з розбавлення 10 . Приготовлені розбавлення по 1 мл розливають у
два ряди пробірок, додають 0,5 мл "нічної" бульйонної культури
хазяїна, 5 мл розтопленого 1,0% МПА та виливають на приготовлений
заздалегідь шар 2,0% МПА у чашках Петрі. Виливають приготовлену
суміш (верхній шар) на нижній шар агару і швидко розподіляють по
поверхні агару, дають можливість застигнути та інкубують у
термостаті при 36 +- 1 град. С протягом 6 годин, після чого
виймають і підраховують кількість бляшок лізису культури хазяїна,
тобто БТО на чашці. Після підрахунку БТО чашки з посівами
залишають до слідуючого дня при кімнатній температурі і роблять
остаточний підрахунок БТО та їх розрахунок на одиницю об'єму
(на мл чи на л в залежності від точки відбору проб). В разі
неможливості інкубації при двух температурах надають перевагу
інкубації при 36 +- 1 град. С. Результат вважається прийнятним при
одержанні відповідних позитивного та негативного контролів.
8.3. Дослідження проб води поверхневих водоймищ
Воду поверхневих водоймищ досліджують об'ємом 10-100 мл в залежності від ступеня їх забруднення. Нижня границя досліджуваного об'єму (10 мл) обумовлена нормативом допустимого рівня коліфагів води поверхневих водоймищ, який дорівнює 100 БТО в одному літрі води. При цьому використовують прямий метод посіву, описаний в п. 9.21 цих методичних рекомендацій з деякими змінами, викладеними нижче. Від загального об'єму проби води відбирають 10 мл і розподіляють цей об'єм по 2,0 мл у 5 пробірок, куди додають 0,5 мл бульйонної культури хазяїна E.coli В, та 5 мл 2,0% МПА. Виливають отриману суміш на нижній шар 2,0% МПА, розлитого в чашки Петрі. Інкубацію проводять як описано в п. 9.2.1. Підраховують загальну кількість БТО на чашках сумарно та розраховують їх кількість в 1 л води.
8.4. Дослідження проб питної води
Питна вода з різних джерел водопостачання досліджується об'ємом 1 л. У відповідності з діючою нормативною документацією коліфаги у питній воді повинні бути відсутніми в об'ємі 1 л (ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999). Для дослідження використовується титраційний метод (метод накопичення, або НВЧ) у відповідності з розділом 11.1 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
В разі необхідності концентрації коліфагів досліджують пробу об'ємом 10 л. Застосовують метод осадження хлоридом алюмінія або сорбції ГГМКК.
Осадження хлоридом алюмінія. У пробу води, підігріту до
18-20 град. С, додають 10% розчин хлориду алюмінія з розрахунку
2 мл на 1 л проби. Доводять рН до 5,8-6,0, обережно перемішують
пробу до утворення пластівців. Залишають пробу на 16-18 годин при
4 град. С до утворення осаду (при неможливості залишають пробу при
кімнатній температурі). Надосадову рідину зливають, а пухкий осад
переносять у чотири 250 мл флакони та центрифугують при
2000 об./хв., протягом 15 хв. Надосадову рідину зливають. У кожний
флакон додають елюент - по 5,0 мл м'ясо-пептонного бульйону (МПБ)
подвійної концентрації з 10% Na HPO (рН 9,2). Флакони з елюентом
2 4
інтенсивно струшують 10 хв. Після цього осад з елюентом переносять
в один флакон і знов центрифугують при вказаному режимі,
надосадову рідину збирають в окремий флакон і досліджують прямим
методом посіву як вказано вище у пункті 5.3. Отриманий об'єм
елюенту розподіляють по 2,0 мл у відповідну кількість пробірок, до
них додається все необхідне у відповідності до пункту 8.3.
| Заступник директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду | Л.М.Мухарська |
СПИСОК
використаних джерел
2. "Положення про державний санітарно-епідеміологічний нагляд в Україні", затв. Постановою Кабінету Міністрів України 22.06.99 N 1109, в редакції Постанови Кабінету Міністрів України від 19.08.02. N 1217.
3. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
4. Закон України "Про захист населення від інфекційних хвороб".
5. ДСП N 9.9.5.064.2000 "Порядок видачі дозволів на роботу із мікроорганізмами 1-4 груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК".
6. Постанова від 27.05.1998 р. N 11 "Про порядок розробки, викладення, оформлення, затвердження державних санітарних правил і норм, гігієнічних нормативів та методичних документів".
7. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003.
8. "Правила функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень".
9. "Методичні рекомендації по проведенню робіт в діагностичних лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 1995.
10. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я N 219-2005. Концентрація ротавірусів із стічних вод за допомогою поліметилсилоксанового адсорбенту "Ентеросгель". Автори: Дзюблик І.В., Обертинська О.В., Миколенко Н.І., Київ, 2005.
11. Методичні вказівки МВ 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.
12. СанПин 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988.
13. ДСанПін "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання", Київ, 1999.
14. Методичні рекомендації "Організація роботи лабораторії при дослідженні біоматеріалу методом полімеразної ланцюгової реакції", Київ, 2007.
15. Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я N 247-2005 "Застосування швидких імунохроматографічних тестів в діагностиці ротавірусної інфекції у дітей в спеціалізованих дитячих лікувальних закладах". Дзюблик І.В., Ковалюк О.В., Обертинська О.В., Костенко О.О., Київ, 2005.
Додаток 1
до Методичних вказівок
АПАРАТУРА,
основні матеріали, реактиви, поживні середовища
Для проведення санітарно-вірусологічного дослідження використовують:
- Автоклав великий (або настільний для маленьких лабораторій).
- Бокс біологічної безпеки з запасними фільтрами безпеки II класу (ламінарна шафа).
- Ваги (аналітичні , електронні, торсійні, лабораторні).
- Водяна баня.
- Дистилятор води електричний.
- Дозатори автоматичні (одно- та восьмиканальні).
- Ізотермічні сумки.
- Камера підрахунку клітин.
- Колби скляні з градуйованою горловиною.
- Колби скляні лабораторні.
- Мікроскоп інвертований.
- Морозильна камера (-20 град. С) типу прилавка; морозильна камера (-70 град. С).
- Одноразовий посуд для культивування культур клітин - стерильні культуральні флакони, пробірки, планшети, піпетки тощо.
- Посуд для відбору проб води з об'єктів довкілля.
- Посуд медичний скляний.
- Пробірки скляні.
- Пробки конусоподібні.
- РН-метр з запасними електродами будь-якої марки або фірми-виробника.
- CO -інкубатор.
2
- Стерильні скельця для культури клітин.
- Сухожаровий стерилізатор.
- Термометри стандартні (0-100 град. С).
- Апарат для фільтрації будь-якої марки або фіми-виробника.
- Ультрафільтраційна система "Мінітан".
- Термостати електричні, сухожарові з автоматичним терморегулятором до 50 град. С.
- Утримувач фільтрів розміром 30, 70, 140 мм.
- Холодильник побутовий елетричний з температурою камери 4-6 град. С.
- Центрифуга лабораторна рефрижераторна.
- Центрифуга низькошвидкісна з охолодженням.
- Циліндри вимірювальні ємністю 100, 250, 500 куб.см.
- Чашки Петрі (діаметром 90-100 мм).
- Алюміній сірчанокислий.
- Аеросил-300, Калушського дослідного виробництва IX поверхонь АН України (Івано-Франківська обл.), ГОСТ 14922-77.
- Вата медична гігроскопічна.
- Калій фосфорнокислий двозаміщений.
- Кислота оцтова.
- Трис буфер 0,05 М рН 8,4
- Лейкопластир.
- Марля медична.
- Натрій фосфорнокислий двозаміщений безводний.
- Поліетиленгліколь з М.В. 6000, 4000.
- Гідрогель метилкремнієвої кислоти ГГМКК виробництва КРЕОМА ФАРМ, Київ (вул. Радищева, 3; м. Київ, Україна 03680, тел. (044) 455-35-40/41 тел./факс (044) 497-95-45).
- Розчин версену.
- Розчин трипсину 0,25%.
- Розчин Хенкса, рН 7,0.
- Середовище RPMI -1640, рН 7,3.
- Середовище Ігла ДМЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла МЕМ для культури клітин, рН 7,2.
- Середовище Ігла, рН 7,2.
- Сироватка великої рогатої худоби без консерванту, виробництва
- Сироватка теляча ембріональна без консерванту.
- Спирт етиловий ректифікований.
- Фільтр типу Петрянова.
- "Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованого хозяйственно-питьевого водоснабжения поверхностных и сточных вод", производства ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Республики Беларусь, г. Минск, тел./факс (375017) 2-26-52-63, ТУ РБ 100558032.047-2001, Регистрационное удостоверение N ИМ-7 1705.
Додаток 2
до пп. 8.1.5, 8.2.3,
8.3.2, 8.4.2
Методичних вказівок
ПЕРЕЛІК
устаткування ПЛР-лабораторії
Для обробки матеріалу і виділення НК:
1. Бокс біологічної безпеки II класу.
2. Центрифуга клінічна для пробірок об'ємом 5-100 мл.
3. Центрифуга - вортекс.
4. Мікроцентрифуга від 12 до 16 000 g для мікроцентрифужних пробірок об'ємом 1,5 мл.
5. Твердотільний термостат для пробірок об'ємом 1,5 мл діапазоном робочих температур 25-100 град. С.
6. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 піпетки: до 20 мкл, до 200 мкл і до 1000 мкл).
7. Одноразові поліпропіленові мікроцентрифужні пробірки з кришками, що загвинчуються або щільно закриваються, об'ємом 1,5 мл.
8. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 200 і до 1000 мкл.
9. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20, 200 і до 1000 мкл.
10. Штативи для наконечників та мікро пробірок об'ємом 1,5 мл.
11. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
12. Посуд з дезінфікуючим розчином.
Для приготування ПЛР-суміші і проведення ампліфікації:
1. Настільний ПЛР- бокс з бактерицидною лампою.
2. Ампліфікатор (термоциклер).
3. Набір автоматичних піпеток змінного об'єму (мінімум 3 штуки).
4. Одноразові поліпропіленові пробірки для ампліфікації об'ємом 0,5 або 0,2 мл (в залежності від марки ампліфікатора).
5. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму з аерозольним бар'єром до 20 та 100 мкл.
6. Штативи для наконечників та мікро пробірок на 0,5 або 0,2 мл.
7. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
8. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
9. Детектор флюоресценції типу "Джин" (при необхідності).
Для електрофоретичного аналізу продуктів ПЛР:
1. Камера для горозинтального електрофорезу.
2. Джерело постійного струму з напругою 150-460 В.
3. Транс ілюмінатор з кабінетом або камерою для перегляду гелів.
4. Відеосистема з цифровою відеокамерою для реєстрації результатів.
5. Комп'ютер для аналізу результатів електрофорезу.
6. Мікрохвильова піч для плавлення агарози.
7. Колба конічна з термостійкого скла для плавлення агарози об'ємом 250 мкл.
8. Мірні циліндри об'ємом 1 л та 100 мл.
9. Штатив для мікропробірок на 0,5 мл.
10. Окрема автоматична піпетка до 20 мкл.
11. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму до 20 мкл в штативі.
12. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
13. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Для гібридизаційно-ферментної детекції продуктів ПЛР:
1. Термостат планшетний, що підтримує температуру 37 град. С.
2. Вошер (не обов'язково).
3. Планшетний спектрофотометр.
4. Комп'ютер (повинен бути зв'язаний через комп'ютерну мережу з комп'ютером, розташованим у чистій зоні і призначений для аналізу результатів гібридизації).
5. Вісьмиканальна піпетка до 200 мкл.
6. Окремий набір одно канальних автоматичних піпеток змінного об'єму.
7. Одноразові наконечники для піпеток змінного об'єму.
8. Мірний циліндр об'ємом 1 л.
9. Холодильник з камерами, що підтримують температуру від 2 до 8 град. С та мінус 20 град. С.
10. Ємкість для скидання відпрацьованих витратних матеріалів.
Додаток 3
до п. 6.4
Методичних вказівок
ОДЕРЖАННЯ ГЕЛЮ БЕНТОНІТА
Шматки сухого бентоніту (наприклад, Курцівського родовища) диспергують у п'ятьох об'ємах дистильованої води (вага : об'єм). Для переходу бентоніту в натрієву форму до суспензії додають вуглекислий натрій (вуглекислий натрій ДСТ 4201-66) до 1 М концентрації, витримують 1 день при кімнатній температурі і кип'ятять на невеликому вогні при помішуванні впродовж одної години. Центрифугують 10 хв. при 2000 об./хв., надосадову рідину видаляють, осад суспендують у потрійному об'ємі дистильованої води в гомогенізаторі типу РТ-2. Центрифугують 15 хвилин при 2000 об./хв. Сама нижня частина осаду, що складається із забруднюючих речовин, відділяється. Інший осад тричі відмивають у потрійному об'ємі дистильованої води протягом 10 хвилин при 2000 об./хв. Відмитий бентоніт заливають 20 об'ємами дистильованої води (стосовно вихідної ваги матеріалу) і струшують у шуттель-апараті 2 години, потім суспензію центрифугують 10 хвилин при 1000 об./хв. Осад, що складається з грубих часток бентоніту і забруднюючих речовин, видаляють. Надосадову рідину (мілкодисперсну фракцію) центрифугують протягом 30 хвилин при 2000 об./хв., при цьому бентоніт седиментується. Осад, крім самої нижньої частини, що містить забруднюючі компоненти, суспендують у 0,14 М розчину NaCl (хлористий натрій ДСТ 4233-6) і знову осаджують при 2000-3000 об./хв. протягом 30 хв. Фракціонування повторюють тричі, видаляючи саму нижню частину осаду. Після третього центрифугировання осад, що представляє собою мілкодисперсну фракцію бентоніту, суспендують у бідистильованій воді до одержання 5-6% суспензії гелеподібної консистенції.
Вміст бентоніту в гелі визначають шляхом його висушування в сухожаровій шафі при 105 град. С с наступним зважуванням сухого залишку. Гель стерилізують автоклавуванням при 0,5 атм протягом 40 хвилин. Гель бентоніту зберігає сорбційні властивості по відношенню до ентеровірусів протягом багатьох років збереження при кімнатній температурі.
Додаток 4
до розділів 6, 7
Методичних вказівок
УЛЬТРАФІЛЬТРАЦІЙНА СИСТЕМА МІНІТАН
В основі роботи ультрафільтраційної системи Мінітан лежить принцип тангенціального потоку через ультрафільтраційні чи мікропористі мембрани. Під дією перестальтичного насосу розчин переходить із резервуару, що знаходиться під атмосферним тиском в корпус із системи Мінітан із швидкістю 100-1000 мл/хв. Зконцентрована фракція повертається в резервуар, а фільтрат збирається в окремому приймачі. Для концентрування вірусів, білків і клітин потрібно вихідний об'єм до 2 л в залежності від бажаного ступіня концентрації.
Завдяки особливостям конструкції пакетика, що має вигляд стопки фільтрів із сепараторів, утворюється постійний плавний потік фракції, що затримується. При такому способі фільтрації відбувається відмивання матеріалу з фільтра за допомогою постійного току рідини, направленим взовж його поверхні. Можливе використання 60 кв.см або 6000 кв.см.
Фірма "Sartorius"
Метод концентрування вірусів у пробах води.
1. Концентрація в системі Sartokon-Mini з модулем (межа відсічення 30 кДа) при пробі V = 3000 мл до V = 400 мл. Час концентрувння - 5 хв.
2. Концентрування на ультраячейці SM 16667 при пробі V = 400 мл, концентрація до V = 1 мл за час 10 хв.
3. Регенерація системи - 20 хв.
4. Загальний час концентрація однієї проби, включаючи регенерацію, 35 хв.
Додаток 5
до розділів 6, 8
Методичних вказівок
МЕТОД
оцінки ефективності концентрації вірусів ("Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. ВОЗ-2003")
Оскільки в кожному алгоритмі дослідження проб води представлені кілька методів концентрації вірусів, то перед тим як вибрати той метод, який планується застосовувати в лабораторії з урахуванням її можливостей та досвіду персоналу необхідно провести оцінку його придатності, тобто атестувати метод в лабораторії. Для цього відому кількість вакцинного поліовірусу типу I (штам Себіна) змішують з відібраною пробою стічної води, далі концентрують вірус із проби тим методом, що планується застосовувати, та визначають кількість поліовірусу типу I в концентраті (елюаті).
Порядок проведення дослідження
1. Готують стандартну серію 10-кратних розведень
вірусовмісного культурального матеріалу з відомим титром
інфекційної активності. Далі розраховують розведення вірусу так,
щоб у об'ємі 100 мл та 1 мл містилось по 20 ТЦД вірусу. З метою
50
перевірки визначеного титру та правильності розрахунків проводять
стандартне титрування в культурі клітин мікрометодом та визначають
титр у вірусовмісному культуральному матеріалі, що був взятий для
дослідження, у зразку об'ємом 100 мл та у зразку об'ємом 1 мл.
2. 1 л проби стічної води ділять на 2 рівні частини. До
однієї з них (0,5 л) додають 20 ТЦД вірусу та проводять
50
концентрування одночасно в двох частинах проби води за вибраним
методом.
3. Після деконтамінації концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус, відбирають 0,9 мл концентрату і готують наступні розведення на підтримуючому середовищі: 0,7 мл концентрату + 1,4 мл середовища; 0,2 мл концентрату + 1,8 мл середовища. Таким чином, отримують розведення концентрату відповідно 1:3 (2,1 мл) та 1:10 (2,0 мл). Матеріал заморожують та зберігають при мінус 20 град. С.
4. У 5 флаконів на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку вносили вірус.
5. У 2 флакони на 50 мл з культурою клітин Нер-2 або RD та в 1 флакон на 50 мл з культурою клітин RD(A) на сформовані моношари вносять по 0,5 мл деконтамінованого концентрату (елюату) з проби, в яку поліовірус I типу не вносили.
6. Культури клітин поміщають у термостат при 37 град. С та інкубують до формування ЦПД.
7. Якщо хоча б у моношарах 2 флаконів із 6, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД, то метод вважається атестованим. Якщо поліовірус не виявляють, то процедуру тестування проводять повторно, починаючи з п. 2, але вже вносять вірус у дозі 100 ТЦД. У цьому випадку метод вважається атестованим, якщо у всіх 6 флаконах, до яких було внесено концентрат з вірусом, проявляється ЦПД.
Додаток 6
до Методичних вказівок
НОРМАТИВНІ ПОСИЛАННЯ
Основою цих методичних вказівок є такі законодавчі та нормативні документи:
1. Закон України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення".
2. ДСанПіН "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання" (затверджено наказом Міністерства охорони здоров'я України від 23.12.96 за N 383, зареєстровано Міністерством юстиції України від 15.04.97 за N 136/1940).
3. Методическое руководство по биотестированию воды. РД 118.02.09.- М., 1991.
4. Методические указания по санитарно-микробиологическому контролю поверхностных водоемов. N 2285-81.
5. Методичні рекомендації по проведенню епідеміологічного і санітарно-вірусологічного нагляду за якістю джерел водопостачання, питної води в системі водопостачання з метою профілактики захворювання гепатитом А та іншими кишковими вірусними інфекціями. N 01-19/12-13.- К., 1982.
6. Методичні рекомендації по застосуванню бентоніту для виявлення ентеровірусів у людини і в навколишньому середовищі. - К., 1986.
7. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнение объектов окружающей среды. N 4146-86.- М., 1986.
8. Методические рекомендации "Ротавирусная инфекция" - М., 1989.
9. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. - М., 1982.
10. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції в умовах практичної вірусологічної лабораторії". - К., 2003.
11. Руководство по контролю качества питьевой воды/ Рекомендации. - Т.І. - Женева: ВОЗ, 1994.
12. Методичні рекомендації "Лабораторна діагностика ротавірусної інфекції". - К., 2002.
13. Методичні рекомендації "Епідеміологія і профілактика ротавірусної інфекції". - К., 2003.
14. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. - Женева: ВОЗ, 2003.