Для проведення дослідження in vitro, зазвичай вимагаєтьсявикористання екзогенного джерела метаболічної активації. Цясистема метаболічної активації не може повністю імітувати умовфункціонування організму ссавців in vivo. Необхідно подбати проте, щоб уникнути умов, які призводять до позитивних результатів,які не відображають спадкової мутагенності і можуть походити відзмін pH, осмотичного тиску або високого рівня цитотоксичності(4)(5).
Це дослідження застосовується для виявлення можливихмутагенів і канцерогенів у ссавців. Багато сполук, що даютьпозитивний результат у цьому дослідженні, є канцерогенами ссавців;проте, немає абсолютного взаємозв'язку між цим дослідженням таканцерогенністю. Взаємозв'язок залежить від класу хімічнихречовин, і збільшується кількість даних, які доводять існуванняканцерогенів, що не виявляються за допомогою цього дослідження,оскільки є припущення, що вони діють через інші механізми, а непошкоджують ДНК напряму.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Аберація хроматидного типу: структурне хромосомнепошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматидабо в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.
Аберація хромосомного типу: структурне хромосомнепошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утвореннірозривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.
Ендоредуплікація: процес, у якому після S-періоду реплікаціїядро ДНК починає не процес мітозу, а новий S-період. Результатом єхромосоми з 4, 8, 16... хроматидами.
Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, та змінімальним порушенням орієнтації хроматид).
Мітотичний індекс: співвідношення клітин у метафазі, поділенена загальну кількість клітин, що спостерігаються в популяціїклітин; показник ступеню розростання цієї популяції.
Кількісна аберація: зміна кількості хромосом відхарактеристик нормальної кількості у використаних клітинах.
Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) навідміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).
Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, щовизначається при мікроскопічному дослідженні стадії метафазиподілу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій іфрагментів, внутрішнього або взаємного обміну.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Клітинні культури піддають впливу досліджуваної речовини якза участю, так і без участі метаболічної активації. Черезвизначені інтервали після піддавання впливу досліджуваної речовиниклітинних культур, їх піддають дії речовин, що спричиняютьблокування метафази (наприклад, колцемід(R) або колхіцин),збирають, зафарбовують, і метафазні клітини аналізують задопомогою мікроскопу з метою виявлення присутності хромосомнихаберацій.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Клітини
Дозволяється використання різноманітних ліній клітин, штамівклітин або первинних клітинних культур, включаючи людські клітини(наприклад, фібробласти китайського хом'яка, лімфоцитипериферичної крові людини або іншого ссавця).
1.4.1.2. Середовище і умови для культур
Для підтримання культур слід використовувати відповіднесередовище та умови вирощування (ємності для культур, концентраціюCO , температуру і вологость). Усталені лінії клітин і штами
2
необхідно регулярно перевіряти на стабільність модальної кількості
хромосом і відсутність зараження мікоплазмою; при виявленні
зараження, їх не слід використовувати. Потрібно знати тривалість
клітинного циклу для даних клітин і умови для них.
1.4.1.3. Підготовка культур
Усталені лінії клітин і штами: клітини розводяться з вихідноїкультури, висіваються в культуральне середовище за такоїщільності, щоб клітини не злилися до часу збирання, і вирощуютьсяпри температурі 37 град.C.
Лімфоцити: цільна кров піддається впливу антикоагулянту(наприклад, гепарину) або відокремлені лімфоцити, отримані відздорових об'єктів, додаються в культуральне середовище, що міститьміоген (наприклад, фітогемагглутинін) і вирощуються притемпературі 37 град.C.
1.4.1.4. Метаболічна активація
Клітини мають піддаватись впливу досліджуваної речовини як вприсутності відповідної системи метаболічної активації, так і заїї відсутності. Найчастіше використовується система доповненоїкоферментами пост-мітохондріальної фракції (S9), приготованої зпечінок гризунів, оброблених ензимами, включаючи такі агенти, як:Арохлор-1254 (6)(7)(8)(9), або суміш фенобарбіталу тав-нафтофлавону (10)(11)(12).
Пост-мітохондріальна фракція, зазвичай, використовується вконцентраціях в діапазоні від 1-10% в об'ємному співвідношенні вкінцевому піддослідному середовищі. Стан системи метаболічноїактивації може залежати від класу хімічних речовин, щовипробовується. В деяких випадках може бути доцільним використаннябільш ніж однієї концентрації пост-мітохондріальної фракції.
Кількість подій, включаючи створення ліній клітин, щовиявляють специфічні аміноацил-тРНК-синтетази, за допомогою генноїінженерії, може надати потенціал для ендогенної активації. Вибірліній клітин для використання має бути науково виправданим(наприклад, релевантністю цитохрому P450 ізоензиму для метаболізмудосліджуваної речовини).
1.4.1.5. Досліджувана речовина/Підготовка
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути задопомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщоце є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовиниможна додавати безпосередньо до досліджуваних систем та/аборозбавити перед введенням. Слід застосовувати свіжі препаратидосліджуваної речовини, якщо тільки дані щодо стабільності невиявляють придатності до зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище
Не має бути підозри на хімічну реакцію розчинника/середовищаз досліджуваною речовиною, вони також повинні бути придатними длявиживання клітин і сумісними з діяльністю S9. Якщовикористовується не добре відомий розчинник/середовище, їхвключення має підтверджуватись даними, що доводять їхнюсумісність. Рекомендується там, де можливо, використовуватиспочатку водний розчинник/середовище. При випробуванні речовин,нестабільних при взаємодії з водою, використовувані органічнірозчинники не мають містити води. Воду можна усунути шляхомдодавання молекулярного сита.
1.4.2.2. Концентрації для впливу
При визначенні найвищої концентрації слід розглянути такікритерії, як цитотоксичність, розчинність у досліджуваних системахта зміни pH або осмотичного тиску.
Цитотоксичність слід визначати з та без метаболічноїактивації в ході основного експерименту, використовуючивідповідний показник цілісності та росту клітин, такий, як ступіньщільності, реальна кількість клітин або мітотичний індекс.Можливо, буде корисним визначення цитотоксичності та розчинності вході підготовчого експерименту. Потрібно використати щонайменшетри концентрації, придатні до аналізування. У випадкуцитотоксичності три концентрації мають покривати діапазон відмаксимальної до незначної токсичності або її відсутності; цезазвичай означає, що рівні концентрації мають бути відділенібільше, ніж фактором між 2 та Кк 10. У момент збору найвищаконцентрація має суттєво зменшитись, що стосується ступенющільності, кількості клітин або мітотичного індексу (всі більш ніж50%). Мітотичний індекс є непрямим показникомцитотоксичних/цитостатичних впливів і залежить від часу, щопройшов після введення речовини. Проте, мітотичний індексзастосовується для суспензійних культур, для яких інші вимірюваннятоксичності можуть бути обтяжливими та непрактичними. Інформаціяпро кінетику клітинного циклу, така як середній час генерації(СЧГ), може використовуватись в якості додаткової інформації.Проте, СЧГ є загальним значенням, яке не завжди відображаєіснування уповільнених субпопуляцій, і навіть найменше збільшеннясереднього часу генерації може бути пов'язане з дуже значноюзатримкою в часі оптимального виходу аберацій.
Для відносно не цитотоксичних речовин максимальнаконцентрація для тестування має становити 5 мю л/мл, 5 мг/мл або0,01 Моль, яка є найнижчою.
Для відносно нерозчинних речовин, які не є токсичними приконцентраціях, нижчих, ніж концентрація нерозчинності, найвищавикористовувана доза має відповідати концентрації вище межірозчинності у кінцевому культуральному середовищі наприкінціперіоду введення речовини. В деяких випадках, (наприклад, колитоксичність проявляється тільки при вищій концентрації, ніжнайнижча концентрація нерозчинності) рекомендується проведеннятестування більш ніж на одній концентрації з видимим прискоренням.Може бути корисною оцінка розчинності на початку і в кінцітестування, тому що розчинність може змінюватися протягом періодувпливу в досліджуваній системі завдяки присутності клітин, S9,сироватки, і т.д. Нерозчинність можна визначити неозброєним оком.Осад не повинен змінювати результати оцінювання.
1.4.2.3. Позитивні та негативні контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (розчинникабо середовище), як з метаболічною активацією, так і без неї,мають входити до складу кожного експерименту. При використанніметаболічної активації хімічна речовина, що використовується дляпозитивної контрольної групи, має бути такою, що вимагає активаціїдля мутагенної реакції.
Для позитивної контрольної групи залучається відомийкластоген з рівнем впливу, що передбачає відтворюване зростання повідношенню до вихідних даних, яке можна виявити; це зростаннядемонструє чутливість досліджуваної системи.
Концентрації для позитивної контрольної групи потрібнообирати таким чином, щоб впливи чітко проявлялися, проте, щобідентичність кодованих мікроскопічних препаратів не відразувиявлялася пристроєм для зчитування. До речовин позитивноїконтрольної групи належать:
------------------------------------------------------------------
| Умови метаболічної | Речовина |Номер РСХ|Номер ЄРІКХР|
| активації | | | |
|--------------------+--------------------+---------+------------|
|Відсутність |Метилметансульфонат | 66-27-3 | 200-625-0 |
|екзогенної |--------------------+---------+------------|
|метаболічної |Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7 |
|активації |--------------------+---------+------------|
| |Етилннитрозосечовина|759-73-9 | 212-072-2 |
| |--------------------+---------+------------|
| |Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| |--------------------+---------+------------|
| |4-нітроквінолін-N- | 56-57-5 | 200-281-1 |
| |оксид | | |
|--------------------+--------------------+---------+------------|
|Присутність |Бензо(альфа)пірен | 50-32-8 | 200-028-5 |
|екзогенної |--------------------+---------+------------|
|метаболічної |Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-028-5 |
|активації |Циклофосфаміду |6055-19-2| |
| |моногідрат | | |
------------------------------------------------------------------
Можна використати інші відповідні речовини позитивноїконтрольної групи. Застосування хімічної речовини, щовикористовується для позитивної контрольної групи з огляду наклас, може розглядатись за наявності.
Негативна контрольна група, що складається окремо зрозчинника або середовища у досліджуваному середовищі, до якоговводяться ті самі речовини, що й досліджуваним культурам, має бутивключена до періоду збору. Окрім того, контрольні групи, що непіддавалися впливу досліджуваної речовини, теж повиннівикористовуватись, якщо немає історично встановлених даних зконтролю, що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливівобраного розчинника.
1.4.3. Процедура
1.4.3.1. Введення досліджуваної речовини
Клітини, що розростаються, піддають дії досліджуваноїречовини як в присутності системи метаболічної активації, так і заїї відсутності. Обробка лімфоцитів має починатися приблизно через72 години після мітогенної стимуляції.
1.4.3.2. Подвійні культури, зазвичай, мають використовуватисяу будь-якій концентрації, вони рекомендовані для негативнихконтрольних культур/контрольних культур розчинника. Якщо міжподвійними культурами може спостерігатися мінімальна генетичнамінливість (13)(14), відповідно до історично встановлених данихвона може бути прийнятною до використання стосовно одиночнихкультур у будь-якій концентрації.
Газоподібні та летючі речовини випробовуються за допомогоювідповідних методів, таких як запечатані ємності для культур(15)(16).
1.4.3.3. Час збору культур
При першому експерименті клітини мають піддаватись впливудосліджуваної речовини як з метаболічною активацією, так і безнеї, від 3 до 6 годин і братись на зразок через проміжок часу,еквівалентний приблизно 1,5 тривалості нормального клітинногоциклу після початку обробки (12). Якщо цей протокол дає негативнірезультати як з активацією, так і без неї, слід провестидодатковий експеримент без активації з постійною дією речовини дотого, як культури візьмуть на зразок через проміжок часу,еквівалентний приблизно 1,5 тривалості нормального клітинногоциклу. Певні хімічні речовини можуть з більшою готовністювиявлятися за час обробки/взяття на зразок більший, ніж 1,5тривалості циклу. Негативні результати з метаболічною активацієюнеобхідно підтверджувати в окремих випадках. У випадках, колипідтвердження негативних результатів не вважається необхідним,потрібно навести обґрунтування.
1.4.3.4. Підготовка хромосом
Клітинні культури піддають дії колцеміду(R) або колхіцину,зазвичай, за час від однієї до трьох годин до збору. Кожнуклітинну культуру збирають і обробляють окремо для підготовкихромосом. Підготовка хромосом включає в себе гіпотонічну обробкуклітин, фіксацію та зафарбовування.
1.4.3.5. Аналіз
Всі мікроскопічні препарати, включаючи препарати позитивноїта негативної контрольних груп, повинні отримати незалежний кодперед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедури фіксації частопризводять до розриву метафазних клітин із втратою хромосом,оцінені клітини мають таким чином містити кількість центромерів,рівну модальному числу +- 2 для всіх типів клітин. Щонайменше200 метафаз, що добре розрослися, мають оцінюватися щодоконцентрації і контролю, рівномірно розподілених серед подвійнихкультур, якщо вони застосовуються. Їх кількість можна зменшити,якщо спостерігається велика кількість аберацій.
Хоча метою тесту є виявлення структурних хромосомнихаберацій, важливо фіксувати випадки поліплоїдії таендоредуплікації, якщо вони мають місце.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Експериментальною одиницею є клітина, тому потрібно оцінюватикількість клітин зі структурними хромосомними абераціями. Різнітипи структурних хромосомних аберацій потрібно заносити в списокразом з їх кількістю і частотою для експериментальних іконтрольних культур. Гепи фіксуються окремо і про нихповідомляють, проте, зазвичай не включають в загальну частотуаберацій.
Паралельні критерії цитотоксичності для всіх піддосліднихекспериментальних і негативних контрольних культур в основнихекспериментах з аберації також мають фіксуватися.
Потрібні індивідуальні дані. Також всі дані мають бутипідсумовані у формі таблиці.
Немає вимог до перевірки чіткої позитивної реакції. Сумнівнірезультати повинні перевірятися за допомогою подальших досліджень,переважно з використанням модифікації експериментальних умов.Потреба у підтвердженні негативних результатів обговорювалася впункті 1.4.3.3. Модифікація параметрів дослідження з метоюрозширення діапазону оцінюваних умов буде розглядатися в подальшихекспериментах. Параметри дослідження, що можуть бути модифіковані,включають в себе просторовий розподіл концентрації та умовиметаболічної активації.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,такі як збільшення, пов'язане з концентрацією, або відтворюванезбільшення кількості клітин з хромосомними абераціями. Перш за всенеобхідно враховувати біологічну релевантність результатів.Можливе використання статистичних методів в якості допоміжних приоцінюванні результатів дослідження (3)(13). Статистична значимістьне має бути єдиним фактором, що визначає позитивну реакцію.
Зростання кількості поліплоїдних клітин може означати, щодосліджувана речовина має потенціал для пригнічення мітотичнихпроцесів та провокування кількісних хромосомних аберацій.Зростання кількості клітин з ендоредуплікованими хромосомами можеозначати, що досліджувана речовина має потенціал для пригніченнярозвитку клітинного циклу (17)(18).
Досліджувана речовина, результати якої не відповідаютьвищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цій системі.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні абонегативні результати, в поодиноких випадках сукупність данихвиключає можливість визначеного судження про активністьдосліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівнимиабо проблематичними, не зважаючи на кількість повтореньексперименту.
Позитивні результати тесту in vitro на хромосомну абераціюозначають, що досліджувана речовина викликає структурні хромосомніаберації у культивованих соматичних клітинах ссавців. Негативнірезультати означають, що в умовах дослідження досліджуванаречовина не викликає структурних хромосомних аберацій укультивованих соматичних клітинах ссавців.
3. ЗВІТНІСТЬ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника.
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини врозчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Клітини:
- тип і джерело клітин,
- характеристики каріотипу та придатність використаного типуклітин,
- можливу відсутність мікоплазми,
- інформація щодо тривалості клітинного циклу,
- стать донорів крові, цільна кров або відокремленілімфоцити, використаний міоген,
- можливу кількість пасажів,
- метод збереження культури клітин, у випадку застосування,
- модальну кількість хромосом.
Умови проведення тесту:
- ідентичність речовини, що спричиняє блокування метафази, їїконцентрація та тривалість піддавання клітини впливу,
- обґрунтування для вибору концентрацій і кількості культур,включаючи, наприклад, дані про цитотоксичність та обмеження щодорозчинності, у випадку застосування,
- склад середовища, можлива концентрація CO ,
2
- концентрація досліджуваної речовини,
- об'єм середовища і доданої досліджуваної речовини,
- температура вирощування,
- час вирощування,
- тривалість дії речовини,
- можлива щільність клітин при висіванні,
- тип і склад системи метаболічної активації, включаючиприйнятності,
- позитивні та негативні контрольні групи,
- методи підготовки мікроскопічних препаратів,
- критерії для оцінки аберацій,
- проаналізована кількість метафаз,
- методи вимірювання токсичності,
- критерії віднесення дослідження до позитивного,негативного, або сумнівного розряду.
Результати:
- ознаки токсичності, наприклад, ступінь щільності, дані проклітинний цикл, кількість клітин, мітотичний індекс,
- ознаки преципітації,
- дані про pH та осмотичний тиск досліджуваного середовища,якщо визначені,
- визначення аберацій, включаючи гепи,
- кількість клітин з хромосомними абераціями і типихромосомних аберацій, наведені окремо для кожної досліджуваної іконтрольної культури,
- зміни в плоїдності, якщо вони помітні,
- співвідношення дози і реакції, де можливо,
- статистичний аналіз, якщо він має місце,
- паралельні дані позитивних та негативних контрольних груп(розчинник або середовище),
- історично встановлені дані позитивних та негативнихконтрольних груп (розчинник або середовище), з діапазонами,середніми величинами та стандартними відхиленнями.
Обговорення результатів.
Висновки
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Evans, H.J., (1976) Cytological Methods for DetectingChemical Mutagens. В: Chemical mutagens, Principles and Methodsfor their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press,New York and London, p. 1-29.
(2) Ishidate, M.Jr. and Sofuni, T., (1985). TheInVitroChromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL)Fibroblast Cells in Culture. В: Progress in Mutation Research,Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers,Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S.,Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk,S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. andZeiger, E., (1978). Chromosome aberration and sister chromaticexchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108chemicals. Environs. Molec. Mutagen 10 (suppl. 10), p. 1-175.
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate,M.Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicityunder Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group9. Mutation Res, 257, p. 147-204.
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K.,(1992). Clastogenicity of low pH to Various Cultured MammalianCells. Mutation Res., 268, p. 297-305.
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975). Methodsfor Detecting Carcinogens and Mutagens with theSalmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res.,31, p. 347-364.
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods forthe Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers,M. and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects ofMutagen/Carcinogens after Activation in a Microsomal System inVitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister ChromatidExchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN)in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. MutationRes., 37, p. 83-90.
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979)Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 MixIn Vitro. Mutation Res., 66, p. 277-290.
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse,D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992). Report ofUK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives toAroclor 1254-induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays.Mutagenesis, 7, p. 175-177.
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T.,(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as anInducer of Metabolic Activation Systems. В: de Serres, F.J.,Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds) In Vitro MetabolicActivation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland,p. 85-88.
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M.Jr., Ivett,J.L., Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994)Report from Working Group on in In Vitro Tests for ChromosomalAberrations. Mutation Res., 312, p. 241-261.
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett,G., Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data fromIn Vitro Cytogenetic Assays. В: Statistical Evaluation ofMutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge UniversityPress, Cambridge, p. 141-154.
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasksare not Necessary for In Vitro Chromosome Aberration Assays in CHOCells. Mutation Res., 312, p. 139-149.
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982)CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and VolatileLiquids. В: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds).Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91-103.
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L.,(1983) Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown onCollagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in theCHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5,p. 795-801.
(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinesehamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest. MutationRes., 119, p. 403-413.
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983)Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells.Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
B.11. МУТАГЕННІСТЬ - ТЕСТ IN VIVO НА ХРОМОСОМНУ
АБЕРАЦІЮ КІСТКОВОГО МОЗКУ ССАВЦІВ
1. МЕТОД
Цей метод відтворює метод, описаний у ТІ ОЕСР 475, Тест наХромосомну Аберацію Кісткового Мозку Ссавців (1997).
1.1. ВСТУП
Тест на Хромосомну Аберацію Кісткового Мозоку Ссавціввикористовується для виявлення структурних хромосомних аберацій,викликаних досліджуваною речовиною у клітинах кісткового мозкутварин, зазвичай гризунів (1)(2)(3)(4). Структурні хромосомніаберації можуть бути двох типів: хромосомні або хроматидні.Підвищення поліплоїдії може означати, що хімічна речовина маєпотенціал для провокування численних аберацій. При використаннібільшості хімічних мутагенів спровоковані аберації належать дохроматидного типу, але трапляються також аберації хромосомноготипу. Хромосомні мутації та пов'язані з ними явища є причиноюбагатьох генетичних хвороб людини і є суттєві докази того, щохромосомні мутації та пов'язані з ними явища, що спричиняють змінив онкогенах і генах-суппрессорах, беруть участь у провокуванніраку у людини і в піддослідних системах.
Зазвичай для проведення цього тесту використовуються гризуни.Кістковий мозок є цільовою тканиною в цьому випробуванні, так якце високо васкуляризована тканина, що містить популяцію клітин зішвидким циклом розвитку, які можна одразу відокремити тавикористати. Інші біологічні види та цільові тканини не єпредметом даного методу.
Цей тест на хромосомну аберацію є особливо доцільним дляоцінки мутагенної загрози, оскільки він дає змогу розглянутифактори метаболізму in vivo, фармакокінетику та процеси репараціїДНК, хоча вони можуть змінюватися в залежності від біологічноговиду і тканини. Тестування in vivo також корисне для подальшихдосліджень мутагенного впливу, визначеного за допомогою тестуванняin vitro.
Якщо є докази того, що досліджувана речовина або реактивніметаболіти не досягнуть цільової тканини, проведення цьоготестування не є доцільним.
Дивіться також Загальний вступ, Частину B.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Аберація хроматидного типу: структурне хромосомнепошкодження, що виявляється в утворенні розривів окремих хроматидабо в утворенні розривів і об'єднанні хроматид.
Аберація хромосомного типу: структурне хромосомнепошкодження, що виявляється в утворенні розривів або в утвореннірозривів і об'єднанні обох хроматид на ідентичній ділянці.
Ендоредуплікація: процес, у якому після S-періоду реплікаціїядро ДНК починає не процес мітозу, а новий S-період. Результатом єхромосоми з 4, 8, 16... хроматидами.
Геп: ахроматичне ушкодження, менше за ширину хроматиди, та змінімальним порушенням орієнтації хроматид).
Мітотичний індекс: співвідношення клітин у метафазі, поділенена загальну кількість клітин, що спостерігаються в популяціїклітин; показник ступеню розростання цієї популяції.
Кількісна аберація: зміна кількості хромосом відхарактеристик нормальної кількості у використаних клітинах.
Поліплоїдія: помноження галоїдної кількості хромосом (n) навідміну від диплоїдної кількості (тобто, 3n, 4n і т.д.).
Структурна аберація: зміна в структурі хромосом, щовизначається при мікроскопічному дослідженні метафазної стадіїподілу клітини, яка спостерігається у вигляді делецій іфрагментів, внутрішнього або взаємного обміну.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Тварин піддають впливу досліджуваної речовини, використовуючивідповідний шлях введення, і знищують у зазначений час післявтручання. Перш ніж знищити, тварин піддають дії речовин, щоспричиняють блокування метафази (наприклад, колцеміду(R) абоколхіцину). Потім виготовляють хромосомні препарати з кістковогомозку тварин і зафарбовують їх, і метафазні клітини аналізують напредмет хромосомних аберацій.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.4.1. Підготовка
1.4.1.1. Вибір біологічних видів тварин
Зазвичай використовують щурів, мишей та китайських хом'яків,хоча можливе також використання інших придатних видів ссавців.Слід залучити для випробувань лабораторні лінії здорових молодихдорослих тварин, що зазвичай використовуються. На початкудослідження коливання ваги тварин має бути мінімальним і неперевищувати +- 20% від середньої ваги для кожної статі.
1.4.1.2. Умови утримання і годування
Застосовуються загальні умови викладені у Загальному вступі,Частині B, проте, оптимальним показником вологості є 50-60%.
1.4.1.3. Підготовка тварин
Здорових молодих дорослих тварин призначають в піддосліднугрупу із застосуванням методу випадкового відбору. Клітки повиннірозташовуватись таким чином, щоб мінімізувати можливі впливи їхмісця розташування. Тварини ідентифікуються окремо. Тваринпристосовують до лабораторних умов протягом щонайменше п'яти днів.
1.4.1.4. Підготовка доз
Тверді досліджувані речовини слід розчинити або усунути задопомогою відповідного розчинника або середовища і розбавити, якщоце є доцільним, перед обробкою клітин. Рідкі досліджувані речовиниможна ввести безпосередньо або розбавити перед введенням. Слідзастосовувати свіжі препарати досліджуваної речовини, якщо тількидані щодо стабільності не виявляють прийнятності до зберігання.
1.4.2. Умови тестування:
1.4.2.1. Розчинник/середовище:
Розчинник/середовище не має спричиняти токсичних впливів привикористаному рівні дозування, а також не має бути підозри нахімічну реакцію розчинника/середовища з досліджуваною речовиною.Якщо використовується не добре відомий розчинник/середовище, їхвключення має підтверджуватись даними, що доводять їхнюсумісність. Рекомендується там, де можливо, використовуватиспочатку водний розчинник/середовище.
1.4.2.2. Контрольні групи
Паралельні позитивні та негативні контрольні групи (звикористанням розчинника або середовища) мають входити до складугрупи кожної статі при випробуванні проведенні кожного тестування.За винятком введення досліджуваної речовини, за тваринами вконтрольній групі доглядають так само, як і за тваринамипіддослідних груп.
Позитивні контрольні групи дають структурні аберації in vivoпри рівнях дозування, при яких очікувалося зростання по відношеннюдо вихідних даних, яке можна виявити. Концентрації для позитивнихконтрольних груп потрібно обирати таким чином, щоб впливи чіткопроявлялися, проте, щоб ідентичність кодованих мікроскопічнихпрепаратів не одразу виявлялася пристроєм для зчитування. Можливимє варіант введення речовини позитивній контрольній групі іншимшляхом, ніж вводилася досліджувана речовина, потім зразок беретьсятільки один раз. За наявності, може розглядатись застосуванняхімічної речовини, що використовується для позитивного контролю зогляду на клас, якщо є доступним. До речовин для позитивногоконтролю належать:
------------------------------------------------------------------
| Речовина | Номер РСХ | Номер ЄРІКХР |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Етилметансульфонат | 62-50-0 | 200-536-7 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Етилннитрозосечовина | 759-73-9 | 212-072-2 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Мітоміцин C | 50-07-7 | 200-008-6 |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Циклофосфамід | 50-18-0 | 200-015-4 |
|Циклофосфаміду моногідрат | 6055-19-2 | |
|-------------------------------+--------------+-----------------|
|Триетилнемеламін | 51-18-3 | 200-083-5 |
------------------------------------------------------------------
Негативні контрольні групи, яким вводиться тільки розчинникабо середовище, а в інших випадках вводяться ті ж речовини, що ідосліджуваним групам, мають включатися до кожного часу відборупроб, якщо тільки не є прийнятною міжтваринна варіабельність, іконцентрація клітин з хромосомними абераціями доступна завдякиісторично встановленим даним з контролю. Якщо зразки у негативнихконтрольних груп беруться один раз, найкращим часом є перший часвідбору проб. Окрім того, контрольні групи, що не піддавалисявпливу досліджуваної речовини, теж повинні використовуватись, якщонемає історично встановлених або опублікованих даних з контролю,що показують відсутність шкідливих та мутагенних впливів обраногорозчинника.
1.5. ПРОЦЕДУРА
1.5.1. Кількість і стать тварин
Кожна піддослідна і контрольна група має включати щонайменшеп'ять придатних для аналізу тварин кожної статі. Якщо на часдослідження наявні дані інших досліджень на таких самих видах звикористанням такого самого шляху введення, що демонструютьвідсутність суттєвої різниці у токсичності, пов'язаної зі статтютварин, буде достатньо проведення дослідження на одній статі. Якщовплив хімічних речовин на людину може залежати від статі, якнаприклад для деяких фармацевтичних засобів, дослідження слідпроводити на тваринах відповідної статі.
1.5.2. Графік введення
Досліджувані речовини переважно вводяться за один раз.Досліджувані речовини можуть також вводитися розділеною дозою,тобто робиться два введення у той самий день з перервою не більшеніж у кілька годин для полегшення введення великого об'ємуречовини. Інший графік введення має бути науково обґрунтованим.
Зразки потрібно брати за два рази, окремо, після введення,протягом одного дня. Для гризунів перший інтервал забору зразківстановить 1,5 тривалості нормального клітинного циклу (останнійзазвичай триває 12-18 годин) після введення речовини. Оскількичас, необхідний для поглинання та метаболізму досліджуваноїречовини, а також її впливу на кінетику клітинного циклу, можевпливати на оптимальний час виявлення хромосомних аберацій,рекомендується зібрати зразки пізніше, через 24 години післяпершого збору зразків. Якщо використовується режим введення дозирозрахований на більш ніж один день, слід використовувати один часзабору зразка через 1,5 тривалості нормального клітинного циклу.
Перед знищенням тваринам вколюється інтраперитональновідповідна доза речовини, що спричиняє блокування метафази(наприклад, колцеміду(R) або колхіцину). Після того зразки зтварин беруться через відповідні інтервали часу. Для мишей цейінтервал складає приблизно від трьох до п'яти годин, длякитайських хом'яків - від чотирьох до п'яти годин. З кістковогомозку збирають клітини і аналізують на предмет хромосомнихаберацій.
1.5.3. Рівень дозування
Якщо дальнометричне дослідження проводиться тому, що немаєнаявних відповідних даних, воно має проводитися в тій самійлабораторії з використанням тих самих біологічних видів, ліній,статі та режиму введення, що використовувались в основномудослідженні (5). Якщо проявляється токсичність, для першого часузабору зразка використовується три рівні дозування. Ці рівнідозування повинні покривати діапазон від максимальної до незначноїтоксичності або її відсутності. При подальшому заборі зразківпотрібно використовувати лише найвищу дозу. Найвища дозавизначається як доза, за якої з'являються такі ознаки токсичності,які при вищих рівнях дозування з дотриманням того самого режимуможуть спричиняти смерть. Речовини зі специфічними видамибіологічної активності при низьких нетоксичних дозах (такі, якгормони та мітогени) можуть бути винятками для критеріїввстановлення дозування і мають оцінюватись в окремих випадках.Найвища доза може також визначатися як доза, за якої з'являютьсядеякі показники токсичності у кістковому мозку (наприклад,зменшення мітотичного індексу більш ніж на 50%).
1.5.4. Тестування на граничний вміст
Якщо випробування на одному рівні дозування, який становитьщонайменше 2000 мг/кг маси тіла з використанням введення за одинраз, або двох введень у той же день, не спричиняє видимихтоксичних впливів, і якщо генотоксичність не передбачається зогляду на дані щодо структурно подібних речовин, то можливо, невиникне необхідності в проведенні повного дослідження звикористанням трьох рівнів дозування. Для більш довготривалихдосліджень гранична доза становитиме 2000 мг/кг маса тіла/день длявведення речовини тривалістю до 14 днів, та 2000 мг/кг масатіла/день для введення речовини тривалістю довше 14 днів.Очікуваний вплив на людину може визначати потребу в використаннівищого рівня дозування під час тестування на граничний вміст.
1.5.5. Призначення доз
Досліджувана речовина, зазвичай, вводиться з їжею,використовуючи зонд для штучного харчування або відповіднуінтубаційну трубку, або шляхом інтраперитонеальної ін'єкції. Іншішляхи введення можуть використовуватися, якщо вони єобґрунтованими. Максимальний об'єм рідини, що вводиться за одинраз з їжею або ін'єкцією, залежить від розміру піддослідноїтварини. Об'єм не має перевищувати 2 мл/100 г маси тіла.Використання об'ємів, більших за ці, має бути обґрунтованим. Завинятком подразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичайпроявляють ускладнені впливи при більшій концентрації,варіативність досліджуваного об'єму потрібно мінімізувати шляхомпристосування концентрації до забезпечення постійного об'єму навсіх рівнях дозування.
1.5.6. Підготовка хромосом
Відразу після знищення тварини береться кістковий мозок,піддається впливу гіпотонічного розчину і фіксується. Потімклітини розподіляються по поверхні мікроскопічних препаратів ізафарбовуються.
1.5.7. Аналіз
Мітотичний індекс слід визначати як міру цититоксичностіщонайменше на 1000 клітин на тварину для всіх піддослідних тварин(включаючи позитивні контрольні групи) та тварин з негативнихконтрольних групп, яких не піддають впливу речовини.
Потрібно проаналізувати щонайменше 100 клітин кожної тварини.Їх кількість можна зменшити, якщо спостерігається велика кількістьаберацій. Всі мікроскопічні препарати, включаючи препаратипозитивної та негативної контрольних груп, повинні отриматинезалежний код перед мікроскопічним аналізом. Оскільки процедуриприготування мікроскопічних препаратів часто призводять до розривуметафаз із втратою хромосом, оцінені клітини мають таким чиноммістити кількість центромерів, що дорівнює кількості 2n +- 2.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Індивідуальні дані тварин мають бути представлені у формітаблиці. Експериментальною одиницею є тварина. Щодо кожної тваринипотрібно визначити кількість оцінених клітин, кількість абераційна одну клітину та кількість клітин зі структурними хромосомнимиабераціями. Різні типи структурних хромосомних аберацій потрібнозаносити в список разом з їх кількістю і частотою для груп, якіпіддають дії речовини, і контрольних груп. Гепи фіксуються окремоі про них повідомляють, проте, зазвичай не включають до загальноїчастоти аберацій. Якщо немає доказів підтвердження різниці реакціїв залежності від статі, для статистичного аналізу можливеоб'єднання даних щодо обох статей.
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Є кілька критеріїв для визначення позитивного результату,оскільки збільшення кількості клітин з хромосомними абераціями,пов'язане з дозуванням, або чітке збільшення кількості клітин забераціями у групі, якій вводилася єдина доза при одноразовомузаборі зразків. Перш за все необхідно враховувати біологічнурелевантність результатів. Можливе використання статистичнихметодів в якості допоміжних при оцінюванні результатів тестування(6). Статистична значимість не має бути єдиним фактором, щовизначає позитивну реакцію. Сумнівні результати мають перевірятисяза допомогою подальших досліджень, переважно з використанняммодифікації експериментальних умов.
Підвищення поліплоїдії може означати, що досліджуванаречовина має потенціал для провокування кількісних хромосомнихаберацій. Збільшення ендоредуплікацій може означати, щодосліджувана речовина має потенціал для пригнічення розвиткуклітинного циклу (7)(8).
Досліджувана речовина, результати якої не відповідаютьвищезазначеним критеріям, вважається не мутагенною в цьомутестуванні.
Хоча більшість експериментів дає чітко позитивні абонегативні результати, в поодиноких випадках сукупність данихвиключає можливість визначеного судження про активністьдосліджуваної речовини. Результати можуть залишатись сумнівнимиабо дискутивними, не зважаючи на кількість проведенихекспериментів.
Позитивні результати тесту in vivo на хромосомну абераціюозначають, що досліджувана речовина викликає хромосомні аберації укістковому мозку досліджуваних біологічних видів. Негативнірезультати означають, що за досліджуваних умов досліджуванаречовина не викликає структурних хромосомних аберацій у кістковомумозку досліджуваних біологічних видів.
Імовірність того, що досліджувана речовина або її метаболітидосягнуть загального кровообігу або, особливо, цільової тканини(наприклад, системна токсичність), підлягають обговоренню.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити наступну інформацію:
Розчинник/середовище:
- обґрунтування для вибору розчинника.
- розчинність та стабільність досліджуваної речовини врозчиннику/середовищі, якщо це відомо.
Піддослідні тварини:
- біологічні види/лінії тварин, що використовуються,
- кількість, вік і стать тварин
- походження, умови утримання, дієта, і т.д.
- вага кожної тварини на початку тестування, включаючидіапазон ваги тіла, середні та стандартні відхилення для кожноїгрупи,
