Про затвердження методичних вказівок "Санітарно-вірусологічний контроль водних обєктів"

Рис. 7.3. Алгоритм санітарно-вірусологічного дослідження питної води

При концентрації вірусів за допомогою бентоніту чи ГГМКК до проб водопровідної/питної води об'ємом 10-20 л відповідно вносять 2,5-5 мл 5% гелю бентоніту чи 20-40 г ГГМКК.

Не застосовуйте ГГМКК, якщо проба води знаходиться у металевому бідоні! Це утруднює відокремлення його від надосаду!

7.1. Дослідження проб води на наявність ротавірусів

Ротавіруси (РВ) людини у пробах води виявляють після етапу концентрації, застосовуючи методи індикації вірусних антигенів або геномної РНК за допомогою готових наборів/тест-систем. У деяких випадках визначення геномної РНК РВ можливе без попереднього етапу концентрації безпосередньо у відібраних пробах.

Найбільш доступними для практичної вірусологічної лабораторії методами виявлення РВ є ІФА, РНГА та ІХА. Інші методи виявлення РВ - електронна мікроскопія, полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією - зазвичай більш складні у виконанні, вимагають значних фінансових ресурсів (для придбання високовартісного обладнання, тест-систем, реактивів, підготовки приміщення тощо) та відповідної підготовки персоналу лабораторій.

7.1.1. Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз (далі ІФА) - високочутливий та специфічний метод, відносно простий у виконанні, дозволяє досліджувати одночасно велику кількість зразків, використовуючи повністю або частково автоматизовані системи: рідер, вошер, термостат тощо. Тривалість дослідження - 4 години. Результат оцінюється якісно як "позитивний" або "негативний".

Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом ІФА. Доцільно застосовувати ІФА після проведення етапу концентрації РВ з проб води і в якості зразків вносити на плашку елюат (концентрат РВ), попередньо відновивши рН до нейтральних значень.

Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІФА не проводити!

Тест-системи для виявлення РВ наведені в табл. 8.1.

Примітка. У таблиці наведені не всі існуючі тест-системи, а тільки найбільш відомі і доступні. Тест-системи не зареєстровані в Україні і ввозяться за разовим дозволом. При застосуванні слід точно дотримуватися інструкції виробника.

7.1.2. Імунохроматографічний аналіз

Доцільним і своєчасним є впровадження в практику роботи вірусологічних лабораторій простих у виконанні, дешевих, чутливих та специфічних тестів, що сконструйовані за принципом імунохроматографічного аналізу (ІХА).

ІХА-тести для виявлення РВ - швидкі, безпечні та зручні у застосуванні. Їх випускають багато фірм-виробників, їх рекомендує до впровадження ВООЗ, "Cito test Rota", виробництва CerTest Biotec. S.L. Іспанія (ТОВ "Фармаско"), та тести "RotaStick", виробництва Novamed Ltd, Ізраїль (ТОВ "Дніпроінвест") зареєстровані в України. Відносна чутливість більшості швидких ІХА-тестів дорівнює 99%, відносна специфічність - близько 98%.

Механізм тестування полягає у наступному: під час тестування зразок наносять на мембрану тесту або сам тест занурюють у досліджуваний зразок. Якщо в досліджуваному матеріалі-елюаті є РВ, то відбувається специфічна імунологічна реакція між РВ і комплексом, який заздалегідь нанесений та висушений на мембрані тесту (антиротавірусні моноклональні антитіла + червоні мікросфери колоїдного золота). Утворений новий комплекс (вірус + моноклональні антитіла + червоні мікросфери колоїдного золота), мігрує вздовж мембрани під дією капілярної сили. У випадку позитивного результату, специфічні поліклональні антитіла, які присутні на мембрані в зоні "Т", будуть захоплювати забарвлене сполучення та утворювати червону смугу в зоні "Т". Просуваючись далі вздовж мембрани до зони "К" (контрольної ділянки тесту) рідина, що вже звільнилась від специфічного імунного комплексу, проявляє лінію зеленого кольору. Наявність зеленої смуги слугує внутрішнім контролем тесту і підтвердженням достатньої кількості використаного зразку, повноти заповнення капілярів мембрани та відповідної якості реагентів. В разі позитивного результату з'являються дві смуги: чітка червона лінія на білій центральній зоні "Т" та чітка зеленої смуга в контрольній зоні.

Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом ІХА. Тест проводять відразу після етапу концентації ротавірусів у пробі води. Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІХА не проводити!

Перед проведенням дослідження значення рН зразків (концентратів) від'юстувати до нейтральних.

Проведення дослідження. Розпакувати тест при кімнатній температурі. Пристроєм, що додається до тесту, або дозатором внести 5 крапель (125 мкл) отриманого концентрату (елюату) у зону Т (тестова зона). Тест залишити на при кімнатній температурі на 5-10 хв. відповідно до інструкції. Облік результатів проводять через 5-10 хв. візуально.

7.1.3. Електронна мікроскопія

Методи електронної мікроскопії є "золотим стандартом" в діагностиці РВІ і дозволяють швидко та надійно ідентифікувати ротавіруси за характерною морфологією, тобто як такі, що нагадують своїм виглядом колесо дитячої машинки (така морфологія вірусу віддзеркалена у назві від лат. Rota - колесо) і мають розміри 70-75 нм. Проте такі дослідження в Україні можливі лише у спеціалізованих лабораторіях, що оснащені електронними мікроскопами.

Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед дослідженням методами електронної мікроскопії не проводити! Не заморожувати і не розморожувати матеріал!

Проведення дослідження. На опірну сітку, покриту вуглеводно-формваровою плівкою-підкладкою, наносять краплю елюату і залишають на 5-10 хв. За цей час вірус адсорбується на гідрофільній поверхні плівки-підкладки. Надлишок рідини видаляють смужкою фільтрувального паперу, торкаючись краю предметної сітки. Після цього на сітку наносять краплину контрастуючої рідини. Через 30-40 с надлишок вологи видаляють за допомогою фільтрувальної смужки. В якості контрастуючих речовин використовують водні розчини 3% молібдату амонію (рН 7,0), 3% фосфорно-вольфрамову кислоту (рН 6,5-6,8), 1% уранілформіату.

Підсушену сітку досліджують під електронним мікроскопом, наприклад ЕМ-125К, вакуумний універсальний пост ВУП-5 виробництва Україна, м. Суми при інструментальному збільшенні 30-60 тис., продивляючись 40-50 секторів сітки. Належність виявлених часток до ротавірусів визначають за розміром та характерною морфологією.

7.1.4. Реакція непрямої гемаглютинації

Принцип РНГА полягає в тому, що попередньо оброблені формаліном або таніном еритроцити (найчастіше барана), на поверхні яких сорбовані специфічні антитіла (сенсибілізовані еритроцити), у присутності гомологічного антигену утворюють агрегати, що проявляється феноменом аглютинації. Метод високочутливий (виявляє 1-2 нг білку) і специфічний (більше 93%). Метод досить простий у виконанні, не потребує складного обладнання та апаратури і може бути виконаний у будь-якій вірусологічній лабораторії!

До складу тест-систем для РНГА входять, як правило, три компоненти: 1) еритроцитарний діагностикум (ЕД) рідкий, що являє собою 1% суспензію еритроцитів барана, сенсибілізованих імуноглобуліновою фракцією асцитної рідини білих щурів, імунізованих ротавірусом мавп SA-11; 2) імунна асцитна рідина (ІАР) білих щурів, імунізованих ротавірусом мавп SA-11; 3) антиген ротавірусу мавп SA-11 (АГ).

Особливості підготовки проб води та концентратів (елюатів) для дослідження методом РНГА з ротавірусним діагностикумом "Ротатест", виробництва Ростов-на-Дону: дослідження проводять відразу після етапу концентації ротавірусів у пробі води. Деконтамінацію елюатів ефіром або антибіотиками перед постановкою ІХА не проводити!

Перед проведенням дослідження значення pH зразків (концентратів) ад'юстувати до нейтральних.

Проведення дослідження. Реакцію проводять в мікропланшетах для імунологічних реакцій в об'ємі 75 мкл. В кожну лунку двох рядів мікропланшета вносять по 25 мкл досліджуваного зразку (елюату). По 25 мкл додають в перші лунки вказаних рядів, після чого готують його послідовні дворазові розведення (від 1:2 до 1:256). Далі в лунки першого ряду додають по 25 мкл 0,9% розчину NaCl, а в лунки другого ряду - по 25 мкл ІАР. Планшет струшують та залишають при кімнатній температурі на 20 хв. для утворення комплексу антигену з антитілом в лунках другого ряду. Після цього в усі лунки вносять по 25 мкл ЕД. Планшет знову струшують і залишають на 1,5-2 годин для специфічної взаємодії АГ ротавірусу з ЕД.

Реакція супроводжується такими контролями:

- контроль неспецифічної аглютинації ЕД (в 3 лунки вносять по 50 мкл 0,9% розчину NaCl та додають по 25 мкл ЕД в кожну);

- контроль специфічної взаємодії ЕД та ІАР. Його виконують по вищеописаній методиці РНГА, використовуючи АГ ротавірусу мавп SA-11, який входить до складу тест-системи. Цей контроль проводять після отримання комплекту, а потім - у разі необхідності.

Облік результатів в контролях: в першому контролі спонтанна аглютинація ЕД повинна бути відсутня. В контролі специфічної взаємодії ЕД та ІАР в першому ряду ЕД повинен реагувати з антигеном в розведенні не менш ніж 1:256, а в другому ряду ІАР повинна знижувати титр АГ не менше ніж в 4 рази.

Позитивним вважають результат у випадку повного гальмування аглютинації в другому ряду РНГА не менше ніж на 2 розведення (в 4 рази) в порівнянні з першим рядом.

Постановка контролів є обов'язковою при одержанні нової тест-системи!

7.1.5. Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією

Проведення дослідження можливе за умов наявності певного набору приміщень, що відповідають "Правилам функціонального устрою та експлуатації приміщень лабораторії молекулярно-генетичних досліджень", згідно до методичних вказівок "Застосування полімеразної ланцюгової реакції для виявлення збудників інфекційних захворювань людини" (МВ 9.9.5.101-203, Київ, 2003), високо вартісного обладнання та діагностичних наборів.

Метод ПЛР зі зворотною транскрипцією (транскриптазно опосередкована ампліфікація) включає етапи:

1) виділення вірусної РНК з досліджуваного матеріалу (проби води, концентрат вірусу, елюат після концентрації),

2) зворотну транскрипцію вірусспецифічної ДНК на матриці вірусної РНК,

3) ампліфікацію послідовностей цієї ДНК та детекцію одержаних ампліфікатів методом електрофорезу у агарозному гелі або ПААГ.

Для проведення дослідження використовують сертифіковані на Україні тест-системи.

Матеріал для дослідження: неконцентровані проби води та концентрат вірусів.

Ефективність виявлення ротавірусів вища після концентрації методом адсорбції на ГГМКК!

Етап 1. Виділення РНК проводиться в кімнаті для обробки матеріалу (Зона 1).

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку 5 мкл внутрішнього контрольного зразка (ВКО Rotavirus-rec), потім по 450 мкл лізуючого розчину. Промаркірувати пробірки.

3. В пробірки з лізуючим розчином і ВКО внести по 100 мкл досліджуваних проб води або концентрату, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ) Rotavirus-rec.

4. Щільно закриті проби ретельно перемішати на вортексі і центрифугувати впродовж 5 с при 5000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. впродовж 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 3. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 3, дотримуючись пункту 8.

10. Додати в пробірки по 400 мкл розчину для відмивання 4. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі, центрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат при +60 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл РНК-елюента, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат при температурі +60 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних оборотах мікроцентрифуги (12 000-13 000 об./хв.) 1 хв.

Супернатант (надосад) містить очищені РНК. Проби готові до постановки реакції зворотної транскрипції і ПЛР.

Реакцію зворотної транскрипції слід проводити відразу після отримання РНК-проби. Відбирати розчин РНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент. Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його на центрифузі.

Очищена РНК може зберігатися при 2-8 град. С до 4 годин. Для тривалого зберігання препарату, необхідно, не захоплюючи сорбент, відібрати розчин РНК, перенести в стерильну пробірку і зберігати при мінус 70 град. С.

Етап 2. Постановка реакції зворотної транскрипції і проведення ПЛР проводиться в кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації (Зоні 2).

Постановка реакції зворотної транскрипції (загальний об'єм реакції - 20 мкл, об'єм РНК-проби - 10 мкл).

При роботі з РНК необхідно використовувати тільки одноразові стерильні пластикові витратні матеріали, що мають спеціальне маркування "RNase-free", "DNase-free".

1. Відібрати необхідну кількість мікропробірок на 0,2 мл.

2. Приготувати реакційну суміш на 12 реакцій. Для цього в пробірку з ліофілізованим DTT додати 125 мкл RT-mix і ретельно перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

3. До отриманого розчину додати 6 мкл ревертази, перемішати на вортексі, осадити краплі з кришки пробірки.

4. Внести в мікропробірки по 10 мкл готовій реакційній суміші.

5. Використовуючи наконечники з бар'єром, додати 10 мкл РНК-проби в пробірку з реакційною сумішшю. Обережно перемішати.

6. Поставити пробірки в ампліфікатор (термостат) при температурі +37 град. С на 30 хв.

7. Отриману в реакції зворотної транскрипції кДНК для подальшої постановки ПЛР розвести в 2 рази ДНК-буфером (до 20 мкл кДНК окремим наконечником додати 20 мкл ДНК-буфера).

Готовий препарат кДНК можна зберігати при температурі -20 град. С впродовж 1 тижня або при температурі -70 град. С протягом року.

Постановка ПЛР (загальний об'ємреакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл).

Обов'язково застосовується "арячий старт", який забезпечується розділенням нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при температурі +95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.

Підготовка пробірок для проведення ПЛР:

1) відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб;

2) на поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1;

3) зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Узяти підготовлені для ПЛР пробірки. Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл кДНК, отриманих в реакції зворотної транскрипції РНК:

позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ПКЗ кДНК;

негативний контроль ПЛР (К-) - внести в пробірку 10 мкл ДНК-буфера.

2. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (дивися інструкцію до набору):

3. Після закінчення реакції пробірки відправити до кімнати для аналізу продуктів ПЛР (Зону 3).

Проби після ампліфікації можна зберігати 16 годин при кімнатній температурі, впродовж тижня - при температурі 2-8 град. С.

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації - проводиться в кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації (Зоні 3).

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю (якщо для нанесення різних проб використовується один і той самий наконечник, то її необхідно промивати буфером з камери після нанесення кожної проби). В кожному рядку доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення електрофорезу (барвник ксиленцианол при цьому пройде приблизно половину довжини гелю - 1,5 см), вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

Робота з ампліфікованими днк повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться за наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг ампліфікованої кДНК (рис. 8.1, табл. 8.2).

Рис.8.1. Облік результатів ПЛР-аналізу.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві помаранчеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 290 п.н. і смуга внутрішнього контрольного зразка (ВКЗ) - на рівні 514 п.н.

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), повинна бути тільки смуга ВКЗ на рівні 514 п.н.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна помаранчева смуга на рівні 290 п.н, що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинне бути ніяких смуг.

5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 290 п.н. більшої або меншої інтенсивності, незалежно від наявності смуги внутрішнього контролю.

6. Негативними вважаються зразки, які містять тільки смугу 514 п.н. більшої або меншої інтенсивності.

7. Окрім смуг 290 п.н. і 514 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з наведеними в таблиці, то відповідний етап аналізу слід переробити.

2. Якщо в доріжці будь-якої з проб відсутні обидві смуги, і 290 п.н. і 514 п.н., результат аналізу даної проби вважається недійсним, необхідно повторити дослідження із самого початку.

3. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

4. Поява специфічної смуги 290 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) вказує на контамінацію реактивів або проб. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Необхідно повторити аналіз проб, а також вжити заходи щодо виявлення джерел контамінації.

7.2. Дослідження проб на наявність аденовірусів 40-41 типів

Індикацію аденовірусів людини в елюатах, отриманих після концентрування, проводять методами електронної мікроскопії, в РНГА із специфічним рідким діагностикумом "Аденотест", ПЛР, ІХА.

Виділення та ідентифікацію аденовірусів з проб води здійснюють у культурі клітин.

7.2.1. Електронна мікроскопія

Єдиний метод лабораторного дослідження, який дозволяє візуально виявити та ідентифікувати аденовірус за морфологічними ознаками, проте найчастіше застосовується в умовах спеціалізованих вірусологічних лабораторій НДІ.

Для приготування препарату на предметну сітку, вкриту вуглецево-формваровою плівкою-підкладкою, наносять концентрат (елюат). Після негативного контрастування фосфорно-вольфрамовою кислотою препарати досліджують при інструментальному збільшенні у 30-50 тисяч разів (див. Розділ 8.1.3). Належність виявлених часток до аденовірусів визначають за характерною морфологією та розміром.

7.2.2. Реакція непрямої гемаглютинації

Використовують еритроцитарний аденовірусний імуноглобуліновий рідкий діагностикум для РНГА "АДЕНОТЕСТ" для виявлення і кількісного визначення титрів аденовірусів 40-41 типів.

До складу тест-системи "АДЕНОТЕСТ" входять три компоненти:

1) діагностикум еритроцитарний аденовірусний імуноглобуліновий рідкий (ЕД);

2) імунна асцитна рідина (ІАР);

3) антиген аденовірусів (АГ).

Реакцію проводять у мікропланшетах для імунологічних реакцій в об'ємі 75 мкл. В кожну лунку двох рядів мікропланшета вносять по 25 мкл стабілізованого 0,9% розчину NaCl. По 25 мкл концентрату, додають в перші лунки вказаних рядів, після чого готують його послідовні дворазові розведення (від 1:2 до 1:256). Далі в лунки першого ряду додають по 25 мкл 0,9% розчину NaCl, а в лунки другого ряду - по 25 мкл ІАР.

Планшет струшують та залишають при кімнатній температурі на 20 хв. для утворення комплексу антиген-антитіло в лунках другого ряду. Після цього в усі лунки вносять по 25 мкл ЕД. Планшет знову струшують і залишають на 1,5-2 годин для специфічної взаємодії АГ аденовірусу з антиаденовірусними імуноглобулінами ЕД.

Реакція супроводжується такими контролями:

- контроль неспецифічної аглютинації ЕД (в 3 лунки вносять по 50 мкл 0,9% розчину NaCl та додають по 25 мкл ЕД в кожну);

- контроль специфічної взаємодії ЕД та ІАР. Його виконують за вищеописаною методикою РНГА, використовуючи замість досліджуваної проби АГ аденовірусу, який титрують від 1:64 до 1:2048. Антиген входить до складу тест-системи у розведенні 1:32. Цей контроль проводять після отримання комплекту, а потім - за необхідністю.

Облік результатів у контролях: у першому контролі спонтанна аглютинація ЕД повинна бути відсутня. УВ контролі специфічної взаємодії ЕД та ІАР в першому ряду ЕД повинен реагувати з антигеном в розведенні не менш ніж 1:256, а в другому ряду ІАР повинна знижувати титр АГ не менше ніж в 4 рази.

Позитивний результат на наявність аденовірусу дають у випадку повного гальмування аглютинації в другому ряду РНГА не менше ніж на 2 розведення (в 4 рази) в порівнянні з першим рядом.

Постановка контролів є обов'язковою при одержанні нової тест-системи. В разі їх невідповідності тест-система вважається непридатною для застосування.

7.2.3. Полімеразна ланцюгова реакція

ПЛР призначена для виявлення в пробах води або в концентраті (елюаті) фрагментів послідовностей ДНК-геному аденовірусу при багаторазовому збільшенні (ампліфікації) кількості цих фрагментів з подальшим ідентифікуванням їх відомими методами - молекулярною гібридизацією, електрофорезом у агарозному чи поліакриламідному гелі (ПААГ). Принцип реакції полягає у багаторазовому повторенні циклів синтезу вірус специфічної послідовності ДНК за допомогою термостабільного ферменту Tag ДНК-полімерази та двох специфічних затравок (праймерів).

Виявлення ДНК аденовірусів в пробах води методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

Для проведення аналізу використовуються проби води без етапу концентрації вірусу та концентрат (елюат), отриманий після концентрування (див. Розділ 6). Цей зразок в кількості 0,5-1 мл переносять в пробірки типу "еппендорф", що вільні від РНКаз та ДНКаз.

Зберігають проби при 2-8 град. С не більше 1 доби, тривало - при мінус 70 град. С. Допускається тільки одноразове заморожування-відтаювання матеріалу.

Доставка проб здійснюється в спеціальному термоконтейнері з охолоджуючими елементами.

Опис етапів ПЛР-аналізу

ПЛР-аналіз складається з трьох етапів:

- виділення ДНК;

- ампліфікація ділянки ДНК - полімеразная ланцюгова реакція (ПЛР);

- електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР та облік результатів ПЛР-аналізу.

Етап 2. Постановка ПЛР (загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм ДНК-проби - 10 мкл).

Проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розпакування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації.

У всіх комплектах АмпліСенс для ампліфікації обов'язково застосовується "гарячий старт", який забезпечується розділенням нуклеотидів і Taq-полімерази прошарком воску. Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.

1. Відібрати необхідну кількість пробірок з ПЛР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб.

2. На поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЛР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЛР-сумішшю-1.

3. Зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Узяти підготовлені для ПЛР стерильні одноразові пробірки на 0,5 (0,2) мл (плюс дві контрольні). Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл ДНК, виділеної з проб води/елюатів або контролів етапу виділення.

2. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР (див. нижче):

а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;

б) позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК;

3. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. табл. 5.1).

1. Лізуючий розчин і розчин для відмивання 1 (якщо вони зберігалися при 2-8 град. С) прогріти при 60-65 град. С до повного розчинення кристалів.

2. Відібрати необхідну кількість одноразових пробірок на 1,5 мл з кришкою, що щільно закривається (включаючи негативний і позитивний контролі виділення). Внести в кожну пробірку по 300 мкл лізуючого розчину. Маркірувати пробірки.

3. В пробірки з лізуючим розчином внести по 100 мкл проб, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром. В пробірку негативного контролю (НК) виділення внести 100 мкл негативного контрольного зразка (НКЗ). В пробірку позитивного контролю (ПК) виділення внести 90 мкл НКЗ і 10 мкл позитивного контрольного зразка (ПКЗ Adenovirus).

4. Щільно закрити проби, ретельно перемішати на вортексі і ценрифугувати впродовж 5 с при 5000 об./хв. на мікроцентрифузі для видалення крапель з внутрішньої поверхні кришки пробірки.

5. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. В кожну пробірку окремим наконечником додати по 25 мкл ресуспендованого сорбенту. Перемішати на вортексі, поставити в штатив на 1 хв., ще раз перемішати і залишити на 5 хв.

6. Центрифугувати пробірки для осадження сорбенту при 10 000 об./хв. протягом 30 с на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

7. Додати в пробірки по 300 мкл розчину для відмивання 1. Перемішати на вортексі до повного ресуспендування сорбенту, процентрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

8. Додати в пробірки по 500 мкл розчину для відмивання 2. Ретельно ресуспендувати сорбент на вортексі. Ценрифугувати 30 с при 10 000 об./хв. на мікроцентрифузі. Видалити супернатант, використовуючи вакуумний аспіратор і окремі наконечники для кожної проби.

9. Повторити відмивання розчином для відмивання 2, згідно з пунктом 8.

10. Повністю видалити супернатант з кожної пробірки окремими наконечниками, використовуючи вакуумний аспіратор.

11. Помістити пробірки в термостат 62 град. С на 5-10 хв. для підсушування сорбенту. При цьому кришки пробірок повинні бути відкритими.

12. В пробірки додати по 50 мкл ТЕ-буфера для елюції ДНК, використовуючи наконечники з аерозольним бар'єром, вільні від РНКаз та ДНКаз. Перемішати на вортексі. Помістити в термостат 62 град. С на 2-3 хв. Перемішати на вортексі і центрифугувати пробірки на максимальних обертах мікроцентрифуги (12-13 000 об./хв.) впродовж 1 хв.

Супернатант містить очищені ДНК. Проби готові до постановки ПЛР.

Відбирати розчин ДНК для реакції потрібно дуже обережно, не захоплюючи сорбент.

Якщо сорбент скаламутився, необхідно осадити його центрифугуванням.

Очищена ДНК може зберігатися при 2-8 град. С до тижня. Для тривалого зберігання препарату, необхідно, не захоплюючи сорбент, відібрати розчин ДНК, перенести в стерильну пробірку і зберігати при мінус 70 град. С.

Етап 2. Постановка ПЛР (проводиться в Зоні 2 - кімнаті для розкапування реагентів і проведення ПЛР-ампліфікації; загальний об'єм реакції - 25 мкл, об'єм кДНК-проби - 10 мкл)

Обов'язково застосовується "гарячий старт". Плавлення воску і перемішування реакційних компонентів відбувається тільки при 95 град. С, що значно знижує кількість неспецифічних реакцій.

Підготовка пробірок для проведення ПЛР:

1) відібрати необхідну кількість пробірок з ПЦР-сумішшю-1 і воском для ампліфікації ДНК досліджуваних і контрольних проб;

2) на поверхню воску внести по 10 мкл ПЛР-суміші-2 ("верхньої"), при цьому ПЦР-суміш-2 не повинна провалюватися під віск і змішуватися з ПЦР-сумішшю-1;

3) зверху додати по краплі масла для ПЛР (приблизно 25 мкл).

1. Взяти підготовлені для ПЦР стерильні одноразові пробірки на 0,2 мл (плюс дві контрольні). Під масло або безпосередньо на масло, використовуючи наконечники з аерозольними бар'єрами, внести по 10 мкл ДНК, виділеної з проб або контролів етапу виділення.

2. Додаткові пробірки призначаються для контролів етапу ПЛР:

а) негативний контроль (К-) замість ДНК-проби внести в підготовлену пробірку 10 мкл ДНК-буфера;

б) позитивний контроль (К+) - внести в пробірку 10 мкл позитивного контрольного зразка ДНК;

3. Запустити на ампліфікаторі потрібну програму (див. Інструкцію до тест-системи).

Етап 3. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР-ампліфікації (проводиться в зоні 3 - кімнаті для аналізу продуктів ампліфікації).

Робота з ампліфікованими ДНК повинна проводитися в окремій кімнаті співробітником лабораторії, що не проводить маніпуляцій в Зоні 1 і Зоні 2.

1. Пробірки з продуктами ампліфікації виставити в штатив послідовно, відібрати з-під шару масла по 10-15 мкл проб і внести в лунки гелю (якщо для нанесення різних проб використовується один і той самий наконечник, то її необхідно промивати буфером з камери після нанесення кожної проби). В кожному ряді доріжок гелю повинен бути обов'язково представлений К+.

2. Підключити камеру до джерела струму, дотримуючи полярність (ДНК рухається до позитивного електроду), і включити джерело (напруга 250-300 В, стабілізація по напрузі), час електрофорезу - 18-20 хв. Оптимальна напруженість електричного поля при цьому складає 10 В/см.

3. Після закінчення часу електрофорезу (фарбник ксіленціанол при цьому пройде приблизно половину довжини гелю - 1,5 см), вимкнути джерело струму, перенести гель на трансілюмінатор. Отримати зображення гелю на комп'ютері за допомогою відеосистеми, відзначивши порядок нанесення, занести в базу даних.

При дослідженні гелю і фотографуванні очі повинні бути захищені спеціальною маскою або скляною пластиною!

Облік результатів ПЛР-аналізу проводиться по наявності або відсутності на електрофореграмі специфічних смуг амплифікованої кДНК (табл. 8.3, рис. 8.2).

Рис. 8.2. Електрофореграмма результатів тестування зразків на наявність ДНК Adenovirus

Довжина специфічних смуг амплифікованих фрагментів кДНК: аденовірусу - 462 п.н.

1. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу виділення (ПК), повинні бути дві яскраві оранжеві смуги, що світяться: специфічна - на рівні 462 п.н.

2. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу виділення (НК), не повинно бути смуг.

3. У доріжці, відповідній позитивному контролю етапу ПЛР (К+), повинна бути яскрава специфічна оранжева смуга на рівні 462 п.н., що світиться.

4. У доріжці, відповідній негативному контролю етапу ПЛР (К-) не повинно бути ніяких смуг.

5. Позитивними вважаються зразки, які містять специфічну смугу, що світиться, на рівні 462 п.н. більшої або меншої інтенсивності.

6. Негативними вважаються зразки, які не містять ніяких смуг

7. Окрім смуг 462 п.н. в доріжках можуть спостерігатися нечіткі розмиті смуги праймер-димерів, які розташовуються нижче за рівень 100 нуклеотидних пар.

Результати аналізу не підлягають обліку в наступних випадках:

1. Якщо результати аналізу контрольних зразків не співпадають з приведеними в табл. 5.3, то відповідний етап аналізу слід переробити.

2. В доріжках з'являються неспецифічні смуги на різних рівнях. Можливі причини: відсутність "гарячого старту" або невірний температурний режим в осередках ампліфікатора.

3. Поява специфічної смуги 462 п.н. в будь-якому з негативних контрольних зразків (НК, К-) вказує на контамінацію реактивів або проби. В цьому випадку результати аналізу вважають недійсними. Треба повторити аналіз проб, а також вжити заходам по виявленню джерела контамінації.

7.2.4. Імунохроматографічний аналіз

ІХА-тести засновані на тих самих принципах імунологічних реакцій, застосуванні таких самих імунобіологічних продуктів, що і добре відомі класичні ІФА тест-системи. Але твердим носієм імунокомпонентів є НЦМ. Їм притаманна висока чутливість та специфічність.

Принцип комбінованого тесту "CITO TEST ROTA-ADENO". Тест побудований на використанні унікальної комбінації кон'югатів моноклональних антитіл проти аденовірусу та ротавірусу з частками барвника - колоїдного золота. В тесті використовуються також антиаденовірусні та антиротавірусні поліклональні антитіла, які вибірково зв'язуються з вірусами у пробі.

Механізм тестування полягає у наступному: під час проходження досліджуваної проби крізь адсорбуючу зону тестового приладу мічений кон'югат зв'язуються з аденовірусами у пробі, утворюючи синю смугу у тест-зоні. За наявності у пробі ротавірусів формується рожева або червна смуга. Компоненти тесту, які не вступили в реакцію, забезпечують виявлення зеленої смуги у контрольній зоні, що свідчить про функціонально активний стан реагентів та правильне проведення тесту. Процедура тесту: ІХА-тест в упаковці та досліджувані проби води або концентрат перед початком тестуванням витримують при кімнатній температурі. Тест виконують методом занурення - тримаючи тест на вертикально, занурюють білим кінцем тесту в зразок, не перевищуючи обмеження занурення, вказаного на тесті стрілками. Облік результату тесту проводиться через 10 хв. без подальшого втручання (рис. 8.3.).

Рис. 8.3. Постановка та облік результатів в ІХА-тесті "CITO TEST ROTA-ADENO", виробництва CerTest S.L. Іспанія (ТОВ "Фармаско")

Негативний результат: лише одна смуга зеленого кольору (контрольна лінія) з'являється на білій центральній ділянці тесту (контрольна ділянка тесту).

Позитивний результат: в доповнення до зеленої контрольної смуги також з'являється одна чітка червона смуга або одна чітка синя смуга або обидві смуги одночасно (лінія результату) на білій центральній зоні тесту (ділянка результату тесту). Наявність червоної і зеленої смуги свідчать про виявлення ротавірусів. Наявність синьої та зеленої смуги - про виявлення аденовірусів. Наявність трьох смуг (червоної, синьої та зеленої) - про одночасне виявлення двох збудників (ротавірусу та аденовірусу).

Тест недійсний: відсутність контрольної зеленої смуги незалежно від появи чи відсутності результативної лінії (червоної або синьої). Недостатня кількість зразку, неправильна техніка виконання тесту чи псування реагентів є вірогіднішими причинами відсутності контрольної лінії.

Інтенсивність синьої та червоної лінії на тестовій ділянці тесту залежить від концентрації вірусів, присутніх в досліджуваному зразку.

7.2.5. Виділення та ідентифікація виділеного агенту в культурі клітин

Аденовіруси можуть культивуватися на багатьох типах культур клітин. Для їх виділення у лабораторній практиці частіше використовуються перещеплювані лінії клітин епітелію людини (HeLa, HEp-2, КВ, L-41) і рідше - клітини приматів (Vero та інші). Найбільшу чутливість до аденовірусів мають первинні або диплоїдні культури клітин нирок ембріону людини. При їх використанні цитопатогенний ефект (ЦПД) проявляється набагато швидше, ніж у перщеплюваних культур клітин, тобто на 2-4 добу після інфікування. Час появи ЦПД залежить від типу вірусу та його концентрації. Ознаками ЦПД, що вказують на наявність аденовірусів у інфікованих чутливих культурах клітин, є округлення клітин, збільшення зернистості у цитоплазмі, формування скупчень клітин різних розмірів, які іноді нагадують виноградні грона. Моношар також може нагадувати сітку з розтягнутими вічками.

Для вирощування культур клітин використовують середовище росту, яке складається з 90% мінімального середовища Ігла (на розчині Ерла) і 10% телячої ембріональної сироватки.

Для підтримки культур клітин використовують мінімальне середовище Ігла (на розчині Ерла) з 2% телячої ембріональної сироватки. Проте, при спостеріганні за інфікованими клітинами кожні 4-5 діб потрібна заміна середовища на нове.

При тривалому зберіганні зразків проб (більше двох тижнів) їх заморожують при температурі 15-30 град. С.

Вищезазначене транспортне середовище слід використовувати при зберіганні матеріалів при температурі + 2 - +8 град. С.

При виділенні аденовірусів із проб, відібраних із об'єктів довкілля, проводять роботу у такій послідовності:

- змінюють середовище росту на підтримуючи у пробірочній культурі клітин з суцільним моношаром;

- проби матеріалів вносять по 0,2 мл в 2-3 пробірки, в яких попередньо замінили середовище росту на середовище підтримки;

- після інфікування пробірки з культурою клітин поміщають в термостат при температурі 37 град. С, витримують протягом 7 діб та мікроскопують з однодобовим інтервалом.

При відсутності ЦПД при інфікуванні культур клітин доцільне проведення двох "сліпих" пасажів.

Ідентифікують та типують виділені у культурі клітин аденовіруси за допомогою типоспецифічних сироваток у реакції нейтралізації (РН) та реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) згідно з інструкцією виробника щодо використання.

Індикацію аденовірусного антигену в культурах інфікованих клітин можна здійснювати одним з вищенаведених методів (див. пункти 7.2.2-7.2.4).

7.3. Дослідження проб на наявність ентеровірусів

7.3.1. Виділення вірусів у культурі клітин

Клітинні лінії, що рекомендуються для виділення ентеровірусів. Поліо- та інші ентеровіруси добре розмножуються в багатьох перещеплюваних клітинах людини і приматів - RD, HeLa, HEp-2, KB та ін. Проби, в яких передбачається присутність поліовірусу, слід перевіряти на двох лініях клітин - L20B і RD.

L20B - лінія мишачих клітин (L-клітин), яким генно-інженерним шляхом надана здатність експресувати рецептор до поліовірусу.

Клітини L20B чутливі до поліовірусів і викликають в них характерний цитопатичний ефект (ЦПД). Деякі віруси (зокрема, аденовіруси і реовіруси) можуть викликати ЦПД в цих клітинах, проте він значно відрізняється від того, що викликається поліовірусом. Небагато неполіомієлітних ентеровірусів (наприклад, Коксаки А) можуть розмножуватися в клітинах L20B (іноді тільки після культивування на іншій лінії клітин) і викликати типову для ентеровірусів ЦПД.

RD - клітини, одержані з рабдоміосаркоми людини. Використання цих двох ліній для лабораторної діагностики поліомієліту забезпечує високу чутливість і специфічність при виявленні поліовірусу, допомагає стандартизувати методику і порівнювати результати, одержані в різних лабораторіях.

У клітинах НЕр-2 розмножуються поліовіруси і віруси Коксаки В, викликаючи ЦПД.

Важливо стежити за чутливістю клітин до поліовірусів, періодично проводячи титрування референс-штамів вакцинних поліовірусів. Необхідно уникати контамінації мікоплазмами, змінюючи робочу лінію клітин після кожних 15 пасажів або тримісячного використання, новою порцією клітин з лабораторного банку. Контаміновані мікоплазмами клітинні матеріали знищують автоклавуванням.

Для виділення поліо- та інших ентеровірусів потрібно приготувати:

- пробірки з культурою клітин L20B, RD та НЕр-2;

- підтримуюче середовище (ПС);

- піпетки на 1 і 5 мл.

Роботу з виділення ентеровірусів проводять у такій послідовності:

- мікроскопують культури з недавно сформованим моношаром для перевірки стану клітин; нормальний моношар формується протягом 2-3 днів після посіву клітин;

- видаляють середовище росту (СР) і замінюють його 1 мл ПС;

- маркірують по 2 пробірки кожного виду зазначених вище чутливих культур клітин для інокуляції матеріалами проб;

- маркірують по 1 пробірці з кожним типом клітин як негативні контролі;

- пробірки з різними видами клітин інокулюють одночасно;

- у кожну пробірку вносять по 0,2 мл досліджуваного матеріалу і інкубують у стаціонарному положенні з кутом нахилу 5 град. при 36 град. С;

- щодня мікроскопують культури, стежачи за появою ЦПД;

- щоденно реєструють результати спостережень за інокульованими і контрольними пробірками - розвиток ЦПД (1+ - до 25%, 2+ - 25-50%, 3+ - 50-75%, 4+ - 75-100%). Якщо розвивається швидка дегенерація клітин протягом одного-двох днів після інокуляції, це може свідчити про токсичність проби. Пробірки з дегенерацією клітин заморожують при -20 град. С, відтаюють і по 0,2 мл рідини вносять у культури клітин того ж самого типу. Якщо ознаки токсичності з'являються знову, повертаються до підготовленої до дослідження проби, розводять її у фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) 1:10 та інокулюють культури, як описано вище.

Контамінація середовища і загибель клітин під впливом бактерій роблять виявлення вірусного ЦПД неможливим. У цьому випадку потрібно повернутися до початкового екстракту проби, повторно обробити його хлороформом і інокулювати культури, як описано вище.

При появі характерної для ентеровірусів ЦПД - закруглені, заломлюючі світло клітини, що відшаровуються від ростової поверхні, продовжують інкубацію до розвитку ЦПД в 75% клітин (3 + ЦПД) і зберігають пробірку при -20 град. С для другого пасажу. Матеріал другого пасажу використовують для типування вірусу і проведення внутрішньотипової диференціації (ВТД).

У випадку, якщо ЦПД не виявилася протягом 7 днів, проводять один "сліпий" пасаж і спостерігають культури ще 7 днів. Вміст окремих пробірок одного пасажу не змішують, а інокулюють окремо.

Сліпий пасаж проводиться також тоді, якщо через 5-7 днів у дослідних і контрольних пробірках з'являються ознаки старіння клітин або дегенерації. Такі пробірки з матеріалом проби заморожують при -20 град. С, відтаюють і переносять по 0,2 мл культуральної рідини у пробірки зі свіжою культурою тих же клітин, спостерігають протягом 7-10 днів. При відсутності ЦПД результат дослідження вважають негативним.