Про затвердження методичних вказівок "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води"

Відповідно до статті 40 Закону України "Про забезпечення санітарного та епідемічного благополуччя населення"

1. Затвердити методичні вказівки "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води" (додаються).

2. Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України методичні вказівки довести до установ і закладів державної санітарно-епідеміологічної служби, міністерств, інших центральних органів виконавчої влади в установленому порядку.

3. Контроль за виконанням наказу покласти на директора Департаменту державного санітарно-епідеміологічного нагляду Міністерства охорони здоров'я України Бережнова С.П.

Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води встановлює ступінь її епідбезпеки відповідно до вимог, що пред'являються при централізованому питному водопостачанні ДСанПіНу N 383/1940 "Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання".

Основним санітарно-показовим тестом забруднення води виділеннями кишечника теплокровних залишаються бактерії групи кишкових паличок (БГКП). На відміну від переважної більшості країн в Україні збережено більш жорсткі вимоги до якості питної води щодо даного показника, тобто враховуються всі різновиди глюкозопозитивних коліформних бактерій, а не тільки лактозопозитивні варіанти. Такий підхід є обґрунтованим, оскільки цілий ряд лактозонегативних кишкових бактерій можуть не тільки потрапляти, а й за відповідних умов розмножуватися у питній воді і спричиняти негативний вплив на стан здоров'я людини. Для уточнення характеру забруднення води представниками кишкових бактерій у ДсанПіНі введено визначення термотолерантних кишкових бактерій (ТКБ). ТКБ є більш специфічними індикаторами фекального забруднення, легко виявляються і в значній мірі представлені саме E.coli, тобто показником свіжого фекального забруднення. В окремих випадках, при отриманні незадовільних показників якості води та при незадовільному санітарно-гігієнічному стані системи водопостачання, проводиться визначення саме E.coli.

Згідно з вимогами ДСанПіНу індекс БГКП (коліформні бактерії) визначається в об'ємі 1 куб. дм води, а ТКБ - відсутність у 100 куб. см. Проте визначення індексу БГКП в 1 куб. дм води передбачає кількісну оцінку, в той час як вимога відсутності ТКБ у 100 куб. см води свідчить лише про якісну оцінку, яка проводиться шляхом обов'язкового дослідження трьох об'ємів води по 100 куб. см.

У ДсанПіНі приділена також велика увага показнику "загальне мікробне число". При невідповідності якості питної води нормативам за органолептичними та іншими інтегральними показниками рекомендовано визначення загальної кількості мікроорганізмів при різних температурах інкубації - при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. та при (22 +- 1) град. С протягом 48 год. Зростання числа колоній при інкубації (36 +- 1) град. С свідчить про можливе забруднення антропогенною мікрофлорою. Зростання числа бактерій, які розвиваються при (22 +- 1) град. С, свідчить про погіршення санітарно-гігієнічного стану системи водопідготовки чи водопостачання. Крім того, різке підвищення цього показника може свідчити про появу джерела забруднення або виникнення умов для вторинного розмноження мікроорганізмів. Визначення цього показника на етапах підготовки води несе суттєву інформацію щодо ефективності технології її очищення та знезараження.

Поряд з визначенням у воді санітарно-показових бактерій вперше введено визначення санітарно-показового вірусу - кишкових бактеріофагів. Виявлення їх у воді з резервуару чистої води свідчить про недосконалість технології водопідготовки, а у воді з мережі водопостачання, крім вказаного, - про наявність умов вторинного забруднення, зокрема збудниками вірусних інфекцій.

Вперше також введено визначення наявності патогенних бактерій та вірусів. Насамперед це визначення сальмонел, шигел, холерних вібріонів, ентеро-, адено- та ротавірусів. Передбачено також визначення наявності інших збудників бактеріальних та вірусних інфекцій у відповідності з наявною епідемічною ситуацією.

У ДСанПіНі збереглася розбіжність щодо термінології, прийнятої у більшості країн світової співдружності та існуючої в офіційних документах України. БГКП не є таксономічною групою, це утилітарна назва, і за визначенням до неї входять грамнегативні бактерії, що не утворюють спор, не мають ферменту оксидазу і ферментують глюкозу з утворенням кислоти та газу.

При дослідженні води джерел водопостачання визначаються лактозопозитивні кишкові бактерії (ЛКБ). Цей термін відповідає прийнятому у багатьох країнах терміну "загальні коліформи". Запропонований ДсанПіНом термін "термотолерантні кишкові бактерії" відповідає терміну "фекальні коліформи (ФК)".

Відбір проб води здійснює особа, яка володіє методикою відбору та умов транспортування проб.

Проби води відбирають у спеціально призначені для такого відбору води стерильні флакони місткістю не менше 500 куб. см зі щільно закритими пробками, які захищені та фіксовані ковпачками. Пробки повинні бути з матеріалу, який витримує стерилізацію сухим жаром чи в автоклаві. Ватно-марлеві пробки після стерилізації заміняють на стерильні щільні пробки.

Відбір проб проводять з дотриманням правил асептики: пробка з ковпачком знімається безпосередньо перед відбором проби, край флакона та пробка не повинні ні до чого торкатися. Після відбору проби флакон щільно закривають пробкою з ковпачком, який фіксують. Води відбирають стільки, щоб не замочити пробку під час транспортування. Якщо пробка замочилася, то це обов'язково відмічають у супроводжувальних документах (Акт відбору проб води ф. N 323/0, Направлення на санітарно-мікробіологічне дослідження ф. 205/0) та у Журналі реєстрації санітарно-мікробіологічних та санітарно-паразитологічних досліджень (ф. N 379/0).

Проби води з водорозбірних кранів відбирають після їх стерилізації шляхом фламбування тампоном, змоченим спиртом, і наступного спускання води протягом 10-15 хвилин при повністю відкритому крані. Воду відбирають безпосередньо з крану без гумових шлангів, водорозподільчих сіток чи інших насадок. Якщо через пробовідбірний кран відбувається постійний вилив води, відбір проб проводять без попереднього фламбування, не змінюючи напору води і наявної конструкції, облаштованих силіконовими чи гумовими шлангами.

Проби хлорованої водопровідної води відбирають в ємкості, куди попередньо для нейтралізації залишкової кількості дезінфектанту вносять до стерилізації 10 мг натрію сірчистокислого у вигляді кристалів чи 2 куб. см його 1,5% розчину на 500 куб. см води.

При відборі проб в одній і тій же точці для різних досліджень першими відбирають проби для бактеріологічних досліджень.

Відібрані проби маркують і супроводжують актом відбору проб води (ф. N 323/0), в якому вказують:

- при відборі проб з очисних споруд - етап очищення та місцезнаходження точки контролю;

- при відборі проб з периферичної водопровідної мережі - точне місце знаходження водорозбірного крану, з якого відбирали проби;

- нормативно-технічний документ, згідно якого проведений відбір;

- дату та час відбору і доставки проби;

- особливі обставини, які мали місце при відборі проб (час спуску води з крану, умови транспортування тощо);

- мету дослідження: відбір проби в порядку поточного санітарно-епідеміологічного нагляду, за епідпоказаннями чи за особливими обставинами (рекомендації санітарно-епідеміологічної служби, звернення населення при змінах органолептичних властивостей води тощо).

Доставка проб здійснюється в продезінфікованих термоконтейнерах при температурі (6 +- 2) град. С. В холодний період року контейнери повинні мати терморегулюючі прокладки, які запобігають промерзанню проб. При дотриманні вказаних умов термін початку дослідження від моменту відбору проб не повинен перевищувати 6 годин.

Якщо пробу неможливо охолодити, дослідження має бути проведеним не пізніше, ніж через 2 години після її відбору. В разі неможливості дотримання термінів доставки проби і температури зберігання аналіз проводити не рекомендується.

4.1. Основне обладнання

- Термостат, що забезпечує регулювання температури від 25 до 55 град. С і градієнт температури в камері +- 1 град. С.

- Водяна баня, що підтримує робочий температурний режим 75 град. С з градієнтом температури +- 5 град. С.

- Водяна баня чи термостат, що здатні підтримувати температуру 45-50 град. С (для поживних середовищ).

- Прилад для мембранної фільтрації під вакуумом з діаметром фільтруючої поверхні 35 чи 47 мм, вакуумний насос для утворення розрідження 0,5-1,0 атм.

- Дистилятор, що забезпечує якість дистильованої води згідно з ГОСТом 6709-72, або прилад для отримання води аналітичної якості.

- Ваги лабораторні загального призначення 4-го класу точності, найвищий рівень зважування 200 г, допустима похибка не більше 0,02 г.

- Ваги лабораторні загального призначення 4-го класу точності, найвищий рівень зважування 1000 г, допустима похибка не більше 0,1 г.

- pH-метр з похибкою вимірювання до 0,01.

- Стерилізатор паровий з режимами стерилізації від температури +100 град. С (текучою парою) до 126 град. С (під тиском).

- Шафа сушильна стерилізаційна, яка забезпечує температуру + (100 - 200) град. С.

- Магнітні мішалки з підігрівом до 30 град. С для приготування середовищ.

- Дозатори для розливу поживних середовищ.

- Дозатори піпеточні для використання в аналізі.

- Холодильники лабораторні або побутові.

- Лупа вимірювальна 4-10х.

- Мікроскоп біологічний.

- Мікроскоп люмінесцентний.

- Прилад для підрахунку колоній бактерій.

- Сумки-холодильники або інша термоізолююча тара.

- Освітлювач ОИ-19.

- Прилад для струшування.

- Прилад для виміру оптичної щільності розчину (стандарт каламутності).

Примітка. допускається використання інших засобів вимірювальної техніки, допоміжного обладнання, яке за технічними характеристиками не поступається зазначеним вище.

4.2. Дрібне обладнання і витратні матеріали

- Мембранні фільтри нітрат- чи ацетатцелюлозні з діаметром пор 0,45 мкм, розміром 35 чи 47 мм; фільтраційні мембрани "Владіпор" МФАС-ОС-1, МФАС-ОС-2, МФА-МА (N 5-8) або аналогічні мембранні фільтри, які мають міжнародний сертифікат якості ISO 9000 чи EN 29 000.

- Пальники газові або спиртові.

- Індикаторні смужки для визначення pH у діапазоні 6-8 з інтервалом 0,2.

- Бактеріологічні петлі.

- Анатомічні пінцети для роботи з мембранними фільтрами.

- Штативи для пробірок.

- Фольга алюмінієва, ковпачки силіконові, металеві.

- Лабораторний посуд скляний або одноразового використання.

- Колби конічні об'ємом по 250 і 500 куб. см.

- Колби Бунзена для фільтрування під вакуумом.

- Флакони скляні об'ємом 100, 250, 500 куб. см.

- Лійки скляні.

- Пробірки бактеріологічні.

- Піпетки Мора на 50 і 100 куб. см.

- Стакани лабораторні.

- Скельця предметні для мікроскопії.

- Скельця покривні для мікроскопії.

- Чашки бактеріологічні (Петрі).

- Поплавки для пробірок і колб.

- Пінцети з тупими кінцями.

- Піпетки місткістю 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 куб. см (за ГОСТом 20292-74).

- Циліндри місткістю 100, 250, 500 куб. см (за ГОСТом 1770-74).

- Мензурки місткістю 100, 250, 500 куб. см (за ГОСТом 1770-74).

- Папір фільтрувальний.

- Вата гігроскопічна медична (за ГОСТом 17206-71).

- Вата негігроскопічна (за ГОСТом 10477-63).

- Олівці чи фломастери по склу.

- Лейкопластир.

- Марля медична, бинти.

- Пенали металеві для піпеток.

- Кристалізатор (за ГОСТом 10973-64).

- Годинник піщаний на 1, 2, 5 хвилин (за ГОСТом 10576-63) або таймер.

4.3. Хімічні реактиви

Всі хімічні реактиви повинні відповідати кваліфікації не нижче ч.д.а.

4.4. Поживні середовища промислового виготовлення:

- Агар сухий поживний.

- Агар Ендо сухий.

- Агар мікробіологічний (ГОСТ 17206-77).

- Агар сухий поживний лужний.

- Пептон основний сухий для накопичення холерного вібріону.

- Середовище Гіса з лактозою.

- Середовище Гіса з манітом.

- Середовище Гіса з глюкозою.

- Сухий поживний бульйон.

- Пептон сухий ферментативний для бактеріологічних досліджень (ГОСТ 13805-76).

- Середовище Плоскірєва.

- Агар з еозинметиленовим синім.

- Агар Мак Конкі.

- Агар ксилозолізиндезоксихолатний.

- Агар дезоксихолатцитратний.

- SS-агар.

- Діамантовий-зелений агар.

- Вісмут-сульфіт агар.

- Магнієве середовище.

- Селенітове середовище.

- Жовчний бульйон.

Діагностичні системи та набори типу: ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та ін. або системи індикаторні паперові (СІП): лактоза, маніт, оксидаза, глюкоза, маноза, сахароза, арабіноза, лізин, аргінін, орнітин.

4.5. Тест-штами мікроорганізмів

Контрольний коліфаг Т2, штам E. coli С (тип штаму В, N 3240) або E. coli В отримують у ДНДІ Генетика - Всеросійської колекції промислових мікроорганізмів (ВКПМ - Росія, 113545, м. Москва, 1-й Дорожний проїзд, д. 1). Штам коліфагу Т2, необхідний для перевірки чутливості мікроорганізму хазяїна E. coli С та E. coli В.

Штами E. coli М17-02, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens отримують у музеї патогенних мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (03038, м. Київ-38, вул. М. Амосова, 5). Ці штами мікроорганізмів використовують для контролю нових партій реактивів для оксидазного тесту і діагностичних тест-систем та їх придатності при тривалому зберіганні. У виробничих лабораторіях, які знаходяться на території водопровідних станцій, не дозволяється культивувати, зберігати і використовувати штам Pseudomonas aeruginosa. У цих лабораторіях із зазначеною метою слід використовувати штам Pseudomonas fluorescens.

5.1 Загальні відомості

Всі сухі поживні середовища і діагностичні імунобіологічні препарати повинні бути дозволені до використання в Україні і мати сертифікат якості (паспорт) відділу контролю організації-виробника та інструкцію з використання.

Варто використовувати стандартизовані сухі поживні середовища промислового виробництва. В цьому випадку слід дотримуватися способу приготування, використання, умов та терміну зберігання, вказаних на етикетці.

Сухі поживні середовища зберігають у сухих темних приміщеннях при кімнатній температурі. Відкриті упаковки щільно закривають. Середовища із зміненою консистенцією (ущільнені, з грудками) або зміненим кольором не використовують.

Приготовлення поживних середовищ проводиться згідно з ГОСТом 10444.1-84.

Усі виготовлені поживні середовища маркують із зазначенням назви середовища, дати виготовлення та терміну придатності.

Дату приготування та результати контролю якості поживних середовищ реєструють в "Журналі приготування та контролю поживних середовищ" (ф. N 256/0).

Для приготування розчинів, реактивів і поживних середовищ використовують воду дистильовану за ГОСТ 6709-72 або очищену. Готують у посуді з інертного матеріалу.

Всі середовища, які стерилізують при (112 +- 2) град. С, готують у стерильному посуді і розливають у стерильні пробірки.

Враховуючи можливу зміну pH поживних середовищ після кип'ятіння та стерилізації, при приготуванні середовищ встановлюють pH на 0,2 вище вказаного, що визначають дослідним шляхом для кожного середовища. Заключний контроль pH проводять у готовому середовищі з використанням pH-метра (рідкі середовища) або паперових індикаторів з шагом діапазону не більше 0,2 (агаризовані середовища). Визначення проводять згідно з інструкцією з використання приладу або індикаторної системи.

Після стерилізації поживні середовища охолоджують при кімнатній температурі, після чого поміщають у холодильник при (6 +- 2) град. С, якщо в Інструкції щодо застосування конкретного препарату не вказано інші умови зберігання.

Готові розлиті у пробірки напіврідкі поживні середовища та середовища з поплавками зберігають при кімнатній температурі не більше 7 діб.

Температуру середовищ, що зберігалися у холодильнику, перед посівом необхідно довести до кімнатної.

Якщо середовище необхідно розлити у чашки Петрі, то його охолоджують до температури 50-60 град. С.

На поверхні розлитого у чашки Петрі середовища не повинно бути слідів вологи. В разі наявності на поверхні середовища слідів вологи чашки перед використанням підсушують у термостаті.

5.2. Рецептура та методи приготування основних поживних середовищ та реагентів.

5.2.1. Стерильний 0,9%-ий фізіологічний розчин

9 г NaCl розчиняють у 1 куб. дм дистильованої води, розливають у пробірки по 10 куб. см або у флакони по 100 куб. см або більше, закривають пробками і стерилізують в автоклаві при (121 +- 1) град. С (1,1 кгс/кв. см) протягом 20 хв. Термін зберігання не більше двох тижнів.

Фізіологічний розчин, який готують для розведень, доцільно стерилізувати у флаконах по 90 куб. см та у пробірках по 9 куб. см.

5.2.2. Поживний бульйон

Застосовується для накопичення мікроорганізмів та є основою для приготування м'ясо-пептонного агару (МПА). Містить у собі органічні сполуки, необхідні для розмноження гетеротрофних мікроорганізмів.

Готують з сухого препарату промислового виробництва за способом, вказаним на етикетці.

5.2.3. Поживний бульйон (20-кратний) для визначення коліфагів готують шляхом збільшення у 20 разів наважки сухого препарату, вказаної на етикетці.

5.2.4. Поживний агар

Застосовується для отримання поверхневого та глибинного росту мікроорганізмів при визначенні загального мікробного числа, коліфагів, отримання ізольованого росту колоній мікроорганізмів та культивування еталонних культур.

При застосуванні поживного агару для визначення коліфагів не рекомендується використовувати високоочищений агар, оскільки іони Са та Mg є важливими факторами для адсорбції коліфагів до бактеріального хазяїна.

Використовують м'ясо-пептонний агар (МПА), в якому вміст агару мікробіологічного становить 2%, 1,5%, 1,0% та 0,7%.

Поживний агар забороняється витримувати у розтопленому стані більше 8 годин. Агар, що залишився, повторному розплавленню не підлягає.

5.2.4.1. Поживний агар промислового виробництва

Готують з сухого комерційного препарату за способом, вказаним на етикетці.

5.2.4.2. Поживний агар 0,7%-ий, 1,0%-ий; 1,5%-ий, 2%-ий

До 1 куб. дм МПБ (п. 5.2.2.) додають відповідно 7,0; 10,0; 15,0; 20,0 г агару у вигляді волокон чи порошку, нагрівають до повного розчинення, перевіряють pH 7,2-7,4, освітлюють, фільтрують у гарячому стані через ватно-марлевий фільтр і розливають у флакони чи пробірки в необхідних для аналізу кількостях. Стерилізують в автоклаві при (121 +- 1) град. C 15 хвилин.

5.2.5. Середовище Ендо

Слабоселективне диференційне середовище для виділення ентеробактерій.

Принцип дії: присутні у середовищі основний фуксин та сульфіт натрію (Na SO ) мають інгібуючу дію на грампозитивну мікрофлору.

5.2.5.1. Середовище Ендо промислового виробництва

Середовище Ендо випускається у вигляді сухого порошку. Склад та спосіб приготування вказано на етикетці. Готове середовище прозоре та має блідо-рожевий колір. Чашки Петрі з середовищем необхідно тримати в захищеному від світла місці. При необхідності зберігають у холодильнику не більше 3-х діб.

5.2.5.2. Модифікація середовища Ендо з додаванням фуксину

З метою збільшення диференційних властивостей у приготовлене та охолоджене до 60-70 град. С середовище перед розливом в чашки додають на 100 куб. см середовища 0,2 куб. см 5%-ного спиртового розчину основного фуксину. Після ретельного перемішування середовище розливають в чашки. Термін зберігання розчину фуксину не більше одного місяця. При дослідженні води після хлорування чи дії інших окисників додавати фуксин не бажано.

5.2.5.3. Модифікація середовища Ендо з додаванням розолової кислоти

Ця модифікація середовища Ендо використовується тільки при дослідженні води методом мембранної фільтрації у випадках, коли в питній знезараженій воді переважає мікрофлора, яка не відноситься до бактерій кишкової групи. Тоді, для попередження заростання посівів споровими аеробними бактеріями, окрім фуксину, на 100 куб. см середовища Ендо додають 0,2 куб. см 5%-вого спиртового розчину розолової кислоти. Термін зберігання розчину розолової кислоти - не більше одного місяця.

5.2.6. Глюкозо-пептонне середовище (ГПС)

ГПС використовують для визначення наявності у воді БГКП (коліформних бактерій).

Правильно приготовлені середовища за п.п. 5.2.6.-5.2.7. зеленого кольору з синюватим відтінком. При утворенні кислоти колір середовища змінюється на жовтий, при газоутворенні газ накопичується в поплавку та на поверхні.

Середовище готують двох видів: звичайне і концентроване.

5.2.6.1. Глюкозо-пептонне середовище звичайної концентрації

Склад середовища: 10 г пептону, 5 г хлористого натрію, 5 г глюкози, 1 куб. дм дистильованої води. Після розчинення вказаних інгредієнтів додають індикатор (2 куб. см 1,6%-вого спиртового розчину бромтимолового синього), встановлюють pH 7,4-7,6, розливають по 10 куб. см у пробірки з поплавками. Стерилізують в автоклаві при (112 +- 1) град. С 20 хв.

5.2.6.2. Глюкозо-пептонне середовище концентроване

При приготуванні концентрованого середовища кількість усіх інгредієнтів, крім води (п. 5.2.6.1), збільшують у 10 разів.

5.2.7. Лактозо-пептонне середовище (ЛПС)

ЛПС використовують для дослідження наявності у воді джерел водопостачання лактозопозитивних кишкових паличок. Середовище з лактозою готують відповідно п.п. 5.2.6.1, 5.2.6.2, але замість глюкози вносять 5 г лактози.

5.2.8. Напіврідке середовище Гіса з глюкозою або лактозою промислового виробництва

Використовують для визначення здатності мікроорганізмів ферментувати вуглеводи з утворенням кислоти та газу.

У напіврідких середовищах газ накопичується по ходу уколу або у товщі середовища, можуть утворюватися розриви середовища. Напіврідкі середовища найбільш чутливі до виявлення навіть невеликого, неінтенсивного газоутворення і дають можливість отримати відповідь через 4-6 годин. Для прискореної реакції роблять посіви масивною кількістю культури в середовище, яке попередньо нагрівають до температури майбутньої інкубації. При інкубації посівів більше ніж 5 годин газ може зникнути. У таких випадках на присутність газу вказують залишені в товщі середовища "кишені" - потемніння середовища на місці колишнього пухирця газу.

Середовище готують з сухого препарату за способом, вказаним на етикетці.

5.2.9. Напіврідке середовище з глюкозою чи лактозою

Використовують у відповідності до п. 5.2.8.

При відсутності препарату промислового виготовлення середовище готують за наступним прописом: в 1 куб. дм дистильованої води розчиняють 10 г пептону, 5 г натрію хлористого, 4-5 г агар-агару, доводять до кипіння, встановлюють pH (7,2-7,4), додають 1 куб. см 1,6%-го спиртового розчину бромтимолового синього. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 20 хвилин. У розплавлене середовище вносять 5 г глюкози чи лактози, нагрівають до кипіння, розливають у стерильні пробірки по 3-5 куб. см і стерилізують при (112 + 1) град. С 12 хвилин.

5.2.10. Діагностичні системи та набори типу: ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та ін. або системи індикаторні паперові (СІП): лактоза, маніт, оксидаза, глюкоза, маноза, сахароза, арабіноза, лізин, аргінін, орнітин - використовують за прописом підприємства-виробника.

5.2.11. Середовища для визначення утворення індолу

Принцип дії: індол у поживному середовищі, в якому є амінокислота триптофан, утворюють мікроорганізми при наявності у них ферменту триптофанази. При додаванні до 2-добової бульйонної культури тест-реактива індол вступає з ним у реакцію, утворюючи рожеве або червоне забарвлення (реакція на індол позитивна).

В якості середовищ використовують бульйон Хотінгера, який завжди містить триптофан, або 2%-ну пептонну воду з додаванням 0,3%-ного триптофану.

5.2.11.1 Тест-реактив для визначення індолу (Ковача)

Приготування: розчинити альдегід у спирті при легкому нагріванні (на водяній бані при 50-55 град. С) і повільно додати кислоту. Альдегід повинен бути світлим, а готовий реактив - прозорим. Реактив Ковача готують невеликими партіями і зберігають у холодильнику при (6 +- 2) град. С не більше 3-4 тижнів.

5.2.11.2.Тест-реактив для визначення індолу (Еріха)

Приготування: альдегід розчиняють у спирті, додають кислоту. Зберігають у темному місці.

5.2.11.3 Індикаторні папірці для визначення індолу

Приготування: розчинити альдегід у спирті при легкому нагріванні (на водяній бані при 50-55 град. С) і повільно додати кислоту. Альдегід повинен бути світлим, а готовий реактив - прозорим. Отриманою теплою рідиною змочують смужки фільтрувального паперу, висушують і нарізають вузькими смужками.

Колір папірця жовтий. При наявності індолу колір папірця змінюється від бузково-рожевого до інтенсивного малинового. Поява інших кольорів на індикаторному папері не враховується.

5.2.12. Цитратний агар Симонса

Цитратне середовище Симонса призначене для диференціації ентеробактерій за їх здатністю використовувати натрію цитрат в якості єдиного джерела вуглецю.

Принцип дії: бактерії, які мають відповідні ензими, здатні розвиватися на середовищах, в яких єдиним джерелом вуглецю є цитрат. При рості бактерій колір середовища змінюється на синій (лужна реакція). Ентеробактерії, які не мають здатності використовувати цитрат, на середовищі Симонса не ростуть. Колір середовища залишається без змін.

5.2.12.1. Цитратний агар Симонса промислового виробництва випускається у сухому вигляді. Спосіб застосування вказаний на етикетці.

5.2.12.2. У разі відсутності промислового препарату середовище готують наступним чином.

Приготування: попередньо ретельно відмитий агар розчиняють при підігріванні у дистильованій воді. Всі солі розчиняють у невеликому об'ємі води, а потім додають до розтопленого агару і доводять до 1 куб. дм. Встановлюють pH 7,2, додають індикатор у вигляді 0,2%-ного водного розчину в об'ємі 40 куб. см, добре перемішують та розливають у пробірки по 5-7 куб. см. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 15 хв. або при (112 +- 2) град. С 30 хв. При охолодженні скошують стовпчик 2-2,5 куб. см.

5.2.13. Фосфатно-буферна пептонна вода

Використовують як середовище попереднього збагачення при визначенні сальмонел та шигел. Готують середовище одинарної та подвійної концентрації.

Приготування: інгредієнти змішують, розливають по 9 куб. см у пробірки або флакони по 90 куб. см, встановлюють pH та стерилізують при (121 +-) 1 град. С 20 хв.

Для приготування середовища подвійної концентрації на 1 куб. дм дистильованої води наважки подвоюють.

5.2.14.1 Селенітове середовище

Середовище призначене для накопичення сальмонел та шигел.

Принцип дії: середовище містить гідроселеніт натрію, який пригнічує розвиток супутньої мікрофлори, та поживні речовини і фосфати, які забезпечують умови для розвитку мікроорганізмів.

Приготування: середовище готують з двох розчинів.

I розчин: попередньо визначають кількісне співвідношення фосфатів для даного зразка пептону чи гідроселеніту натрію з тим, щоб готове середовище мало pH 6,9-7,1. Таке визначення потрібне кожного разу при зміні серії кожного з основних інгредієнтів, які входять до середовища.

Після встановлення співвідношення фосфатів до розчину додають пептон та лактозу. Розливають у флакони по 50 куб. см і стерилізують при (112 +- 1) град. С 30 хв.

II розчин: розчин готують ex tempore. До 100 куб. см дистильованої води додають 10 г гідроселеніту натрію.

Перед початком роботи у кожний флакон з 50 куб. см основного розчину (I) додають 2 куб. см гідроселеніту натрію (II). Стерилізація не потрібна.

Основний розчин (I) зберігають при температурі (6 +- 2) град. С протягом 1-2 місяців.

Для приготування середовища подвійної концентрації маси інгредієнтів збільшують у два рази. Основний розчин (I) подвійної концентрації розливають у флакони по 500 куб. см та стерилізують, як вказано вище.

До 500 куб. см досліджуваної проби води додають 500 куб. см основного розчину подвійної концентрації та 40 куб. см 10%-ного розчину гідроселеніту натрію, який виготовлено ex tempore.

5.2.14.2. Селенітове середовище Лейфсона, сухе промислового виробництва.

Середовище призначене для накопичення сальмонел та шигел.

Принцип дії: середовище містить гідроселеніт натрію, який пригнічує розвиток супутньої мікрофлори, поживні речовини та фосфати, які забезпечують умови для розвитку мікроорганізмів. Випускається у сухому вигляді. Спосіб застосування вказаний на етикетці.

5.2.15.1. Магнієве середовище

Середовище призначене для накопичення сальмонел.

Принцип дії: інгібуючий ефект середовища на супутню мікрофлору води базується на дії діамантового зеленого та магнію хлориду, при цьому у концентраціях, які використовуються, вони не діють на розвиток сальмонел. Пептон та дріжджовий діалізат сприяють розвитку сальмонел, а дигідрофосфат калію забезпечує необхідну реакцію pH.

Середовище складається з трьох розчинів.

Приготування: після розчинення при підігріванні інгредієнтів всі три розчини змішують, розливають по 50 куб. см у флакони і стерилізують при (112 +- 1) град. С 30 хв.

У середовище подвійної концентрації входять інгредієнти у кількості, збільшеній у 2 рази. Середовище подвійної концентрації розливають по 500 куб. см у флакони. При його використанні до 500 куб. см середовища додають 500 куб. см води, яка досліджується.

5.2.15.2. Магнієве середовище, сухе промислового виробництва

Середовище призначене для накопичення сальмонел.

Принцип дії: інгібуючий ефект середовища на супутню мікрофлору води базується на дії діамантового зеленого та магнію хлориду. При при цьому у концентраціях, які використовуються, вони не діють на розвиток сальмонел. Пептон та дріжджовий діалізат сприяють розвитку сальмонел, а дигідрофосфат калію забезпечує необхідну реакцію pH.

Випускається у сухому вигляді. Спосіб застосування вказаний на етикетці.

5.2.16. Середовище Мюлера

Тетратіонатний бульон Мюлера є середовищем накопичення для сальмонел.

Принцип дії: при додаванні до середовища тіосульфату натрію та розчину Люголя ex tempore утворюється тетратіонат натрію. Ця сполука майже не затримує розвиток більшої частини сальмонел. В той же час вона інгібує іншу мікрофлору кишечнику. Бульйон у середовищі забезпечує поживні речовини, крейда має буферні властивості.

Приготування: в стерильні флакони додають 45 г крейди, стерилізують сухим жаром, після чого додають 900 куб. см бульйону Хоттінгера. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 30 хв., pH 7,2-7,4.

Ex tempore асептично додають 20 куб. см розчину Люголя та 100 куб. см натрію тіосульфату, добре перемішують і розливають у флакони у необхідному об'ємі. Готове середовище не стерилізують.

Розчин не використовують до повного розчинення йоду кристалічного. Зберігають у флаконі з темного скла.

Тіосульфат натрію розчиняють у воді та стерилізують при (112 +- 1) град. С 20 хв.

5.2.17. Середовище з охмеленим суслом

Середовище використовується для накопичення шигел та сальмонел.

Принцип дії: інгібуюча дія на супутню мікрофлору здійснюється за рахунок діамантового зеленого та pH. Наявність охмеленого сусла сприяє активному розвитку шигел і сальмонел.

Приготування: середовище готують ex tempore наступним чином: охмелене сусло наливають у стерильний посуд відповідної ємкості, додають пептон, розмішують, доводять до кипіння, охолоджують, доливають 500 куб. см досліджуваної води, доводять pH до 7,8, додають діамантовий зелений.

5.2.18. Жовчний бульйон

Середовище для накопичення та подальшого визначення шигел.

Принцип дії: шигели, сальмонели та деякі інші представники кишкових бактерій є стійкими до дії високих концентрацій жовчі, що надає їм селективну перевагу.

Приготування: жовч додають до бульйону. Встановлюють pH не нижче 7,6. Розливають у пробірки або флакони. Стерилізують при (121 +- 1) град. С 20 хв.

5.2.19. Вісмут-сульфіт агар

Селективне середовище для виділення сальмонел.

Принцип дії: діамантовий зелений та вісмут, які є у складі середовища, інгібують ріст грампозитивної мікрофлори та багатьох ентеробактерій, в тому числі і шигел. Ріст сальмонел також може бути затриманий, тому чашки з посівами передивляються через 24 та 48 годин. Аглютинуюча здатність сальмонел, які виросли на цьому середовищі, також знижена. Диференційні властивості середовища полягають у тому, що сірководень, який утворюють бактерії з сульфіту заліза, викликає почорніння індикатора безбарвного сульфіту вісмуту. Тому бактерії, які утворюють сірководень, формують чорні, чорні з коричневим або з темно-зеленим відтінком колонії. Багато з них мають металевий блиск. Середовище під колоніями має чорний колір. Бактерії, які не утворюють сірководень, виростають у вигляді дрібних, безбарвних, зеленкуватих або коричневих колоній.

Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Середовище непрозоре, зеленкувато-горіхового кольору.

5.2.20. Пептон основний сухий

Призначений для приготування рідкого поживного середовища збагачення - пептонної води, яка використовується для виділення та культивування холерних вібріонів.

Принцип дії: в пептонній воді холерний вібріон випереджає за темпом росту супутню бактеріальну флору і накопичується в найбільшій кількості на поверхні, утворюючи ніжну плівку. У зв'язку з цим для пересівів та приготування мазків необхідно брати плівку або рідину з поверхні середовища.

5.2.20.1. Основний розчин пептону.

Використовується як 10%-ий розчин для приготування 1%-ної пептонної води при додаванні до досліджуваної проби (1-е середовище збагачення). Готують з сухого промислового препарату за способом, вказаним на етикетці. Зберігається до 2 років.

5.2.20.2. Пептонна вода 1%-на.

Основний розчин пептону розводять у співвідношенні 1:10 дистильованою водою. Після встановлення pH 8,4 +- 0,2 розливають в пробірки або флакони і стерилізують під тиском 0,7 атм. 20 хвилин. 1%-ну пептонну воду можна готувати безпосередньо із комерційного препарату, для чого беруть наважку, в 10 разів меншу, ніж в рецепті основного пептону.

Готове середовище прозоре, блідо-жовтого забарвлення.

5.2.20.3. Пептонна вода з телуритом калію - селективне середовище збагачення для холерного вібріона.

Принцип дії: телурит калію інгібує ріст супутньої мікрофлори. В 1%-ну пептонну воду після стерилізації додають телурит калію до кінцевої концентрації його в середовищі 1:100000 або 1:200000. Попередньо готують робочий 0,1%-ий розчин телуриту калію.

Термін зберігання робочого розчину 7 днів, а поживних середовищ з телуритом не більше 48 год. за умови зберігання в холодильнику.

5.2.21. Лужний агар сухий

Поживне середовище для виділення та культивування холерного вібріону.

Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище прозоре, жовтого кольору.

Всі поживні середовища, інгібітори сторонньої мікрофлори, які використовуються для діагностики холери, підлягають бактеріологічному контролю.

5.2.22. Агар Плоскірєва

Агар Плоскірєва - селективне середовище для виділення шигел та сальмонел.

Принцип дії: до складу середовища входять жовчні солі, діамантовий зелений та йод, які інгібують ріст грампозитивної флори, значно затримують ріст ешеріхій та іншої супутньої мікрофлори (перші 24 години). Диференційні властивості базуються на зміні pH у кислу сторону при розвитку лактозопозитивних бактерій, які утворюють колонії жовто-рожевого кольору. Лактозонегативні бактерії виростають безбарвними або слабо забарвленими.

Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище прозоре, має рожево-жовтий відтінок.

5.2.23. Агар з еозин-метиленовим синім (ЕМС)

Слабоселективне середовище для виділення ентеробактерій.

Принцип дії: середовище має певну інгібуючу дію на грампозитивну мікрофлору. При ферментації лактози чи сахарози утворюється кислота. Комплекс індикаторів випадає в осад при pH 4,7, забарвлюючи кислотоутворюючі бактерії в темно-фіолетовий, майже чорний колір, часто з зеленим блиском. Бактерії, які не ферментують вказані вуглеводи, утворюють безбарвні або рожеві колонії.

ЕМС випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище прозоре, має фіолетово-рожевий колір.

5.2.24. Середовища з антибіотиками

Використовуються для виділення шигел.

Принцип дії: базується на стійкості шигел до антибіотиків, які широко використовуються на практиці (левоміцетин, тетрациклін та ін.). Вибір антибіотика залежить від резистентності шигел, які циркулюють у даній місцевості. Антибіотики додають до звичайних середовищ.