ТЕСТУВАННЯ ДОЗАМИ, ЩО ПЕРЕВИЩУЮТЬ 2000 МГ/КГ
З метою охорони тварин та гуманного ставлення до нихзабороняється тестування тварин за Категорією 5 (5000 мг/кг), ідозволяється лише в тих випадках, коли є велика ймовірність того,що отримані результати можуть бути безпосередньо пов'язані зохороною здоров'я людини та захистом тварин (10). Подальшетестування із застосуванням більших доз непотрібно.
Якщо тестування є необхідним, тоді потрібно виконувати лишеодин його етап з дозою 5000 мг/кг. У випадку, якщо перша тваринапомирає в ході експерименту, подальше тестування проходить звикористанням дози 2000 мг/кг, як показано в блок-схемахДодатку 1. І, навпаки, коли тварина виживає, дозують двохнаступних. Якщо вмирає тільки одна з трьох тварин, є ймовірністьтого, що показник НД може бути більшим за 5000 мг/кг. Коли
50
вмирають обидві тварини, дозування продовжують з 2000 мг/кг.
Додаток 3
В.2. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (ВДИХАННЯ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Бажано мати попередню інформацію про гранулометричний складречовини, тиск пари, температуру плавлення, температуру кипіння,загорання та вибуху (якщо є).
Див. також Вступ до Частини В (А).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Див. Вступ до Частини В (В).
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Декілька груп з піддослідними тваринами піддають дії хімічноїречовини в різних концентраціях - по одній на групу. Потімспостерігають вплив речовини та пов'язані з цим летальні випадки.Померлим під час тесту тваринам роблять розтин, і після закінченняексперименту тваринам, що вижили, також роблять розтин.
Тварин, що виявляють гострі ознаки нездужання та болю, занеобхідності, позбавляють життя гуманним способом. Не дозволяєтьсязастосовувати такі дози хімічних речовин, в результаті роз'їдаючоїабо подразливої дії яких виникає сильний біль чи нездужання.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ
1.6.1. Підготовка
Необхідно, щоб не менше п'яти днів до початку експериментутварини перебували в спеціальних умовах утримання та годування. Допочатку тестування тварини навмання вибирають та розподіляють напевну кількість груп. Моделювання ситуації, коли тварин піддаютьдії препарату, непотрібно, якщо це не передбачено приладом, якийзастосовуватиметься при тестуванні.
Сухі тверді речовини при потребі подрібнюють, щобгранулометричні зразки були відповідного розміру.
Якщо необхідно отримати відповідну концентрацію речовини ватмосфері, дозволяється додавати необхідну технологічну рідину тавикористовувати апаратний контроль за рідиною. У випадку, якщозастосовуються добавки або інші технологічні рідини, необхідноотримати про них необхідну інформацію, щоб не викликати токсичнихефектів. Можна використовувати дані за минулі періоди.
1.6.2. Умови тестування
1.6.2.1. Тварини в ході експерименту
Перевага віддається щурам, якщо немає інших вказівок. Прицьому застосовуються спеціальні лабораторні види тварин. На моментпроведення тесту необхідно, щоб вага тварин кожної статі неперевищувала +- 20% середнього показника.
1.6.2.2. Кількість та стать тварин
Для кожного рівня концентрації використовують не менше10 гризунів (по п'ять особин кожної статі). Важливо, щоб самки дотого ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство.
Примітка: в тестах для визначення гострої токсичності, якийпіддаються тварини вищого від гризунів виду, кількість тваринповинна бути меншою. Дозування при цьому ретельно розподіляютьтак, щоб не перевищити середню дозу токсичності. Під часпроведення таких тестів слід уникати доз, в результаті дії якихможе настати летальний кінець.
1.6.2.3. Концентрації доз
Їх повинна бути достатня кількість - не менше трьох, з такимінтервалом, щоб можна було виявити ознаки токсичності в тварин тапоказники смертності. Такої інформації повинно бути достатньо длятого, щоб побудувати криву концентрації смертності, і, якщо єможливість, визначити НД . 1.6.2.4. Граничного тесту.
50
1.6.2.4. Граничний тест
Якщо в результаті тестування п'яти самок та п'яти самців звикористанням 20 мг/л газу або 5 доріжок/л аерозолю або порошкупротягом 4 годин (або, якщо таке неможливо через фізико-хімічні тавибухові властивості речовини, максимально можливої концентрації)не буде виявлено суміші, від якої наступає смерть протягом14 днів, - подальше тестування вважається непотрібним (18 АТР,рішення ЄЕС 93/21, L 110/93).
1.6.2.5. Тривалість дії
Тривалість дії - 4 години.
1.6.2.6. Обладнання
Тестування тварин проводять із застосуванням інгаляційногообладнання, яке розроблено таким чином, щоб підтримуватидинамічний потік повітря з 12 повітряних обмінів на годину длятого, щоб був рівномірний розподіл кисню при рівномірному впливіатмосфери. Якщо дослід проводять в камері, необхідно, щоб їїконструкція була такою, щоб мінімізувати скупчення тварин, інадати їм якомога більше можливості вдихнути хімічну речовину. Длятого, щоб була певна стабільність всередині камери, необхідно, якправило, щоб загальний "об'єм" тварин не перевищував 5% від об'ємусамої камери. Використовуються камери для фіксації ротової таносової області тварини або лише голови, або ж застосовують окремікамери для того, щоб тварина могла там розміститись повністю;перші два види камери можуть мінімізувати ризик проходженняхімікату іншими шляхами.
1.6.2.7. Період спостереження
Період спостереження повинен тривати не менше 14 днів. Проте,обмежувати в часі період спостереження непотрібно. Вінвизначатиметься токсичними реакціями, швидкістю появи ознактоксичності та періодом відновлення; при потребі цей період часуочікування збільшують. Важливим є спостереження за тим, коли самез'являються/зникають ознаки токсичності, яка їх тривалість в часі,а також, коли настає летальний кінець, особливо, якщоспостерігається тенденція затримки смерті.
1.6.3. Процедура
Перед початком експерименту тварин зважують, а потім піддаютьвпливу концентрації речовини в призначеному для цього пристроїпротягом 4 годин, після врівноваження з концентрацією камери. Часврівноваження повинен бути коротким. Температура проведення тестувстановлюється на рівні 22 +- 3 град.С. Бажано, щоб відноснавологість повітря становила 30%-70%, а в окремих випадках(наприклад, тестування аерозолів) таких вимог не дотримуються.Якщо всередині камери встановити невеликий від'ємний тиск(>= 5 мм води), тоді це допоможе запобігти витіканню речовининазовні. Під час експерименту тваринам не дають води та їжі.Необхідно використовувати відповідні системи для створення тамоніторингу навколишньої атмосфери в експерименті. Система маєзабезпечити стійкі стабільні умови проведення тесту якомогашвидше. Конструкція камери повинна бути такою, щоб розподілення вній речовини було рівномірним.
У ході моніторингу проводять наступні вимірювання:
(а) швидкість повітряного потоку (постійно);
(b) фактична концентрація тестованої речовини, взятої в зонідихання не менше трьох разів під час експерименту (деякіатмосфери, наприклад, аерозолі високої концентрації можуть непотребувати такого частого моніторингу). У ході експериментурівень концентрації речовини не повинен коливатись більше, ніж на+- 15% від середнього показника. Проте, для деяких аерозолів цьогорівня контролю отримати не вдається, і дозволяється коливанняконцентрації речовини в більших межах. Для аерозолів проводятьаналіз розміру часток стільки разів, скільки необхідно (не меншеодного разу в одній групі тесту);
(c) температура та вологість, якщо можливо - постійно.
Під час проведення експерименту необхідно систематичнозаписувати спостереження. Роблять окремі записи стосовно кожноїтварини. У перший день експерименту спостереження проводять доситьчасто. Необхідно, принаймні, кожного робочого дня робити ретельнийклінічний огляд, а також проводити інші спостереження щодня, щобмінімізувати втрати тварин в ході експерименту (наприклад, розтинабо замороження тварин, знайдених вже мертвими, ізоляція слабких,напівмертвих тварин, а також тих, які зазнають сильного болю).
Під час спостережень потрібно виявляти зміни на шкірі,шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі,системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі.Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності таповедінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являютьсятремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання влетаргічний сон та кому. Необхідно якомога точніше записати чассмерті. Індивідуальну вагу тварин визначають потижнево післяексперименту та на момент смерті.
Тварини, які померли в ході тесту, а також ті, які вижилипісля закінчення експерименту, піддаються розтину. Особливу увагузвертають на зміни у верхніх та нижніх дихальних шляхах. Всізагальні патологічні зміни також записують. В окремих випадкахберуть зразки тканин для гістопатологічного дослідження.
2. ДАНІ
Всі дані підсумовують у вигляді таблиці, в якій стосовнокожної групи вказують наступне: кількість тварин на початку тесту,час смерті окремих тварин, кількість тих тварин, в яких виявленоінші ознаки токсичності, опис токсичних ефектів та результатирозтину. Якщо виживання тварини перевищує норму одного дня,необхідно вирахувати та записати зміни у вазі. Результати щодотварин, яких було гуманним способом позбавлено життя, черезвиявлення в них ознак недомагання сильного болю чи нездужання,записуються, як летальні випадки, причиною яких став гострий більвід приймання хімікату. Показник НД визначається відповідним для
50
цього методом. Оцінка даних повинна включати співвідношення (якщо
такі мають місце) між дією речовини на тварину та ступенем
важкості отриманих в результаті цього відхилень. Сюди входять
аномалії поведінки, клінічні відхилення, загальні ураження, зміни
у вазі, смертність та інші токсичні ефекти.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУВАННЯ
Звітність про результати тестування, якщо можливо, включатиповинна містити наступну інформацію:
- біологічний вид та походження тварин, умови утримання,середовище та харчування тощо,
- умови проведення тестування: опис приладу, де булопроведено експеримент, конструкція, тип, розміри, системанадходження повітря, система генерації аерозолів, методкондиціювання повітря, утримання тварин в тестовій камері, якщотака використовується.
Дані результатів експерименту
Подаються в таблиці з середніми показниками та показникомможливого відхилення (наприклад, стандартне відхилення) і містять,якщо можливо, наступне:
(а) швидкість повітряного потоку через інгаляційний пристрій;
(b) температура та вологість повітря;
(c) номінальні концентрації (загальна кількість тестованоїречовини, введеної в інгаляційний пристрій, поділена на об'ємповітря);
(d) особливості технологічної рідини, якщо таказастосовується;
(e) фактичні концентрації в дихальній зоні тесту;
(f) Мас-медіанний аеродинамічний діаметр (ММАД) таГеометричне стандартне відхилення (ГСВ);
(g) період врівноваження;
(h) час впливу (дії речовини на об'єкт тестування);
- зведення в таблиці отриманих даних про вплив на кожну стать(наприклад, кількість тварин, які померли або були гуманнопозбавлені життя, кількість тварин з ознаками токсичності,кількість тварин в ході експерименту),
- час смерті під час експерименту, причини та критерії дляпозбавлення тварин життя гуманним способом,
- всі інші спостереження,
- показник НД щодо кожної статі - визначається в кінці 50періоду спостереження (визначеним методом розрахунків),
- 95% інтервал довіри для НД (там, де можна отримати такі 50дані),
- крива дозування/смертності, падіння (якщо дозволяє методвизначення),
- результати розтину,
- будь-які гістопатологічні результати,
- обговорення результатів (звернути особливу увагу на те,який вплив на показник НД має гуманне позбавлення тварин життя),
50
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРИТАЦІЯ
Див. Вступ до Частини В (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Див. Вступ до Частини В (D).
В.3. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ (УРАЖЕННЯ ШКІРИ)
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Див. Вступ до Частини В (А).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Див. Вступ до Частини В (В).
1.3. БАЗОВІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Тестована речовина вводиться в шкіру вибраними дозами кількомгрупам піддослідних тварин, по одній дозі на групу. Даліспостерігають ефекти цього дозування та випадки смертності.Тварин, які в ході експерименту помирають, віддають на розтин, атих, які вижили після закінчення тесту, також розтинають.
Тварин, які мають явно виражене наростання болю та сильностраждають, необхідно позбавити життя гуманно. Не потрібнозастосовувати такі дози хімічних речовин, які спричиняють різкийсильний біль та нездужання через свою роз'їдаючу корозійнувластивість.
1.5. КРИТЕРІЙ ЯКОСТІ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.6.1. Підготовка
Протягом п'яти днів до початку експерименту тварин розміщуютьу дослідних клітках, з відповідними умовами утримання тагодування. Перед тестом вибирають навмання молодих та здоровихтварин та групують. Приблизно за 24 години до тесту необхідновидалити шерсть, вирізавши або поголивши ділянку від спини доголови тварини. Важливо це робити обережно, щоб в ході такоїпроцедури не пошкодилась шкіра тварин, оскільки її ураження можевплинути потім на проникність хімічної речовини. Так, необхідно,щоб 10% тіла тварини було чистим від шерсті, для введенняхімікату. У випадку використання сухих твердих хімічних речовинможна застосовувати пульверизатор, а саму речовину потрібнозмочити в достатній кількості води або, при потребі, в іншомутехнологічному розчині для кращого приставання до шкіри. Коливикористовується технологічна рідина, необхідно врахувати її впливна властивість шкіри пропускати хімікат. Як правило, рідини в ходітестування використовують нерозбавленими.
1.6.2. Умови проведення тесту
1.6.2.1. Тварини для експерименту
Беруть дорослого щура або кролика. Якщо доцільно, тоді можнавикористовувати тварин інших видів. Зазвичай беруть лабораторнихтварин. Що стосується ваги, то на момент експерименту, вага особинкожної статі може коливатись від межах +- 20% відносно певногосереднього показника.
1.6.2.2. Стать та кількість тварин
Використовується не менше п'яти тварин однієї статі накожному етапі дозування. Якщо використовуються самки, важливо, щобвони ще не народжували та на момент тесту не чекали потомство.Також, якщо є інформація про те, що одна стать є чутливішою, ніжінша, тоді варто дозувати представників саме цієї статі.
Примітка: в тестах на визначення гострої токсичності, дезадіяні тварини вищого від гризунів виду, кількість тварин повиннабути меншою. Дозування при цьому ретельно розподіляють так, щоб неперевищити середню дозу токсичності. Під час проведення такихтестів слід уникати доз, в результаті дії яких може настатилетальний кінець.
1.6.2.3. Концентрації дозувань
Їх повинна бути достатня кількість - не менше трьох, з такимінтервалом, щоб можна було виявити ознаки токсичності в тварин тапоказники смертності. При фасуванні дози враховують роз'їдаючі такорозійні властивості самої речовини. Такої інформації повиннобути достатньо для того, щоб побудувати криву дозування таотриманих результатів, і, якщо є можливість, - визначити НД .
50
1.6.2.4. Граничний тест
Використовуючи вищеописані процедури можна провестиексперимент із застосуванням дози рівня 2000 мг/кг на вагу тіла наприкладі групи з п'яти тварин, як самок, так і самців. Варіантповного тесту не розглядатиметься, якщо результатом такогоексперименту буде смерть, що наступила внаслідок прийманнязазначеного хімікату.
1.6.2.5. Період спостереження
Період спостереження повинен тривати не менше 14 днів. Проте,обмежувати в часі період спостереження непотрібно. Вінвизначатиметься токсичними реакціями, швидкістю появи ознактоксичності та періодом відновлення; при потребі цей період часуочікування збільшують. Важливим є спостереження за тим, коли самез'являються/зникають ознаки токсичності, яка їх тривалість в часі,а також, коли настає летальний кінець, особливо, якщоспостерігається тенденція затримки смерті.
1.6.3. Процедура
Тварин розміщують в клітках окремо. Хімічну речовинурозподіляють рівномірно, охоплюючи приблизно 10% загальноїповерхні тіла тварини. Якщо використовуються хімікати високоїтоксичності, тоді загальна поверхня тіла тварини, вкрита такоюречовиною, може бути меншою, але так, щоб ця речовинарозподілялась рівномірним тонким шаром.
Протягом періоду усіх 24 годин хімічні речовини при контактіз шкірою повинні бути в марлевій сітці з не подразнюючою клейкоютасьмою. Місце проведення тесту також потім відповідно накривають,щоб речовина з сітки не просочилась, і тварини не могли їїпроковтнути. Утримуючі пристрої необхідні для того, щоб тварина непроковтнула хімікат, але повна фіксація не рекомендується.
Наприкінці експерименту видаляють рештки речовини, і, якщонеобхідно, промивають шкіру водою або чимось іншим.
Під час проведення експерименту необхідно систематичнозаписувати проведення спостережень. Роблять окремі записи прокожну тварину. У перший день експерименту спостереження проводятьдосить часто. Необхідно, принаймні, кожного робочого дня робитиретельний клінічний огляд, а також проводити інші спостереженнящодня, щоб мінімізувати втрати тварин в ході експерименту(наприклад, розтин або замороження тварин, знайдених вже мертвими,ізоляція слабких, напівмертвих тварин, а також тих, які зазнаютьсильного болю).
У процесі спостережень потрібно виявити зміни на шкірі,шерсті, очах, слизовій оболонці, а також в дихальній системі,системі кровообігу, вегетативній та центральній нервовій системі.Також спостерігаються зміни в соматомоторній діяльності таповедінці. Необхідно уважно слідкувати за тим, чи з'являютьсятремтіння та конвульсії, виділення слини, діарея, впадання влетаргічний сон та кому. Необхідно якомога точніше записати чассмерті. Індивідуальну вагу тварин визначають щотижнево післяексперименту та на момент смерті. Тварини, які померли в ходітесту, а також і ті, які вижили після закінчення експерименту,піддаються розтину. Особливу увагу звертають на зміни у верхніх танижніх дихальних шляхах. Всі загальні патологічні зміни такожзаписують. В окремих випадках беруть зразки тканин длягістопатологічного дослідження.
Оцінка токсичності в представників протилежної статі
Після того, як закінчено тестування однієї статі, дозуютьхоча б одну групу з п'яти тварин протилежної статі, щоб визначити,чи ці тварини не є більш чутливими до хімічної речовини. В окремихвипадках може бути доцільним тестувати й меншу кількість тварин.Якщо є достовірна інформація про те, що тварини тієї статі, надякою проводились експерименти, є більш чутливими до взятоїхімічної речовини, тоді проведення подальшого тестування можнауникнути.
2. ДАНІ
Всі дані підсумовують у вигляді таблиці, в якій про кожнугрупу вказують наступне: кількість тварин на початку тесту, чассмерті окремих тварин, кількість тих тварин, у яких виявлено іншіознаки токсичності, опис токсичних ефектів та результати розтину.Якщо виживання тварини перевищує одноденну норму, необхідновирахувати та записати зміни у вазі. Результати, що стосуютьсятварин, яких було гуманним способом позбавлено життя, черезвиявлення в них ознак гострого болю та нездужання, записуються, яклетальні випадки, причиною яких стали гострий біль від прийманняхімікату. Показник НД визначається відповідним для цього
50
методом.
Оцінка даних повинна включати співвідношення (якщо такі маютьмісце) між дією речовини на тварину та ступенем тяжкості отриманиху результаті цього відхилень. Сюди входять аномалії поведінки,клінічні відхилення, загальні ураження, зміни у вазі, смертністьта інші токсичні ефекти.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТАТИ ТЕСТУ
Звітність про результати тесту, якщо можливо, повинна міститинаступну інформацію:
- біологічний вид та походження тварин, умови утримання,середовище та харчування тощо,
- умови проведення тестування (включаючи метод очищення шкіривід шерсті та обробка камери: з накриттям чи без),
- час смерті під час або протягом експерименту, причини такритерії для позбавлення тварин життя гуманним способом,
- рівні дозувань (з використанням технологічної рідини,концентрації),
- стать дозованих тварин,
- введення в таблицю отриманих даних про кожну стать, рівеньдози (наприклад, кількість померлих/позбавлених життя тварин вході тесту, кількість тварин з ознаками токсичності, загальнакількість протестованих тварин),
- час настання смерті після дозування, причини та критеріїдля гуманного позбавлення життя,
- всі інші спостереження,
- показник НД стосовно кожній статі - визначається на 5014 день спостереження (визначеним методом розрахунків),
- 95% інтервал довіри для НД (там, де можна отримати такі 50дані),
- крива дозування/смертності, падіння (якщо дозволяє методвизначення),
- результати розтину,
- будь-які гістопатологічні результати,
- результати будь-якого тесту стосовно протилежній статі,
- обговорення результатів (звернути особливу увагу на те,який вплив на показник НД матиме гуманне позбавлення тварин
50
життя),
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРИТАЦІЯ
Див. Вступ до Частини В (D).
4. ПОСИЛАННЯ
Див. Вступ до Частини В (Е).
В.4. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ: УРАЖЕННЯ/РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ
1. МЕТОД
Даний метод є еквівалентним ТІ (Тестовим інструкціям) ОЕСР404 (2002).
1.1. ВСТУП
Під час підготовки та розробки цього вдосконаленого методуособливу увагу приділяли питанням модернізації охорони тварин,оцінці існуючої інформації про хімічну речовину, з метою можливогоуникнення потреби проведення лабораторних дослідів на тваринах.Даним методом рекомендується аналізувати фактичну вагу тварин напідставі існуючої відповідної інформації перед самим проведеннямдослідження на живих істотах (тести на роз'їдання та ураженняшкіри). Якщо для такої оцінки немає достатньо даних, тоді їх можнаотримати з наступного тесту (1). Стратегія тестування включаєвиконання дійсних та загальноприйнятих тестів у пробірці, іподається, як Додаток до даного методу. Крім того, в ходіпочаткового тесту в пробірці рекомендується поступове, а неодночасне, застосовування до тварини трьох тестових зразків.
З метою дотримання правил охорони тварин та розумногонаукового підходу необхідно утриматись від проведення тестів наживих організмах до тих пір, поки не буде оцінено дію хімічноїречовини (роз'їдання/ураження шкіри) методом аналізу фактичноїваги. До таких даних входять лабораторні дослідження на людяхта/або тваринах, докази роз'їдання речовиною або кількомаструктурно подібними речовинами або сумішами таких речовин, дані,що показують високу кислотність або лужність речовини (2)(3), атакож результати дійсних загальноприйнятих тестів на живихорганізмах (коли доза вводиться спочатку в ізольовані клітини, апотім в організм) та в пробірці (4)(5)(5а). Такий метод аналізуповинен зменшити потребу в проведені тесту на живих істотах напредмет виявлення роз'їдання/ураження шкіри хімікатами, про діюяких вже є достатньо інформації з інших тестів.
Перевага надається стратегії послідовного тестування, якаполягає в проведенні експериментів в пробірці або колишніхдосліджень на живих організмах на предмет роз'їдання/ураженняшкіри. Дана стратегія подається, як Додаток до цього Методу. Такастратегія була розроблена, одностайно рекомендована учасникамисемінару ОЕСР (6) та прийнята, як рекомендована стратегіятестування Глобальної Гармонізованої Системи (ГГС) класифікаціїхімічних речовин (7). Дану стратегію рекомендується застосовуватиперед виконанням дослідів на живих організмах. Що стосуєтьсяістотно нових хімічних речовин, то рекомендується поступовийпідхід до тестування для розробки науково обґрунтованих даних щодоураження/роз'їдання речовиною поверхні об'єкта експерименту. Якщойдеться про вже існуючі речовини, про які немає достатньоінформації щодо ефекту ураження/роз'їдання, тоді описана стратегіяповинна заповнити такі прогалини. Можливе впровадження іншоїметодики або стратегії, а також прийняття рішення щодо відмовизастосування поступового підходу. Проте, необхідно обґрунтуватидоцільність таких рішень.
Якщо не вдається визначити корозійну активність або ефектураження/подразнення за допомогою аналізу фактичної ваги,сумісного зі стратегією поступового тестування, необхіднорозглянути можливість тестування на живих організмах протягом4 годин.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Ураження/подразнення шкіри: завдання шкірі оборотної шкодипісля застосування тестованої речовини протягом 4 годин.
Роз'їдання шкіри: завдання шкірі необоротної шкоди; тобто,візуально спостерігається омертвіння епідерму шкіри, післязастосування тестованої речовини протягом 4 годин. Типовимиознаками реакції роз'їдання є виразки, кровотечі, криваві струпи,і наприкінці 14-го дня експерименту відбувається зміна кольоручерез відбілювання шкіри, спостерігаються великі ділянки облисіннята шрами. Деякі ураження викликають спірні запитання, томурекомендується гістопатологія.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ
Хімічну речовину, що є предметом тестування, наносять однієюдозою на шкіру піддослідної тварини; неуражені ділянки шкіриякості слугують для порівняння. Показник рівня роз'їдання шкіризчитується та записується через певні інтервали, і описується далідля того, щоб забезпечити повну оцінку отриманих результатів.Дослідження повинно тривати стільки, щоб оцінити можливістьоборотності/необоротності отриманих ефектів.
Тварин, які виявляють ознаки тривалих страждань та гострогоболю на будь-якому з етапів тестування, необхідно позбавити життягуманним способом. Критерії прийняття рішень щодо гуманностіпозбавлення життя тварин, які знаходяться в передсмертному стані,можна знайти в посиланні (8).
1.4. ОПИС МЕТОДУ
1.4.1. Підготовка до проведення тесту на живих організмах
1.4.1.1. Вибір виду тварин
В якості найкращої лабораторної тварини підходитькролик-альбінос та молоді дорослі кролі загалом. Доцільністьвикористання інших видів тварин повинна бути відповіднообґрунтована.
1.4.1.2. Підготовка тварин
Приблизно за 24 години до початку тесту необхідно видалитишерсть, вирізавши шерсть або поголивши ділянку від спини до головитварини. Важливо це робити обережно, щоб в ході такої процедури непошкодилась шкіра тварин, тому варто вибирати лише тварин зіздоровою, неушкодженою шкірою.
1.4.1.3. Умови утримання та годування
Тварин необхідно тримати окремо. Температура векспериментальних приміщеннях, де утримують кролів повинна бути вмежах 22 град.С (+- 3 град.С). Незважаючи на те, що відноснавологість повітря повинна бути, принаймні, 30% та, якщо можливо,не перевищувати 70%, за винятком, коли приміщення прибирають,необхідно намагатись, щоб цей показник був 50-60%. Освітлення маєбути штучним, з інтервалом 12 годин (світло-темно). Що стосуєтьсясучасного годування тварин в лабораторних умовах, то необхідно,щоб в їх раціоні кількість питної води не обмежувалась.
1.4.2 Процедура тесту
1.4.2.1. Застосування/нанесення тестованої речовини
Тестовану речовину наносять на невелику ділянку шкіри(приблизно, 6 кв.см) і накривають клаптиком марлі, якуприкріплюють до тіла тварини клейкою тасьмою, яка б не спричинялаподразнення. Якщо в деяких випадках пряме нанесення речовининеможливе (наприклад, рідини або пастоподібні речовини), тодіхімікат спочатку наносять на марлю, яку в свою чергу прикріплюютьна шкіру тварини. Марля з речовиною повинна бути вільноприкріплена до шкіри за допомогою напівгерметичної пов'язки навесь період експерименту. Якщо речовина наноситься на марлю, апотім на шкіру, то закріплюватись вона повинна так, щоб бувхороший контакт та рівномірний розподіл хімікату по всій поверхнішкіри. Необхідно, щоб тварина не змогла дістати марлю з речовиною,а також з'їсти або вдихнути її.
Рідини, в основному, застосовують в нерозбавленому виді. Увипадку використання сухих твердих хімічних речовин (за потребиможна застосовувати пульверизатор) саму речовину потрібно змочитив достатній кількості води або, при потребі, в іншомутехнологічному розчині для кращого приставання до шкіри. Коливикористовується технологічна рідина (не вода) необхідно, щобможливий вплив хімікату на шкіру, її роз'їдання, був мінімальним,якщо можливо.
Наприкінці тестування, яке триває, як правило, 4 години,видаляють всі залишки речовини, використовуючи, якщо потрібно,воду чи відповідний розчинник, не змінюючи отриманих результатівна шкірі або цілісність епідермісу.
1.4.2.2. Рівень дозувань
Беруть дозу рідини із вмістом 0,5 мл, або 0,5 г сухої чипастоподібної речовини.
1.4.2.3. Початковий тест (на живих організмах:ураження/роз'їдання шкіри на прикладі однієї тварини)
Дуже важливо, щоб тест на живих організмах проводивсяспочатку на одній тварині, особливо тоді, коли є підозра того, щоречовина може мати ефект роз'їдання. Це відповідає вимогамстратегії поступового тестування (див. Додаток 1).
Якщо роз'їдаючо-корозійні властивості речовини було виявленона основі аналізу фактичної ваги, тоді подальше тестування натваринах непотрібне. Більшість речовин, які можуть матикорозійно-роз'їдаючі властивості, як правило, не потребуютьподальшої тестової перевірки на живих організмах. Проте, в тихвипадках, коли додаткової інформації недостатньо через відсутністьдостатніх доказів, обмежена кількість тестів допускається. Прицьому застосовується такий підхід:
На тварину в певній послідовності наносять три марлевихклаптика з хімікатом. Через три хвилини забирають перший клаптик.Якщо на шкірі не спостерігається жодної серйозної реакції, тодінаносять другий марлевий клаптик з хімікатом, який знімають черезгодину. Якщо на даній стадії спостережень буде виявлено, щоексперимент гуманним чином можна продовжити до 4 годин загалом,тоді наноситься третій марлевий клаптик, який знімається через4 години, а результати записують.
Якщо в ході одного з трьох етапів експериментуспостерігатиметься ефект роз'їдання шкіри, тестування негайноприпиняють. У випадку, коли такого ефекту не спостерігаєтьсянавіть після закріплення останнього марлевого клаптика, затвариною спостерігають 14 днів, за винятком, якщо ефект роз'їданняшкіри з'являється раніше.
Якщо взята хімічна речовина, ймовірно, не є корозійною, алише спричиняє подразнення, тоді для нанесення її на тваринузастосовують лише один марлевий клаптик протягом 4 годин.
1.4.2.4. Тест-підтвердження (тестування на живих організмахна предмет ураження/роз'їдання шкіри): дослід на додатковихтваринах
Якщо ефект роз'їдання/корозії не спостерігається під часпочаткового тесту, тоді необхідно отримати підтвердження проподразнення або його відсутність, провівши дослід на двохдодаткових тваринах з нанесенням хімічної речовини на 4 години. Увипадку, коли ефект подразнення спостерігається в першомутестуванні, послідовно проводять тест-підтвердження, або роблятьдослід на ще двох тваринах одночасно. В окремих випадках, якщо непроводиться початковий тест, двом-трьом тваринам прикріпляють поодному клаптику марлі з хімікатом, який знімають за 4 години.Подальше тестування непотрібно, якщо беруть двох тварин, на якихвиявляють однакові результати. В іншому ж випадку тестують і третютварину. Необхідність використання додаткових тварин пояснюєтьсялише нечіткими та непереконливими результатами.
1.4.2.5. Період спостереження
Тривалість періоду спостереження повинна бути достатньоюнастільки, щоб повною мірою оцінити оборотність отриманих ефектів.Проте, експеримент необхідно зупинити в будь-який час, якщопіддослідна тварина виявляє ознаки гострого болю або знедужання.Щоб визначити оборотність отриманих результатів, за тваринамипотрібно спостерігати 14 днів після зняття марлевих клаптиків.Якщо оборотність спостерігається раніше 14 днів, експеримент слідприпинити відразу.
1.4.2.6 Клінічні спостереження та класифікація реакцій шкіри
Всіх тварин необхідно перевірити на предмет появи в них ознакеритеми (почервоніння шкіри) та набряків на 60-тій хвилині, апотім через 24, 48 та 72 години після зняття марлевого клаптика зречовиною. При проведенні початкового тесту над однією твариноюнеобхідно одразу після зняття марлі з хімікатом оглянути місцепроведення експерименту. Результати отриманих реакцій на шкірікласифікують та записують, як показано нижче в Таблиці градацій.Якщо ураження шкіри не класифікується, як подразнення абороз'їдання на 72-ій годині експерименту, необхідно, при потребі,проводити спостереження 14 днів, щоб визначити оборотністьефектів. Крім спостережень за появою роз'їдання, необхідноповністю описувати та фіксувати всі локальні ефекти, такі, якобезжирення шкіри та будь-які систематичні шкідливі ефекти(наприклад, клінічні ознаки токсичності та вага тіла). У випадкупояви нечітких або незрозумілих результатів проводятьгістопатологічний огляд.
Класифікація реакцій на шкірі є завжди суб'єктивною. Тому,для узгодженості та координації в процесі класифікації рівнівураження шкіри, а також з метою допомогти лабораторіям таперсоналу під час отримання та інтерпретації результатівспостережень, необхідно, щоб працівники мали належну підготовку такваліфікацію для підрахунку балів системи (див. подану нижчеТаблицю). Корисним може виявитись ілюстрований довідник зкласифікації результатів роз'їдання шкіри та інших уражень (9).
2. ДАНІ
2.1. ЗВІТНІСТЬ
Результати експерименту підсумовують у вигляді таблиці впідсумковому звіті про результати. Таблиця повинна відображати всіпункти, перелічені в секції 3.1.
2.2. ОЦІНЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Показники/бали подразнення шкіри оцінюються відповідно дохарактеру та шкідливості уражень, а також їх оборотності абонеоборотності. Індивідуальні показники не є абсолютним стандартомв плані оцінки подразнюючих властивостей матеріалу, оскількипроводиться оцінка інших ефектів тестованого матеріалу. Тож, такііндивідуальні показники варто розглядати, як номінальні, стосовнояких необхідно робити порівняння з іншими, отриманими в ходіексперименту, величинами.
Під час оцінки результатів подразнення шкіри необхідновраховувати оборотність отриманих уражень. Якщо такі ознаки, якоблисіння (невелика ділянка), гіперкератоз, гіперплазія та лущенняшкіри продовжуються до 14 дня спостереження, тоді речовинувважають такою, що спричиняє подразнення.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТНІСТЬ ПРО РЕЗУЛЬТИ ТЕСТУ
Звітність про результати тесту, якщо можливо, повинна міститинаступну інформацію:
Підстава для проведення тесту на живих організмах: аналізфактичної ваги (на основі попередніх даних тестування, включаючирезультати стратегії поетапного тестування):
- опис відповідних даних з попереднього тестування,
- дані, отримані на кожному етапі стратегії тестування,
- опис виконаних тестів на живих організмах, включаючи деталіпроведення процедур, результати, отримані в ході тестуваннябазових речовин,
- аналіз фактичної ваги для проведення досліду на живихорганізмах.
Речовина для тестування:
- дані ідентифікації (наприклад, номер CAS, походженняхімікату, відсутність домішок, наявні домішки, номер партії),
- фізичні характеристики та фізико-хімічні властивості(наприклад, рН, змінність, розчинюваність, стійкість),
- якщо це суміш - її склад та співвідношення компонентів увідсотках.
Технологічна рідина:
- ідентифікація, концентрація (якщо потрібно), об'єм,
- доцільність застосування технологічної рідини.
Піддослідні тварини:
- види та роди тварин, обґрунтована доцільність використанняінших тварин (не кроликів),
- кількість тварин кожної статі,
- індивідуальна вага тварин на початку та наприкінці тесту,
- вік тварин на момент експерименту,
- походження тварин, умови утримання тощо.
Умови проведення тестування:
- техніка підготовки ділянки, на яку наноситиметься хімікат,
- інформація про матеріали, що використовуються дляпідготовки ділянки, на яку наноситиметься хімікат,
- деталі щодо приготування тестованої речовини, їїзастосування/нанесення та зняття.
Результати:
- зведення в таблицю інформації про кожну тварину: показникиподразнення/роз'їдання шкіри, які замірювались постійно,
- опис уражень шкіри в ході спостережень,
- детальний опис особливостей та рівня подразнення абороз'їдання в ході спостереження, а також будь-які гістопатологічнідані,
- опис інших шкідливих локальних (наприклад, обезжиренняшкіри) та систематичних ефектів, в додаток до вже описаних ефектівураження або роз'їдання шкіри,
- обговорення результатів.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes,R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray,T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J. J.L.,Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use ofAlternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM WorkshopReport 8. ATLA 23, p. 410-429.
2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988)Classification as Corrosive or Irritant to Skin of PreparationsContaining Acidic or Alkaline Substance Without Testing onAnimals. Toxicollogy In Vitro, 2, p. 19-26.
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998)Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skincorrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, 'Skin Irritation',European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre,Brussels.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G.andLiebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on invitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by theManagement Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Reportof the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and AcceptanceCriteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held inSolna, Sweden, 22-24 January 1996(http://www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).
(7) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard ClassificationSystem for Human Health and Environmental Effects of ChemicalSubstances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the ChemicalsCommittee and the Working Party on Chemicals, November 1998(http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition,Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints forExperimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD EnvironmentalHealth and Safety Publications. Series on Testing and AssessmentNo 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos.htm).
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). UnitedStates Environmental Protection Agency, Office of Pesticides andToxic Substances, Washington, DC, August 1990.
(Дані публікації можна отримати на вимогу в СекретаріатіОЕСР).
Таблиця 1
КЛАСИФІКАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ РЕАКЦІЇ НА ШКІРІ
Інформація про появу почервоніння та струпів
Почервоніння (еритема) .................................... 0
Легке почервоніння (ледве помітне) ........................ 1
Явно виражене почервоніння ................................ 2
Почервоніння середнього та високого рівня ................. 3
Дуже сильне почервоніння (яловиче почервоніння) або
утворення струпів, ще не класифікується, як еритема ....... 4
Максимально можливе: 4
Утворення набряків
Набряки відсутні .......................................... 0
Ледь помітний набряк (легкої форми) ....................... 1
Легкий набряк (краї шкіри явно виражені та припідняті)..... 2
Набряк середньої форми (краї шкіри припідняті,
