Про затвердження інструкцій, регламентуючих діяльність закладів служби крові України

- стандартний універсальний реагент антирезус - анти-Rh0(D);

- стандартні еритроцити для контролю;

- центрифужні або інші пробірки місткістю 8 - 10 мл.

Попередня обробка досліджуваної крові не потрібна. Може бути використана кров, взята безпосередньо перед дослідженням з місця уколу пальця, консервована кров і осад еритроцитів в пробірці після утворення згустку крові, взятої без стабілізатора.

Дозволяється зберігати кров протягом 3 діб при температурі + (6 +- 2) град. C.

У штатив ставлять 2 ряди пробірок за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів у кожному ряді і по 2 пробірки для контрольних досліджень - стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів. На пробірках надписують прізвище і ініціали особи, кров якої досліджують. Відповідно позначають і контрольні пробірки.

У всі пробірки 1-го ряду вносять по 2 краплі (0,1 мл) стандартного універсального реагенту антирезус.

У всі пробірки 2-го ряду вносять по 2 краплі (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і по одній краплі (0,05 мл) 33% розчину поліглюкіну.

У кожну пару пробірок вносять відповідно до позначення по 1 краплі (0,05 мл) досліджуваної крові, стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів.

Вміст пробірок перемішують струшуванням і потім поволі повертають по осі, нахиляючи майже до горизонтального положення так, щоб вміст розпливався по стінках. Таке розпливання крові по стінках пробірок робить реакцію більш вираженою. Як правило, аглютинація настає вже протягом 1-ї хвилини, але для утворення стійкого комплексу антиген - антитіло і чітко вираженої реакції, а також зважаючи на можливість сповільненої реакції у разі слабкої аглютинабельності еритроцитів, контакт еритроцитів з реагентом при повертанні пробірок має тривати не менше 3 хв.

Через 3 хв. в пробірки додають по 2 - 3 мл 0,9% розчину натрію хлориду і перемішують вміст 2 - 3-кратним повертанням пробірок (не струшувати!).

Пробірки передивляються на світлі неозброєним оком або через лупу з 2-кратним збільшенням. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів.

За наявності аглютинації у вигляді великих грудочок або пластівців із склеєних еритроцитів на тлі освітленої рідини досліджувану кров можна вважати резус-позитивною (Rh+). У разі відсутності аглютинації (в пробірці зберігається гомогенне забарвлення) досліджувану кров можна вважати резус-негативною (Rh-). Однак ці результати слід вважати вірогідними тільки після перевірки контрольних зразків, тобто у разі позитивної реакції зі стандартними резус-позитивними еритроцитами і негативної - з резус-негативними, а також після перегляду результатів у 2-му контрольному ряді.

У всіх пробірках 2-го контрольного ряду аглютинації не повинно бути.

Наявність аглютинації в будь-якій пробірці контрольного ряду вказує на неспецифічне склеювання еритроцитів і не дозволяє враховувати результат дослідження як вірогідний.

У таких випадках для визначення резус-належності слід застосовувати іншу сироватку антирезус, включаючи сироватку з повними антитілами, або відмити еритроцити теплим 0,9% розчином натрію хлориду для вимивання з них аутоантитіл.

- стандартні сироватки антирезус з повними антитілами;

- стандартні еритроцити для контролю;

- пробірки висотою 2 - 2,5 см і діаметром 0,5 - 0,6 см з гладким дном заокругленої форми або планшети з заглибинами такої ж конфігурації;

- лупа з 6 - 8-кратним збільшенням;

- термостат (37 град. C).

Кров для дослідження беруть у кількості 2 - 3 мл у звичайні пробірки, в яких знаходиться 0,25 мл (5 крапель) 3,8 - 5,0% розчину натрію цитрату або іншого стабілізатора. На пробірці надписують прізвище, ініціали та групу крові особи, від якої взято кров.

Еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірки доливають доверху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст їх перемішують і центрифугують при швидкості обертання ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв.

Можна брати кров без стабілізатора. У такому разі після зсідання в пробірці залишається деяка кількість вільних еритроцитів. Одержані за такою методикою еритроцити відмивають, як вказано вище.

З відмитих еритроцитів готують 2% завис, для чого одну краплю еритроцитів переносять у відповідно позначену пробірку, в якій знаходиться 49 крапель 0,9% розчину натрію хлориду.

Припустимо зберігати кров у холодильнику протягом 3 діб при температурі +(6 +- 2) град. C.

У штатив встановлюють два ряди маленьких пробірок, в кожному ряді за кількістю досліджуваних зразків еритроцитів і дві - для контролю. Попередньо штатив накривають аркушем паперу. На ньому злегка наколюють отвори, крізь які і встановлюють пробірки.

Проти кожної пари пробірок на папері надписують прізвище, ініціали особи, кров якої будуть досліджувати.

У всі пробірки першого ряду вносять по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, у всі пробірки другого ряду - по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус другої серії, у всі пробірки обох рядів - по 1 краплі 0,9% розчину натрію хлориду.

У відповідно позначені пари пробірок додають по 1 краплі (0,05 мл) 2% завису досліджуваних еритроцитів, а в контрольні пробірки - по 1 краплі (0,05 мл) 2% завису контрольних (стандартних резус-позитивних і резус-негативних) еритроцитів.

Вміст пробірок ретельно перемішують струшуванням, і штатив з ними ставлять у термостат за температури 37 град. C на 1 год. За цей час еритроцити осідають на дно, попередньо увійшовши в контакт з сироваткою антирезус.

Пробірки слід розглядати по повздовжній осі над джерелом світла, закритим матовим склом. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів, що проявляється в різній формі їх осаду на дні пробірки. У разі позитивного результату осад еритроцитів розташовується на дні пробірки нерівномірним шаром. Видно шорсткість, губчастість або зернистість його структури. Контури осаду ніколи не бувають рівними, вони зігнуті, іноді згорнуті до середини. У деяких випадках еритроцити розташовуються у вигляді хвилястого віночка навколо більш світлої центральної частини.

У разі негативного результату осад еритроцитів розташовується рівномірним шаром без шорсткостей, інколи з невеликим просвітленням у центрі. Межі його являють собою правильно окреслене коло.

Діаметр осаду у разі негативного результату завжди менший, ніж у разі позитивного.

Зразки еритроцитів, що дають аглютинацію із сироваткою анти-D(Rh0), є резус позитивними (Rh+), зразки еритроцитів, що не дають аглютинації з сироваткою анти-D(Rh0) - резус-негативні (Rh-). Однак результат враховують як вірогідний за умови співпадання їх в обох серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної групи або групи 0(I).

Примітка. Повні антитіла не виявляють слабкий різновид фактора D^U.

Після визначення резус-фактора з усіх пробірок обережно відсмоктують сироватку (еритроцити залишаються на дні) і збирають її в ампулу або в пробірку.

Цю сироватку можна повторно декілька разів застосовувати для визначення резус-фактора, поки активність її не вичерпається, тобто поки вона буде давати чітку аглютинацію зі стандартними резус-позитивними еритроцитами і негативну - зі стандартними резус-негативними еритроцитами.

1.5.1. Під час визначення резус-належності двома серіями стандартних сироваток у тих випадках, коли вони використовуються різними методами, результат враховують як вірогідний за умови співпадання його в обох серіях досліджень після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність кожної серії сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної або групи 0(I) і в контрольних пробах без сироватки (реагенту) антирезус.

1.5.2. Якщо під час визначення резус-належності спостерігається слабка або сумнівна реакція, то слід повторно досліджувати кров даної особи тими ж та іншими серіями сироватки антирезус або моноклональними реагентами, а також використовувати сироватку, що вміщує повні антитіла.

Якщо за таких умов усі серії сироваток, що містять неповні антитіла, дадуть також слабку або сумнівну реакцію, а з повними антитілами реакція буде негативною, це означає, що еритроцити мають слабку різновидність антигену резус, так званий фактор D^U, який зустрічається в популяції з частотою близько 1%. У цих випадках резус-належність крові хворого або вагітної жінки оцінюють, як резус-негативну (Rh-), а резус-належність крові донора - як резус-позитивну (Rh+), не допускаючи, таким чином, переливання його крові резус-негативним реципієнтам.

1.5.3. Інколи зустрічаються зразки еритроцитів, що дають слабко виражену реакцію. У цих випадках слід повторно досліджувати їх кількома серіями сироваток антирезус високої активності або моноклональними антитілами (реагенти анти-D-супер).

1.5.4. Для визначення резус-належності крові донорів недостатньо розділення їх тільки на резус-позитивних і резус-негативних за сироваткою анти-D(Rh0), а необхідно додатково досліджувати сироватками, що мають антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh''), або моноклональними антитілами.

До числа резус-негативних донорів зараховують тільки тих осіб, кров яких не має жодного з вказаних антигенів.

1.5.5. Визначення антигенів резус-C(rh'), E(rh''), c(hr') і e(hr'') проводять сироватками, що мають антитіла відповідної специфічності, або моноклональними реагентами. Ці антитіла можуть бути в сироватці як у чистому вигляді, так і в різних співвідношеннях.

Ці дослідження проводять тими ж методами, що і визначення резус-фактора - D(Rh0). Як позитивний контроль використовують стандартні еритроцити, що мають відповідний антиген.

Моноклональні реагенти (антитіла) призначені для виявлення окремих антигенів системи резус на еритроцитах людини. Їх можна застосовувати замість ізоімунних сироваток або паралельно з ними.

Моноклональні тест-реагенти - це моноклональні антитіла, які виробляються гетерогібридомою. Одержують моноклональні антитіла з культуральної рідини гібридомних клітин-продуцентів. Технологія виготовлення тест-реагентів виключає можливість їх контамінації патогенними для людини вірусами.

Моноклональні антитіла анти-D-супер призначені для виявлення на еритроцитах людини антигену D(Rh0) і використовуються в серологічних тестах замість або паралельно з імунною анти-D-сироваткою.

Моноклональні анти-D-антитіла випускають у вигляді повних (IgM) та неповних (IgG) антитіл.

Оскільки IgM-антитіла не аглютинують деякі зразки еритроцитів із слабким варіантом D (зокрема, D^U), необхідно такі "негативні" еритроцити додатково досліджувати в желатиновому тесті або непрямій пробі Кумбса з використанням анти-D-реагентів, що мають IgG-антитіла. Такими реагентами є поліклональні сироватки або моноклональні анти-D-IgG-реагенти.

Анти-D-IgM-антитіла викликають пряму аглютинацію еритроцитів, які мають D-антиген, і можуть використовуватись в будь-якій модифікації прямої аглютинації: в пробірках, на площині, в мікроплатах.

Моноклональні антитіла анти-C-супер вміщують антитіла, здатні викликати пряму аглютинацію еритроцитів, що несуть на собі C(rh')-антиген системи резус. Даний реагент не має антитіл іншої специфічності і тому придатний для виявлення C-антигену в еритроцитах будь-якої групи крові за системою AB0.

Моноклональні анти-C-антитіла можуть бути використані в реакціях прямої аглютинації в пробірках, на площині, в мікроплатах. У разі застосування тесту на площині, скло необхідно попередньо злегка підігріти.

Моноклональні анти-CDE антитіла виготовляють із моноклональних антитіл (IgM та IgG) для виявлення в еритроцитах антигену C (один IgM-клон), D-антигену (один IgM-клон та один IgG-клон) і антигену E (один IgM-клон) шляхом прямої аглютинації в пробірках, на площині та в мікроплатах.

Слід підкреслити, що D^U-позитивні еритроцити також аглютинуються цим реагентом. Проте в разі негативної реакції слабкий DU фенотип можна виявити в непрямому тесті Кумбса з використанням IgG-компонентів анти-CDE моноклональних антитіл.

Реакцію з моноклональними анти-резус-тест-реагентами можна ставити в пробірках, на площині та в мікроплатах.

2.2.1. Одну краплю 3 - 5% завису еритроцитів сполучають з краплею моноклонального рідкого тест-реагенту.

2.2.2. Пробірки струшують до повного перемішування реагентів, після чого центрифугують при швидкості ротора 1000 об./хв. протягом 1 хв. Допускається попередня (перед центрифугуванням) інкубація при кімнатній температурі або при температурі 37 град. C протягом 30 хв.

2.2.3. Обережно струшують осад у пробірках.

У разі негативного результату осад еритроцитів легко розбивається, створюючи гомогенну непрозору суспензію.

Якщо результат позитивний, осад не розбивається, залишаючись у вигляді одного або декількох великих аглютинатів на тлі прозорої рідини.

2.3.1. На скляну площину зі змочуваною поверхнею наносять дві краплі тест-реагенту анти-резус (0,1 мл), 1 краплю досліджуваної крові (0,05 мл) і ретельно змішують.

2.3.2. Через 20 - 30 сек. починають погойдувати площину. Чітка аглютинація починається і спостерігається досить чітко за 60 сек. Результат реакції слід враховувати через три хвилини, уникаючи висихання краплини.

2.4.1. В комірку мікроплати капають одну краплину тест-реагенту анти-резус і додають до неї одну краплю 3 - 5% завису еритроцитів. Ретельно перемішують вручну або вібратором для мікроплат.

2.4.2. Центрифугують при швидкості обертання ротора 1000 об./хв. протягом 1 хв. або попередньо інкубують 30 хв. при кімнатній (від 20 до 27 град. C) температурі.

2.4.3. Злегка струшують мікроплату. Якщо результат негативний, осад розбивається у вигляді рівномірного забарвлення рідини.

У разі позитивного результату осад залишається у вигляді великих аглютинатів.

2.4.4. Відчитування результатів необхідно проводити у прохідному світлі з дзеркалом або з використанням спеціального обладнання, наприклад, апарату автоматичного обліку мікроплат.

2.5.1. Готують 3 - 5% суспензію досліджуваних еритроцитів в 0,9% розчині натрію хлориду.

2.5.2. У пробірці сполучають 1 краплю суспензії еритроцитів з 1 краплею моноклональних анти-CDE-антитіл і ретельно перемішують реагенти.

2.5.3. Ставлять на водяну баню при температурі 37 град. C на 15 хв.

2.5.4. Після інкубації еритроцити тричі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду. Для цього в пробірки доливають до верху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст їх перемішують і центрифугують при швидкості 1500 об./хв. протягом 5 хв.

2.5.5. Додають до осаду еритроцитів 2 краплі антиглобулінової сироватки Кумбса, ретельно перемішують.

2.5.6. Центрифугують протягом 1 хв. при швидкості обертання ротора 1000 об./хв. при кімнатній температурі.

2.5.7. Струшують пробірку та враховують аглютинацію.

2.5.8. Аглютинація еритроцитів свідчить про наявність антигена D^U.

У разі негативного результату реакції ставлять паралельний контроль з D-позитивними та D-негативними еритроцитами в пробі Кумбса.

Примітка. Інші антигени за системою резус, такі, наприклад, як C(rh'), c(rh'), E(rh''), e(hr''), а також антигени інших систем (Келл) виявляються ізоімунними сироватками, що мають відповідну специфічність. У перспективі розвитку біотехнології можлива заміна ізоімунних сироваток повністю моноклональними реагентами, переваги яких на сьогодні цілком очевидні.

- неправильний вибір антирезусних сироваток за груповою належністю;

- помилковий порядок розміщення сироваток, реагентів або дослідної крові у штативах;

- неправильне співвідношення між сироваткою і еритроцитами (еритроцитів повинно бути приблизно в 10 разів менше ніж сироватки);

- недотримання необхідної температури в водяній бані (при температурі нижчій від 42 град. C аглютинація може не наступити, при вищій від 48 град. C краплини швидко висохнуть);

- недотримання часу, необхідного для проведення реакції;

- висновок робиться з висохлої краплі;

- використання для визначення резус-фактора старої, гемолізованої або інфікованої крові;

- визначення резус-належності за допомогою однієї серії антирезусної сироватки.

- використання протермінованих сироваток;

- використання малоактивних сироваток;

- використання забруднених, інфікованих сироваток.

- феномен поліаглютинабельності еритроцитів. Поліаглютинацію вдається усунути за допомогою відмивання еритроцитів, хоч і не завжди;

- наявність антигену D^U (слабка різновидність антигену D). Еритроцити з цим аглютиногеном дають дуже нечітку аглютинацію зі стандартними антирезусними сироватками та з МКА. Реципієнтів з антигеном DU рахують резус-негативними, донорів - резус-позитивними;

- зниження рівня резус-аглютиногенів при деяких захворюваннях (хвороби системи крові, печінки, нирок, імунної системи).

Антитіла системи AB0 - ізоаглютиніни a(яльфа) і b(бета) у людей є нормальними (природними) антитілами. Вони належать до повних антитіл-аглютинінів, добре реагують у сольовому середовищі, краще виявляються при кімнатній температурі +(22 +- 2) град. C і погано - при температурі +37 град. C. Додавання в реакцію колоїдних речовин не посилює активності цих антитіл, непряма проба Кумбса їх не виявляє.

Нормальні антитіла a(альфа) і b(бета) легко абсорбуються груповими субстанціями A і B. Вони чутливі до дії високої температури: прогрівання при температурі 70 град. C протягом 10 хв. достатньо, щоб антитіла повністю втратили активність.

Крім нормальних (природних) антитіл a(альфа) і b(бета) в людини можуть з'явитися імунні антитіла анти-A і анти-B. Імунні антитіла практично відсутні в крові людей, але можуть з'явитися внаслідок ізоімунізації у разі парентерального попадання в організм несумісного в груповому відношенні антигену, наприклад, у разі AB0-несумісної вагітності, під час помилкового переливання крові, несумісної за системою AB0, а також під час проведення деяких щеплень та імунізації.

У разі AB0 - несумісної вагітності, яка стала причиною гемолітичної хвороби плода, імунні антитіла анти-A або анти-B майже завжди наявні в крові матері до моменту народження хворої дитини. Звичайно це супроводжується високим титром нормальних антитіл a(альфа) і b(бета).

Після помилкового переливання несумісної крові імунні антитіла анти-A і анти-B з'являються звичайно на 5-ту - 7-му добу, досягаючи максимуму до 15 - 25-ї доби з наступним зниженням їх титру. У крові таких хворих одночасно підвищується титр нормальних антитіл a(альфа) і b(бета) на 3 - 8 ступенів також з наступним зниженням після 25 - 30-ї доби.

Імунні антитіла анти-A і анти-B можуть бути як у формі повних, так і неповних антитіл. Вони активні при температурі 37 град. C, можуть мати дещо більш високий титр у разі проведення реакції в колоїдному середовищі порівняно з сольовим і виявляються в непрямій пробі Кумбса. Імунні антитіла не абсорбуються при додаванні групонеспецифічної субстанції. Вони стійкі до температурного впливу і зберігають активність під час прогрівання сироватки протягом 10 хв. при температурі 70 град. C, тобто за умов, коли нормальні антитіла a(альфа) і b(бета) повністю інактивуються.

Виявлення імунних антитіл може бути цінною діагностичною ознакою, зокрема, при вирішенні питання про причини гемотрансфузійних ускладнень і гемолітичної хвороби новонароджених. Ці дослідження рекомендують для використання на практиці. Найбільш демонстративною відмінністю нормальних антитіл a(альфа) і b(бета) від імунних антитіл анти-A і анти-B є їх поведінка під дією високої температури.

На врахуванні цих відмінностей грунтується застосування різних методів для виявлення нормальних антитіл та імунних антитіл анти-A і анти-B.

Стандартні еритроцити (або суміш еритроцитів) груп A(II) і B(III) двічі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду шляхом центрифугування, при швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого на дні пробірки залишається еритроцитна маса, з якої готують 2 - 3% завис окремо кожної групи.

Досліджувану сироватку в кількості 0,5 мл розводять у чотири рази 0,9% розчином натрію хлориду, щоб уникнути коагуляції під час нагрівання, потім розливають порівну в дві пробірки, одну з них прогрівають протягом (10 +- 1) хв. при температурі +(70 +- 0,5) град. C, точно дотримуючи температуру і час.

Таким чином, отримуємо дві порції сироватки - нативної і прогрітої, кожна з яких розведена 1:4.

Визначення антитіл починається реакцією аглютинації в сольовому середовищі в маленьких пробірках. Якщо цим методом повних імунних антитіл не виявлено, дослідження далі доповнюють непрямою пробою Кумбса.

Під час дослідження сироватки групи A(II) або B(III) в штативі розміщують в один ряд 12 маленьких пробірок. У разі дослідження сироватки групи 0(I) - два ряди по 12 пробірок. Штатив попередньо накривають аркушем паперу, в якому проколюють отвори для пробірок. У разі дослідження крові вагітної жінки використовують для дослідження еритроцити її чоловіка. Під час дослідження сироватки породіллі використовують еритроцити її дитини.

На папері надписують прізвище і групу крові особи, чию сироватку досліджують, групу крові стандартних еритроцитів і на кожній пробірці - ступінь розведення сироватки (1:4; 1:8; 1:16 і т. д. до 1:8000).

У всі пробірки кожного ряду, починаючи з другої, накапують по 2 краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Потім у першу і в другу пробірки (кожного ряду) накапують по дві краплі приготовленої непрогрітої сироватки, розведеної в чотири рази.

У другій пробірці кожного ряду сироватку змішують з 0,9% розчином натрію хлориду і дві краплі цієї суміші переносять у третю пробірку, з третьої (також після перемішування) - в четверту і т. д. до останньої, з якої дві краплі виливають. Таким чином у пробірках утворюється розведення сироватки від 1:4 до 1:8000.

У другому штативі готують розведення попередньо прогрітої сироватки, за такої умови достатньо розмістити по 6 пробірок (розведення сироватки від 1:4 до 1:128).

Після приготування розведеної сироватки у всі пробірки додають по одній краплі 2 - 3% завису стандартних еритроцитів іншої групи: якщо досліджується сироватка групи B(III) - еритроцити групи A(II), якщо сироватка A(II) - еритроцити групи B(III) і у разі дослідження сироватки групи 0(I) в один ряд пробірок додають еритроцити групи A(II), а в другий ряд - еритроцити групи B(III).

Вміст пробірок старанно перемішують, після чого штативи залишають в спокої на 1 год.: з нативною сироваткою - при кімнатній температурі, з прогрітою - при температурі 37 град. C.

Результат оцінюють за формою осаду еритроцитів на дні пробірки, проглядаючи його над джерелом світла через лупу з 6 - 8-кратним збільшенням.

За наявності аглютинації осад розміщується у вигляді грудочок нерівномірним шаром із зігнутими, інколи загорнутими всередину, краями. За умови відсутності аглютинації осад еритроцитів розміщується рівномірним шаром у центрі дна пробірки у вигляді правильно окресленого кола.

Результати зазначають на папері біля кожної пробірки знаком (+) або (-).

Наявність аглютинації свідчить про присутність повних антитіл, а останнє розведення, у якому вона спостерігається, - про їх титр.

Титр антитіл нативної (не прогрітої) сироватки відноситься до аглютинінів (a(альфа) і b(бета), титр антитіл в прогрітій сироватці - до імунних антитіл анти-A (або анти-B).

У тому випадку, коли аглютинація спостерігається у всіх пробірках, дослідження треба повторити, продовжуючи розведення сироватки.

Негативний результат у всіх пробірках з прогрітою сироваткою свідчить про відсутність повних імунних антитіл.

Стандартні еритроцити A(II) і B(III) двічі відмивають 0,9% розчином натрію хлориду (п. 1.1), після чого на дні пробірок залишаються еритроцити, які використовують для дослідження.

У разі дослідження сироватки A(II) або B(III) в штатив вставляють 6 пробірок, при дослідженні сироватки групи 0(I) - два ряди по 6 пробірок. Пробірки нумерують. Штатив попередньо накривають аркушем паперу, в якому роблять отвори для пробірок. На папері роблять позначки, вказуючи на кожній пробірці її номер та всі інші відомості, як сказано вище, для реакції сольової аглютинації.

У всі пробірки, починаючи з N 2, накапують по три краплі (0,15 мл) 0,9% розчину хлориду натрію, а потім у пробірки N 1 і N 2 - по три краплі (0,15 мл) досліджуваної, заздалегідь прогрітої, сироватки і далі готують її розведення, як це зазначено вище, для методу сольової аглютинації, але в об'ємі трьох крапель.

У всі пробірки пастерівською піпеткою додають по одній маленькій краплі (0,01 мл) еритроцитів іншої групи, змішують сироватку з еритроцитами і штатив ставлять для інкубації в термостат на 45 хв. при температурі 37 град. C. За цей час імунні антитіла, якщо вони є в сироватці, фіксуються на еритроцитах.

Після інкубації відмивають еритроцити, для чого в пробірки доливають 0,9% розчин натрію хлориду, перемішують вміст і центрифугують при швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Надстійну рідину відливають. Таке відмивання повторюють тричі (при об'ємі пробірок 10 мл достатньо дворазового відмивання).

Після відмивання в кожну пробірку додають 3 - 5 (0,15 - 0,25 мл) крапель 0,9% розчину натрію хлориду для одержання приблизно 5% завису еритроцитів і з кожної пробірки по одній краплі такого завису переносять на білу пластинку, яка має змочувану поверхню, пронумерувавши попередньо місця на пластинці відповідно до номерів пробірок. До кожної краплі додають по одній краплі сироватки для проби Кумбса і перемішують їх скляною паличкою. Далі протягом 10 хв. спостерігають результат при періодичному похитуванні пластинки.

2.5. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації, яку видно неозброєним оком на білому тлі пластинки. Настання аглютинації позначають на папері на кожній пробірці знаком "+" із зазначенням часу її прояву в хвилинах і секундах. Відсутність аглютинації позначають знаком "-".

Наявність аглютинації свідчить про присутність імунних антитіл анти-A або анти-B неповної форми, а останнє розведення, в якому воно спостерігається, - про їх титр. Оскільки непряма проба Кумбса ставиться як доповнення тільки при хибно-негативному результаті в сольовому середовищі, контроль щодо можливого хибно-позитивного результату за рахунок повних антитіл проводити немає необхідності.

У тому випадку, якщо аглютинація спостерігається у всіх пробірках, слід повторити дослідження, продовживши розведення сироватки.

Негативний результат у всіх пробірках свідчить про відсутність імунних антитіл неповної форми в даній порції досліджуваної сироватки.

У ході вищеописаних досліджень визначають три види антитіл:

- нормальні повні антитіла-аглютиніни a(альфа) і b(бета) (термолабільні);

- імунні повні антитіла анти-A і анти-B (термостабільні);

- імунні неповні антитіла анти-A і анти-B (термостабільні).

Загальне заключення роблять на основі співставлення результатів усіх досліджень:

а) наявність імунних (термостабільних) антитіл повної або неповної форми свідчить про те, що мало місце попадання в організм людини антигену, несумісного за системою AB0. Титр цих антитіл звичайно буває нижчим, ніж нормальних повних (термолабільних) ізоантитіл a(альфа) і b(бета), найчастіше 1:8 - для імунних повних антитіл і 1:32 - для імунних неповних антитіл;

б) високий титр нормальних повних антитіл-ізоаглютинінів a(альфа) і b(бета) (a вище за 1:256 і b(бета) вище за 1:128 за даного методу дослідження) навіть за відсутності імунних термостабільних антитіл у момент дослідження свідчить про стан підвищеної сенсибілізації організму і дозволяє зробити припущення про попередні надходження антигену, несумісного за системою AB0;

в) відсутність імунних термостабільних антитіл анти-A і анти-B у разі титру нормальних антитіл a(альфа) не вище за 1:256 і b(бета) не вище за 1:128 (за даним методом дослідження) свідчить про відсутність у людини ізоімунізації груповими факторами системи AB0 до моменту даного дослідження.

Сироватки з імунними повними гемаглютинуючими антитілами від алоімунізованих донорів можуть бути використані для визначення груп крові за системою AB0 як стандартні типуючі реагенти.

Гемолізини - антиеритроцитарні антитіла класу IgG, імунної природи, які здатні активувати систему комплементу, викликаючи гемоліз еритроцитів. Найчастіше вони виявляються вперше у вагітних жінок з групою крові 0(I), коли чоловік має групу крові A(II), або B(III), або AB(IV), і тоді антитіла мають характеристику відповідно: анти-A або анти-B імунних гемолізинів. У вперше вагітних жінок з групою крові A(II) можлива поява анти-B гемолізинів (якщо чоловік має групу крові B(III) або AB(IV), але вірогідність імунізації значно менша. Якщо вагітна має групу крові B(III), а чоловік - A(II) або AB(IV), то можлива поява анти-A імунних гемолізинів, але ще з меншою вірогідністю.

У лабораторних умовах гемолізини виявляють шляхом реакції досліджуваної сироватки з тест-еритроцитами в присутності комплементу (проба на виявлення гемолізинів є комплементзалежною реакцією).

4.1.1. Обладнання: пробірки скляні, пастерівські піпетки, вата, штативи лабораторні, термостат, центрифуга ЦКЛ, холодильник побутовий, водяна баня.

Реагенти: усе необхідне для визначення груп крові за системою AB0 (перехресним методом) та резус, досліджувана сироватка, еритроцити:

а) панель стандартних еритроцитів усіх груп крові за системою AB0;

б) еритроцити чоловіка (для вагітних) або дитини (для породіль);

в) еритроцити досліджуваної особи;

г) 0,9% розчин натрію хлориду, комплемент або щойно одержана сироватка крові як його джерело або від людини, що має AB(IV) групу крові, або від кролика або від гвінейської свинки.

Комплемент застосовують у тому випадку, коли досліджувана сироватка зберігалась більш як 48 год. до моменту дослідження, і внаслідок цього активність комплементу знизилась або зникла. Через це можливий псевдонегативний результат.

4.2.1. Спочатку визначають групову та резус-належність досліджуваної особи, а також групову належність тест-еритроцитів (донорів, чоловіка, дитини), якщо вони не відомі.

4.2.2. У штатив вміщують три ряди пробірок (відалівських або звичайних). Якщо досліджувана сироватка відноситься до 0(I) групи, тобто має ізогемаглютиніни a(альфа) + b(бета), то слід встановити 4 ряди пробірок:

1 ряд (дослід) - 10 пробірок;

2 ряд (контроль еритроцитів) - за кількістю зразків тест-еритроцитів;

3 ряд (контроль комплементу) - 1 - 2 пробірки.

Обов'язково ставлять контроль досліджуваної сироватки з тестеритроцитами донора 0(I) групи.

4.2.3. Готують 5% завис тричі відмитих еритроцитів:

а) чоловіка або дитини;

б) донорських еритроцитів 0(I), A(II), B(III) груп.

Щоб одержати 5% завис, у пробірці сполучають 0,25 мл відмитих еритроцитів з 5 мл 0,9% розчину натрію хлориду, або спрощено: 1 краплю тест-еритроцитів поєднують з 19 краплями 0,9% розчину натрію хлориду.

4.2.4. Дослідження починають з того, що в першу пробірку 1 ряду штативу вносять 3 краплі цільної сироватки, а в усі наступні - по 3 краплі ізотонічного розчину натрію хлориду.

У другу пробірку 1 ряду вносять 3 краплі цільної сироватки і починають її титрувати, переносячи з 2-ї в 3-ю пробірку по 3 краплі суміші досліджуваної сироватки з 0,9% розчином натрію хлориду і так до кінця ряду - із 3-ї в 4-ту, із 4-ї в 5-ту ..., а з останньої пробірки 3 краплі виливають. У результаті одержують розведення сироватки: цільна, 1:2; 1:4; 1:8; 1:16 і т. д. до 1:512.

4.2.5. У всі пробірки 1-го ряду вносять по 1 краплі 5% завису тест-еритроцитів (донора, чоловіка або дитини).

Під час виконання проби слід додержуватись такого правила: вносити краплю еритроцитів просто в сироватку, а не давати їй стікати по стінках пробірки; у такому разі можливі сліди гемолізу внаслідок підсихання еритроцитів.

4.2.6. Якщо пробу виконують з комплементом, то досліджувану сироватку прогрівають на водяній бані при температурі 56 град. C протягом 30 хв., після чого титрують (п. 5.2.4), в усі пробірки додають завис еритроцитів (1 краплю) і комплемент (по 3 краплі в кожну пробірку).

4.2.7. Пробірки 2-го ряду в штативі призначені для контролю еритроцитів: 1 крапля 5% завису тест-еритроцитів + 3 краплі 0,9% розчину натрію хлориду. Контролю піддають всі зразки тест-еритроцитів, що були в дослідженні.

4.2.8. Пробірки 3-го ряду - контроль комплементу. В пробірку вносять 1 краплю 5% завису тест-еритроцитів і додають 3 краплі комплементу. Контроль комплементу здійснюють на всіх зразках тест-еритроцитів, які були в дослідженні. Якщо досліджується свіжа сироватка хворого і комплемент не використовується, то 3-й ряд пробірок в штатив не ставиться.

4.2.9. 4-й ряд пробірок у штативі - обов'язковий контроль досліджуваної сироватки з тест-еритроцитами донора 0(I) групи крові. В пробірку вносять 1 краплю 5% завису тест-еритроцитів 0(I) групи крові від інтактного донора і додають 3 краплі досліджуваної суцільної сироватки.

4.2.10. Штатив струшують і ставлять у термостат при температурі 37 град. C на 1 год. для інкубації.

4.2.11. Після інкубації пробірки виймають з термостата, струшують та центрифугують 1 хв. при швидкості обертання ротора від 1000 до 1500 об./хв. при кімнатній температурі.

Результати реакції враховують візуально за наявністю або відсутністю гемолізу. Завдяки тому, що дослідження проводили у різних розведеннях, є можливість визначити титр ізоімунних гемолізинів при позитивній реакції. Титром імунних гемолізинів вважають те розведення сироватки, де спостерігається гемоліз. Виразність реакції (інтенсивності гемолізу) оцінюють за плюсовою системою.

Реакція позитивна (+++): на дні пробірки осаду немає, надосадова рідина інтенсивно забарвлена в червоний колір.

Реакція позитивна (++): на дні пробірки невеликий осад, надосадова рідина має значний шар забарвленої рідини.

Реакція позитивна (+): на дні пробірки осад значний, над ним тонкий шар ледве забарвленої рідини.

Реакція негативна (-): усі еритроцити знаходяться на дні пробірки, надосадова рідина незабарвлена.

Контроль: у контрольних пробірках гемолізу не повинно бути. Якщо він є, необхідно повторити дослідження, додержуючись методики, та додатково залучити інші реагенти.

4.4. Приклад формулювання відповіді (результату аналізу)

4.4.1. У досліджуваній сироватці крові (прізвище та ініціали) виявлено імунні гемолізини до еритроцитів (чоловіка, дитини, донора - непотрібне викреслити) анти-A або анти-B в титрі... ("+" або "++" або "+++").

4.4.2. У досліджуваній сироватці крові (прізвище та ініціали) імунні гемолізини до еритроцитів (чоловіка, дитини, донора - непотрібне викреслити) анти-A або анти-B не виявлено.

Резус-антитіла належать до ізоімунних антитіл, яких в нормі немає в сироватці людини, а з'являються в крові резус-негативних людей тільки внаслідок імунізації.

Умовами, що сприяють утворенню антитіл, є введення резус-негативній людині резус-позитивної крові або вагітність резус-негативної жінки резус-позитивним плодом.

Визначення резус-антитіл разом з визначенням резус-належності хворого і донора необхідне для запобігання імунному конфлікту внаслідок переливання резус-несумісної крові, а також для діагностики резус-конфлікту вагітних і можливого захворювання плода або новонародженого на гемолітичну хворобу.

Визначення резус-антитіл важливе також при відборі матеріалу для приготування сироватки анти-резус.

Резус-антитіла бувають різні за специфічністю: анти-D(Rh0), антиC(rh'), анти-E(rh''), анти-c(hr'), анти-e(hr'') і за формою: повні і неповні.

Специфічність антитіл визначається тим, з якими із резус-антигенів вони реагують. Форма антитіл визначається тим, яким чином вони реагують з еритроцитами, що несуть на собі специфічні для них резус-антигени.

Повні антитіла, що з'єднуються з резус-антигенами еритроцитів, викликають аглютинацію (склеювання) цих еритроцитів під час реакції в сольовому середовищі. Неповні антитіла в цих умовах тільки з'єднуються з еритроцитами, але не викликають аглютинації, так що зовні ця реакція нічим не проявляється.

Для того, щоб встановити, чи пройшла реакція між неповними резус-антитілами і еритроцитами, необхідні спеціальні умови, зокрема, додавання колоїдних розчинів (желатину, поліглюкіну) або використання сироватки для проби Кумбса, яка реагує з імуноглобулінами людини (непряма проба Кумбса). За всіх зазначених умов реакція між резус-антитілами і еритроцитами, що мають резус-антиген, у кінцевому результаті також проявляється у вигляді аглютинації еритроцитів.

Різні методи визначення резус-антитіл вимагають різних оптимальних для них температурних умов.

З метою забезпечення трансфузійної терапії, профілактики посттрансфузійних ускладнень гемолітичного типу необхідно проводити переливання крові, беручи до уваги алосенсибілізацію донорів і реципієнтів антигенами еритроцитів.

Кров донорів, вагітних жінок і хворих рекомендовано досліджувати на наявність антитіл до антигенів еритроцитів незалежно від їх резус-належності. Якщо виявлено антитіла, цільну кров або плазму донора не можна використовувати для переливання.

Титр і специфічність виявлених антитіл досліджують під час кожної кроводачі. Донори, які не мають в сироватці антитіл до антигенів еритроцитів, проходять кожен рік повторне дослідження.

Первинне дослідження антитіл у крові донорів здійснюють лабораторії закладів служби крові з допомогою реакції конглютинації з 10% розчином желатину та сумішшю еритроцитів 3 - 5 донорів групи 0(I) Rh+ і 3 - 5 донорів 0(I) Rh- з оцінкою результату під мікроскопом.

У тому випадку, коли антитіла до антигенів еритроцитів виявляли (або не виявляли, але в анамнезі були множинні гемотрансфузії або ускладнення вагітності), дослідження антитіл повторювали в антиглобуліновому тесті в лабораторії, яка має панель типованих еритроцитів.

У разі імунізації резус-негативних людей повторними трансфузіями крові або під час вагітності утворюються антитіла анти-D(Rh0), але за цих умов можуть утворюватись і інші резус-антитіла.

Тому під час визначення антитіл у сироватці крові людини цю сироватку досліджують зі стандартними резус-позитивними еритроцитами, що обов'язково мають три резус-антигени: D(Rh0), C(rh'), E(rh'').

Якщо антигени C(rh') і E(rh'') в еритроцитах спеціально не визначали, то число резус-позитивних зразків повинно бути не менше 20 для того, щоб серед них обов'язково зустрілись ці три резус-антигенти.

Як контроль на специфічність реакції, а також для виявлення антитіл анти-c(hr') і e(hr'') в дослідження включають стандартні резус-негативні cde(rh0) еритроцити і, якщо можливо, власні еритроцити особи, сироватку якої досліджують.

Таке дослідження є попереднім. Для уточнення специфічності потрібні додаткові специфічні дослідження.

Найчастіше у разі імунізації факторами групи Rh утворюються неповні антитіла; інколи одночасно з ними утворюються і повні. Крім того, зустрічаються випадки, коли у людини утворюються тільки повні резус-антитіла.

Тому визначення резус-антитіл слід проводити не менш як двома методами, одним з яких обов'язково повинен бути метод сольової аглютинації, що виявляє повні антитіла, а другий - будь-який метод, що виявляє неповні антитіла.

Існують різні методи дослідження сироваток. З них непряма проба Кумбса, реакція із застосуванням желатину і реакція із застосуванням поліглюкіну виявляють неповні резус-антитіла, і з цією метою може бути використаний будь-який з них.

Метод дослідження сироватки в сольовому середовищі виявляє повні резус-антитіла і обов'язково має використовуватись одночасно з будь-яким із згаданих вище.

Кров для приготування еритроцитів беруть у кількості 0,5 - 1,0 мл у звичайні пробірки місткістю не менше 10 мл, в які налито 0,25 мл 3,8 - 5,0% розчину натрію цитрату. Пробірки нумерують і пишуть на них прізвище, ініціали, групу крові і резус-належність особи, від якої взято кров. Пробірки доливають доверху 0,9% розчином натрію хлориду, потім вміст пробірок перемішують, центрифугують і відсмоктують відмивну рідину. Таке відмивання повторюють двічі.

Після відмивання на дні пробірки залишаються відмиті еритроцити, які і застосовують для дослідження сироватки.

2.2.1. В штатив вставляють і нумерують пробірки за числом і нумерацією зразків еритроцитів, з якими досліджують сироватку.

2.2.2. У всі пробірки вводять по 3 краплі (0,15 мл) досліджуваної сироватки.

2.2.3. З дна кожної пробірки, що містить відмиті стандартні еритроцити, дуже тонкою пастерівською піпеткою набирають 1 маленьку краплю (0,01 мл) еритроцитів і переносять її в пробірку з досліджуваною сироваткою відповідно з нумерацією пробірок.

2.2.4. Вміст пробірок старанно перемішують шляхом струшування і ставлять для інкубації в термостат на 45 хв. при температурі 37 град. C. За цей час резус-антитіла, якщо вони є в досліджуваній сироватці, фіксуються на еритроцитах.

2.2.5. Після інкубації в пробірки доливають доверху ізотонічний розчин натрію хлориду, вміст пробірок перемішують і центрифугують за швидкості ротора 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого надосадову рідину відсмоктують. Таке відмивання еритроцитів повторюють 3 - 4 рази.

2.2.6. У кожну пробірку до відмитих таким чином еритроцитів додають 4 - 7 крапель ізотонічного розчину натрію хлориду для одержання 5% завису.

2.2.7. Одну краплю (0,05 мл) завису еритроцитів із кожної пробірки переносять на білу порцелянову або будь-яку іншу білу пластинку зі змочуваною поверхнею і до кожної краплі додають по одній краплі (0,05 мл) сироватки, заготовленої для проби Кумбса.

2.2.8. Сироватку старанно перемішують з еритроцитами (скляною паличкою або кутом предметного скла), після чого пластинку злегка похитують, спостерігаючи результат (наявність або відсутність аглютинації еритроцитів).

Аглютинація звичайно починається протягом 10 - 30 сек., але при низькому титрі резус-антитіл може настати значно пізніше, тому спостереження слід продовжувати до 20 хв.

Аглютинація в цих випадках відбувається внаслідок того, що сироватка для проби Кумбса з'єднується з антитілами, а поскільки останні фіксовані на еритроцитах, то еритроцити також втягуються в реакцію, яка проявляється у вигляді аглютинації.