимальний об'єм рідини, що вводиться за один раз, залежить відрозміру піддослідної тварини. Об'єм не має перевищувати 1 мл/100 гмаси тіла, за винятком використання водних розчинів, де можливовикористовувати 2 мл/100 г маси тіла. За винятком подразнюючих чироз'їдаючих речовин, які зазвичай виявляють ускладнені впливи прибільшій концентрації, коливання досліджуваного об'єму потрібномінімізувати шляхом пристосування концентрації до забезпеченняпостійного об'єму на всіх рівнях дозування.
1.4.3.1. Загальні спостереження
Загальні клінічні спостереження слід здійснювати щонайменшеодин раз на день, краще в той самий час щоденно, беручи до увагипіковий період передбаченого впливу після введення дози. Станздоров'я тварин потрібно фіксувати. Щонайменше два рази на деньпроводяться спостереження з метою виявлення захворюваності ісмертності тварин. Помираючі тварини та тварини що постійностраждають, мають бути вилучені, як тільки цей факт помітять,знищені гуманним способом і піддані розтину.
Один раз перед першим введенням (з метою проведення порівняньв межах об'єкта) і щонайменше раз на тиждень після нього,необхідно проводити розгорнуті клінічні спостереження за всіматваринами. Ці спостереження потрібно здійснювати поза кліткою, деутримується тварина на стандартному місці, бажано в один і тойсамий час. Вони повинні детально фіксуватися, бажано звикористанням систем оцінювання, які легко можуть зрозуміти вдослідній лабораторії. Потрібно прослідкувати за тим, щобколивання умов випробування були мінімальними і бажано, щобспостереження проводилось персоналом, що не знає про введенняречовини. Фіксувати потрібно зміни у шкірі, хутрі, очах, слизовихоболонках, впливі на секреторні та екскреторні функції, а такожавтономній діяльності (наприклад, сльозовиділенні, пілоерекції,розмірі зіниць, незвичні респіраторні явища). Зміни в ході,поставі і реакції на догляд, так само, як наявність клонічних аботонічних рухів, стереотипів (наприклад, надмірна чистка хутра,періодично повторюване ходіння по колу) або дивна поведінка(наприклад, самоушкодження, ходіння назад) мають такожфіксуватися.
На четвертий тиждень піддавання впливу потрібно провестиоцінку сенсорної реактивності на стимули різного типу (наприклад,слухові, візуальні та пропріоцептивні імпульси); оцінку силизахвату та моторної активності. Подальша докладна інформація щодопроцедур, які можуть проводитися після вищенаведених, розглянуто влітературі (дивіться Загальний вступ, Частину B).
Функціональні спостереження, що проводяться на четвертийтиждень піддавання впливу, можуть не проводитися, якщо дослідженняпроводиться як підготовче до подальшого підгострого (90-денного)дослідження. У цьому випадку, функціональні спостереження маютьвключатися в це подальше дослідження. З іншого боку, наявністьданих функціональних спостережень з дослідження введенняповторюваної дози може надати можливість вибрати рівні дозуваннядля подальшого підгострого дослідження.
Функціональні спостереження можна також пропустити виключнодля груп, які іншим чином виявляють ознаки токсичності до такоїміри, що це може значно впливати на процес функціональноговипробування.
1.4.3.2. Маса тіла і споживання їжі/води
Всіх тварин зважують щонайменше один раз на тиждень.Вимірювання споживання їжі і води слід проводити щонайменше одинраз на тиждень. Якщо досліджувана речовина вводиться з питноюводою, вимірювання споживання води необхідно проводити такожщонайменше один раз на тиждень.
1.4.3.3. Гематологія
Наступні гематологічні дослідження мають проводитисянаприкінці періоду дослідження: гематокрит, концентраціягемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальнийпідрахунок лейкоцитів, підрахунок тромбоцитів і вимірюваннячасу/потенціалу згортання крові.
Зразки крові слід взяти з визначеного місця одразу перед абопід час процедури знищення тварин, і зберігати за відповіднихумов.
1.4.3.4. Клінічна біохімія
Клінічні біохімічні дослідження для виявлення найбільшихтоксичних впливів на тканини і, особливо, впливів на нирки іпечінку, мають проводитися на зразках крові, отриманих від усіхтварин (крім помираючих та/або знищених випадково) відразу передабо під час процедури знищення тварин. Рекомендується не годуватитварин вночі перед забором крові для зразків(1). При проведеннідослідження плазми чи сироватки мають враховуватися показникисоди, калію, глюкози, загальної кількості холестерину, сечовини,креатиніну, загальної кількості протеїнів та альбумінів,щонайменше два визначення впливів показників ензимів абогепатоцелюларних впливів (таких, як аланін-амінотрансфераза,аспартат-амінотрансфераза, лужна фосфатаза,гамма-глутамилтранспептидаза та сорбіт-дегідрогеназа). Вимірюваннядодаткових ензимів (печінкового або іншого походження) та надлишкужовчі може надати корисну інформацію за певних умов.
----------------
(1) Для кількісних вимірювань сироватки і плазми, особливостосовно глюкози, бажано не годувати тварин вночі перед заборомкрові. Головною причиною цього є те, що підвищена варіативність,що є неуникненним результатом годування тварин, може замаскуватибільш слабко виражені ефекти і ускладнити інтерпретацію. З іншогобоку, проте, якщо не годувати тварин вночі, це може змінитизагальний метаболізм тварини і, особливо при проведеннідосліджень, пов'язаних з годуванням, може порушити щоденневведення досліджуваної речовини. Якщо було вирішено не годуватитварин вночі, клінічні біохімічні дослідження слід проводити післяфункціональних спостережень на 4-му тижні дослідження.
Можливе проведення необов'язкового аналізу сечі протягомостаннього тижня дослідження з використанням збору сечі,розпланованого за часом; досліджується зовнішній вигляд, об'єм,осмотична концентрація або питома вага, pH, протеїни, клітиниглюкози і крові/клітин крові.
Окрім того, слід розглянути можливість проведення дослідженьдля виявлення маркерів сироватки загального ушкодження тканини.Якщо відомі властивості досліджуваної речовини можуть, абопередбачається, що вони можуть завдати шкоди метаболічнимпоказникам, включаючи показники кальцію, фосфату, основнихтригліцеридів, специфічних гормонів, метгемоглобіну тахолінестерази, потрібно виконати інші аналізи. Їх слід визначатидля певних класів речовин або від випадку до випадку.
У цілому потрібен гнучкий підхід, що залежить відбіологічного виду та/або впливу, що спостерігався чи очікуєтьсявід даної речовини.
Якщо історично встановлених вихідних даних недостатньо, слідрозглянути можливість визначення гематологічних і клінічнихбіохімічних перемінних перед початком введення доз речовини.
1.4.3.5. Макроскопічні обстеження під час розтину
Всі тварини, що використовувались для дослідження, піддаютьсяповному і детальному макроскопічному обстеженню під час розтину,що включає ретельний огляд зовнішньої поверхні тіла, всіх отворів,черепної, грудної і черевної порожнин та їх вмісту. Печінку,нирки, наднирники, яєчка, епідідіміс, тимус, селезінку, мозок тасерце усіх тварин слід позбавити від сполучної тканини, якщо цепотрібно, і виміряти їх вагу у вологому стані якомога скорішепісля препарування, щоб уникнути висихання.
Інші тканини слід зафіксувати за допомогою найбільшпридатного з точки зору як для типу тканини, так і дляпередбаченого наступного гістопатологічного обстеження, фіксуючогозасобу: всі макроскопічні ушкодження, мозок (репрезентативніобласті, включаючи головний мозок, мозочок та вароліїв міст),спинний мозок, шлунок, товстий і тонкий кишечник (включаючиПейєрові бляшки), печінку, нирки, наднирники, селезінку, серце,тимус, щитовидну залозу, трахею та легені (фіксуються вдуваннямфіксатора і подальшим зануренням), гонади, додаткові статевіоргани (наприклад, матка, простата), сечовий міхур, лімфатичнівузли (бажано один лімфатичний вузол, що супроводжує маршрутвведення речовини та ще один, віддалений від маршруту введенняречовини для дослідження системних впливів), периферичні нерви(сідничний або великий гомілковий) - переважно у безпосереднійблизькості до м'язу та відділів кісткового мозку (або, в якостіальтернативи, свіжий вставлений в рамку аспірат кісткового мозку).Клінічні та інші показники можуть виявити потребу в оглядідодаткових тканин. Також всі органи, які можуть розглядатися уякості цільових органів, ґрунтуючись на відомих властивостяхдосліджуваної речовини, слід зберігати.
1.4.3.6. Гістопатологічне обстеження
Повне гістопатологічне дослідження збережених органів ітканин має здійснюватися на всіх тваринах в контрольній групі та угрупі, якій вводилася висока доза. Ці обстеження слід провеститакож на тваринах з груп, де застосовуються інші дози, якщо угрупі, якій вводилася висока доза, спостерігалися зміни, викликанівведенням речовини.
Слід провести обстеження всіх макроскопічних ушкоджень.
При використанні супутньої групи необхідно здійснитигістопатологічне дослідження тканин і органів, ідентифікованих яктакі, що проявляють вплив на піддослідні групи.
2. ДАНІ
Необхідно отримати індивідуальні дані. Також всі дані покожній піддослідній групі мають бути підсумовані у формі таблиці,де зазначені кількість тварин на початку випробування, кількістьтварин, що померли під час випробування або були знищені згуманістичних міркувань, а також час смерті або знищення кожноїтварини, кількість тварин з ознаками токсичного впливу, описвиявлених ознак токсичного впливу, включаючи час початку,тривалість і силу токсичного впливу, кількість тварин зушкодженнями, типи ушкоджень і відсоток тварин з будь-якими типамиушкоджень.
За можливості, цифрові результати слід оцінювати,використовуючи відповідний і загальноприйнятий статистичний метод.Статистичні методи обирають на етапі розробки плану дослідження.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ЩОДО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт щодо проведеного дослідження має, за можливості, міститинаступну інформацію:
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
- кількість, вік і стать тварин
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
- вага кожної тварини на початку дослідження, а також черезкожен тиждень та наприкінці дослідження.
Умови випробування:
- обґрунтування вибору розчинника, окрім води,
- обґрунтування вибору рівня дозування,
- детальний склад досліджуваної речовини/розробки раціонухарчування, досягнута концентрація, стабільність і гомогенністьпрепарату,
- докладна інформація щодо застосування досліджуваноїречовини,
- перехід від концентрації досліджуваної речовини уїжі/питній воді (в мільйонних долях) до поточної дози (мг/кг маситіла/день), у випадку застосування такого переходу,
- детальна інформація щодо якості їжі і води.
Результати:
- маса тіла/зміни маси тіла,
- споживання їжі і води, у випадку застосування,
- дані токсичної реакції з огляду на стать і рівеньдозування, включаючи ознаки токсичного впливу,
- природа, жорсткість умов і тривалість клінічнихспостережень (як щодо зворотних, так і щодо незворотних змін),
- оцінка сенсорної активності, сили захвату та моторноїактивності,
- гематологічні дослідження з відповідним базиснимоцінюванням,
- клінічні біохімічні дослідження з відповідним базиснимоцінюванням,
- маса тіла при знищенні і дані про вагу органів,
- показники, виявлені під час розтину,
- детальний опис всіх гістопатологічних показників,
- дані щодо абсорбції, за наявністю,
- статистична обробка результатів, якщо вона є доцільною.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
Цей метод аналогічний методу, що застосовується уТІ ОЕСР 407.
B.8. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ
(ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ІНГАЛЯЦІЮ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Корисно отримати попередню інформацію про розподіл розмірівчастинок, тиск пару, точку плавлення, точку кипіння, температурузаймання і вибуховість (якщо це є застосовним) речовини.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B (A).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (B).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Кілька груп піддослідних тварин на певний період щоденнопіддають впливу досліджуваної речовини в градуйованихконцентраціях; одна концентрація використовується для однієї групипротягом 28 днів. Якщо для створення відповідної концентраціїдосліджуваної речовини в атмосфері, необхідне використанняконтрольної групи розчинника, така група має бути використана.Протягом періоду застосування за тваринами ведеться щоденнеспостереження для виявлення ознак токсичності. Проводиться розтинтварин, які помирають під час дослідження, а по завершеннідослідження проводиться їх розтин.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини утримуються в експериментальних умовах та увідповідних умовах харчування протягом щонайменше п'яти днів передекспериментом. Перед тестом тварин відбирають із застосуваннямвипадкового відбору і розподіляють в необхідну кількість груп. Занеобхідності, для створення відповідної концентрації речовини ватмосфері до досліджуваної речовини може додаватися відповіднийрозчинник. Якщо розчинник або інша домішка використовується дляполегшення дозування, вони повинні мати підтвердження того, щовони не спричиняють токсичних впливів. Можливе використанняісторично встановлених даних, якщо це є доцільним.
1.6.2. Умови проведення дослідження
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Якщо немає протипоказань, перевага при виборі з біологічнихвидів гризунів надається щуру. Слід залучити для випробуваньлабораторні лінії здорових молодих тварин, що зазвичайвикористовуються.
На початку дослідження коливання ваги використовуваних тваринне повинно становити +- 20% від відповідного середнього показника.
1.6.2.2. Кількість і стать
Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) слідвикористовувати для кожної піддослідної групи. Тварини жіночоїстаті мають бути не вагітними і такими, що ніколи не народжували.Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їх кількість потрібнозбільшити на кількість тварин, яких планується знищити дозавершення дослідження. На додаток, супутній групі з 10 тварин (по5 тварин кожної статі) може вводитися доза найвищої концентраціїпротягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодозворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичноговпливу впродовж 14 днів після введення речовини. Такожвикористовується супутня група з 10 контрольних тварин (по5 тварин кожної статі).
1.6.2.3. Концентрація для впливу
Потрібно щонайменше три концентрації, з використаннямконтролю або контролю розчинника (що відповідає концентраціїрозчинника на найвищому рівні), якщо розчинник використовується.За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами вконтрольній групі доглядають так само, як і за тваринамипіддослідної групи. Найвища концентрація має призводити дотоксичних впливів але не спричиняти смерть, принаймні масову.Найнижча концентрація не повинна виявляти жодних ознактоксичності. Якщо існують придатні до використання оцінки впливуна людину, найнижча концентрація має перевищувати концентрацію,використану в попередніх дослідженнях. В ідеалі, проміжнаконцентрація має спричиняти мінімальні токсичні впливи, якіможливо спостерігати. Якщо використовується більш ніж однапроміжна концентрація, концентрації мають розташовуватись навідстані одна від одної для забезпечення градуювання токсичнихвпливів. Для отримання значущих результатів у групах, дезастосовується речовина в низькій і проміжних концентраціях, атакож в контрольній групі, повинен бути низький відсотоксмертності.
1.6.2.4. Час впливу
Тривалість щоденного впливу має становити шість годин, проте,для задоволення специфічних вимог може виникнути потреба в змінітривалості.
1.6.2.5. Обладнання
Дослідження на тваринах слід проводити за допомогоюінгаляційного обладнання, здатного забезпечувати динамічний потікповітря протягом щонайменше як 12 обмінів повітря за годину дляпідтримання відповідного вмісту кисню та рівномірно розподіленоїатмосфери впливу. При використанні камери її конструкція маєзабезпечувати мінімальне скупчення піддослідних тварин імаксимальний вплив інгаляції досліджуваною речовиною. Загальнеправило для забезпечення стабільності атмосфери в камері означає,що загальний "об'єм" піддослідних тварин не повинен перевищувати5% об'єму камери для дослідження. Вплив за допомогою камери можебути рото-носовим, тільки на голову або індивідуальним на всетіло; перші два варіанти дозволяють мінімізувати поглинання черезінші шляхи.
1.6.2.6. Період спостереження
За піддослідними тваринами ведеться щоденне спостереження зметою виявлення ознак токсичності під час всього періоду введенняречовини та часу відновлення. Час смерті та час, коли з'явились ізникли ознаки токсичності, має фіксуватися.
1.6.3. Процедура
Тварин щоденно піддають впливу досліджуваної речовини, від5 до 7 днів на тиждень протягом 28 днів. Тваринам у будь-якійсупутній групі, призначеним для подальшого спостереження, не сліднічого вводити впродовж подальших 14 днів для визначеннявитривалості чи відновлення після токсичних впливів. Температура,за якої проводиться випробування, має підтримуватись на рівні22 +- 3 град.C.
В ідеалі, відносна вологість має становити від 30 до 70%, алев певних випадках (наприклад, випробування деяких аерозолів) цеможе бути нездійсненним. Підтримання злегка від'ємного тискувсередині камери (<= 5 мм води) запобігатиме витоку досліджуваноїречовини в навколишнє середовище. Тваринам не дають їжі і води підчас впливу.
Потрібно використовувати динамічну інгаляційну систему звідповідною аналітичною системою контролю концентрації. Длявстановлення відповідної концентрації для впливу рекомендуєтьсяпроведення контрольного випробування. Потік повітря слідвідрегулювати для забезпечення гомогенності умов у камері длявпливу. Система має забезпечувати досягнення стабільних умоввпливу якомога швидше.
Вимірювання або моніторинг слід проводити щодо:
(a) швидкості потоку повітря (постійно),
(b) поточної концентрації досліджуваної речовини, щовимірюється в зоні дихання. Впродовж щоденного періоду впливуконцентрація не повинна коливатися у межах більш ніж +- 15% відсереднього показника. Проте, у випадку застосування деякихаерозолів контрольного рівня неможливо досягти, тому може бутиприйнятий ширший діапазон. Впродовж усього періоду дослідженняповсякденна концентрація має підтримуватись на можливомустабільному рівні. Для аерозолів слід проводити щонайменше одинаналіз розмірів частинок на тиждень для піддослідної групи.
(c) температури і вологості, за можливості постійно.
Під час подальшого впливу проводяться спостереження та їхрезультати фіксуються систематично; для кожної тварини дані маютьзаписуватись окремо. Спостереження всіх тварин мають здійснюватисящоденно, а ознаки токсичного впливу - фіксуватися, включаючи часпочатку, ступінь та тривалість. Спостереження мають включати змінив шкірі, хутрі, очах, слизових оболонках, функціонуваннідихальної, кровоносної вегетативної та центральної нервовоїсистем, соматомоторній активності та стереотипі поведінки.Вимірювання ваги тварин слід проводити щотижня. Такожрекомендується щотижня вимірювати споживання їжі. Необхідноздійснювати регулярне спостереження за тваринами з метоюзапобігання втрати тварин через такі причини, як канібалізм,автоліз тканин або неправильне розміщення. По закінченню періодудослідження робиться розтин всіх тварин з несупутніх груп, щовижили. Помираючі тварини та тварини, що постійно страждають,мають бути вилучені, як тільки про цей факт помітять, знищенігуманним способом і піддані розтину.
Наступні дослідження проводяться наприкінці випробування длявсіх тварин, включаючи тих, що входять до складу контрольноїгрупи:
гематологія, включаючи принаймні гематокрит, концентраціягемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальнийпідрахунок лейкоцитів, підрахунок і вимірювання потенціалузгортання;
клінічні дослідження біохімії крові, включаючи принаймні одинпараметр функцій печінки та нирок: аланін-амінотрансферазасироватки (раніше відома як глютамінова піровинограднатрансаміназа), аспартат-амінотрансфераза сироватки (раніше відомаяк глютамінова щавелевооцтова трансаміназа), азот сечовини крові,альбумін, креатинін крові, загальний білірубін і загальнівимірювання протеїнів сироватки;
Інші аналізи, які можуть бути необхідними для адекватноїтоксикологічної оцінки, включають аналіз показників кальцію,фосфору, хлориду, соди, калію, аналіз глюкози натщесерце на вмістжирів, гормонів, кислотно-лужний баланс, активність метгемоглобінута холінестерази.
За необхідності, з метою розширеного вивчення виявленихтоксичних впливів можуть проводитися додаткові клінічні біохімічнідослідження.
1.6.3.1. Макроскопічні обстеження під час розтину
Всі тварини, що використовувались для дослідження, піддаютьсяповному макроскопічному обстеженню. Принаймні печінку, нирки,наднирники, легені і яєчка слід зважити у вологому стані якомогаскоріше після препарування, щоб уникнути висихання. Органи ітканини (дихальний тракт, печінку, нирки, селезінку, яєчка,наднирники, серце і будь-які органи, в яких виявлено макроскопічніушкодження або зміни розміру) потрібно зберігати у відповідномузасобі для можливого гістопатологічного дослідження у майбутньому.Легені слід витягти неушкодженими, зважити і закріпити задопомогою відповідного фіксатора, щоб забезпечити збереженнялегеневої структури.
1.6.3.2. Гістопатологічне обстеження
В контрольній групі (групах) і групі, якій вводилася дозависокої концентрації, слід провести гістопатологічне дослідженнязбережених органів і тканин. Органи і тканини, в яких буловиявлено ушкодження, приписуються досліджуваній речовині принайвищому рівні дозування, та такі органи слід обстежити в усіхгрупах низького дозування. Для тварин будь-якої з супутніх группотрібно провести гістопатологічне дослідження, приділяючиособливу увагу органам та тканинам, визначених як ті, що маютьознаки впливу, в інших піддослідних групах.
2. ДАНІ
Дані мають бути підсумовані у формі таблиці, де зазначенікількість тварин на початку проведення дослідження і кількістьтварин з будь-якими ушкодженнями для кожної піддослідної групи.
Всі виявлені результати слід оцінювати, використовуючивідповідний статистичний метод. Можливе використання будь-якоговизнаного статистичного методу.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
За можливості, звіт про повинен проведення дослідження маємістити таку інформацію:
- біологічні види, лінії, походження, умови навколишньогосередовища, дієта, і т.д.
- умови досліду.
Опис апарату для введення, включаючи конструкцію, тип,розміри, джерело повітря, систему подачі аерозолів, методкондиціонування повітря та метод утримання тварин у камері длявипробування дослідження за умови її використання. Обладнання длявимірювання температури, вологості і, за необхідності,стабільності концентрації аерозолю або розподілу розмірів частиноктакож має бути описане.
Дані з піддавання впливу:
Вони мають бути представлені у формі таблиці з середнімипоказниками і ступенем мінливості (наприклад, стандартневідхилення) і за можливості мають включати:
(a) швидкість потоку повітря через інгаляційне обладнання;
(b) температуру і вологість повітря;
(c) номінальні концентрації (загальну кількість досліджуваноїречовини, що подається в інгаляційне обладнання, поділену на об'ємповітря);
(d) природу розчинника, якщо він використовується;
(e) поточну концентрацію в досліджуваній зоні дихання;
(f) загальний серединний аеродинамічний діаметр (ЗСАД) івідхилення від геометричного стандарту (ВГС);
- дані токсичної реакції в залежності від статі іконцентрації,
- час смерті під час дослідження або випадки, коли тваринидожили до моменту знищення,
- опис токсичних або інших впливів, рівень відсутностівпливу,
- час спостереження будь-якої аномальної ознаки і подальшийперебіг її розвитку,
- дані про масу тіла і харчування,
- проведені гематологічні дослідження та їх результати,
- проведені біохімічні дослідження та їх результати,
- показники, виявлені під час розтину,
- докладний опис всіх гістопатологічних показників,
- статистична обробка результатів, якщо вона є доцільною,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (E).
B.9. ТОКСИЧНІСТЬ ПОВТОРНОЇ ДОЗИ
(ВВЕДЕНОЇ ЧЕРЕЗ ШКІРУ ВПРОДОВЖ 28 ДНІВ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ, Частину B (A).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (B).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Немає.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджувана речовина прикладається щоденно до шкіриградуйованими дозами кільком групам піддослідних тварин, одна дозадля однієї групи протягом 28 днів. Протягом періоду прикладання затваринами ведеться щоденне спостереження для виявлення ознактоксичності. Проводиться розтин тварин, які помирають під часдослідження, а по завершенні дослідження проводиться розтин тихтварин, що вижили.
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Немає.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Тварини утримуються в експериментальних умовах і увідповідних умовах харчування протягом щонайменше п'яти днів передпроведенням дослідження. Перед тестом тварин відбирають методомсліпого відбору і розподіляють в піддослідну і контрольну групи.Незадовго до випробування хутро обстригається зі спинної частинитулубу піддослідних тварин. Можливе застосування гоління, якепотрібно здійснити приблизно за 24 години до проведеннядослідження. Повторне обстригання або гоління зазвичай слідпроводити приблизно з інтервалом у тиждень. При обстриганні абоголінні хутра необхідно подбати про те, щоб уникнути потертостішкіри. Не меш ніж 10% поверхні тіла слід очистити для застосуваннядосліджуваної речовини. При вирішенні питання про зону очищення тарозміри покриття потрібно враховувати вагу тварини. При тестуваннітвердих речовин, які можуть подрібнюватися в порошок, якщо це єдоцільним, досліджувана речовина повинна бути достатньо зволоженаводою або, за необхідності, відповідним розчинником з метоюзабезпечення тісного контакту зі шкірою. Рідкі досліджуваніречовини, зазвичай, застосовуються нерозбавленими.Використовується схема щоденного застосування від 5 до 7 днів натиждень.
1.6.2. Умови проведення дослідження:
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Можуть використовуватись дорослі щури, кролики або морськісвинки. Можливе використання інших біологічних видів, але їхвикористання вимагає обґрунтування.
На початку дослідження коливання ваги використовуваних тваринне повинно перевищувати +- 20% від відповідного середньогопоказника.
1.6.2.2. Кількість і стать
Щонайменше 10 тварин (п'ять самців і п'ять самок) зі здоровоюшкірою слід використовувати для кожного рівня дозування. Тваринижіночої статі мають бути не вагітними і такими, що ніколи ненароджували. Якщо заплановане проміжне знищення тварин, їхкількість потрібно збільшити на кількість тварин, яких плануєтьсязнищити до завершення дослідження. Окрім того, супутній групі з10 тварин (по 5 тварин кожної статі) може даватися доза високогорівня протягом 28 днів, а також проводяться спостереження щодозворотності, витривалості або відстроченої ймовірності токсичноговпливу впродовж 14 днів після введення речовини. Такожвикористовується супутня група з 10 контрольних тварин (по5 тварин кожної статі).
1.6.2.3. Рівень дозування
Потрібно щонайменше три рівня дозування з використаннямконтролю або контролю розчинника, якщо розчинник використовується.Період впливу має становити щонайменше шість годин на день.Прикладання досліджуваної речовини слід здійснювати в один і тойсамий час кожного дня і вивірити інтервали (тижневий абодвотижневий) для підтримання постійного рівня дозування взалежності від ваги тварини. За винятком введення досліджуваноїречовини, за тваринами в контрольній групі доглядають так само, які за тваринами піддослідної групи. Якщо розчинник використовуєтьсядля полегшення дозування, контрольна група повинна отримувати такусаму дозу, як і піддослідні групи, і отримувати таку самукількість, яку отримує група з найвищим рівнем дозування. Найвищийрівень дозування повинен призводити до токсичних впливів, але неспричиняти смерть, принаймні масову. Найнижчий рівень дозування неповинен виявляти ніяких ознак токсичності. Якщо існують придатнідля використання оцінки впливу на людину, найнижчий рівеньдозування має перевищувати використаний в попередніх дослідженнях.В ідеалі, середній рівень дозування має спричиняти мінімальнітоксичні впливи, які можливо спостерігати. Якщо використовуєтьсябільш ніж одна проміжна доза, рівні дозування повиннірозташовуватись на відстані один від одного для забезпеченнякласифікації токсичних впливів. Для отримання значущих результатіву групах, де застосовується речовина в низькій і проміжнихконцентраціях, а також в контрольній групі, повинен бути низькийвідсоток смертності.
Якщо застосування досліджуваної речовини спричиняє сильнеподразнення шкіри, концентрацію слід зменшити, результатом чогобуде зменшення або відсутність інших токсичних впливів привисокому рівні дозування. Більш того, якщо шкіру було сильнопошкоджено, може виникнути необхідність у завершенні дослідження іздійсненні нового дослідження з нижчими концентраціями.
1.6.2.4. Тестування на граничний вміст
Якщо попереднє дослідження на рівні дозування, який становить1000 мг/кг, або на вищому рівні дозування щодо можливого впливу налюдину, якщо він є відомим, не виявило токсичних впливів,необхідність в проведенні подальших досліджень може зникнути.
1.6.2.5. Період спостереження
За піддослідними тваринами ведеться щоденне спостереження зметою виявлення ознак токсичності. Час смерті та час, колиз'явились і зникли ознаки токсичності, має фіксуватися.
1.6.3. Процедура
Тварин потрібно доглядати окремо. Тварин щоденно піддаютьвпливу досліджуваної речовини, в ідеалі 7 днів на тиждень протягом28 днів. Тваринам у будь-якій супутній групі, призначеним дляподальшого спостереження, не слід нічого вводити впродовжподальших 14 днів для визначення витривалості чи відновлення післятоксичних впливів. Період впливу має становити щонайменше шістьгодин на день.
Досліджувана речовина наноситься рівномірно на зону тіла, якаскладає приблизно 10% загальної поверхні тіла. При використаннівисокотоксичних речовин площа покритої поверхні може зменшуватись,але якомога більша площа має бути покрита якомога тоншим і більшрівномірним шаром речовини.
Під час впливу досліджувана речовина прикріплюється до шкіриза допомогою губчастої марлевої пов'язки та не подразнюючоїстрічки. Зона тестування повинна далі вкриватися відповідним чиномз метою утримання марлевої пов'язки і досліджуваної речовини тазапобігання можливості ковтання твариною досліджуваної речовини.Для запобігання ковтання досліджуваної речовини можнавикористовувати фіксатори, проте, повне обмеження рухливостііммобілізація не рекомендується. В якості альтернативи можнавикористовувати "захисний прилад на комір".
По закінченні періоду впливу залишок досліджуваної речовинислід прибрати, де це можливо, використовуючи воду або іншийвідповідний спосіб очищення шкіри.
Спостереження всіх тварин має здійснюватися щоденно, а ознакитоксичного впливу - фіксуватися, включаючи час початку, ступінь татривалість. Спостереження мають включати зміни в шкірі, хутрі,очах, слизових оболонках, а також у функціонуванні дихальної,кровоносної, вегетативної та центральної нервової систем,соматомоторній активності та стереотипі поведінки. Вимірюванняваги тварин потрібно проводити щотижня. Також рекомендуєтьсящотижня вимірювати споживання їжі. Необхідно здійснювати регулярнеспостереження за тваринами з метою запобігання втрати тварин черезтакі причини, як канібалізм, автоліз тканин або неправильнерозміщення. По закінченні періоду дослідження робиться розтин всіхтварин з несупутніх груп, що вижили. Помираючі тварини та тваринищо постійно страждають, мають бути вилучені, як тільки цей фактпомітять, знищені гуманним способом і піддані розтину.
Наступні дослідження проводяться наприкінці проведеннятестування всіх тварин, включаючи тих, що входять до складуконтрольної групи:
1) гематологія, включаючи принаймні гематокрит, концентраціюгемоглобіну, підрахунок еритроцитів, загальний і диференціальнийпідрахунок лейкоцитів, підрахунок і вимірювання потенціалузгортання;
2) клінічні дослідження біохімії крові, включаючи принаймніодин параметр функцій печінки та нирок: аланін-амінотрансферазасироватки (раніше відома як глютамінова піровинограднатрансаміназа), аспартат-амінотрансфераза сироватки (раніше відомаяк глютамінова щавелевооцтова трансаміназа), азот сечовини,альбумін, креатинін крові, загальний білірубін і загальні протеїнисироватки;
Інші аналізи, що можуть бути необхідними для адекватноїтоксикологічної оцінки, включають аналіз показників кальцію,фосфору, хлориду, соди, калію, аналіз глюкози натщесерце на вмістжирів, гормонів, кислотно-лужний баланс, активність метгемоглобінута холінестерази.
За необхідності, можуть проводитися додаткові клінічнібіохімічні дослідження для розширеного вивчення виявлених впливів.
1.6.4. Макроскопічні обстеження під час розтину
Всіх тварин, що використовувались для дослідження, піддаютьповному макроскопічному обстеженню під час розтину. Принаймніпечінку, нирки, наднирники, яєчка слід зважити у вологому станіякомога скоріше після препарування, щоб уникнути висихання. Органиі тканини, тобто неушкоджена шкіра і шкіра після впливудосліджуваної речовини, печінка, нирки, селезінка, яєчка,наднирники, серце і цільові органи (будь-які органи, в якихвиявлено макроскопічні ушкодження або зміни розміру) потрібнозберігати у відповідному засобі для можливого гістопатологічногодослідження у майбутньому.
1.6.5. Гістопатологічне обстеження
В контрольній групі і групі, якій вводилася висока доза,потрібно провести гістопатологічне дослідження збережених органіві тканин. Органи і тканини, в яких було виявлено ушкодження,приписуються досліджуваній речовині при найвищому рівні дозування,та такі органи слід обстежити в усіх групах низького дозування.Для тварин будь-якої з супутніх груп потрібно провестигістопатологічне дослідження, приділяючи особливу увагу органам татканинам, визначених як ті, що мають ознаки впливу, в іншихпіддослідних групах.
2. ДАНІ
Дані повинні бути підсумовані у формі таблиці, де зазначенікількість тварин на початку дослідження і кількість тварин збудь-якими ушкодженнями для кожної піддослідної групи.
Всі виявлені результати слід оцінювати, використовуючивідповідний статистичний метод. Можливе використання будь-якоговизнаного статистичного методу.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
За можливості, звіт про проведення дослідження має міститинаступну інформацію:
- дані про тварину (біологічні види, лінії, походження, умовинавколишнього середовища, дієта, і т.д.)
- умови дослідження (включаючи тип пов'язки: оклюзивна абонеоклюзивна),
- рівні дозування (включаючи розчинник, якщо вінвикористовується) та концентрації,
- рівень відсутності впливу, де можливо,
- дані токсичної реакції в залежності від статі і дозування,
- час смерті під час дослідження або випадки, якщо тваринидожили до знищення,
- токсичні або інші впливи,
- час спостереження будь-якої аномальної ознаки і подальшийперебіг її розвитку,
- дані про масу тіла і харчування,
- проведені гематологічні дослідження та їх результати,
- проведені біохімічні дослідження та їх результати,
- показники, виявлені під час розтину,
- докладний опис всіх гістопатологічних показників,
- статистична обробка результатів, де вона є можливою,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ, Частину B (E).
B.10. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VITRO
НА ХРОМОСОМНУ АБЕРАЦІЮ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 473, ТестIn Vitro на Хромосомну Аберацію Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Метою тесту in vitro на хромосомну аберацію є визначенняагентів, які спричиняють структурні хромосомні аберації укультивованих клітинах ссавців (1)(2)(3). Структурні абераціїможуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні. Привикористанні більшості хімічних мутагенів спровоковані абераціїналежать до хроматидного типу, але трапляються також абераціїхромосомного типу. Підвищення поліплоїдії може означати, щохімічна речовина має потенціал для провокування кількіснихаберацій. Проте цей метод було розроблено не для вимірюваннякількісних аберацій і, зазвичай, він не використовується з цієюметою. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиноюбагатьох генетичних хвороб людини, і є суттєві докази того, щохромосомні мутації та пов'язані з ними явища, що спричиняють змінив онкогенах і генах-супрессорах пухлин соматичних клітин, берутьучасть у викликанні раку у людини і піддослідних тварин.
Тест in vitro на хромосомну аберацію може залучати культуриусталених ліній клітин, штамів клітин або первинних клітиннихкультур. Клітини для використання відбираються, спираючись наздатність культури до зростання, стабільність каріотипу, кількістьхромосом, різноманітність хромосом та частоту спонтанниххромосомних аберацій.
