Про затвердження методичних вказівок "Санітарно-вірусологічний контроль водних обєктів"

Культури з негативним результатом спостерігають в цілому не менше 14 днів, після чого їх знищують.

При позитивному результаті (наявність ЦПД) у клітинах RD, але негативному в клітинах L20B після 14 днів спостереження проводять повторне пересівання на клітинах L20B. Деякі штами поліовірусів погано розмножуються в клітинах L20B у першому пасажі і не викликають чіткої ЦПД. У той же час, вони добре розмножуються в клітинах RD і при переносі цих ізолятів в клітини L20B викликають чітку ЦПД. Тому, щоб не втратити можливість виділення такого штаму поліовірусу, усі матеріали, які викликали ЦПД у клітинах RD, але були негативні в клітинах L20B, досліджуються повторно на L20B. Для цього по 0,2 мл культуральної рідини із пробірок з клітинами RD, де було виявлено ЦПД, переносять у пробірки з клітинами L20B.

Деякі проби можуть містити віруси, що викликають ЦПД у клітинах L20B, але не відносяться до ентеровірусів (наприклад, окремі реовіруси і аденовіруси). У багатьох випадках ЦПД, викликана ними, суттєво відрізняється від ЦПД, властивої ентеровірусам. Присутність у пробі такого агента реєструється. Деякі неполіомієлітні ентеровіруси викликають ЦПД в клітинах L20B, проте спроби ідентифікувати поліовірус у цих випадках слід робити, щоб виключити його присутність. При отриманні невизначених або таких, що важко інтерпретуються результатів типування виділених вірусів ізоляти слід направити для дослідження в Центральну лабораторію з діагностики поліомієліту.

Найбільшу увагу необхідно приділяти попередженню вірусної перехресної контамінації при інокуляції культур клітин при проведенні пасажів. Середовище з інокульованих пробірок не можна зливати через край, його видаляють піпеткою, а піпетки міняють після кожної процедури. Мікродозатори використовують тільки з наконечниками, що не утворюють аерозоль. Піпетками працюють обережно, щоб уникнути утворення аерозолю. Бризки і краплі негайно обробляють дезінфектантом.

Для достовірності негативних результатів виділення поліовірусу та інших ентеровірусів можуть бути проведені додаткові дослідження.

Додатковий пасаж. Матеріал інокульованої культури клітин заморожують і відтаюють для звільнення внутрішньоклітинного вірусу і переносять у пробірку з моношаром клітин. Використання "молодих" нормальних клітин сприяє розвитку чіткого ЦПД, непомітного після первинної інокуляції, особливо у випадках токсичності або бактеріальної контамінації проби. Не слід проводити більш одного додаткового пасажу (три пасажі всього), оскільки збільшується небезпека перехресної контамінації і отримання помилкового позитивного результату.

Адсорбція вірусу на клітинному моношарі. Із пробірок з культурою клітин видаляють середовище досліджуваного матеріалу, промивають клітини стерильним ФСБ, вносять по 0,2 мл екстракту проби і протягом 1 години при кімнатній температурі обережно похитують або обертають пробірки для рівномірного розподілу інокулята на моношарі клітин. Потім до кожної пробірки додають по 1 мл ПС. Цим методом можна виявити вірус у низьких концентраціях, понизити токсичність проби і прискорити появу ЦПД щонайменше на один день.

Недоліки методу включають збільшення можливості вірусної перехресної і бактерійної контамінації через додаткове відкриття пробірок з культурою клітин. Високий ризик перехресної контамінації при роботі з пробами, що містять вірус у великих концентраціях, не дозволяє використовувати цей метод для пересіву виділених вірусів.

Для ідентифікації виділених штамів поліовірусів їх розведені суспензії змішують у рівних об'ємах з сироватками тварин, імунних до 1, 2 та 3 типів поліовірусів. Суміші вірусу і сироваток вносять до лунок планшета для мікронейтралізації і витримують 1 годину при 36 град. С, щоб антитіла зв'язалися з вірусом. Потім до сумішей додають суспензію клітин, поміщають у термостат і щодня перевіряють наявність ЦПД. Імунна сироватка, що затримує розвиток ЦПД, вказує на тип вірусу.

Розведення до робочих титрів імунних моноспецифічних поліклональних сироваток проводиться згідно з інструкцією виробника щодо їх використання.

Суміші розливають у флакончики для заморожування з гвинтовими кришками і зберігають при -20 град. С. Моновалентні імунні сироватки, що залишилися, зберігають так само і використовують для підтвердження типу окремих штамів вірусу і приготування нових партій сумішей.

Нові серії сумішей перевіряють з вакцинними штамами поліовірусів типів 1, 2 і 3 на здатність ідентифікувати поліовіруси.

Якщо вірус виділений одночасно на клітинах RD та L20B, то штам, виділений на L20B, досліджують першим, щоб найбільш важливий результат отримати найшвидше. Якщо отриманий результат сумнівний, типують штам, виділений на клітинах RD. Штам, одержаний на L20B, направляють до Центральної лабораторії з діагностики поліомієліту для подальших досліджень.

Потрібно приготувати:

- стерильні мікротитрувальні планшети культуральні 96-ти лункові з пласким дном та кришками;

- стерильні пробірки місткістю 5 мл для розведень;

- одноразові пластикові піпетки на 1 мл і 2 мл;

- стерильні крапельниці на 50 мкл або мікродозатори з наконечниками, що не утворюють аерозоль (з фільтрами);

- флакон з культурою клітин, на яких був виділений вірус (зазвичай L20B).

- суміші антиполіовірусних сироваток;

- ПС.

Проводять роботу у такій послідовності:

- маркірують край мікротитрувального планшета, як вказано на рис. 8.4. (для двох штамів вірусу);

- вносять по 50 мкл кожної з 4 сумішей імунних сироваток в колонки 1-8 рядів від A до D (кожну суміш розливають окремою крапельницею або дозатором);

- додають по 50 мкл середовища в лунки контролю вірусу (від A9 до D10);

- додають по 50 мкл середовища в лунки титрування (від E1 до H10);

- додають по 100 мкл середовища в лунки контролю клітин (від G11 до H12) і закривають планшет;

- розливають по 0,9 мл середовища у пробірки 1-2 і 5-7 і по 1,9 мл середовища в пробірки 3 і 4;

Рис. 8.4. Схема планшету для ідентифікації поліовірусу

- додають 0,1 мл вірусної суспензії в першу пробірку (розведення 10-1) стерильною піпеткою або мікродозатором з наконечником з фільтром;

- іншою піпеткою (наконечником мікродозатора) ретельно і обережно перемішують вміст першої пробірки;

- переносять 0,1 мл у другу пробірку та змінюють піпетку (наконечник);

- продовжують розведення, переносячи по 0,2 мл в пробірки 3 і 4 (рис. 8.5.) і далі по 0,1 мл;

Рис. 8.5. Титрування виділеного штаму поліовірусу

- вносять по 100 мкл суспензії клітин у дослідні та контрольні лунки;

- поміщають планшет в термостат при 36 град. С;

- щодня мікроскопують лунки планшету для виявлення ЦПД, результати реєструють;

- продовжують мікроскопування і облік результатів протягом 24 годин після того, як ЦПД в лунках контролю вірусу досягне 100% (зазвичай 3-5 днів).

При підготовці розведення вірусу потрібно пам'ятати про зміну піпеток або наконечників дозатора, щоб уникнути перенесення вірусу зовнішньою поверхнею кінчика піпетки або наконечника.

Суміш імунних сироваток, яка пригнічує розвиток ЦПД, вказує на тип вірусу або типи вірусів в суміші. Нездатність вірусу розмножуватися у присутності суміші імунних сироваток є результатом нейтралізації його інфекційності однією із сироваток, що входять в суміш.

На рис. 8.6. наведено типову схему ідентифікації виділеного поліовірусу на мікротитрувальному планшеті та інтерпретацію отриманих результатів.

Рис. 8.6. Ідентифікація виділеного штаму поліовірусу мікрометодом

У табл. 8.4. представлені всі можливі комбінації наявності і відсутності ЦПД, які можуть спостерігатися в лунках мікротитрувального планшету з різними сумішами імунних сироваток, і наведена їх інтерпретація. Поява ЦПД, що іноді спостерігається після формування кінцевого результату, може пояснюватися дуже високою дозою вірусу, використаною в досліді, або присутністю другого вірусу в нижчій концентрації. Рекомендується перевірити суміш вірусів за допомогою монотипоспецифічних імунних сироваток.

1. Збирають суспензію вірусу з відповідних лунок планшета, де проводилося типування.

2. Якщо планшет заклеєний листом, його не знімають, уникаючи перехресної контамінації, протирають 70% спиртом і проколюють над потрібною лункою стерильним наконечником. Не можна намагатися проколоти скляною піпеткою пластикову кришку планшета - скло може зламатися і травмувати оператора.

3. Готують розведення вірусної суспензії 1:10.

4. На мікротитрувальному планшеті для кожного вірусу, що перевіряється, розливають в 2 лунки по 50 мкл сироватки антиполіо-1 у 2 лунки по 50 мкл сироватки антиполіо-2 у 2 лунки по 50 мкл сироватки антиполіо-3 і в 2 лунки - по 50 мкл середовища росту для контролю вірусу.

5. Додають по 50 мкл розведеної суспензії вірусу в усі 8 лунок.

6. Витримують 1 годину при 37 град. С і додають по 100 мкл суспензії клітин.

7. Закривають (або заклеюють) планшет і витримують 24-48 годин при 36 град. С, реєструючи появу і розвиток ЦПД.

Усі поліовіруси повинні негайно направлятися до Центральної лабораторії з діагностики поліомієліту, яка проводить підтверджуючі дослідження та направляє матеріал для проведення внутрішньотипової диференціації поліовірусів до Регіональної референс-лабораторії ВООЗ.

Поява ЦПД в лунках, що містять усі комбінації імунних сироваток (нижній ряд таблиці), можлива у двох випадках. 1) Виділений вірус не є поліовірусом, а відноситься до ентеровірусів, аденовірусів або інших вірусів. 2) Виділена суміш поліовірусу з іншим вірусом. Оскільки виявлення поліовірусу є пріоритетним завданням, вірус, виділений у клітинах L20B, повинен бути направлений щонайшвидше до Центральної лабораторії з діагностики поліомієліту для подальшого дослідження.

Ідентифікація неполіомієлітних ентеровірусів (НПЕВ)

Із введенням у практику клітинної лінії L20B відпала необхідність проводити нейтралізацію ентеровірусів для виключення маскування ними поліовірусу в змішаній культурі.

На даний час для типування НПЕВ користуються сумішами імунних сироваток. Розведення до робочих титрів імунних сироваток проводиться у відповідності до інструкції виробника з їх використання.

Потрібно приготувати:

- мікротитрувальні планшети культуральні 96-ти лункові з пласким дном та кришками;

- стерильні пробірки місткістю 5 мл для розведень;

- одноразові пластикові піпетки на 1 і 2 мл;

- стерильні одноразові крапельниці на 50 мкл або мікродозатори з наконечниками, що не утворюють аерозоль (з фільтрами);

- флакон з культурою клітин RD;

- суміші сироваток, імунних до ентеровірусів, у робочому розведенні;

- підтримуюче середовище.

Кожен вірус досліджують із сумішшю трьох типів антиполіосироваток, сумішшю антисироваток до вірусів Коксаки (B1-B6) і з сумішами антисироваток до вірусів ECHO.

Віруси, які не типувалися набором імунних сироваток, можливо присутні в досліджуваному матеріалі у вигляді агрегатів і повної їх нейтралізації не відбувається. Для цього слід повторити типування після обробки матеріалу хлороформом (приблизно 10% від об'єму проби). Заморожування культуральної рідини може привести до агрегації вірусів, тому типування проводять після обробки матеріалу хлороформом, але до його заморожування.

Проводять наступну роботу:

- маркірують краї мікротитрувального планшету, як показано на рис. 8.7.;

Рис. 8.7. Ідентифікація виділених штамів ентеровірусів

- вносять по 50 мкл сумішей імунних сироваток у відповідні лунки колонок 1-9;

- вносять по 50 мкл середовища до лунок контролю вірусу (колонка 10, ряди A до D);

- вносять по 100 мкл середовища до лунок контролю клітин (колонки 11 і 12, ряди від A до D);

- вносять по 50 мкл розведення вірусу N 1 в лунки колонок 1-10 рядів А і В і вірусу N 2 - в лунки колонок 1-10 рядів C і D;

- готують розведення вірусів N 1 і N 2 для титрування і розливають по 50 мкл у відповідні лунки (ряди E і F для вірусу N 1, ряди G і Н - для вірусу N 2);

- закривають планшет і витримують 1 годину при 36 град. С;

- розливають по 100 мкл суспензії в усі лунки;

- закривають планшет нетоксичною клеючою плівкою (стрічкою) і поміщають в термостат при 36 град. С;

- щодня мікроскопують лунки, спостерігають і реєструють розвиток ЦПД;

- після одержання 100% ЦПД в лунках контролю вірусу реєструють результати ще через 24 години;

- ідентифікують вірус за результатами нейтралізації ЦПД відповідними сумішами сироваток, використовуючи таблицю ідентифікації, прикладену до набору сумішей.

7.3.2. Виявлення РНК ентеровірусів в пробах води методом полімеразної ланцюгової реакції зворотної транскрипції

Матеріал для дослідження: неконцентровані проби води та концентрат вірусів.

Елюат в кількості 0,5-1 мл після рекомендованої концентраціїї переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.

Перед дослідженням проби зберігають при температурі +2-8 град. С не більше одної доби, тривалий час - при температурі мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.

Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.

Етап 1. Виділення РНК (проводиться в Зоні 1 - кімнаті для обробки матеріалу).

1. Лізующий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ Enterovirus-rec). Потім по 450 мкл лізуючого розчину. Промаркірувати пробірки.

3. До пробірки з лізуючим розчином і ВКЗ внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. У пробірку з негативним контролем (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). У пробірку з позитивним контролем (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ Enterovirus-rec).

4. Щільно закрити проби, ретельно перемішати за допомогою вортекса і ценрифугувати протягом 5 с при 5 000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент за допомогою вортекса. До кожної пробірки окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, дотримуючись п. 8.

10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат 60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і процентрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12-13 000 об./хв.) протягом 1 хв.

Супернатант містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.

Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК/ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно відцентрифугувати.

Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ампліфікації)

Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл)

При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальне маркування "RNase-free", "DNase-free".

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готової реакційної суміші.

5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.

6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) на 37 град. С на 30 хв.

7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).

Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі мінус 20 град. С впродовж 1 тижня або при температурі мінус 70 град. С протягом року.

Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)

У всіх комплектах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С.

Підготовка пробірок для проведення ПЛР.

1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.

2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.

3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл, для ампліфікації з кришкою без підігріву).

1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК.

Позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК.

Негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.

2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору).

3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (електрофорезу, Зону 3).

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації

Робота з ампліфікованими днк повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю. В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+, К-.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хвилин. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення електрофорезу, вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться за наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК.

Довжина специфічних смуг ампліфікованих фрагментів кДНК:

- ентеровірусу - 207 п.н.

- ВКЗ Enterovirus-rec - 440 п.н.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 207 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 440 п.н.

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКО на рівні 440 п.н.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 207 п.н., що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.

5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 207 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю. Смуга внутрішнього контрольного зразка може бути відсутній в пробах з високою концентрацією РНК Enterovirus.

6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 440 п.н. більшої або меншої інтенсивності

7. Окрім смуг 207 п.н. і 440 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з приведеними в табл. 8.5., то відповідний етап аналізу слід переробити.

Рис. 8.8. Електрофоретична рухливість продуктів ампфлікації у позитивних контролях

2. Якщо в доріжці якій-небудь з проб відсутні обидві смуги, і 207 п.н. і 440 п.н., результат аналізу по даній пробі вважається недійсним, необхідно повторити дослідження цієї клінічної проби із самого початку. Причиною могла з'явитися помилка в процедурі обробки клінічного матеріалу, що привела до втрати РНК/ДНК або інгібування ЗТ та/або ПЛР.

3. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

4. Поява специфічної смуги 207 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходам по виявленню джерела контамінації.

7.4. Дослідження проб на наявність віруса гепатиту А

7.4.1. Визначення вірусних антигенів ВГА в ІФА

Елюати, отримані після концентрування досліджуваних об'ємів води, аналізуються методом ІФА у відповідності до Інструкціїї, що додається до стандартного комерційного діагностичного набору, зареєстрованого в Україні.

7.4.2. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією

Для проведення дослідження рекомендовано використовувати сертифіковані тест-системи.

Для проведення аналізу використовуються проби води без додаткової концентрації або концентрат (елюат). Зразок у кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.

Проби зберігають при 2-8 град. С не більше одної доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.

Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.

ПЛР-аналіз складається з чотирьох етапів, кожний з яких має свої контрольні зразки:

- виділення РНК;

- отримання комплементарной ДНК (кДНК) на матриці РНК - реакція зворотної транскрипції (ЗТ);

- ампліфікація ділянки ДНК - полимеразная ланцюгова реакція (ПЛР);

- електрофоретический аналіз продуктів ПЛР і облік результатів ПЛР-аналізу.

Етап 1. Виділення РНК (проводиться в Зоні 1 - кімнаті для обробки матеріалу)

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ HAV-rec). Потім по 450 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.

3. В пробірки з лізуючим розчином та ВКЗ внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ HAV-rec).

4. Щільно закриті проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5 000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.

10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат 60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбента. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) протягом 1 хв.

Супернатант містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.

Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК/ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.

Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації).

Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл)

При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальну маркіровку "RNase-free", "DNase-free".

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.

5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.

6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) на 37 град. С на 30 хв.

7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).

Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі мінус 20 град. С протягом тижня або при температурі мінус 70 град. С протягом року.

Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)

У всіх комплектах для ампліфікації сімейства АмпліСенс обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С.

1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.

2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.

3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК.

Позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК.

Негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.

2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору).

3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3). Проби після ампліфікації можна берегти 16 годин при кімнатній температурі, протягом тижня при 2-8 град. С.

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації)

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в нкремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю. В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення електрофорезу, вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищений спеціальною маскою або скляною пластиною!

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК.

Довжина специфічних смуг ампліфікованих фрагментів кДНК:

- вірусу гепатиту А (HAV) - 430 п.н.

- внутрішнього контролю (ВКЗ) - 680 п.н.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 430 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 680 п.н. (табл. 8.6.)

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 680 п.н.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 430 п.н., що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.

5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 430 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю. Смуга внутрішнього контрольного зразка може бути відсутній в пробах з високою концентрацією РНК.

6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 680 п.н. більшої або меншої інтенсивності

7. Окрім смуг 430 п.н. і 680 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наприведеними в табл. 8.6., то відповідний етап аналізу слід переробити.

2. Якщо в доріжці якій-небудь з проб відсутні обидві смуги, і 430 п.н. і 680 п.н., результат аналізу по даній пробі вважається недійсним, необхідно повторити дослідження цієї клінічної проби із самого початку. Причиною могла з'явитися помилка в процедурі обробки клінічного матеріалу, що привела до втрати РНК/ДНК або інгібування ЗТ та/або ПЛР.

3. У доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

4. Поява специфічної смуги 430 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) указує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Вимагається повторити аналіз проб, а також вжити заходи по виявленню джерела контамінації.

З багаточисельної групи фагів як санітарно-показові віруси визначені постійно наявні у кишечнику людини соматичні коліфаги, які у великій кількості потрапляють у стічні води, у водойми зі стічними водами та поверхневим стоком і, як слідство, у питну воду (водопровідну, колодязну та інші джерела).

Коліфаги - це бактеріальні віруси, котрі складаються з капсиду, який вміщує одно- або двуниткову ДНК в якості геному.

Виявлення у воді кишкових бактеріофагів може свідчити про наявність патогенних вірусів, особливо у питній воді. Наявність їх у воді з резервуару чистої води станції водопідготовки вказує на недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.

Коліфаги слугують найбільш адекватною моделлю оцінки ефективності того чи іншого прийому очистки та знезараження води від вірусів. Методи їх визначення доступні лабораторіям любого рівня, не потребують спеціального обладнання та дають можливість отримати результати вже через 6-24 годин.

Бактеріофаги здатні інфікувати певні штами хазяїна E.coli та утворювати видимі бляшки (зони лізису, прозорі зони) різного розміру та морфології на зливному газоні бактеріального росту хазяїна за відповідних умов культивування. Визначення коліфагів можна проводити двома методами:

- титраційним методом (метод накопичення) або найбільш вірогідного числа (НВЧ);

- прямим методом без попередньої концентрації коліфагів та після їх концентрації.

Титраційний метод дозволяє виявляти незначну кількість коліфагів в об'єкті, але загальний об'єм води, як правило, не перевищує 1 л. Цей метод застосовується при дослідженні питної води після очистки та знезараження, води з розподільчої системи або інших малозабруднених об'єктів. Отримання результату можливе через 24-48 годин.

Прямий метод застосовується для визначення коліфагів у стічній воді та інших водних об'єктах зі значним антропогенним забрудненням. Застосування прямого методу визначення коліфагів у питній воді має технічну обмеженість внаслідок неможливості дослідження великих об'ємів. В той же час він застосовується для визначення коліфагів у питній воді та інших видах чистих вод після попередньої концентрації фагів з великих об'ємів у малі. Використовують методи концентрації хлоридом алюмінія та ГГМКК. Результат отримують через 6-24 годин.

8.1. Відбір проб для дослідження

Відбір проб різних видів вод для дослідження на наявність коліфагів відрізняється від вказаного в Розділі 4 цих методичних рекомендацій об'ємом проб. Стічну воду відбирають об'ємом 100 мл. Воду з інших об'єктів відбирають об'ємом 1000 мл, якщо не передбачена концентрація. При необхідності концентрації коліфагів пробу відбирають об'ємом 10 л.

Необхідність концентрації коліфагів доречно проводити у пробах води за епідпоказниками, коли дослідження води на патогенні віруси негативні, а коліфаги в 1000 мл не визначаються, у той час, як реєструється захворюваність населення на вірусні інфекції з водним шляхом передачі.

Концентрація коліфагів також доречна при дослідженні різних видів питної води з метою надати у короткий строк більш достовірну оцінку можливості проходження вірусів через ті чи інші етапи очисних споруд та можливої наявності вірусів в інших видах вод (колодязній, зі скважини, каптажів, інших індивідуальних джерел питної води).

Незадовільна якість води за санітарно-хімічними та бактеріологічними показниками також може спонукати до визначення коліфагів з їх попередньою концентрацією, що суттєво доповнить характеристику води та роботу очисних споруд стосовно антивірусного бар'єру.

8.2. Дослідження проб стічної води

Кількість коліфагів у стічній воді, як правило, знаходиться на рівні сотень та сотень тисяч в одному мл в залежності від характеру стічних вод та ступеня їх очистки. Допустимий рівень коліфагів в очищеній стічній воді, яку дозволено скидати у водоймище, повинен дорівнювати 1000 бляшкотвірних одиниць в літрі (БТО/л) (СанПиН 4630-88 "Охрана поверхностных вод от загрязнения", Москва, 1988). Стічну воду досліджують двошаровим методом посіву за Граціа. Метод складається з наступних складових:

- приготування тест-культури хазяїна E.coli В або E.coli С;

- приготування чашок Петрі з 2% м'ясо-пептонним агаром (МПА) для нижнього шару;

- приготування суміші відповідних об'ємів досліджуваної проби, культури хазяїна E.coli та 1,0% МПА для верхнього шару агара;

- контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, які використовуються (негативний контроль);

- контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).

Приготування тест-культури хазяїна, постановку негативного та позитивного контролів виконують відповідно до пунктів 11.1.1.; 11.1.4.; 11.1.5 Методичних вказівок MB 10.2.1-113-2005 "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води", Київ, 2005.

8.2.1. Проведення аналізу