приблизно, на 1 мм) ....................................... 3
Сильний набряк (краї шкіри припідняті більше, ніж
на 1 мм та заходять за визначену ділянку) ................. 4
Максимально можливе: 4
Якщо результати досліджень нечіткі або незрозумілі, тодіпроводять гістопатологічний огляд.
Додаток
Стратегія поступового тестування
на предмет оцінки подразнення та роз'їдання шкіри
ЗАГАЛЬНИЙ РОЗГЛЯД
З метою розумного наукового підходу та охорони життя твариндуже важливо уникати зайвого проведення досліджень на живихістотах, а також мінімізувати можливість будь-яких експериментів,в ході яких тваринам, ймовірно, буде завдано серйозної шкоди.Перед тим, як розглянути саму можливість проведення тестів наживих організмах, необхідно зробити оцінку інформації щодоможливого ураження шкіри: подразнення та роз'їдання. Потреба впроведенні досліджень над тваринами може виявитись зайвою, якщовже є достатньо інформації щодо класифікації хімічної речовини напредмет ураження та роз'їдання шкіри. Таким чином, застосуванняаналізу фактичної ваги та стратегії поступового тестування зможутьмінімізувати потребу в проведенні тесту на живих організмах, якщотестована речовина може викликати шкідливі реакції.
Метод аналізу фактичної ваги рекомендується застосовувати длятого, щоб оцінити доступну інформацію щодо подразнення тароз'їдання шкіри хімічною речовиною з метою визначення потреби впроведенні додаткових досліджень, які відрізняються відекспериментів на живих організмах. Якщо потреба в подальшихдослідженнях все ж існує, тоді рекомендується застосовуватистратегію поступового тестування для розробки та вдосконаленнявідповідних експериментальних даних. Метод аналізу фактичної вагизастосовується до тих хімічних речовин, про які відсутня будь-якаісторія досліджень, з метою розробки даних для оцінки потенційноможливих ефектів ураження та роз'їдання шкіри. Описана в даномуДоповненні стратегія тестування була розроблена в ході семінаруОЕСР (1), згодом затверджена і розвинута в ГлобальнійГармонізованій Системі (ГГС) Класифікації Хімічних Речовин щодовпливу на здоров'я людини та навколишнє середовище. Рішення будозатверджено 28 листопада 1998 року, під час 28-го Спільногоскликання хімічного комітету та Робочої групи з дослідженняхімічних речовин (2).
Незважаючи на те, що стратегія поступового тестування не єкомпонентом методу В.4, вона все ж носить рекомендаційний характерщодо визначення характеристик подразнення/роз'їдання шкіри. Такийрекомендаційний характер даної стратегії представляє собою, якпередовий досвід, так і певні етичні критерії оцінки результатівдосліду на живих організмах на предмет виявлення ефектівподразнення та роз'їдання шкіри. Метод тестування дає рекомендаціїщодо проведення експерименту на живих організмах, а такожпідсумовує показники, на які варто звернути увагу ще до початкусамого тестування. Стратегія являє собою підхід до оцінки вжеіснуючої бази даних про роз'їдаючі властивості хімічних речовин, атакож багаторівневий підхід щодо формування відповідних даних проречовини, які потребують додаткового вивчення або про які непроводилось жодних досліджень. Дана стратегія також рекомендуєпроведення в певних умовах вже оцінених та загальноприйнятихтестів на живих організмах або в пробірці з метою визначенняподразнення/роз'їдання шкіри.
СТРАТЕГІЯ ТЕСТУВАННЯ ТА ОПИС ОЦІНЮВАННЯ
Перед проведенням тестів, як елементу стратегії поступовоготестування (див. Малюнок), необхідно зробити оцінку існуючої зданого питання інформації, щоб визначити потребу в дослідах наживих організмах. Незважаючи на те, що важливу інформацію можнаотримати з оцінки окремих параметрів (наприклад, крайнє значеннярН), необхідно враховувати всю інформацію в цілому. Сумнівнаінформація про дію речовини або її аналогів повинна перевірятисьметодом оцінки фактичної ваги, а рішення про застосування такогометоду необхідно обґрунтувати. Особливо підкреслити необхідно вжеіснуючу інформацію про дію речовини на тварин та людей, а такожрезультати досліджень на живих організмах і в пробірці. Необхідноуникати, якщо можливо, проведення експериментів над тваринами(живими організмами) на предмет виявлення роз'їдаючих властивостейхімічної речовини. До показників стратегії тестування входитьнаступна інформація:
Оцінка даних про дію хімічної речовини на тварин та людей(Етап 1). Першими беруться до уваги результати дії речовини налюдях, наприклад, дані клінічних та професійних досліджень,доповіді, результати щодо тварин (наприклад, окремі та повторюваніексперименти щодо визначення токсичності ураження шкіри). Такаінформація враховується першою, оскільки безпосередньо стосуєтьсядії речовини на шкіру. Під час проведення експериментів на живихорганізмах непотрібно застосовувати хімічні речовини, які відомісвоєю роз'їдаючою та подразнюючою дією або, навпаки, не проявляютьтаких ознак.
Аналіз залежності речовини від структури (ЗРВ) (Етап 2).Результати тестування структурно пов'язаних хімічних речовиннеобхідно при можливості враховувати. Якщо є достатньо інформаціїпро структурно пов'язані речовини або суміші таких речовин, асаме, їх роз'їдаючу та подразнюючу дію на людей та/чи тварин, тодіможна припустити, що тестована речовина продемонструє такі самірезультати. За таких умов даний хімікат тестувати непотрібно.Негативні результати досліджень структурно пов'язаних речовин абоїх сумішей не дають достатніх доказів про відсутність роз'їдаючоїта подразнюючої дії хімічної речовини під час використаннястратегії поступового тестування. Для визначення можливості ефектуподразнення та роз'їдання шкіри необхідно застосовуватизагальноприйняті та оцінені методи ЗРВ.
Фізичні та хімічні властивості, хімічна активність (Етап 3).Сильнодіючими можуть виявитись хімічні речовини з крайнімзначенням рН, а саме: <= 2,0 та >= 11,5. Якщо крайнє значення рН єосновним при визначенні роз'їдаючої дії речовини на шкіру, тодітакож можна брати до уваги такі характеристики речовини, яккислотно-лужний резерв (або буферну ємність) (3)(4). Якщо збуферної ємності випливає, що взята речовина не може проявлятироз'їдаючої дії на шкірі, тоді варто далі проводити дослідження,щоб цей факт можна було підтвердити. Для цього застосовуютьзагальноприйняте тестування в пробірці або на живих організмах(коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім ворганізм тварини) - див. етапи 5, 6.
Шкірна токсичність (Етап 4). Якщо хімічна речовинавиявляється досить токсичною після нанесення на шкіру, дослідженняефектів роз'їдання/подразнення шкіри на живих організмах непрактикують, оскільки та кількість речовини, що, як правилозастосовується, може перевищити максимально допустиму дозутоксичності, і, відповідно, призвести до загибелі тварин абоспричинити сильний біль. Крім того, коли проведені накроликах-альбіносах досліди шкірної токсичності показують, що призастосуванні дози в 2000 мг/кг (відносно ваги) або більше, не буловиявлено жодних ознак подразнення чи роз'їдання, подальшідослідження в цьому напрямку непотрібні. Під час оцінки гостроїшкірної токсичності слід враховувати ряд факторів. Так, наприклад,інформації про ураження шкіри може виявитись недостатньо.Тестування та спостереження могли проводитись на інших видахтварин (не на кроликах), які можуть суттєво відрізнятисьчутливістю до хімічної речовини. Також, форма тестованої речовини,що наноситься на тіло тварини, може бути невідповідною для оцінкиефекту роз'їдання/подразнення шкіри (наприклад, розріджуванняречовин для перевірки шкірної токсичності (5)). Проте, в тихвипадках, коли на кроликах проводились добре розроблені таорганізовані експерименти для виявлення шкірної токсичності,отримані в результаті цього негативні результати можна вважатидостатнім доказом того, що хімічна речовина не викликаєподразнення або роз'їдання.
Результати тестів в пробірці або на живих організмах (колидоза вводиться спочатку в ізольовані клітини, а потім в організмтварини) (Етап 5, 6). На тваринах непотрібно тестувати хімічніречовини, які виявили подразнюючу та роз'їдаючу дію під часпроведення спеціально розроблених для цього тестів в пробірці абона живих організмах (коли доза вводиться спочатку в ізольованіклітини, а потім в організм тварини) (6)(7). Можна припустити, щотакі хімікати продемонструють подібні шкідливі ефекти під часекспериментів на живих організмах (де доза вводиться одразу ворганізм тварини).
Тести на кроликах (Етап 7, 8). У випадку, якщо буде прийняторішення про застосування аналізу фактичної ваги для проведеннятестування на живих організмах, починати необхідно з початковоготесту на одній тварині. Якщо результати покажуть, що речовина маєподразнюючу/роз'їдаючу дію, тоді подальше тестування непотрібно.І, навпаки, коли в першому тестуванні такого ефекту неспостерігається, необхідно взяти ще двох додаткових тварин іпровести над ними експеримент для підтвердження ефекту роз'їданняабо подразнення шкіри. Якщо ефект подразнення спостерігається вжев початковому тестуванні, тоді тест-підтвердження проводятьпоетапно або тестуючи двох тварин одночасно.
ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report onthe OECDWorkshop on Harmonisation of Validation and AcceptanceCriteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held onSolna, Sweden, 22-24 January 1996(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard ClassificationSystem for Human Health and Environmental Effects ow ChemicalSubstances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the ChemicalsCommittee and the Working Party on Chemicals, November 1998(http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A.,Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M., (1998). AnEvaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for SkinCorrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H.,(1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin owPreparations Containing Acidic or Alkaline Substances, WithoutTesting on Animals. Toxicology In Vitro, 2(1), p. 19-26.
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal,Human, and In Vitro Test Methods for Predicting Skin Irritation,in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors):Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1-56032-356-6, Chapter 31,p. 411-436.
(6) Testing Method B.40.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. andLiebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on invitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by theManagement Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
Малюнок
СТРАТЕГІЯ ТЕСТУВАННЯ
ТА ОЦІНКИ ШКІРНОГО ПОДРАЗНЕННЯ/РОЗЇДАННЯ
Діяльність Результат Висновок
-----------------
1. |Існуючі дані | Роз'їдання Найвищий показник;
|про ефект | вважається роз'їданням.
|ураження шкіри | Тестування непотрібно.
|або слизової |
|оболонки людини| Подразнення Найвищий показник;
|та/чи тварини | вважається подразненням.
----------------- Тестування непотрібно.
|
| Ефект Найвищий показник;
| подразнення/ ефект
| роз'їдання подразнення/роз'їдання
| відсутній відсутній
| Тестування непотрібно.
|
|
|
|
\/
Інформація відсутня або непереконлива
-----------------
2. |Проведіть | Передбачається Вважається роз'їданням.
|оцінку ЗРВ | сильне Тестування непотрібно.
|на предмет | ураження шкіри
|роз'їдання/ |
|подразнення | Передбачається Вважається подразненням.
|шкіри | подразнення шкіри Тестування непотрібно.
-----------------
|
|
|
\/
Прогнозування неможливе
або не допускає роз'їдання
чи негативного результату
-----------------
3. |Виміряйте рН | рН <= 2,0 та >= 11,5 Роз'їдання допускається.
|(враховуючи | (при великій Тестування непотрібно.
|буферну | буферній ємності,
|ємність, якщо | якщо потрібно)
|потрібно) |
-----------------
|
\/
2 < рН < 11,5 або рН <= 2,0 та >= 11,5
при малій буферній ємності/або її
відсутності, якщо потрібно
-----------------
4. |Проведіть | Сильна токсичність Потрібне подальше
|оцінку даних | тестування.
|про |
|систематичну | Ефект Роз'їдання/подразнення
|токсичність дії| роз'їдання/подразнення не допускається.
|на шкіру(1) | відсутній під час Подальше тестування
----------------- тестування на кроликах непотрібно.
| при обмеженій дозі, що
| становить 2000 мг/кг
| або більше
\/
Така інформація недоступна
або вважається непереконливою
-----------------
5. |Необхідно | Роз'їдання Роз'їдання допускається
|провести | під час досліду на живих
|оцінені та | організмах. Подальше
|загально- | тестування непотрібно.
|прийняті |
|тестування в |
|пробірці та на |
|живих |
|організмах |
|(коли доза |
|вводиться |
|спочатку в |
|ізольовані |
|клітини, а |
|потім |
|в організм |
|тварини) на |
|предмет |
|роз'їдання |
|шкіри |
-----------------
|
\/
Речовина не має роз'їдаючої дії
-----------------
6. |Необхідно | Подразнення Роз'їдання допускається
|провести | під час досліду на живих
|оцінні та | організмах. Подальше
|загально- | тестування непотрібно.
|прийняті |
|тестування в |
|пробірці та |
|на живих |
|організмах |
|(коли доза |
|вводиться |
|спочатку в |
|ізольовані |
|клітини, а |
|потім в |
|організм |
|тварини) на |
|предмет |
|подразнення |
|шкіри |
-----------------
|
\/
Коли відсутні загальноприйняті
методи тестування в пробірці або
на живих організмах (коли хімікат
спочатку вводиться в клітину
ізольовано) на предмет подразнення
шкіри, або хімічна речовина
не викликає подразнення
-----------------
7. |Проведіть | Сильне ураження Ефект роз'їдання.
|початковий тест| шкіри Подальше тестування
|над кроликом | непотрібно.
|(лише одна |
|тварина) |
-----------------
|
\/
Сильного ураження немає
-----------------
8. |Проведіть тест-| Роз'їдання або Ефект роз'їдання або
|підтвердження | подразнення подразнення.
|на ще одній | Подальше тестування
|або двох | непотрібно.
|тваринах |
----------------- Відсутність Немає ефекту роз'їдання
роз'їдання або чи подразнення.
подразнення Подальше тестування
непотрібно.
----------------
(1) береться до уваги перед Етапом 2, 3.
B.5. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: ПОДРАЗНЕННЯ ОКА/РОЗ'ЇДАННЯ
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у ТІОЕСР 405 (2002).
1.1. ВСТУП
При підготовці цього оновленого методу особлива увагаприділялася можливості вдосконалення шляхом оцінки наявноїінформації щодо досліджуваної речовини з метою уникнення зайвихдосліджень на лабораторних тваринах, враховуючи, таким чином,питання захисту тварин. Цей метод містить наступну рекомендацію:перш ніж проводити описане дослідження гострого подразненняока/роз'їдання in vivo, потрібно здійснити аналіз вагомихдоказів (1) на основі існуючих відповідних даних. Якщо наявнихданих недостатньо, рекомендується розробляти їх шляхомзастосування послідовних тестувань (2)(3). Стратегія тестуваньвключає виконання затверджених і прийнятих досліджень in vitro ірозглядається в Додатку до методу дослідження. Додатковорекомендується застосування дослідження подразнення/роз'їдання нашкірі in vivo для передбачення подразнення ока, перш ніж проводитидослідження на оці живих організмів.
В інтересах як фундаментальної науки, так і захисту тварин,не слід вдаватися до досліджень in vivo до проведення оцінкиметодом аналізу вагомих доказів всіх доступних даних, щостосуються потенційної корозійної активності/подразнення речовиноюока. Такі дані включатимуть дані, отримані з існуючих дослідженьна людях та/або лабораторних тваринах, дані щодо корозійноїактивності/подразнення однієї або більше структурно подібнихречовин або суміші таких речовин, дані, що демонструють високукислотність або лужність речовини (4)(5), та результатизатверджених і прийнятих досліджень роз'їдання/подразнення шкіри влабораторних умовах і на неживих організмах (6)(6a). Дослідженняпотрібно проводити до проведення аналізу вагомих доказів, абопісля проведення цього аналізу.
Для певних речовин такий аналіз може означати необхідність впроведенні дослідження на живих організмах роз'їданняока/потенціалу подразнення речовини. В усіх зазначених випадкахперед проведенням випробування на оці живого організму доцільнопровести спочатку дослідження впливу речовини на шкіру і оцінитирезультати згідно з методом випробування B.4 (7). Застосуванняметоду аналізу вагомих доказів і стратегії послідовних випробуваньзменшує потребу в проведенні випробувань на живих організмах длявиявлення корозійної активності/подразнення для речовин, щодо якихвже отримано достатньо результатів у ході інших досліджень. Якщовизначення корозійного потенціалу або потенціалу подразнення щодоока не може бути виявлене за допомогою стратегії послідовнихвипробувань, навіть після застосування дослідження впливуроз'їдання або подразнення на шкіру живих організмів, можливепроведення дослідження впливу роз'їдання/подразнення на око живихорганізмів.
Стратегія послідовних випробувань, що включає в себезастосування затверджених досліджень роз'їдання/подразнення влабораторних умовах та на неживих організмах, якій надаєтьсяперевага, внесена у Додаток до цього методу випробування.Стратегію було розроблено і одностайно рекомендовано учасникамисемінару ОЕСР, а також було внесено як рекомендовану стратегіювипробувань у склад Всесвітньо Гармонізованої Системи КласифікаціїХімічних Речовин (ВГС) (9). Рекомендується використовувати цюстратегію випробувань перед проведенням випробувань на живихорганізмах. Для нових речовин рекомендований поетапний підхід довипробувань з метою отримання науково вагомих даних щодокорозійної активності/подразнення речовини. Для існуючих речовин,щодо яких немає достатньої кількості даних пророз'їдання/подразнення очей і шкіри, ця стратегія застосовується зметою заповнення прогалин у даних. Використання іншої стратегіїабо процедури випробувань, або рішення не використовуватипоетапний підхід до випробувань має бути виправданим.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Подразнення ока: зміни в оці, викликані застосуваннямдосліджуваної речовини до зовнішньої поверхні ока, які повністюзворотні впродовж 21 дня після застосування.
Роз'їдання очей: пошкодження тканини ока або серйозні фізичнірозлади зору, викликані застосуванням досліджуваної речовини дозовнішньої поверхні ока, які повністю зворотні впродовж 21 дняпісля застосування.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Речовина, що випробовується, застосовується в одиничній дозідо одного з очей піддослідної тварини; неушкоджене оковикористовується в якості контрольного. Ступіньподразнення/роз'їдання ока розраховується шляхом оцінюванняпошкоджень кон'юнктиви, роговиці і райдужної оболонки черезвизначені проміжки. Інші впливи на око і шкідливі для здоров'ясистемні впливи також описані для повноти оцінки впливів.Тривалість дослідження має бути достатньою для оцінки зворотностіабо незворотності впливів.
Тварини, що демонструють постійні ознаки сильних стражданьта/або болю на будь-якому етапі досліджень, підлягають знищеннюгуманним способом, а речовині надається відповідна оцінка.Критерії для прийняття рішення щодо гуманного знищення помираючихабо сильно страждаючих тварин можна знайти за посиланням(10).
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка до досліджень на живих організмах
1.4.1.1. Вибір біологічних видів
Кролик-альбінос якнайкраще підходить для лабораторнихдосліджень; для досліджень обирають здорових молодих дорослихтварин. Для використання інших ліній біологічних видів потрібнеобґрунтування.
1.4.1.2. Підготовка тварин
Огляд обох очей кожної з попередньо вибраних піддосліднихтварин проводиться за 24 години до початку випробування. Тварини,що мають прояви подразнення очей, ушкодження очей або вже існуючіураження рогівки, не підлягають використанню.
1.4.1.3. Умови утримання і годування
Тварин потрібно утримувати окремо. Температура у приміщенні,де утримуються піддослідні тварини має становити 20 град.C(+- 3 град.C) для кроликів. Хоча відносна вологість має становитипринаймні 30% і не перевищувати 70%, крім часу прибиранняприміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітлення має бутиштучним, у наступній послідовності: 12 годин світла, 12 годинтемряви. Стосовно годування, можливе використання узгодженихлабораторних дієт з безперервним постачанням питної води.
1.4.2. Процедура дослідження
1.4.2.1. Застосування досліджуваної речовини
Досліджувану речовину слід помістити в кон'юнктивальний мішокодного ока кожної тварини після того, як обережно відтягли нижнюповіку від очного яблука. Потім повіки слід обережно притиснутиодна до одної впродовж однієї секунди з метою запобігання втратиречовини. Інше око, що залишається неушкодженим, використовуєтьсяв якості контрольного.
1.4.2.2. Зволоження
Очі піддослідних тварин не слід промивати протягом принаймні24 годин після введення досліджуваної речовини, окрім випадківвведення твердих речовин (див. Розділ 1.4.2.3.2) та негайногороз'їдаючого або подразнюючого ефекту. Через 24 години можна увипадку необхідності промити око.
Використання супутньої групи тварин для вивчення впливупромивання не рекомендується, якщо це не є науково обґрунтованим.Якщо є потреба в супутній групі, слід використати двох кроликів.Умови промивання, як от: час промивання, склад і температурарозчину для промивання, тривалість, об'єм рідини і швидкістьзастосування, необхідно ретельно задокументувати.
1.4.2.3. Рівень дозування
1.4.2.3.1. Тестування рідин
Для тестування рідин використовується доза 0,1 мл. Спрей зрозпилювачем не використовується для введення речовинибезпосередньо в око. Рідкий спрей слід виштовхувати і збирати вконтейнер перед введенням дози 0,1 мл в око.
1.4.2.3.2. Тестування твердих речовин
При тестуванні твердих речовин, паст і порошкових речовин,кількість використовуваної речовини має становити 0,1 мл або небільше 100 мг. Досліджуваний матеріал має бути подрібненим надрібний пил. Об'єм твердого матеріалу слід вимірювати післяобережного ущільнення, наприклад, шляхом постукування мірногоконтейнера. Якщо тверда досліджувана речовина не вивелася з окапіддослідної тварини завдяки фізіологічним механізмам в першийпроміжок спостереження впродовж однієї години після втручання, окоможна промити сольовим розчином або дистильованою водою.
1.4.2.3.3. Тестування аерозолів
Рекомендується зібрати спреї з розпилювачем і аерозолі передзакапуванням в око. Єдиний виняток становлять речовини взапресованих аерозольних контейнерах, які неможливо зібрати черезвипаровування. В таких випадках око слід тримати відкритим, адосліджувану речовину ввести в око простим викидом тривалістю біляоднієї секунди на відстані 10 см прямо перед оком. Ця відстаньможе варіюватися в залежності від тиску розпилювача і його вмісту.Необхідно подбати про те, щоб не пошкодити око тиском розпилювача.У випадках, коли це є доцільним, може виникнути потреба вимірятипотенціал "механічного" пошкодження ока силою розпилювача.
Оцінка дози аерозолю може проводитись за допомогою наступногоспособу моделювання випробування: речовина розпилюється на папірдля зважування через отвір розміром з око кролика, розташованийбезпосередньо перед папером. Збільшення ваги паперувикористовується для визначення приблизної кількості речовини,розпиленої в око. Для летючих речовин дозу можна оцінити, зважуючиприймаючий контейнер до та після видалення досліджуваногоматеріалу.
1.4.2.4. Початкове тестування (дослідження впливуроз'їдання/подразнення на око живого організму з використаннямоднієї тварини)
Як зазначено в стратегії послідовних випробувань(див. Додаток 1), наполегливо рекомендується проведеннядослідження на живому організмі, використовуючи спочатку однутварину.
Якщо результати випробування показують, що речовина єроз'їдаючою або викликає сильне подразнення ока за умовивикористання описаної процедури, подальші дослідженняподразнюваності ока необхідно припинити.
1.4.2.5. Місцева анестезія
Місцева анестезія може використовуватись в окремих випадках.Якщо аналіз вагомих доказів показує, що речовина потенційно можевикликати біль, або попередні випробування виявили можливістьболісних реакцій, можливе застосування місцевої анестезії передзакапуванням досліджуваної речовини. Тип, концентрацію і дозумісцевої анестезії слід ретельно добирати, щоб переконатися, щорізниця в реакції на досліджувану речовину не є результатомвикористання анестезії. Контрольне око також має бутианестезоване.
1.4.2.6. Підтверджувальне тестування (дослідження впливуподразнення на око живого організму з використанням додатковихтварин)
Якщо роз'їдаючого впливу під час початкового тестування неспостерігалось, подразнення або негативна реакція має бутипідтверджена використанням додатково до двох тварин. Якщо під часпочаткового випробування спостерігався сильний подразнюючий ефект,що вказує на можливий сильний (незворотній) вплив під часпідтверджувального випробування, рекомендується проводитипідтверджувальне випробування послідовним способом на однійтварині за один раз, а не з використанням двох додаткових тваринодночасно. Якщо у другої тварини проявляється роз'їдаючий абосильний подразнюючий ефект, випробування не продовжують. Дляпідтвердження слабких або помірних реакцій подразнення можевиникнути потреба в використанні додаткових тварин.
1.4.2.7. Період спостереження
Тривалість періоду спостереження має бути достатньою дляповної оцінки величини та зворотності виявлених впливів. Проте,експеримент слід припинити на будь-якому етапі, якщо тваринадемонструє постійні ознаки сильного болю або страждань(9). Длявизначення зворотності впливів необхідно спостерігати за твариноювпродовж 21 дня після застосування досліджуваної речовини. Якщозворотні ефекти спостерігається раніше, ніж через 21 день, слідприпинити експеримент в цей момент.
1.4.2.7.1. Клінічні спостереження і класифікація реакцій ока
Очі необхідно оглянути через 1, 24, 48 і 72 години післязастосування досліджуваної речовини. Тварин слід піддаватидослідженням не довше, ніж потрібно для отримання остаточноїінформації. Тварини, що демонструють постійний сильний біль абостраждання, підлягають невідкладному знищенню гуманним способом, аречовині дається відповідна оцінка. Тварини з наступнимиураженнями ока після закапування підлягають знищенню гуманнимспособом: рогівкова перфорація або значна кількість рогівковихвиразок включаючи стафілому; кров у передній камері ока;непрозорість рогівки 4 ступеню, що зберігається впродовж 48 годин;відсутність реакції зіниці на світло (реакція райдужки другогоступеню), що зберігається впродовж 72 годин; утворення виразоккон'юнктивальної мембрани; некроз кон'юнктиви або мигальноїперетинки; або відторгнення некротичних мас. Такі ураженнязазвичай є незворотними.
Тварини, у яких ураження ока не прогресують, можуть бутизнищені не раніше, ніж через три дні після закапування. Затваринами з м'якими або помірними ураженнями потрібно спостерігатидо того, як вони зникнуть, або впродовж 21 дня, тобто дозакінчення дослідження. Спостереження необхідно проводити через 7,14 та 21 день з метою визначення статусу уражень, а також їхзворотності або незворотності.
Ступінь реакцій ока (кон'юнктиви, роговиці і райдужноїоболонки) потрібно фіксувати при кожному огляді (Таблиця 1). Провсі інші ураження ока (наприклад, паннус, забарвлювання) абошкідливі для здоров'я системні впливи також потрібно повідомляти.
Перевірка реакцій може бути полегшена використаннямбінокулярної лупи, ручної щілинної лампи, біомікроскопу або іншоговідповідного приладу. Після запису спостережень через 24 годиниможливе проведення подальшого огляду за допомогою флуоресцину.
Класифікація реакцій ока обов'язково є суб'єктивною. Длягармонізації процесу класифікації реакцій ока і з метою допомогидослідним лабораторіям і тим, хто бере участь у здійсненні таінтерпретації спостережень, персонал, що проводить спостереження,має бути відповідно проінструктованим щодо використовуваноїсистеми оцінювання.
2. ДАНІ
2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Оцінку подразнення ока слід проводити в поєднанні з оцінкоюприроди та сили уражень, та їх зворотності чи їх відсутності.Індивідуальна оцінка не являє собою абсолютного стандарту щодоподразнюючих якостей матеріалу, тому інші впливи досліджуваногоматеріалу також оцінюються. Навпаки, індивідуальну оцінку не слідрозглядати як опорну величину; вона є суттєвою тільки тоді, колипідтверджується повним описом і оцінкою всіх спостережень.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:
Обґрунтування для дослідження на живому організмі: аналізвагомих доказів, отриманих з вже існуючих випробувань, включаючирезультати, отримані за допомогою стратегії послідовнихвипробувань.
- опис відповідних даних попередніх тестувань,
- дані, отримані з кожного етапу стратегії тестування,
- опис здійснених тестувань в лабораторних умовах, включаючидеталі процедур, результати, отримані щодо досліджуваних/еталоннихречовин,
- опис здійснених досліджень впливу подразнення/роз'їдання нашкіру живого організму, включаючи отримані результати,
- аналіз вагомих доказів для здійснення дослідження на живомуорганізмі.
Досліджувана речовина:
- ідентифікаційні дані (наприклад, номер РСХ (Реферативноїслужби з хімії), джерело, ступінь очищення, відомі домішки, номерпартії),
- фізична природа і фізико-хімічні властивості
( наприклад,pH, летючість, розчинність, стабільність, реактивність з водою)
, - у випадку використання суміші, склад і процентний вмісткомпонентів,
- при використанні місцевої анестезії, ідентифікація, ступіньочищення, тип, доза та потенційна взаємодія з досліджуваноюречовиною.
Розчинник:
- ідентифікація, концентрація (якщо потрібно), використанийоб'єм,
- обґрунтування для вибору розчинника.
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,обґрунтування для використання інших тварин, окрімкроликів-альбіносів,
- вік кожної тварини на початку дослідження,
- кількість тварин кожної статі в піддослідній і контрольнійгрупах (якщо вимагається),
- вага кожної тварини на початку і наприкінці випробування,
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
Результати:
- опис методу, використаного для оцінювання ступенюподразнення в кожний період спостереження (наприклад, ручноїщілинної лампи, біомікроскопу або іншого відповідного приладу),
- табличні дані реакції подразнення/роз'їдання для кожноїтварини в кожний період спостереження до вилучення кожної твариниз процесу випробування,
- текстовий опис ступеню і природи подразнення абороз'їдання, що спостерігалося,
- опис всіх інших уражень ока (наприклад, васкуляризація,утворення паннуса, рубці, забарвлювання),
- опис місцевих і системних шкідливих для здоров'я впливів наінші органи, крім очей, та гістопатологічні показники, якщо вониє.
Обговорення результатів.
3.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Екстраполяція результатів досліджень подразнення ока улабораторних тварин дійсна для людини тільки до певної міри. Вбагатьох випадках кролик-альбінос проявляє більшу чутливість доподразнюючих або роз'їдаючих око речовин, ніж людина.
Потрібна обережність в інтерпретації даних з метою виключенняподразнення, спричиненого вторинною інфекцією.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes,R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray,T.J. B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L.,Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use ofAlternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM WorkshopReport 8. ATLA 23, p. 410-429.
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux,P., Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E.,Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of EyeIrritation Potential: Statistical Analysis and Tier TestingStrategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.
(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach forevaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161-177
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H.,(1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin ofPreparations Containing Acidic or Alkaline Substance WithoutTesting on Animals. ToxicollogyIn Vitro, 2, p. 19-26.
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the EyeIrritation Potential of Solutions Prepared at a SinglepH.J.Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. andLiebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on invitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by theManagement Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermalirritation/corrosion.
(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Reportof the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and AcceptanceCriteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held inSolna, Sweden, 22-24 January 1996(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(9) OECD, (1998) Harmonised Integrated Hazard ClassificationSystem for Human Health and Environmental Effects of ChemicalSubstances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the ChemicalsCommittee and the Working Party on Chemicals, November 1998(http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition,Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints forExperimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD EnvironmentalHealth and Safety Publications. Series on Testing and AssessmentNo 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.
Таблиця 1
КЛАСИФІКАЦІЇ УРАЖЕНЬ ОКА
Рогівка
Непрозорість: ступінь щільності (виміри слід
проводити в найщільнішій області)(*)
Немає утворення виразок або непрозорост ................... 0
Окремі або розсіяні області непрозорості (крім незначного
помутніння від звичайного відблиску); елементи райдужки чітко видимі .................................................... 1
Легко визначається напівпрозора область; елементи райдужки
мають незначне затемнення ................................. 2
Перламутрова область; елементи райдужки невидимі;
розмір зіниці майже не визначається ....................... 3
Мутна рогівка, райдужка не визначається
через непрозорість ........................................ 4
Максимально можливо: 4
ПРИМІТКИ
(*) Необхідно відмітити область помутніння рогівки
Райдужка
Нормальна ................................................. 0
Помітно поглиблені зморшки, гіперемія, набухання, помірна
гіперемія навкруги рогівки або ін'єкції; райдужка реагує на
світло (в'яла реакція розглядається як вплив) ............. 1
Крововилив, макроскопічне руйнування або відсутність
реакції на світло ......................................... 2
Максимально можливо: 2
Кон'юнктива
Почервоніння (стосується пальпебральної кон'юнктиви та
кон'юнктиви очного яблука, за винятком рогівки та райдужки)
Нормальна ................................................. 0
Деякі кровоносні судини є гіперемічними (ін'єктованими) ... 1
Розпливчастий, малиновий колір; окремі судини неможливо
легко визначити ........................................... 2
Розпливчастий яскраво червоний ............................ 3
Максимально можливо: 3
Хемоз
Набухання (стосується повік та/або мигальних перетинок)
Нормальна ................................................. 0
Набухання дещо вище норми ................................. 1
Очевидне набухання з частковою еверсією повік ............. 2
Набухання з майже наполовину закритими повіками ........... 3
Набухання з повіками, закритими більш ніж наполовину ...... 4
Максимально можливо: 4
Додаток
Стратегія проведення
послідовних досліджень подразнення
та роз'їдання ока
ЗАГАЛЬНИЙ ОГЛЯД
В інтересах фундаментальної науки і захисту тварин важливоуникати зайвого використання тварин та мінімізувати випробування,що можуть викликати важкі реакції у тварин. Необхідно оцінити всюінформацію стосовно подразнення/роз'їдаючої активності речовинидля ока перш ніж проводити дослідження in vivo. Вже отриманодостатньо результатів для класифікації досліджуваної речовини зточки зору її потенціалу роз'їдання або подразнення ока, і немаєпотреби проводити випробування на лабораторних тваринах. Отже,застосування аналізу вагомих доказів та стратегії послідовнихвипробувань мінімізує потребу у проведенні випробувань in vivo,особливо якщо речовина може викликати важкі реакції.
Для оцінки існуючої інформації щодо подразнення та роз'їданняочей речовинами та з метою визначення необхідності проведенняінших, не in vivo, досліджень на оці з метою визначення такогопотенціалу рекомендується застосування аналізу вагомих доказів.Якщо виникне потреба в подальших дослідженнях, рекомендуєтьсязастосування стратегії послідовних тестувань для подальшоїрозробки відповідних експериментальних даних. Для речовин, які немають історії тестувань, необхідно використовувати стратегіюпослідовних досліджень для оцінки роз'їдання/подразнення очей.Стратегію тестувань, описану в цьому Додатку, було розроблено насемінарі ОЕСР (1). Вона була затверджена і доповнена вГармонізованій інтегрованій системі класифікації загроз здоров'юлюдини, спричинених хімічними речовинами, та їх впливом нанавколишнє середовище, що було підтверджено на 28-му спільномузасіданні Комітету Хіміків і Робочої Групи Хіміків у листопаді1998 року (2).