8.2.2. Приготування розчину натрію хлористого з концентрацією 8,5 г/л.
Наважку (8,50+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.21) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14) і доводять об'єм розчину до мітки. Розчин зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.3. Приготування розчину забуференого фізіологічного, (рН 7,4 +- 0,1).
Змішують 4 об'єми розчину натрію хлористого (8,5 г/л) (п. 8.2.2) з 1 об'ємом буферу Міхаеліса (п. 8.2.1). Розчин зберігають при температурі від 4 до 8 град. С протягом місяця.
8.2.4. Приготування розчину натрію лимоннокислого (3,8 г на 100 г розчину).
Наважку (3,80+-0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.20) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.14), яку відміряють циліндром (п. 3.13). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 град. С протягом одного тижня.
8.2.5. Приготування розчину кальцію хлористого 0,025 моль/л.
Наважку (2,77+-0,01) г кальцію хлористого зневодненого (п. 3.16) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9) та розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14), об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла з притертим корком (п. 3.12) при температурі від 4 до 6 град. С протягом місяця.
8.2.6 Приготування каолін-еритрофосфатидної суміші.
2,5-3,0% емульсію еритрфосфатиду (п. 3.15) розбавляють забуференим фізіологічним розчином (п. 8.2.3) до 0,1% емульсії, розфасовують по 1 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.11), герметично закупорюють і зберігають за температури мінус 20 град. С один рік.
Перед роботою емульсію еритрфосфатиду розморожують, розбавляють до концентрації 0,01% забуференим фізіологічним розчином (п. 8.2.3) у співвідношенні (1:9) та додають (5,00+-0,01) мг каоліну (п. 3.17) на 1 мл емульсії еритрфосфатиду, перемішують. Суміш стабільна при температурі від 4 до 6 град. С 2 доби. Замість еритрофосфатидів можна використовувати кефалін.
8.3. Одержання плазми крові.
Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.
У пробірку поліетиленову (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,5 мл розчину натрію лимоннокислого 5,5 водного (п. 8.2.4) та змішують відповідно з 4,5 мл крові (співвідношення 1:9). Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).
Центрифугують (п. 3.8) протягом 10 хв з прискоренням 1200-1400 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетиленову (п. 3.11).
Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з клінічної лабораторної діагностики.
8.4. Одержання стандартної донорської плазми крові.
Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові більш ніж 7 донорів, отриману, як вказано в п. 8.4, розфасувати по 1-2 мл у пробірки поліетиленові (п. 3.11), заморозити та зберігати протягом двох тижнів при температурі мінус 20 град. С.
Безпосередньо перед виконанням вимірювань плазму крові розморожують у бані водяній лабораторній (п. 3.4) при 37 град. С (до повного відтаювання пробірку не струшувати). Після відтаювання плазма повинна бути прозорою.
9. ХІД ВИЗНАЧЕННЯ
9.1. В пробірку мірну лабораторну (п. 3.10) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,1 мл плазми крові, що досліджується (п. 8.3), додають 0,1 мл каолінеритрофосфатидної суміші (п. 8.2.6), перемішують і інкубують протягом трьох хвилин (час, достатній для повної активації факторів контакту) при температурі 37 град. С на бані водяній лабораторній (п. 3.3).
9.2. Через 3 хвилини додають 0,1 мл попередньо підігрітого до температури 37 град. С 0,025 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5) і одночасно включають секундомір (п. 3.6). Пробірки з реагентами через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і визначають час утворення згустку. Критерієм закінчення реакції є утворення гелю.
Час зсідання стандартної донорської плазми крові становить від 35 до 55 с.
9.3. При подовженні часу АЧТЧ більше 60 с проводять корекційно-інгібіторні проби, при виконанні яких готують суміш: 1 частина стандартної донорської плазми крові (0,02 мл) (п. 8.4) та 9 частин плазми крові, що досліджується (0,18 мл) (п. 8.4).
Якщо додавання 1 частини контрольної плазми крові (а тим більше, 5 частин) не корегує первинне подовження АЧТЧ, то це вказує на присутність антикоагулянтів. Якщо нормалізація подовження АЧТЧ проходить вже при додаванні 1 частини стандартної плазми крові, це вказує на дефіцит факторів внутрішнього шляху зсідання крові.
10. ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ВИМІРЮВАНЬ
10.1. За результат вимірювання приймають середнє значення
(х , с) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за
ср
формулою:
х = ( х + х )/2,
ср 1 2
де х , х - значення, отримані у двох паралельних
1 2
вимірюваннях.
10.2. Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 N 1:
- форма 237/о - "Аналіз крові (показники системи згортання)";
- форма 238/о - "Аналіз крові (показники системи згортання - скорочений варіант)";
- форма 250/о - "Журнал реєстрації аналізів і їх результатів";
- форма 262/о - "Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії".
11. КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ
11.1. Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.
11.2. Вимірювання часу зсідання плазми крові в тесті АЧТЧ проводять відповідно до розділу 9.
11.3. Отримані дані заносять у таблицю 2.
Таблиця 2
------------------------------------------------------------------
| N | Х | Х | Х - Х |( Х - Х ) в степені 2|
| | 1 | 2 | 1 2 | 1 2 |
|---+---------+---------+----------------+-----------------------|
------------------------------------------------------------------
11.4 За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п.10.1), середньоквадратичне відхилення (дельта) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.
11.5 Будують контрольну карту кумулятивних сум.
11.6 Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2дельта) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.
11.7 Якщо отримані результати вимірів не відповідають вимогам розділу 2 та п.11.6, то виміри необхідно повторити.
11.8 Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювання необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.
12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ
------------------------------------------------------------------
| Документ | Найменування | N пункту |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 7328-82Е |Меры массы общего назначения и|8.2.1; |
| |образцовые. |8.2.2; |
| |Технические условия |8.2.3; |
| | |8.2.4; |
| | |8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 24104-88Е |Весы лабораторные общего | 8.2.1; |
| |назначения и образцовые. | 8.2.2; |
| |Общие технические условия | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-1-2850-80 |Баня водяна лабораторна | 9.1; 9.2 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 28311-89 |Дозаторы медицинские | 8.2.6; |
| |лабораторные | 8.3; 8.4;|
| | | 9.1; 9.2 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 5.375-4215-77 |Центрифуга ЦЛР-1 | 8.3; 8.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-05.2147-78 |Іономір універсальний ЕВ-74 | 8.2.1 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 13646-68 |Термометры стеклянные ртутные | 9.1; 9.2;|
| |для точных измерений | 9.3 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-1819.0021-90 |Секундомір механічний "Слава" | 9.1; 9.2 |
| |с ДСПР 1-2-000. Технічні умови| |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-2-407-89 |Банки и флаконы с притертой | 8.2.1; |
| |пробкой | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 208 УССР 273-84 |Пробірки поліетиленові | 8.2.6; |
| | | 8.3; 8.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 1770-74 |Посуда мерная лабораторная | 8.2.1; |
| |стеклянная. Цилиндры, | 8.2.2; |
| |мензурки, колбы, пробирки. | 8.2.3; |
| |Технические условия | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 8.3; 9.1;|
| | | 9.2; 9.3 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 6709-79 |Вода дистиллированная. | 8.2.1; |
| |Технические условия | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4161-77 |Кальцій хлористий | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГФХ, с. 140 |Каолін | 8.2.6 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 6-09-2082-78 |Кефалін | 8.2.6 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Р N 82/848/8 (Мінськ, |Еритрофосфатид | 8.2.6 |
|Білорусь) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 6-09-2082-78 |Натрій 5,5'- | 8.2.1 |
| |диетилбарбітуровокислий | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4233-77 |Натрій хлористий | 8.2.1; |
| | | 8.2.2; |
| | | 8.2.3 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 22280-76 |Натрій лимоннокислий 5,5 | 8.2.4 |
| |водний | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 3118-77 |Фіксонал соляної кислоти | 8.2.1 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Мінхімпромом СРСР |"Правила техніки безпеки при | 5 |
|від 27.07.77: |експлуатації електроустановок"| |
|НАОП 1.1.10-1.01-85 | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про подальше удосконалення | 5 |
|від 19.12.97 N 359 |атестації лікарів" | |
|( z0014-98 ) та від | | |
|23.10.91 N 146 | | |
|( v0146282-91 ) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України від |"Про атестацію середніх | 5 |
|23.10.91 N 146 |медичних працівників" | |
|( v0146282-91 ) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про затвердження медичної | 10.2 |
|від 04.01.01 N 1 |облікової документації, що | |
|( v0001282-01 ) |використовується в | |
| |лабораторіях | |
| |лікувально-профілактичних | |
| |закладів" | |
------------------------------------------------------------------
Міністерство охорони здоров'я України
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ МОЗ України
15.11.2002 N 417
МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ
ВИЗНАЧЕННЯ ТОЛЕРАНТНОСТІ ПЛАЗМИ КРОВІ ЛЮДИНИ ДО ГЕПАРИНУ МВВ 42.01-09-2002
ПОГОДЖЕНО
Головний метролог
МОЗ України
А.М.Ніколенко
10.10.2002
ПОГОДЖЕНО
Головний спеціаліст з
клінічної лабораторної
діагностики МОЗ України
В.А.Дєєв
10.10.2002
1. ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ
Документ встановлює порядок виконання вимірювання толерантності плазми крові до гепарину та її здатність нейтралізувати введений гепарин.
Методика призначена для використання у закладах охорони здоров'я.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ
Методика забезпечує вимірювання толерантності плазми крові до гепарину та її здатність нейтралізувати введений гепарин за характеристиками, наведеними у таблиці 1.
Таблиця 1
------------------------------------------------------------------
|Діапазон вимірювань,| Середньоквадратичне |Коефіцієнт варіації,|
| с | відхилення, | V(%) |
| | дельта (с) | |
|--------------------+----------------------+--------------------|
| 7 - 21 | +- 2 | 5,4 |
------------------------------------------------------------------
3. ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ
3.1. Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е
3.2. Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е
3.3. Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80
3.4. Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89
3.5. Іономір ЕВ-74 ТУ 25-05.2147-78
3.6. Секундомір механічний ТУ 25-1819.0021-90
3.7. Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ
13646-68
3.8. Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5. 375-4215-77
3.9. Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ
1770-74
3.10. Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ
98-891-021-91Е
3.11. Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР 273-84.
3.12. Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89
3.13. Циліндри ГОСТ 1770-74
3.14. Вода дистильована ГОСТ 6709-79
3.15. Гепарин Р0700/02005 N 0945/06.97 Б-2 ЛС N 3884/99
3.16. Кальцій хлористий ТУ 6-09-4711-81
3.18. Натрій 5,5'-диетилбарбітуровокислий ТУ 6-09-2082-78
3.19. Натрій лимоннокислий 5,5 водний ГОСТ 22280-76
3.20. Натрій хлористий ГОСТ 4233-77
3.21. Фіксанал кислоти соляної ГОСТ 3118-77
Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути атестовані та повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.
4. МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ
Метод визначення толерантності плазми до гепарину базується на здатності плазми крові, що містить в собі тромбоцити, нейтралізувати введений гепарин. При внесенні в плазму крові, визначеної кількості гепарину час її рекальціфікації змінюється в залежності від коагуляційної і антикоагуляційної активності крові.
5. ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ
При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 "Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях", затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 "Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок", затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.
6. ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ
До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 N 359, від 23.10.91 N 146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.
7. УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ
При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:
7.1. Температура середовища (22+-5) град. С.
7.2. Відносна вологість від 60% до 75%.
7.3. Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).
7.4. Напруга електромережі (220+-22) В.
7.5. Освітленість від 300 до 400 лк.
8. ПІДГОТОВКА ТА ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ
8.1. Усі засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести в робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.
8.2. Приготування розчинів.
8.2.1. Приготування буферу Міхаеліса (рН 7,4+-0,1).
Розчин А. Наважку (20,60+-0,01) г натрію 5,5'-диетилбарбітуровокислого (п. 3.18) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14) і об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігається у флаконах з темного скла (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
Розчин Б. Фіксонал кислоти соляної 0,1 моль/л (п. 3.21) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9) і об'єм розчину доводять до мітки дистильованою водою (п. 3.14). Розчин зберігається у флаконах з темного скла (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
Розчин В. Наважку (7,30+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.20) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), відміряють циліндром (п. 3.13) 290 мл розчину А і 210 мл розчину Б, додають в колбу та об'єм доводять до мітки. рН буферу перевіряють на іонометрі універсальному (п. 3.5). Буфер зберігають у флаконах з темного скла (п. 3.12) протягом місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.2. Приготування розчину натрію хлористого з концентрацією 8,5 г/л.
Наважку (8,50+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.20) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14) і доводять об'єм розчину до мітки. Розчин зберігають у флаконах з темного скла (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.3 Приготування розчину забуференого фізіологічного (рН 7,4+-0,1).
Змішують 4 об'єми розчину натрію хлористого (8,5 г/л) (п. 8.2.2) з 1 об'ємом буферу Міхаеліса (п. 8.2.1). Розчин зберігають при температурі від 4 до 8 град. С протягом місяця.
8.2.4 Приготування розчину натрію лимоннокислого (3,8 г на 100 г розчину).
Наважку (3,80+-0,01) г натрію лимоннокислого (п. 3.19) розчиняють у 96,2 г дистильованої води (п. 3.14), яку відміряють циліндром (п.3.13). Розчин зберігають при температурі від 4 до 6 град. С протягом одного тижня.
8.2.5 Приготування 0,025 моль/л розчину кальцію хлористого.
Наважку (2,77+-0,01) г кальцію хлористого (п. 3.16) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9) та розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14), об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла з притертою пробкою (п. 3.12) при температурі від 4 до 6 град. С протягом місяця.
8.2.6 Приготування гепарин-кальцієвої суміші.
0,05 мл розчину гепарину (п. 3.15) дозатором лабораторним (п. 3.4) додають до 250 мл 0,025 моль/л розчину кальцію хлористого (п. 8.2.5).
Активність суміші змінюється першу добу, а потім протягом 14 днів лишається стійкою. Розчин готують кожні 14 днів, зберігають при температурі від 4 град. С до 6 град. С.
8.3 Одержання плазми крові.
Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.
У пробірку поліетиленову (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,5 мл розчину натрію лимоннокислого (п. 8.2.4) та змішують з 4,5 мл крові (співвідношення 1:9). Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).
Центрифугують (п. 3.8) протягом 10 хв з прискоренням 300 g. Плазму крові переносять дозатором лабораторним (п. 3.4) у пробірку поліетилену (п. 3.11). Вимоги до зразків плазми крові установлюються у розділах преаналітики посібників з клінічної лабораторної діагностики.
8.4 Одержання стандартної донорської плазми крові.
Для приготування стандартної донорської плазми крові необхідно змішати у рівних співвідношеннях плазму крові більш ніж 7 донорів, отриману, як вказано в п. 8.3.
9. ХІД ВИЗНАЧЕНЬ
9.1. 0,2 мл тромбоцитарної плазми крові, що досліджується (п. 8.3) та плазми крові донора (п. 8.4) переносять у пробірки мірні лабораторні (п. 3.10) і вміщують у баню водяну лабораторну при температурі 37 град. С.
9.2 Через одну хв інкубації додають 0,2 мл гепарин-кальцієвої суміші (п. 8.2.6), попередньо підігрітої до температури 37 град. С, перемішують і включають секундомір (п. 3.7).
Через кожні 2-3 хв, а в кінці реакції через кожні З0 с, пробірки поволі нахиляють і фіксують час, коли суміш більше не стікає при нахилі пробірки. Через 5-6 хв прозорість плазми змінюється, що вказує на початок зсідання проби. Критерієм закінчення реакції є утворення гелю. Момент утворення згустку фіксують секундоміром (3.6).
Нормальні показники для здорової людини складають 8-16 хв ( у 75% людей - 11-14 хв).
_______________
Примітка. Визначення проводять не пізніше, як через 2-3 годин після забору крові у зв'язку з тим, що показники толерантності плазми до гепарину, визначені пізніше вказаного часу, можуть бути підвищені.
10. ОБРОБКА ТА ОФОРМЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТіВ ВИМІРЮВАНЬ
10.1. За результат вимірювання приймають середнє значення
(х , хв) двох паралельних вимірювань, яке розраховується за
ср
формулою:
х = ( х + х )/2,
ср 1 2
де х , х - значення, отримані у двох паралельних вимірюваннях.
1 2
10.2. Результати вимірювань заносяться до облікової медичної документації, затвердженої наказом МОЗ України від 04.01.01 N 1:
- форма 237/о - "Аналіз крові (показники системи згортання)";
- форма 238/о - "Аналіз крові (показники системи згортання - скорочений варіант)";
- форма 250/о - "Журнал реєстрації аналізів і їх результатів";
- форма 262/о - "Журнал обліку аналізів, зроблених в лабораторії".
11. КОНТРОЛЬ ПОХИБКИ ВИМІРЮВАНЬ
11.1. Визначення систематичної похибки вимірювань за даною методикою проводиться методом паралельних проб. Для цього проводять по два паралельних вимірювання 10 проб пацієнтів поточного дня.
11.2. Вимірювання толерантності плазми до гепарину проводять відповідно до розділу 9.
11.3. Отримані дані заносять у таблицю 2.
Таблиця 2
------------------------------------------------------------------
| N | Х | Х | Х - Х |( Х - Х ) в степені 2|
| | 1 | 2 | 1 2 | 1 2 |
|---+---------+---------+----------------+-----------------------|
------------------------------------------------------------------
11.4. За отриманими результатами вимірювань розраховується середнє значення показників (п. 10.1), середньоквадратичне відхилення (дельта) та коефіцієнт варіації (V). Результати розрахунків порівнюються з величинами, наведеними в таблиці 1 розділу 2.
11.5. Будують контрольну карту кумулятивних сум.
11.6. Кожного дня різницю між двома паралельними вимірюваннями проб, відмічають на карті. Результати, які попадають за межі контрольних вимірювань (2дельта) вказують на наявність недоліків в системі вимірювання.
11.7. Якщо отримані результати вимірів не задовольняють вимоги розділу 2 та п. 11.6, то виміри необхідно повторити.
11.8. Якщо результати повторного контролю незадовільні, то виконання вимірювань необхідно припинити, виявити та усунути причини, які до цього призвели.
12. ПОСИЛАННЯ НА НОРМАТИВНІ ДОКУМЕНТИ
------------------------------------------------------------------
| Документ | Найменування | N пункту |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 24104-88 Е |Весы лабораторные общего | 8.2.1; |
| |назначения и образцовые. | 8.2.2; |
| |Общие технические условия | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-1-2850-80 |Баня водяна лабораторна | 9.1; 9.2 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 28311-89 |Дозаторы медицинские | 8.2.6; |
| |лабораторные | 8.3; 8.4;|
| | | 9.1; 9.2 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 5.375-4215-77 |Центрифуга ЦЛР-1 | 8.3; 8.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-05.2147-78 |Іономір універсальний ЕВ-74 | 8.2.1 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 13646-68 |Термометры стеклянные ртутные | 9.1; 9.2 |
| |для точных измерений | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 25-1819.0021-90 |Секундомір механічний "Слава" | 9.1; 9.2 |
| |с ДСПР 1-2-000. Технічні умови| |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 64-2-407-89 |Банки и флаконы с притертой | 8.2.1; |
| |пробкой | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.4; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 208 УССР 273-84 |Пробірки поліетиленові | 8.3; 8.4 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 1770-74 |Посуда мерная лабораторная | 8.2.1; |
| |стеклянная. Цилиндры, | 8.2.2; |
| |мензурки, колбы, пробирки. | 8.2.3; |
| |Технические условия | 8.2.4; |
| | | 8.2.5; |
| | | 9.1; 9.2 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 6709-79 |Вода дистиллированная. | 8.2.1; |
| |Технические условия | 8.2.2; |
| | | 8.2.3; |
| | | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4161-77 |Кальцій хлористий | 8.2.5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ТУ 6-09-2082-78 |Натрій 5,5'- | 8.2.1 |
| |диетилбарбітуровокислий | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 4233-77 |Натрій хлористий | 8.2.1; |
| | | 8.2.2; |
| | | 8.2.3 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Р0700/02005 |Гепарин | 8.2.4 |
|N 0945/06.97 | | |
|Б-2 ЛС N 3884/99 | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 22280-76 |Натрій лимоннокислий 5,5 | 8.2.1 |
| |водний | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|ГОСТ 3118-77 |Фіксонал соляної кислоти | 5 |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Мінхімпромом СРСР |"Правила техніки безпеки при | 5 |
|від 27.07.77: |експлуатації електроустановок"| |
|НАОП 1.1.10-1.01-85 | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про подальше удосконалення | 5 |
|від 19.12.97 N 359 |атестації лікарів" | |
|( z0014-98 ) та від | | |
|23.10.91 N 146 | | |
|( v0146282-91 ) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України від |"Про атестацію середніх | 5 |
|23.10.91 N 146 |медичних працівників" | |
|( v0146282-91 ) | | |
|----------------------+------------------------------+----------|
|Наказ МОЗ України |"Про затвердження медичної | 10.2 |
|від 04.01.01 N 1 |облікової документації, що | |
|( v0001282-01 ) |використовується в | |
| |лабораторіях | |
| |лікувально-профілактичних | |
| |закладів" | |
------------------------------------------------------------------
Міністерство охорони здоров'я України
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ МОЗ України
15.11.2002 N 417
МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ
ВИМІРЮВАННЯ ЧАСУ ЗСІДАННЯ ПЛАЗМИ КРОВІ ЛЮДИНИ В ТЕСТІ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ПРОТРОМБІНОВОГО КОМПЛЕКСУ (ПРОТРОМБІНОВИЙ АБО ТРОМБОПЛАСТИНОВИЙ ЧАС) ВИЗНАЧЕННЯ ПРОТРОМБІНОВОГО ІНДЕКСУ МВВ 42.01-10.2002
ПОГОДЖЕНО
Головний метролог
МОЗ України
А.М.Ніколенко
10.10.2002
ПОГОДЖЕНО
Головний спеціаліст з
клінічної лабораторної
діагностики МОЗ України
В.А.Дєєв
10.10.2002
1. ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ
Документ встановлює порядок виконання вимірювання часу зсідання плазми крові людини в тесті протромбіновий час (тромбопластиновий час) та визначення протромбінового індексу (ПІ).
Методика призначена для використання у закладах охорони здоров'я.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ПОХИБКИ ВИЗНАЧЕННЯ
Методика забезпечує вимірювання часу зсідання плазми крові людини в тесті протромбіновий час (тромбопластиновий час) за характеристиками, наведеними у таблиці 1.
Таблиця 1
------------------------------------------------------------------
|Діапазон вимірювань,| Середньоквадратичне |Коефіцієнт варіації,|
| с | відхилення, | V(%) |
| | дельта (с) | |
|--------------------+----------------------+--------------------|
| 14 - 22 | +- 0,6 | 5 |
------------------------------------------------------------------
3. ЗАСОБИ ВИМІРЮВАЛЬНОЇ ТЕХНІКИ, ДОПОМІЖНЕ ОБЛАДНАННЯ, РЕАКТИВИ І МАТЕРІАЛИ
3.1. Ваги 2 кл. точності ГОСТ 24104-88Е
3.2. Важки лабораторні 2 кл. точності ГОСТ 7328-82Е
3.3. Баня водяна лабораторна ТУ 64-1-2850-80
3.4. Дозатори медичні лабораторні ГОСТ 28311-89.
3.5. Іономір універсальний ЕВ-74 ТУ 25-05.2147-78
3.6. Секундомір механічний ТУ 25-1819.0021-90
3.7. Термометр скляний ртутний для точних вимірювань ГОСТ
13646-68
3.8. Центрифуга ЦЛР-1 ТУ 5.375-4215-77
3.9. Колби мірні місткістю від 100,0 до 1000.0 мл ГОСТ
1770-74
3.10. Пробірки мірні лабораторні місткістю 10 мл ТУ
98-891-021-91Е
3.11. Пробірки поліетиленові місткістю (10-15) мл ТУ 208 УССР
273-84
3.12. Флакони з притертим корком ТУ 64-2-407-89
3.13. Циліндри від 100 мл та на 1000 мл ГОСТ 1770-74
3.14. Вода дистильована ГОСТ 6709-7913
3.15. Кальцій хлористий ГОСТ 4161-77
3.16. Натрій 5,5-диетилбарбітуровокислий ТУ 6-09-2082-78.
3.17. Натрій лимоннокислий 5,5 водний ГОСТ 22280-76
3.18. Натрій хлористий ГОСТ 4233-77
3.19. Тромбопластин
3.20. Фіксанал кислоти соляної ГОСТ 3118-77
Всі засоби вимірювальної техніки повинні бути повірені у встановленому порядку. Допускається застосування іншого обладнання, лабораторного посуду, а також реактивів і матеріалів з метрологічними та технічними характеристиками не нижчими, ніж наведені.
4. МЕТОД ВИЗНАЧЕННЯ
Метод визначення активності протромбінового комплексу базується на вимірюванні часу зсіданні плазми крові в присутності тканинного тромбопластину та кальцію хлористого.
Результати вимірювань представляють у вигляді протромбінового індексу (ПІ), який відповідає відношенню часу зсідання стандартної донорської плазми крові до часу зсідання плазми крові хворого, відношення представлене у відсотках:
ПІ = (А/В) х 100, де А - протромбіновий час зсідання стандартної донорської плазми крові, В - протромбіновий час зсідання плазми крові, що досліджується.
5. ВИМОГИ ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ
При виконанні вимірювань необхідно дотримуватись вимог НАОП 1.3.10-1.06-77 "Загальні правила безпеки роботи в хімічних лабораторіях", затверджених 27.07.77 Мінхімпромом СРСР: НАОП 1.1.10-1.01-85 "Правила техніки безпеки при експлуатації електроустановок", затверджено 10.09.85 Міненерго СРСР та ЦК галузевої профспілки; правил безпеки роботи, що представлені в експлуатаційній документації на засоби вимірювальної техніки та допоміжні пристрої.
6. ВИМОГИ ДО КВАЛІФІКАЦІЇ ВИКОНАВЦЯ
До виконання методики допускаються спеціалісти із спеціальною освітою, які відповідають кваліфікаційним вимогам відповідно до наказів МОЗ України від 19.12.97 N 359, від 23.10.91 N 146, та пройшли курси з клінічної лабораторної діагностики у державних навчальних закладах освіти системи МОЗ України різного рівня акредитації, наукових закладах або таких, що до них прирівняні, і мають право видавати документи державного зразка згідно з чинним законодавством України.
7. УМОВИ ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ
При проведені вимірювань повинні бути забезпечені наступні умови:
7.1. Температура середовища (22+-5) град. С.
7.2. Відносна вологість від 60% до 75%.
7.3. Атмосферний тиск від 84,0 до 106,7 кПа (від 600,0 до 800,3 мм рт.ст).
7.4. Напруга електромережі (220+-22) В.
7.5. Освітленість від 300 до 400 лк.
8. ПІДГОТОВКА ТА ВИКОНАННЯ ВИМІРЮВАНЬ
8.1. Усі засоби вимірювальної техніки та допоміжне обладнання привести в робочий стан згідно з інструкціями по експлуатації.
8.2. Приготування розчинів.
8.2.1. Приготування буферу Міхаеліса (рН 7,4+-0,1).
Розчин А. Наважку (20,60+-0,01) г натрію 5,5'-диетилбарбітуровокислого (п. 3.16) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14) і об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігається у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
Розчин Б. Фіксанал кислоти соляної 0,1 моль/л (п. 3.20) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9) і об'єм розчину доводять до мітки дистильованою водою (п. 3.14). Розчин зберігається у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
Розчин В. Наважку (7,30+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.18) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), відміряють циліндром (п. 3.13) 290 мл розчину А і 210 мл розчину Б, додають в колбу та об'єм доводять до мітки. рН буферу перевіряють на іонометрі універсальному (п. 3.5). Буфер зберігають у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.2. Приготування розчину натрію хлористого з концентрацією 8,5 г/л.
Наважку (8,50+-0,01) г натрію хлористого (п. 3.18) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9), розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14) і доводять об'єм розчину до мітки. Розчин зберігається у флаконах з темного скла з притертим корком (п. 3.12) протягом одного місяця при температурі від 4 до 8 град. С.
8.2.3. Приготування розчину забуференого фізіологічного (рН 7,4+-0,1).
Змішують 4 об'єми розчину натрію хлористого (8,5 г/л) (п. 8.2.2) з 1 об'ємом буферу Міхаеліса (п. 8.2.1). Зберігати розчин при температурі від 4 до 8 град. С протягом місяця.
8.2.4. Приготування розчину натрію лимоннокислого (3,8 г на 100 г розчину).
Наважку (3,80+-0,01) г натрію лимоннокислого 5.5 водного (п. 3.17) розчиняють у 96,2 мл дистильованої води (п. 3.14), яку відміряють циліндром (п. 3.13). Зберігають розчин при температурі від 4 до 6 град. С протягом одного тижня.
8.2.5 Приготування 0,025 моль/л розчину кальцію хлористого.
Наважку (2,77+-0,01) г кальцію хлористого зневодненого (п. 3.15) переносять у мірну колбу місткістю 1000,0 мл (п. 3.9) та розчиняють у дистильованій воді (п. 3.14), об'єм розчину доводять до мітки. Розчин зберігають у флаконах темного скла з притертим корком (п. 3.12) при температурі від 4 до 6 град. С протягом місяця.
8.2.6 Приготування суспензії тромбопластину.
Наважку (20,0+-0,1) мг тромбопластину (п. 3.19 перемішують з 1 мл забуференого фізіологічного розчину (п. 8.2.3), який відміряють дозатором лабораторним (п. 3.4). Суспензію центрифугують 3-7 хв з прискоренням 200-300 g та дозатором лабораторним (п. 3.4) рідину переносять в пробірку поліетиленову (п. 3.11). Перед використанням суспензію перемішують.
Активність тромбопластину перевіряють по часу зсідання стандартної донорської плазми крові:
1. В пробірку мірну лабораторну (п. 3.10) вносять 0,1 мл розчину кальцію хлористого (п. 8.2.3) та 0,1 мл суспензії тромбопластину. Суміш інкубують 60 с на бані водяній (п. 3.3) при температурі 37 град. С.
2. До тромбопластин-кальцієвої суміші додають 0,1 мл стандартної донорської плазми крові, включають секундомір (п.3.6). Пробірки через кожні 1-2 секунди нахиляють на 45 градусів і виміряють час появи ниток або згустку фібрину. Час зсідання 0,1 мл стандартної донорської плазми крові дорівнює 16-18 с.
8.3. Одержання плазми крові.
Кров у хворого беруть натщесерце з вени гострою сухою голкою з широким діаметром, без шприца (для запобігання гемолізу). При заборі крові перші 5-6 крапель відкидають. Під час взяття крові не рекомендується накладати джгут і робити масаж передпліччя для запобігання активації зсідання крові і фібринолізу.
У пробірку поліетиленову (п. 3.11) дозатором лабораторним (п. 3.4) вносять 0,5 мл розчину натрію лимоннокислого (п. 8.2.4) та змішують з 4,5 мл крові (співвідношення 1:9). Пробірку з сумішшю щільно закривають корком і повільними рухами обережно декілька разів перемішують (не струшуючи).