Про затвердження інструкцій, регламентуючих діяльність закладів служби крові України

На виконання рішення колегії МОЗ України від 03.11.98 N 11 "Проблеми гематології, служби крові, профілактики СНІДу в донорстві та запобігання розповсюдженню туберкульозу" та з метою регламентації діяльності закладів служби крові України

1. Затвердити:

1.1. Інструкцію з визначення груп крові за системами AB0 та резус (додається).

1.2. Інструкцію з фракціонування донорської крові на її компоненти (плазма, еритроцити, тромбоцити, лейкоцити) та їх консервування (додається).

1.3. Інструкцію з донорського плазмаферезу (додається).

1.4. Інструкцію з контролю стерильності консервованої крові, її компонентів, препаратів, консервованого кісткового мозку, плазмозаміщуючих та консервуючих розчинів, умов їх заготівлі (додається).

1.5. Інструкцію з переливання крові та її компонентів (додається).

2. Інструкції ввести в дію з 01.11.99 року.

3. Міністру Автономної Республіки Крим, начальникам управлінь охорони здоров'я обласних, Київської та Севастопольської міських державних адміністрацій забезпечити в підвідомчих закладах служби крові доведення, впровадження та неухильне виконання інструкцій, регламентуючих діяльність закладів служби крові.

4. Вважати такими, що втрачають чинність:

4.1. "Инструкцию по определению группы крови системы AB0 при помощи стандартных изогематоглютинирующих сывороток", затверджена МОЗ СРСР 07.09.90 N 05-М/27.

4.2. "Инструкцию по фракционированию консервированной крови на клеточные компоненты и плазму", затверджена МОЗ СРСР 11.06.87 N 06-14/24.

4.3. "Инструкцию по применению плазмафереза", доповнення N 1 до наказу МОЗ СРСР від 15.02.72 N 132.

"Инструкцию по применению двукратного плазмафереза", затверджена МОЗ СРСР N 06-14/18 1979 р.

4.4. "Инструкцию по контролю стерильности консервированной крови, ее компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов", затверджена МОЗ СРСР 22.06.89 N 04-14/21-14.

4.5. "Инструкцию по переливанию крови и ее компонентов", затверджена МОЗ СРСР 03.12.88 р.

5. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Міністра В.Л.Весельського.

Групи крові у людини - це система антигенів еритроцитів, яка представлена олігосахаридними структурами, зв'язаними з білками оболонки еритроцитів, котрі здатні викликати утворення специфічних антитіл і вступати з ними в реакцію. Антигенна структура еритроцитів (фенотип) є генетично визначеною (генотип). Характерною властивістю групових антигенів є їх здатність до стимуляції продукції відповідних до них антитіл у людей, які не мають цього антигену. В трансфузіологічній серології відрізняються два типи групових антитіл: природні та імунні.

Відомо більше 20 систем еритроцитарних антигенів. Однак практичне значення мають система AB0 та система Rh, оскільки вони найчастіше є причиною важких посттрансфузійних ускладнень, і їх необхідно, в першу чергу, враховувати при гемотрансфузіях.

Система AB0 представлена двома груповими антигенами A і B (аглютиногенами) та груповим олігосахаридом H, останній знаходиться на еритроцитах групи 0 і не має антигенної детермінанти. У межах антигену A спостерігається дальша антигенна диференціація на підгрупи A1, A2 та інші. Різновиди антигену B з'являються дуже рідко. У сироватці крові людей без відповідного антигену наявні природні (постійні, регулярні) антитіла класу IgM до групових антигенів A і B - анти-A (алоаглютинін, ізоаглютинін, гемаглютинін a(альфа) та анти-B (алоаглютинін, ізоаглютинін, гемаглютинін b(бета). Таким чином, різні співвідношення групових антигенів еритроцитів та алоантитіл (ізоаглютинінів) сироватки крові дають чотири групи крові:

Імунні антитіла анти-A чи анти-B, найчастіше класу IgG з'являються в результаті переливань груповонесумісної крові або внаслідок імунізації матері груповими антигенами плода. Природні та імунні групові антитіла відрізняються рядом фізико-хімічних і біологічних властивостей, з яких найбільше значення мають здатність проходити через плаценту, оптимальна температура та оптимальне середовище реакції з антигенами, теплова чутливість.

Визначення груп крові за системою AB0 грунтується на феномені аглютинації з використанням двох методичних підходів:

1. На еритроцитах визначають наявність антигенів A, B за допомогою:

а) стандартних сироваток із специфічними ізоаглютинінами;

б) моноклональних антитіл (МКА);

2. У сироватці визначають наявність ізоаглютинінів a(альфа) та b(бета) за допомогою стандартних еритроцитів відомої групи крові.

Визначення групи крові у людей проводять лікарі-лаборанти спеціалізованих і відповідно сертифікованих лабораторій з наступним записом результатів в спеціальний журнал та внесенням їх у вигляді штампу в паспорт (згідно діючої інструкції). При надходженні на стаціонарне лікування, первинне визначення групи крові виконують спеціально підготовлені лікарі-лаборанти централізованих (клінічних) лабораторій. Результат визначення групи крові записують у спеціальний журнал та на бланк з вказанням дати та за підписом особи, яка проводила визначення. Цей бланк підклеюють до карти стаціонарного хворого. Крім того, результат, який вказаний на цьому бланку, лікуючий лікар фіксує на титульній сторінці і скріплює підписом з вказанням дати. Доцільно звірити результат з попередніми даними (паспорт, історія хвороби).

У невідкладних випадках, коли хворому необхідна термінова трансфузія компонентів крові, а визначення групи крові лікарем-лаборантом неможливо організувати, визначення групи крові проводить лікуючий лікар з обов'язковим наступним наданням пробірки з кров'ю хворого в лабораторію для остаточного визначення групової належності.

Визначення групи крові в усіх випадках проводиться за допомогою стандартних сироваток обов'язково двох серій кожної групи або моноклональних антитіл. В сумнівних випадках додатково перевіряють присутність ізоаглютинінів за допомогою стандартних еритроцитів.

Групу крові у донорів визначають лікар або лікар-лаборант 2 рази: один раз, коли донор вперше звернувся (за допомогою стандартних сироваток двох різних серій кожної групи або МКА), і другий раз підчас остаточного зарахування в донори (перехресним методом, тобто одночасно за допомогою МКА, стандартних сироваток двох різних серій кожної групи і стандартних еритроцитів). Результат обох визначень записують на титульній сторінці особового журналу та облікової карти донора з вказанням дати і за підписом осіб, що визначали групу крові. В подальшому група крові у донорів визначається під час кожної наступної кроводачі два рази, як зазначено раніше.

1.1. Стандартні сироватки груп 0(I), A(II), B(III)

Стандартні сироватки груп 0(I), A(II), B(III) двох різних серій кожної групи і стандартна сироватка групи AB(IV). Стандартні сироватки для визначення груп крові виготовляють спеціальні лабораторії при установах служби крові. Сироватки зберігають у холодильнику при температурі + (6 +- 2) град. C. Термін зберігання сироватки вказаний на етикетці.

Вихідний контроль якості стандартних сироваток здійснює відділ технічного контролю закладів служби крові, державний контроль лабораторії Державного контролю за якістю препаратів крові та кровозамінників Київського НДІ гематології та переливання крові і Львівського НДІ патології крові та трансфузійної медицини.

1.2 Стандартні еритроцити підгруп 0(I), A(II), B(III)

Стандартні еритроцити готують із крові донорів (див. Інструкцію щодо забору і обліку крові, яку отримують від донорів малими дозами для приготування стандартних еритроцитів). Кров від донорів беруть у кількості 2 - 4 мл у пробірку, що містить 0,25 - 0,50 мл 3,8% або 5,0% розчину натрію цитрату, або гепарин, або консервант крові. Далі в пробірку (на 10,0 мл) до верху доливають 0,9% розчин натрію хлориду, перемішують її вміст і центрифугують протягом 5 хв. при швидкості обертання ротора 1500 об./хв., або відстоюють до повного осадження еритроцитів. Надосад зливають, додають 0,9% розчин натрію хлориду до початкового об'єму крові і використовують як стандарт при визначенні групи крові перехресним методом. Стандартні еритроцити зберігають у холодильнику при температурі + (6 +- 2) град. C. Термін зберігання - до 3 діб.

Стандартні тест-еритроцити можна одержати в готовому вигляді в закладах служби крові, які виготовляють ці стандарти.

1.3. Моноклональні антитіла анти-A, анти-B, анти-AB.

1.4. Ізотонічний (0,9%) розчин натрію хлориду.

1.5. Білі порцелянові або інші пластини, предметні скельця з змочуваною поверхнею.

1.6. 3,8% - 5% розчин натрію цитрату, гепарин, консервант крові.

1.7. Пробірки.

1.8. Піпетки.

1.9. Скляні палички.

1.10. Вата гігроскопічна.

Визначення проводять у приміщенні з задовільним освітленням при температурі від +15 до +25 град. C. Використовують цільну кров, відмиті еритроцити, еритроцити в плазмі, сироватці або в 0,9% розчині натрію хлориду. У хворих на анемію кров стабілізують гепарином.

2.1.1. Позначити на площині групу крові зліва направо "0", "A", "B".

2.1.2. Під відповідними позначками нанести по одній великій краплі (0,1 мл) кожної сироватки двох серій.

2.1.3. Поряд з кожною сироваткою нанести по 1 маленькій краплі (0,01 мл) досліджуваної крові (еритроцитів).

2.1.4. Змішати окремими скляними паличками кожну краплю крові (еритроцитів) з відповідною сироваткою.

2.1.5. Змішавши всі краплі, пластину погойдують, потім на 1 - 2 хв. залишають у спокої і знову погойдують. Спостереження за ходом реакції проводять не менше як 5 хв., хоча аглютинація починається вже протягом перших 10 - 30 с. Спостереження необхідно продовжувати далі - до 5 хв., тому що можлива пізня аглютинація, наприклад, з еритроцитами групи A2.

2.1.6. Через 3 - 4 хв. до крапель суміші сироватки з еритроцитами, де відбулась аглютинація, додають по 1 краплі (0,05 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і продовжують спостерігати до 5 хв. при періодичному погойдуванні пластини.

Реакція ізогемаглютинації в кожній краплі може бути позитивною і негативною.

У разі позитивної реакції (звичайно протягом перших 10 - 30 сек. від початку змішування) в суміші з'являються видимі неозброєним оком дрібні червоні зернятка (аглютинати), які складаються з склеєних еритроцитів. Дрібні зернятка поступово склеюються в більш великі зерна, а інколи - в пластівці неправильної форми, в результаті чого сироватка зовсім або частково знебарвлюється.

У разі негативної реакції рідина весь час (5 хв.) залишається рівномірно забарвленою і в ній не спостерігається зернистості (аглютинатів).

Результати реакції в краплях з сироватками однієї і тієї ж групи (двох серій) мають співпадати.

Результати реакцій з сироватками трьох груп: 0(I), A(II) і B(III) можуть дати чотири різні комбінації (табл. 1).

2.3.1. Визначення групи крові перехресним методом базується на паралельному визначенні наявності або відсутності групових антигенів на еритроцитах і наявності або відсутності групових ізоаглютинінів у сироватці обстежуваної крові. Паралельне визначення ізоаглютинінів у сироватці з стандартними еритроцитами A та B обов'язкове у донорів і реципієнтів.

2.3.2. Для визначення групи крові використовують стандартні сироватки груп 0a(альфа)b(бета)(I), Ab(бета)(II) і Ba(альфа)(III) двох серій кожної групи, сироватку групи AB0(IV) і стандартні еритроцити груп 0(I), A(II) і B(III).

2.3.3. Під відповідними позначками груп крові на пластинку наносять по одній великій краплі (0,1 мл) стандартних сироваток груп 0(I), A(II) і B(III) послідовно зліва направо.

2.3.4. На нижню частину пластинки (третій ряд) під відповідними написами наносять по одній маленькій (0,01 мл) краплі стандартних еритроцитів у такій послідовності зліва направо: 0(I), A(II) і B(III) (табл. 2).

2.3.5. З пробірки, що містить кров хворого, піпеткою знімають сироватку і наносять її по одній великій краплі (0,1 мл) на підготовлені стандартні еритроцити (третій ряд). Після цього тією ж піпеткою набирають з дна пробірки еритроцити обстежуваної крові і наносять їх по маленькій краплі (0,01 мл) в 6 точок (другий і перший ряд) - по одній краплі поряд з кожною краплею підготовленої стандартної сироватки.

2.3.6. У всіх краплях сироватку старанно перемішують з еритроцитами сухою скляною паличкою, ретельно промиваючи її 0,9% розчином натрію хлориду і витираючи ватою після кожного перемішування. Пластинку періодично погойдують, проводячи спостереження за ходом реакції протягом 5 хв.

2.3.7. У процесі аглютинації, але не раніше ніж через 3 хв., в ті краплі, в яких вона з'явилася, додають по одній краплі (0,05 мл) 0,9% розчину натрію хлориду і продовжують спостереження при погойдуванні пластинки до 5 хв.

Трактування результатів реакцій проводять за оцінкою і співставленням результатів, отриманих за допомогою стандартних сироваток (два верхні ряди) і за допомогою стандартних еритроцитів (нижній ряд).

Результати реакцій, отриманих за допомогою стандартних сироваток і стандартних еритроцитів, повинні співпадати, тобто вказувати на наявність аглютиногенів та аглютинінів відповідно до однієї й тієї ж групи крові. Можливі чотири комбінації результатів (табл. 3).

Примітка. При встановленні групи крові AB(IV) необхідно провести контрольне дослідження цих еритроцитів з сироваткою групи AB(IV). Підтвердженням належності до цієї групи є відсутність аглютинації.

Моноклональні антитіла анти-A та анти-B призначені для визначення груп крові людини за системою AB0 замість стандартних ізогемаглютинуючих сироваток.

Визначення груп крові за системою AB0 у донорів і реципієнтів перехресним методом включає виявлення антигенів A і B в еритроцитах людини за допомогою МКА анти-A та анти-B, виявлення ізоаглютинінів a(альфа) і b(бета) у сироватці або плазмі досліджуваної крові стандартними тест-еритроцитами всіх груп.

Моноклональні антитіла анти-A і анти-B продукуються двома різними гібридомами і є розведеною асцитичною рідиною мишей-носіїв відповідної гібридоми, в якій знаходяться специфічні імуноглобуліни класу M (IgM), спрямовані проти груповоспецифічних антигенів A і B людини.

МКА не мають антитіл іншої специфічності і тому не викликають неспецифічної поліаглютинації еритроцитів.

МКА анти-A та анти-B перевірені всіма поширеними методами визначення груп крові - паралельно з ізогемаглютинуючими сироватками AB0. Результати довели надійність визначення груп крові у разі застосування моноклональних реагентів. Авідність, тобто час настання реакції аглютинації, її яскравість, у МКА анти-A та анти-B набагато вища, ніж у стандартних сироваток, особливо у випадку слабко виражених антигенів еритроцитів.

Визначення груп крові за системою AB0 проводиться в крові, як стабілізованій за допомогою консервантів (глюгіцир, цитроглюкофосфат, гепарин, натрію цитрат), так і в крові без консерванту. Визначення групи крові проводять у приміщенні з добрим освітленням при температурі від +15 до +25 град. C.

Реагенти не можна зберігати у відкритому вигляді, тому що у разі висихання активність антитіл знижується. Заборонено користуватися реагентами, якщо в них знаходяться нерозчинні пластівці або є помутніння. Для кожного реагенту використовують свою маркіровану (анти-A або анти-B) піпетку.

Визначення групи крові за системою AB0 реагентами МКА проводять звичайними методами виявлення антигенів еритроцитів під час масового визначення в установах служби крові - на планшетах або автоматичних системах, у разі індивідуального визначення - на білій порцеляновій або будь-якій іншій пластинці зі змочуваною поверхнею.

Беручи до уваги високу активність і авідність реагентів МКА, а також повну їх стандартність, для кожного визначення групи крові (крім випадку, коли група крові визначається вперше) достатньо застосовувати по одній серії реагентів анти-A і анти-B. У такому випадку необхідно використовувати МКА анти-AB, оскільки цей реагент служить додатковим контролем. Якщо реагенту анти-AB немає, слід проводити визначення двома серіями МКА анти-A і анти-B.

На планшет або пластинку МКА анти-А і анти-В наносять по одній великій краплі (0,1 мл) під відповідними написами: "анти-A" або "анти-B". Поряд з краплями антитіл наносять досліджувану кров по одній маленькій краплі, приблизно в 10 разів меншій від краплі антитіл (0,01 мл).

Під час визначення групи крові на планшеті антитіла і кров змішують ретельно вимитою сухою кулькою, погойдуючи планшет; у разі визначення на пластинці - скляною паличкою, яку промивають і насухо витирають після розмішування кожної краплі. Спостереження за перебігом реакцій з МКА проводять за легкого погойдування пластинки чи планшета не більше 3 хв. Результат реакції в кожній краплі може бути позитивним або негативним. Позитивний результат виражається в аглютинації (склеюванні) еритроцитів. Аглютинати помітні неозброєним оком у вигляді дрібних червоних агрегатів, що швидко зливаються і утворюють більші пластівці аж до великого аглютинату.

У разі негативної реакції крапля залишається рівномірно забарвленою, аглютинати в ній не виявляються. Аглютинація з МКА анти-A і анти-B звичайно настає в перші 3 сек.

Оцінку результатів реакції аглютинації з МКА анти-A і анти-B представлено в табл. 4, в яку також включено результати визначення ізоаглютинінів в сироватці (плазмі) реципієнтів і донорів за допомогою стандартних тест-еритроцитів.

Можливі чотири комбінації результатів:

3.4.1. Аглютинації немає (-) ні з МКА анти-A, ні з МКА анти-B. Таким чином, досліджувані еритроцити не мають антигенів АК і B, отже кров належить до групи 0(I). Це підтверджується наявністю аглютинінів a(альфа) та b(бета) і в досліджуваній сироватці (плазмі) за результатами позитивної реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами груп A(II) і B(III).

3.4.2. Аглютинація (+) спостерігається тільки з МКА анти-A. Відповідно досліджувані еритроцити містять антиген A, отже кров належить до групи A(II). Це підтверджується наявністю аглютинінів b(бета) в досліджуваній сироватці (плазмі): позитивній реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами групи B(III).

3.4.3. Аглютинація (+) спостерігається тільки з МКА анти-B. Отже, досліджувані еритроцити містять тільки антиген B, і кров належить до групи B(III). Це підтверджується наявністю аглютинінів a(альфа) у досліджуваній сироватці (плазмі): за результатами позитивної реакції аглютинації зі стандартними еритроцитами групи A(II).

3.4.4. Аглютинація (+) спостерігається як з МКА анти-A, так і з МКА анти-B. Відповідно досліджувані еритроцити містять обидва антигени (A і B), отже кров належить до групи AB(IV). Це підтверджується відсутністю аглютинінів a(альфа) та b(бета) у досліджуваній сироватці (плазмі): реакція аглютинації зі стандартними еритроцитами груп A(II) і B(III) негативна.

УВАГА. Для запобігання перехресному забрудненню реагентів не слід плутати піпетки, а використане при дослідженні групи крові обладнання (планшети, пластинки, кульки, палички та ін.) після роботи слід ретельно мити і висушувати.

Реагенти МКА для визначення груп крові виготовлені на 0,9% розчині натрію хлориду, який перешкоджає спонтанній аглютинації еритроцитів. Однак для виключення аутоаглютинації, котра може спостерігатися у деяких хворих (мієломна хвороба, опікова хвороба), а також у пуповинній крові новонароджених, у випадку позитивної реакції аглютинації еритроцитів з обома моноклональними реагентами анти-A і анти-B, тобто встановлення групи крові AB(IV), необхідно провести додаткове контрольне дослідження даного зразка крові з 0,9% розчином натрію хлориду. Для цього змішують одну велику краплю (0,1 мл) 0,9% розчину натрію хлориду з маленькою (0,01 мл) краплею досліджуваної крові. Відсутність аглютинації в досліджуваній крові свідчить, що кров належить до групи AB(IV).

За наявності спонтанної аглютинації (позитивна реакція в контрольній краплі) рекомендується повторити визначення групи крові, використовуючи відмиті еритроцити даного зразка крові.

У випадку розбіжності результатів визначення групи крові у донорів за допомогою МКА і стандартних еритроцитів, використання такої крові для переливання хворим не дозволяється, і кров направляють для детального дослідження до спеціалізованої лабораторії.

Моноклональні реагенти анти-A, анти-B та анти-AB випускаються у флаконах або ампулах по 20, 50, 100 і 200 доз (1 доза = 0,1 мл), в яких, крім реагенту, знаходиться також консервант (0,1% натрію азид) і відповідний барвник.

Термін зберігання - 2 роки в холодильнику при температурі +(6 +- 2) град. C. Реагенти можуть зберігатись протягом одного місяця в темному приміщенні при температурі від 10 до 25 град. C та відносній вологості (65 + 15)%.

Якщо результати двох тестів не співпадають у разі дослідження крові донора, то цю кров не можна використовувати для трансфузії до з'ясування причин неспівпадання. Якщо це явище встановлене в крові реципієнта, якому необхідне термінове переливання крові, то в цьому випадку йому можна перелити резус-сумісну еритроцитну масу групи 0(I) або резус-негативну еритроцитарну масу групи 0(I).

- помилковий порядок розміщення стандартних сироваток або еритроцитів у штативах; помилковий порядок розміщення моноклональних реагентів;

- помилковий порядок нанесення їх на пластинку;

- неправильне співвідношення кількості сироватки і еритроцитів, а також кількості моноклональних реагентів і еритроцитів;

- недотримання часу, необхідного для проведення реакції;

- проведення реакції при температурі в приміщенні, вищій 25 град. C (псевдонегативний результат);

- невикористання контрольної реакції з сироваткою групи AB(IV); або ізотонічного розчину натрію хлориду при роботі з МКА;

- забруднення або використання мокрих піпеток, пластинок, паличок;

- використання недоброякісних стандартів, наприклад, перетермінованих сироваток (недостатньо активних), забруднених або частково висушених, які можуть викликати неспецифічну реакцію аглютинації. Те ж саме відноситься і до моноклональних реагентів.

Поряд з цим слід звернути увагу на режим центрифугування: надмірне центрифугування еритроцитів під час їх відмивання може спричинити псевдопозитивний результат, а недостатнє - псевдонегативний.

У всіх випадках нечіткого або сумнівного результату необхідне повторне визначення групи крові за допомогою стандартних алоімунних сироваток двох серій, моноклональних реагентів, а також перехресним методом.

- слабкі форми антигену A (частіше) або B (рідко).

У цьому випадку сироватка може вміщувати надмірні антитіла, а відповідний антиген на еритроцитах не виявляється. Необхідно провести повторне тестування еритроцитів, використовуючи інші серії реагентів та інший лабораторний посуд. Доцільно також декілька разів відмити досліджувані еритроцити та подовжити час реєстрації реакції. Якщо при повторному визначенні результати знову не співпадають, таку кров слід направляти до спеціалізованої серологічної лабораторії;

- поліаглютинабельність еритроцитів, коли всі AB0-реагенти викликають однакову аглютинацію.

У цьому випадку слід перевірити, чи відбувається аглютинація тестованих еритроцитів у стандартній сироватці групи AB(IV) (якщо типування здійснювали за допомогою алоімунних сироваток) або в 0,9% розчині натрію хлориду (якщо використовували моноклональні антитіла). Поліаглютинацію вдається усунути шляхом повторного відмивання еритроцитів, хоч і не завжди.

Утворення "монетних стовпчиків" можна також прийняти за аглютинацію. У цьому випадку до реагента з еритроцитами слід додати 1 - 2 краплі 0,9% розчину натрію хлориду і погойдати площину - уявна аглютинація звичайно зникає;

- змішана аглютинація (кров'яна химера), коли частина еритроцитів зібрана в аглютинати, а решта - лишається вільною від аглютинації. Найчастіше це явище зустрічається у хворих, або у новонароджених при замінних переливаннях крові, що мають групу крові A, B або AB, яким 1 - 3 місяці тому переливали кров групи 0(I), а також після трансплантації кісткового мозку групи 0(I), рідше - у різногрупних близнюків. Завдяки ретельно зібраному анамнезу, це явище знаходить свої пояснення;

- при гемолітичній хворобі новонароджених, аутоімунних та інфекційних захворюваннях еритроцити хворих можуть спонтанно піддаватися аглютинації ізоімунними сироватками внаслідок сенсибілізації антитілами та комплементом.

У цьому випадку необхідно повторити визначення з моноклональними антитілами та в прямій пробі Кумбса.

- стандартні еритроцити в присутності досліджуваної сироватки утворюють "монетні стовпчики", що імітує позитивний результат.

До тестованої сироватки з еритроцитами слід додати 1 - 2 краплі фізіологічного розчину натрію хлориду та погойдати площину, і "монетні стовпчики" розпадуться, тоді як дійсна аглютинація залишиться сталою. Аномальний результат підтверджує реакція тестованої сироватки з стандартними еритроцитами групи 0(I);

- сироватка не має ізогемаглютинінів. Це спостерігається у новонароджених та у пацієнтів з тяжкими порушеннями імунної системи. Висновок щодо групи крові роблять на підставі дослідження еритроцитів з алоімунними сироватками чи з МКА. У цих випадках єдиним способом для підбору крові є проба на сумісність, якщо немає можливості визначити специфічність антитіл та підібрати типовані еритроцити.

Система резус включає 3 пари антигенів еритроцитів: D(Rh0) і d(Hr0), C(rh') і c(hr'), E(rh'') і e(hr''), які генетично зумовлені і представлені трьома парами алеломорфних генів на парі хромосом. Різні комбінації антигенів системи Rh на поверхні еритроцитів створюють 18 теоретично можливих фенотипів, тобто груп крові за системою Rh.

У трансфузіологічній практиці підлягають обліку, в першу чергу, три антигени - D(Rh0), C(rh') і E(rh''). Особливе значення має антиген D, який є сильним імуногеном. Ці антигени можуть знаходитися на еритроцитах людей разом або окремо, утворюючи сім різних співвідношень, а також можуть бути взагалі відсутніми (генотип ccddee). Ці відмінності дозволяють умовно розділити еритроцити людей на 8 груп. З них 4 групи, в яких знаходиться антиген D(Rh0), є резус-позитивними (Rh+), а 4 групи, які не мають антигену D(Rh0), - резус-негативними (Rh-).

На відміну від системи AB0, у сироватці крові людей практично не буває природних антитіл до антигенів системи Rh. Антитіла системи Rh мають виключно імунний характер і утворюються в результаті Rh-несумісної трансфузії чи вагітності.

Врахування груп крові за системою Rh є важливим для практики трансфузійної медицини.

Визначення резус-належності проводить спеціально підготовлений лікар або лікар-лаборант, який має посвідчення встановленого зразка, видане спеціалізованою установою або закладом (профільним НДІ, центром крові).

Визначення резус-належності проводять у реакції аглютинації за допомогою алоімунних сироваток або моноклональних реагентів.

Особи, які мають D(Rh0)-антиген умовно називаються резус-позитивними (їх 85% серед білого населення Європи), а ті, які його не мають - резус-негативними (Rh-).

Визначення резус-належності крові донорів проводять у два етапи: спочатку кров донорів досліджують стандартною сироваткою анти-D(Rh0) або моноклональними реагентами анти-D-супер, а потім кров тих донорів, які дали негативну реакцію з сироваткою анти-D(Rh0), досліджують додатково із стандартними сироватками антирезус, що містять, крім анти-D(Rh0), антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh''). Антитіла анти-C(rh') і анти-E(rh'') можуть знаходитись у сироватці як у чистому вигляді, так і в суміші з антитілами D(Rh0), наприклад: анти-D(Rh0) + C(rh'), анти-D(Rh0) + E(rh'') або анти-D(Rh0) + С(rh') + E(rh'').

У відсотках представлено частоту поширення резус-позитивних і резус-негативних варіантів, які зустрічаються серед населення європейського регіону (табл. 5).

Дослідження фенотипу резус необхідно проводити у жінок з підозрою на ізосенсибілізацію та у вагітних жінок з підозрою на резус-конфліктну вагітність.

Результат визначення резус-належності крові донорів фіксують в особовому журналі та на титульній сторінці донорської картки з вказанням дати і за підписом осіб, які проводили визначення.

Результат визначення резус-належності крові хворих та інших осіб записують у спеціальний журнал та на бланк з вказанням дати та за підписом особи, яка проводила визначення. Цей бланк підклеюють до історії хвороби і, крім того, результат, який вказаний на цьому бланку, лікуючий лікар фіксує на титульній сторінці історії хвороби і скріплює підписом з зазначенням дати.

Сироватки антирезус виготовляють звичайно у вигляді універсальних, тобто позбавлених групових антитіл. Такі сироватки придатні для визначення резус-належності крові людей будь-якої групи за системою AB0. Однак за певних обставин сироватки антирезус виготовляють з крові різних груп за системою AB0. У цих випадках у разі визначення резус-фактора необхідно враховувати групову специфічність сироватки. Сироваткою антирезус групи 0(I) визначається резус-фактор тільки в еритроцитах групи 0(I); сироваткою антирезус групи A(II) визначається резус-фактор тільки в еритроцитах 0(I) і A(II); сироваткою антирезус групи B(III) визначається резус фактор тільки в еритроцитах груп 0(I) і B(III); сироваткою антирезус групи AB(IV) і спеціально виготовленою - універсальною, визначається резус-фактор в еритроцитах групи AB(IV) і будь-якої іншої групи крові.

Під час кожного дослідження для перевірки специфічності і активності сироватки антирезус необхідно ставити контроль.

Для контролю застосовують стандартні резус-позитивні еритроцити групи 0(I) або тієї ж групи, що і досліджувана кров, і стандартні резус-негативні еритроцити обов'язково тієї ж групи, що і досліджувана кров.

Стандартні сироватки для визначення резус-належності можуть мати різні за формою резус-антитіла - повні і неповні. Кожні з цих антитіл активні тільки в особливих умовах, тому методика визначення резус-фактора залежить від того, які резус-антитіла знаходяться в стандартній сироватці.

Визначення резус-фактора обов'язково треба проводити двома серіями стандартних сироваток антирезус. Якщо стандартні сироватки активні в різних умовах (наприклад, одна з них містить повні антитіла і тому активна в сольовому середовищі, а друга містить неповні антитіла і активна в колоїдному середовищі - в желатині або поліглюкіні), то визначення резус-належності слід проводити різними методами, як вказано в супровідній інструкції для кожної серії сироватки.

Таким чином, метод визначення резус-фактора залежить від форми резус-антитіл у стандартній сироватці та способу її виготовлення.

Видаючи сироватку антирезус, до неї прикладають коротку супровідну інструкцію з описом того методу, для якого призначена ця сироватка.

Стандартні сироватки антирезус з неповними антитілами. Стандартні еритроцити для контролю. Центрифужні або будь-які інші тонкостінні пробірки ємністю 10 - 15 мл. Водяна баня при температурі від 46 до 48 град. C або сухоповітряний термостат при температурі від 46 до 48 град. C. 10% розчин желатину. Желатин можна зберігати з консервантами: натрію сульфацилом (альбуцидом) з розрахунку 100 мг альбуциду на 10 мл 10% розчину желатину або з натрію азидом з розрахунку 10 мг на 10 мл 10% розчину желатину.

Кров для дослідження слід брати в кількості 2 - 5 мл в пробірку без стабілізатора. На пробірці підписати прізвище, ініціали і групу крові особи, від якої взято кров.

Звичайно після зсідання крові на дні пробірки лишається невелика кількість вільних еритроцитів, які слід використовувати для дослідження. Якщо цих еритроцитів недостатньо, слід струснути згусток для відділення більшої кількості еритроцитів.

Якщо брати кров з 3,8 - 5,0% розчином натрію цитрату (0,25 мл натрію цитрату на 1 мл крові), гепарином або іншим стабілізатором, еритроцити необхідно відмити, для чого в пробірку доливають до верху 0,9% розчин натрію хлориду, вміст її перемішують і центрифугують при 1500 об./хв. протягом 5 хв. при кімнатній температурі. Для дослідження потрібно використовувати відмиті еритроцити.

Для визначення резус-належності кров можна брати з місця проколу пальця скляною паличкою і негайно вводити в пробірку з сироваткою антирезус, змішаною з желатином у співвідношенні 1:2.

Для визначення резус-належності кров можна зберігати в холодильнику протягом трьох діб при температурі + (6 +- 2) град. C.

У разі використання двох серій сироватки антирезус у штативі розміщують три ряди центрифужних або будь-яких інших пробірок (об'ємом не менше 10 мл) у кожному ряді за числом досліджуваних зразків еритроцитів і по дві пробірки для стандартних резус-позитивних і резус-негативних еритроцитів. На кожній з трьох пробірок надписують прізвище та ініціали особи, кров якої буде досліджено. В однаково позначені пробірки (три ряди) вводять по одній краплі (0,05 мл) досліджуваних еритроцитів, а в контрольні - по одній краплі (0,05 мл) стандартних (Rh0+) і (Rh0-) еритроцитів.

У всі пробірки додають по дві краплі (0,1 мл) 10% розчину желатину, попередньо підігрітого до розчинення на водяній бані при температурі від 46 до 48 град. C.

У всі пробірки першого ряду додають по одній краплі (0,05 мл) сироватки антирезус однієї серії, у всі пробірки другого ряду - по 1 краплі (0,05 мл) сироватки антирезус другої серії. Третій ряд є контролем для виключення можливого неспецифічного склеювання досліджуваних еритроцитів, наприклад, за рахунок ауто-, теплових або холодових антитіл, і туди сироватку антирезус не додають.

Вміст пробірок перемішують струшуванням, і штатив з пробірками ставлять на водяну баню при температурі від 46 до 48 град. C на 5 - 10 хв. або в сухо-повітряний термостат при тій же температурі на 30 хв.

Після виймання пробірок з водяної бані або з термостату до них додають 5 - 8 мл 0,9% розчину натрію хлориду і перемішують вміст шляхом 1 - 2-кратного перевертання пробірок.

Пробірки переглядають на світлі неозброєним оком або через лупу з двократним збільшенням. Результат оцінюють за наявністю або відсутністю аглютинації еритроцитів.

За умови позитивного результату аглютинати легко розрізняються у вигляді червоних грудочок на прозорому, майже знебарвленому, тлі рідини.

За умови негативного результату в пробірці видно рівномірно забарвлену в світло-червоний колір, дещо опалесціюючу, рідину.

Зразки еритроцитів, що дали аглютинацію з сироваткою анти-D(Rh0), є резус-позитивними (Rh0+).

Зразки еритроцитів, що не дали аглютинації з сироваткою анти-D(Rh0), - резус-негативні (Rh0).

Однак результати враховують як вірогідні за умови співпадання їх в обох серіях сироватки антирезус і після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної групи і групи 0(I). У пробірках третього (контрольного) ряду аглютинації не повинно бути.

Наявність аглютинації в будь-якій пробірці контрольного ряду свідчить про неспецифічність реакції. За цих умов позитивний результат з сироваткою антирезус не може бути врахований як вірогідний. У таких випадках для визначення резус-належності слід використовувати сироватку антирезус з повними антитілами або попередньо відмити еритроцити теплим 0,9% розчином натрію хлориду для вимивання з них аутоантитіл. За сумнівного результату необхідно проводити мікроскопічне дослідження.