Про удосконалення лікування хворих на ВІЛ-інфекцію та СНІД

5. Промивають мазки проточною водою 1 хв.

6. Пофарбовані мазки висушують на повітрі.

Фарбування розчином толуїдинового синього

1. Препарат фіксують 10-15 хв. в 10% формаліні, змивають дистильованою водою.

2. Мазки занурюють в сульфатно-оцтовий реагент на 5 хв., потім реагент перемішують скляною паличкою і залишають в ньому ще на 10 хв.

3. Підготовлені мазки фарбують 3 хв. 0,15% толуїдином синім (75 мг толуідинового синього + 15 мл дистильованої води + 0,5 мл концентрованої соляної кислоти + 35 мл абсолютного етилового спирту).

4. Змивають проточною водою.

5. Дофарбовують 0,25% водним метаніловим жовтим - 2 хв., змивають водою, висушують на повітрі.

Фарба придатна протягом одного року; сульфатно-оцтовий реагент - один тиждень.

Результат:

при мікроскопічному дослідженні пофарбованих мазків - оболонка цист інтенсивно фарбується в синьо-фіолетовий колір.

Серологічні методи дослідження:

антигени Pheumocystis carinii в харкотинні в нормі не виявляються. Пневмоцисти - факультативні патогени, які знаходяться в альвеолах легень тварин та хворої людини. Найбільша кількість їх у промивних водах бронхів (лаваж) та в біоптатах, одержаних при трансбронхіальній біопсії. З метою діагностики антигенів пневмоцисти використовують метод прямої флюоресценції. Дослідження промивних вод та біоптатів при прямій флюоресценції дає позитивний результат у 90% пацієнтів, хворих на СНІД.

Результат:

при мікроскопічному дослідженні цисти синьо-фіолетового кольору, тканинні елементи і фон - синьо-зелені.

2.3.2. Токсоплазмоз - збудник Toxoplasma gondii

Матеріал для дослідження:

кров, послід породіллі, біоптати лімфатичних вузлів, інших органів, у тому числі мозку, або осад люмбального ліквору.

Метод мікроскопічного дослідження:

мікроскопія фарбованих мазків в світловому мікроскопі. Знахідки паразитів в крові безперспективні, в біоптатах лімфовузлів ідентифікація T.Gondii складна в зв'язку з малою кількістю токсоплазм. Відносно легко ідентифікуються ооцисти і трофозоїти T.Gondii в біоптатах мозку та люмбальному лікворі. Фарбування за Романовським-Гімза, Райтом.

Мікроскопія при збільшенні об. 90 ок. 7.

Серологічні дослідження:

використовують методи діагностики токсоплазмозу, які вказують на наявність токсоплазмозних антитіл (РЗК, РНГА, ІФА тощо). На жаль, серологічні методи малоінформативні при діагностиці токсоплазмозу ЦНС-патології, яку викликає T.Gondii у хворих на СНІД.

Якщо в сироватці крові виявлено в низьких або середніх титрах IgG до токсоплазм, це свідчить про стан інфікованості хворого.

З діагностичної точки зору, важливо виявити антитіла до токсоплазм у хворих на СНІД в люмбальному лікворі. Виявлення IgG в крові і лікворі свідчить про свіжу токсоплазмозну інфекцію. Виявлення IgG в крові і лікворі у високих титрах може свідчити про токсоплазмоз. Серологічні дослідження необхідно проводити в динаміці.

T.Gondii в біологічних рідинах визначають методом ПЛР. Токсоплазмозні імуноглобуліни M і G визначають методом ІФА. Методики виконують згідно з інструкцією до діагностичних наборів.

При токсоплазмозі необхідно виділяти токсоплазмозну інфекцію (носійство) та токсоплазмоз (захворювання). Головним в лабораторній діагностиці є не сам факт виявлення антитіл, а уточнення стадії процесу - встановлення носійства чи хвороби. Визначення антитіл імуноглобулінів класу IgM та IgG дозволяє підтвердити або спростувати діагноз токсоплазмозу.

Антитіла IgM до токсоплазм в сироватці крові в нормі відсутні.

Антитіла IgM до токсоплазм з'являються в гострому періоді хвороби і можуть зберігатися до 2 років. Визначення IgM необхідно для діагностики гострого періоду токсоплазмозної інфекції. Антитіла IgG з'являються в період реконвалесценції, у перехворілих IgG зберігаються до 10 років. Виявлення IgG необхідне для встановлення періоду реконвалесценції токсоплазмозу та оцінки рівня імунітету. Рівень антитіл IgM та IgG необхідно визначити в динаміці з інтервалом 14-20 днів методом ІФА. Перевагу при тестуванні методом ІФА для визначення імуноглобулінів класу G слід віддавати тест-системам, що дозволяють визначити кількість антитіл в міжнародних одиницях.

2.3.3. Криптоспоридіоз - збудник кокцидії роду Cryptosporidium

Матеріал для дослідження:

фекалії, блювоти, харкотиння, промивні води бронхів, біоптати слизової оболонки кишечнику, жовч.

Метод дослідження:

світлова мікроскопія.

Консерванти для тривалого зберігання матеріалу:

10% розчин формаліну; 2,5% розчин біхромату калію; консервант Турдієва (80 мл дистильованої води, 0,16 г азотнокислого натрію, 10 мл концентрованого формаліну, 2 мл гліцерину, 8 мл розчину Люголя). Наявність формаліну у складі консерванту Турдієва забезпечує безпеку роботи медпрацівників з патогенним матеріалом.

Приготування мазка:

На предметне скло наносять невелеку кількість матеріалу і роблять тонкий мазок, висушують на повітрі, фіксують в суміші Нікіфорова протягом 10-15 хв., тримають над полум'ям спиртівки або в метанолі 2-3 хв., фарбують карболфуксином за Циль-Нільсеном в модифікації:

Приготування робочого розчину карбол фуксину:

а) 10 г основного фуксину розчиняють в 100 мл абсолютного спирту.

б) 50 г фенолу нагрівають і розчиняють в невеликій кількості дистильованої води. Після чого спиртовий розчин фуксину змішують з розчином фенолу і доводять до 1 л дистильованої води.

2) Мазки фекалій фарбують 5-10 хв.

3) Промивають мазки водопровідною водою, а потім знебарвлюють розчином (100,0 мл 95% етилового спирту, 1 мл концентрованої соляної кислоти) 20-30 сек.

4) Промивають проточною водою.

5) Дофарбовують мазки в 0,25% розчині малахітового зеленого 30 сек. (3 г сухої фарби малахітового зеленого додають до 100,0 мл дистильованої води). Зберігають довго в посуді з темного скла. Для фарбування беремо: 1 мл 3% малахітового зеленого, 100,0 мл гліцерину, 100,0 мл дистильованої води.

6) Мазки промивають проточною водою, висушують на повітрі.

7) Мікроскопія в світловому мікроскопі при збільшенні 100х10.

Результат:

Ооцисти криптоспоридія фарбуються в різні відтінки червоного кольору, мають вигляд округлих утворень, діаметром біля 5 мк. Супутня мікрофлора фарбується в зелений колір.

Імунолюмінесцентна мікроскопія:

діагностика захворювань заснована на виявленні антигенів криптоспоридій у фекаліях. Антигени криптоспоридій, в матеріалі який досліджується в нормі, відсутні. Фекалії хворих досліджують методом імунофлюоресценції з метою виявлення ооцист мікроспоридій. Метод чутливий та специфічний. При виявленні навіть однієї флюоресцентної плями дослідження позитивне.

2.3.4. Ізоспоріоз - збудник кокцидії роду Isospora.

Матеріал для дослідження:

фекалії, жовч, біоптати слизової оболонки кишечнику.

Методи дослідження - мікроскопічне дослідження.

Мікроскопічне дослідження нативного мазка:

1. Метод збагачення за Фюлеборном. Приготування флотаційного розчину, 400,0 г хлориду натрію розчиняють в 1,0 л води, питома вага 1,2. Співвідношення фекалій і флотаційного розчину 1:20. Поверхнева плівка знімається через 40-50 хв. і мікроскопію здійснюють в світловому мікроскопі (7Х20).

2. Невеликий шматочок фекалій розміщують на предметному склі в краплі дистильованої води або в розчині Люголя, покривають покривним склом. Препарат повинен бути тонким, чим тонший препарат, тим легше знайти в ньому ооцисти. Ооцисти дуже легкі, внаслідок чого вони знаходяться біля краю покривного скла. Для позитивного дослідження необхідно продивитись приблизно 10 препаратів.

Мікроскопія. Об'єктив 40, окуляр х10 або х7, конденсор опущений, діафрагма напівзакрита (7, 12)

2.4. Діагностика грибкових інфекцій

2.4.1. Кандидоз - збудник Canlida albicans.

Діагностика поверхневого кандидозу побудована на виявленні елементів грибів при мікроскопії пофарбованих препаратів або виділення чистої культури грибів бактеріологічним методом дослідження.

Матеріал для дослідження:

кров, харкотиння, слиз з рота, носа, гній, фекалії, промивні води бронхів, шлунка, жовч, сеча, зскрібок зі шкіри, нігтів, виділення з очей, вух, статевих органів, біоптати органів.

Мікроскопічний метод дослідження:

Патологічний матеріал можна вивчати в нефарбованих або фарбованих препаратах. Для приготування нативних препаратів рідкий матеріал поміщають в суміш спирту з гліцерином 1:1, додають 2 частини води. Шкірні часточки, зскрібки з нігтів попередньо обробляють 10% лугом. При мікроскопії звертають увагу на наявність справжнього міцелію (наявність перегородок) та псевдоміцелію, морфологію спор.

Фарбування матеріалу

При фарбуванні мазків за Грамом, дріжджові клітини фарбуються в темно-фіолетовий колір; фарбовані за Цилем-Нільсеном - дріжджові клітини сині; за Романовським-Гімзом - рожево-фіолетові. Для диференціювання дріжджоподібних клітин від справжніх дріжджів використовують модифіковане фарбування за Цилем-Нільсеном:

1. Водний фуксин Пфейфера наливають на шматочок фільтрувального паперу, яким покривають мазок, підігрівають до появи пари.

2. Знімають фільтрувальний папір, надмір фарби (знімають) змивають водою.

3. Капають на мазок 5% сірчану кислоту на 1-2 секунди.

4. Змивають кислоту водою.

5. Дофарбовують 1% малахітовим зеленим, або 1% метиленовим синім водними розчинами 10-20 хв.

Результат:

світлова мікроскопія: справжні дріжджі забарвлюються в рожевий колір.

Бактеріологічний метод:

найбільш достовірним методом діагностики кандидозу є виділення культури Candida albicans.

Матеріал для дослідження:

мазок з слизової зіва, носа, статевих органів, очей, шкіри, вух - забирають стерильним тампоном. Тампони вміщують в 10,0 мл рідкого середовища Сабуро, струшують зі скляними кульками 5 хв. Одержаний змив (0,1-0,2 мл) засівають на тверде поживне середовище - Сабуро, або сусло-агар.

Харкотиння гомогенізують стерильним фізіологічним розчином 10 в 6-му степені і засівають по 0,2 мл на тверде поживне середовище - Сабуро, сусло-агар, поживний агар.

Фекалії розводять стерильним фізіологічним розчином 10 в кубі і засівають по 0,1 мл на тверде поживне середовище, оброблене розчином антибіотика.

Сечу центрифугують і засівають 0,1 мл осаду на тверде поживне середовище - Сабуро, сусло-агар.

Кров засівають на рідке середовище Сабуро у співвідношенні 1:10.

Жовч засівають після центрифугування 0,1 осаду на тверде поживне середовище.

Поживні середовища: Сабуро, сусло-агар, поживний агар.

Дослідження:

після інкубації посівів патологічного матеріалу на середовище Сабуро або сусло-агару при 37 град. С на протязі 48 год. вивчають ріст колоній, їх кількість, підозрілі колонії досліджують.

Основні відмінності сахароміцетів від дріжджоподібних грибів:

1. Справжні дріжджі утворюють аскоспори.

2. Сахароміцети не мають псевдоміцелію.

3. Сахароміцети не утворюють хламідоспор.

Видову ідентифікацію дріжджоподібних грибів здійснюють шляхом вивчення ферментативної активності. Тип філаментації вивчають на картопляній воді або крохмале-рисовому відварі. Видову диференційну діагностику грибів типу кандида проводять за здатністю розщеплювати вуглеводи (глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза).

Серологічні дослідження:

антитіла до грибів роду Candida (Candida albicans) в сироватці в нормі не виявляються. Діагностичний титр 1:80. При вісцеральних формах кандидоза велике значення мають серологічні дослідження. Методом ІФА антитіла до Candida albicans визначаються у 90% хворих у перші 2 тижні захворювання і зберігаються до 5 років. Для підтвердження діагнозу сироватки досліджують у динаміці, збільшення рівня антитіл в 4 рази свідчить про гостру стадію захворювання. Зниження рівня антитіл в 4 рази свідчить про стадію реконвалесценції та успішну терапію захворювання. Серологічна діагностика при поверхневому кандидозі малоефективна і лише в тяжких випадках супроводжується підвищенням рівня антитіл, доцільно використовувати її при діагностиці вісцеральних форм кандидозу. Виявлення кандидозного антигену доцільно проводити у хворих з інвазійним кандидозом.

2.4.2. Криптококоз збудник Cryptococcus neoformans.

Матеріал для дослідження:

харкотиння, ліквор, гній, сеча, біоптати уражених органів, секційний матеріал.

Мікроскопічне дослідження:

кров і ліквор досліджують в нефарбованих препаратах, виявляючи круглі або овальні клітини від 2 до 20 мкм. Для більш чіткого виявлення капсули гриба краще готувати тушеві препарати з осаду люмбального ліквору. Для цього туш розводять дистильованою водою 1:4, центрифугують 10-15 хв. при 3000 об./хв. Надосадову рідину збирають в окрему ємкість і стерилізують при 110 град. С протягом 30 хв. Краплю ліквору змішують з краплею розведеної туші на предметному склі, покривають покривним скельцем і мікроскопують за допомогою імерсійного об'єктива при зменшеному освітленні. Якщо грибів мало, то ліквор рекомендують центрифугувати і тушевий препарат готують із осаду ліквору. Виявлені на темному фоні дріжджоподібні клітини оточені світлим обручем (капсула) є доказом етіологічного обґрунтування криптококозу. Товсту краплю крові фарбують будь-яким барвником і шукають в препараті дріжджоподібні клітини, оточені капсулою.

Бактеріологічний метод:

найбільш доказовий метод - метод бактеріологічного дослідження матеріалу. З метою одержання чистих культур, патогенний матеріал засівають на тверді поживні середовища. Використовують середовище Сабуро та сусло-агар. Інкубація 37 град. С. Колонії виростають на 2-3 день при t - 37 град. С, частину чашок Петрі інкубують при t - 25 град. С (для непатогенних криптококів). Колонії в перші дні випуклі, сметаноподібні, з часом колір змінюється до інтенсивно коричневого. Для визначення уреазної активності криптокока культуру висівають на середовище Христіансена.

Склад середовища Христіансена:

1 г пептону, 1 г глюкози, 5 г NaCl , 2 г дигідрофосфата калію, 15 г агару, дистильована вода до 1 л, рН - 6,8. У готове середовище додають 0,2% фенолового червоного в 50% етиловому спирті. Розливають в пробірки по 4,5 мл, стерилізують при температурі 115 град. С 10 хв. В кожну пробірку з розплавленим і охолодженим до 40 град. С середовищем додають по 0,5 мл 20% сечовини. Культуру засівають по поверхні середовища, інкубують при 25-27 град. С.

Облік результатів через 2-3 доби. При наявності криптокока неоформонс середовище забарвлюється в червоний колір. Для ідентифікації Cryptococcus neoformans від непатогенних криптококів використовується картопляно-морквяне середовище, 200 г лушпиння картоплі та моркви кип'ятять в 1 л дистильованої води на протязі 1 години, фільтрують через марлю і доводять до 1 л дистильованою водою, додають 5 г глюкози і 15 г агару. Стерилізують при температурі 110 град. С протягом 15 хв. В охолоджене до 55 град. С середовище додають 1 мл 6% тіаміну і 500 мг стрептоміцину.

Посіви інкубують при 28 град. С. Колонії Cryptococcus neoformans мають коричневий колір, сапрофіти не мають кольору.

Серологічне дослідження:

метод латекс-аглютинації для визначення антигену криптокока виконуються згідно з вказівками інструкції до діагностичного набору.

2.4.3. Аспергильоз - збудник гриби роду Aspergillus

Матеріал для дослідження:

харкотиння, промивні води бронхів, гайморових пазух, ліквору, сечі, фекалій, плевральної рідини, шкірні та нігтьові часточки, виділення з вуха, кров, біоптати тканин.

Методи дослідження:

світлова мікроскопія.

Мікроскопічне дослідження нативного препарату:

окремі патологічні частинки переносять на предметне скло, покривають покривним скельцем і дивляться при малому та великому збільшенні. Препарати з ліквору, крові, промивних вод, сечі і т.д. центрифугують 1500 об./хв. 5 хвилин. Осад переносять на предметне скло в краплю 10% гідроокису калію, покривають покривним склом і мікроскопують.

При мікроскопії нативного препарату виявляють ланцюжки конідій, фрагменти міцелію, конідієносці.

Мікроскопічне дослідження фарбованого препарату:

з метою виготовлення пофарбованого мазка, матеріал розподіляють тонким мазком на предметному склі, фіксують в суміші Нікіфорова або над полум'ям пальника, фарбують за Грамом, мікроскопують під імерсією в світлову мікроскопі. При мікроскопії фарбованих препаратів виявляємо гіфи міцелію, конідієносці. В гістологічних препаратах можна виявити розгалужений міцелій, інколи конідії та конідієносці.

Бактеріологічне дослідження:

патологічний матеріал засівають на мікологічні середовища: Сабуро, сусло-агар з додаванням 100-200 од/мл пеніциліну, стрептоміцину, левоміцетину. Засіяні чашки Петрі інкубують при температурі 37 град. С 2-3 дні, передивляються і при виявленні спороношення вивчають культуру гриба.

Метод посіву:

1. Кров досліджують в 2-3 повторах. Засівають кров у співвідношенні 1:10 на рідке середовище Сабуро. Інкубують при температурі 37 град. С або 28 град. С протягом 10 днів. Перший висів через 5 днів, другий через 10 днів. Для ідентифікації використовують макроморфологічні культуральні властивості та мікроморфологію грибів. Мікроморфологію вивчають по нативних препаратах під малим та великим збільшенням світлового мікроскопа.

2. Фекалії розводять 1:10 фізіологічним розчином, відстоюють і засівають надосадову рідину 0,1 мл на поверхню твердого поживного середовища.

3. Виділення з вух, зіва, носа, статевих органів, взяті стерильним тампоном, засівають, проводячи тампоном по поверхні твердого середовища, обертаючи тампон з усіх боків.

4. Шкірні та нігтьові часточки засівають, притискуючи їх до поверхні середовища.

5. Ліквор засівають на тверде поживне середовище по 0,1 мл і 1:5 на рідке середовище Сабуро (середовище збагачення), флакони з засівом на середовище збагачення інкубують при температурі 28 град. С до 10 днів з висівом на 3-й, 7-й, 9-й день інкубації.

6. Біоптати тканин засівають на чашки, торкаючись відбитками зрізів до поверхні твердого середовища.

У роду Aspergillius конідієносці здебільше не розгалужені, несептовоні і мають на кінцях здуття у вигляді куль, на поверхні яких лежать тісним шаром циліндричні клітини-стеригми, кожна несе на собі ланцюжок конідій (спор), за рахунок чого утворюється кулеподібна голівка конідію.

Голівка може бути радіальною, коли стеригми і ланцюжки конідій розходяться радіально і не радіально, коли стеригми знаходяться тільки на верхівці кулі, стиснуті догори. Міцелій та конідієносці не мають кольору, конідії забарвлені у світлі тони, колір колоній залежить від кольору маси конідій.

Характеристика деяких патогенних грибів роду Aspergillius

Aspergillius fumigftus

колонії гладенькі, зелені з різними відтінками. Конідієносці гладенькі, кінцеві здуття зворотно-пляшковидні, несучі стеригми тільки у верхній половині. Кожна стеригма розділяє ланцюжок конідій. Гриб термофільний, добре росте при температурі 37 град.С.

Aspergillius niger

колонії гладенькі, міцелій білий або жовтий, спороносна зона колоній від темно-фіолетового до чорного кольору. Конідієносці гладенькі, безбарвні, кулясті.

Aspergillius flavus

колонії жовто-зеленого кольору, конідієносці жовті, шорсткі. Здуття кулеподібне, голівки не радіальні. Стеригми одноядерні в малих голівках і двоядерні у великих голівках. Канідії грушоподібні або круглі.

Aspergillius nidulans

колонії шовковисті, зворотний бік колоній має червоно-бурий колір, конідієносці бурі, гладенькі. Вздуття грушоподібної форми. Стеригми двурядні, конідії кулеподібні, гладенькі, зеленого або оливкового кольору.

Серологічні методи дослідження (ІФА):

антитіла до збудника аспергильозу в сироватці крові в нормі не виявляють. При серологічному дослідженні методом ІФА антитіла класу IgG до антигенів Aspergillius виявляються в сироватці крові в більшості інфікованих і практично у всіх хворих, в легенях яких при рентгенологічному дослідженні виявлено грибковий "шар" (приблизно 90% випадків). Тест специфічний. Рівень антитіл досліджується в динаміці. Для захворювання характерне наростання рівня антитіл (7, 12, 16)

2.4.4. Гістоплазмоз - збудник Histoplasma capsulatum

Матеріал для дослідження:

харкотиння, біопунктати печінки, селезінки, шкіри, лімфовузлів.

Метод мікроскопічного дослідження:

при фарбуванні мазка методом Романовського-Гімза гістоплазми забарвлюються в синій колір, цитоплазма - в темно-синій колір. В пофарбованих препаратах виявляються дрібні дріжджоподібні утворення, розміщені в клітинах ретикуло-ендотеліальної системи і поза ними.

Культивування

матеріалу проводять на мікологічні середовища - Сабуро, сусло-агар. Для одержання міцелярної форми колоній культури вирощують при t 25-30 град. С, ріст уповільнений (10-14 днів). На середовищі виростають білі, пухнасті колонії, з часом стають коричневими, по периферії плоскі. При мікроскопії виявляють тонкий міцелій, мікроконідії, які сидять на тонкій ніжці. Конідії мають вигляд грушоподібний або овальний.

Серологічне дослідження:

реакція зв'язування комплементу, реакція імунодифузії, латексаглютинація з гістоплазміном і антигеном дріжджоподібних клітин, шкірна проба. Виконуються згідно з інструкцією до набору.

Антиретровірусна терапія (АРТ) призначена для специфічного лікування ВІЛ-інфекції і спрямована на максимальне пригнічення реплікації ВІЛ в організмі. Як наслідок АРТ призводить до відновлення клітин імунної системи, покращання клінічного стану хворого та продовження тривалості життя.

Проведення лабораторного моніторингу є невід'ємним компонентом надання медичної допомоги людям з ВІЛ/СНІДом, яке спрямоване на запобігання тяжким і загрозливим для життя ускладненням.

Антиретровірусну терапію призначають на основі лабораторних або клінічних показників, відповідно до класифікації ВООЗ.

До лабораторних показників відносяться: кількість СД4+-клітин/мкл крові хворого або, якщо визначити її неможливо, загальна кількість лімфоцитів, а також рівень вірусного навантаження (ВН).

До клінічних показників - клінічні прояви ВІЛ-інфекції у формі розвитку опортуністичних інфекцій, уражень нервової системи, онкологічні захворювання. При оцінці стану хворого на ВІЛ-інфекцію перевага надається такому показнику, як кількість СД4+-лімфоцитів.

Моніторинг ефективності антиретровірусної терапії здійснюється за такими показниками:

- клінічне спостереження;

- імунологічний стан (визначення кількості СД4+-лімфоцитів);

- вірусологічна відповідь на АРТ (визначення рівня ВН).

Основні рекомендовані тести проводяться для оцінки ефективності антиретровірусної терапії і включають визначення загальної кількості лімфоцитів, кількості СД4+-лімфоцитів; моніторинг гепатотоксичності та оцінку ниркової функції. Визначення кількості СД4+-лімфоцитів вважається пріоритетним, як найкращий показник імунної реакції організму на терапію.

Тестування на вірусне навантаження вважається необов'язковим через труднощі, пов'язані з вартістю дослідження, але це важливий показник, який дозволяє своєчасно оцінити ефективність антиретровірусних препаратів і визначити ризик формування резистентних форм вірусу.

3.1. Оцінка імунологічного стану ВІЛ-інфікованих

Оцінка імунологічного стану проводиться шляхом визначення кількості СД4+-лімфоцитів в 1 мкл крові. Рівень СД4+-лімфоцитів обумовлює ступінь розвитку імунодефіциту, стадію захворювання і, таким чином, дозволяє прийняти рішення щодо початку антиретровірусної терапії і профілактики опортуністичних інфекцій. Цей показник також є імунологічним критерієм оцінки ефективності АРТ.

У разі неможливості визначення кількості СД4+-лімфоцитів, слід визначати загальну кількість лімфоцитів (TCL) (альтернативний тест).

Кількість СД4+-лімфоцитів визначається методом проточної цитометрії, який є максимально стандартизованим і дозволяє оцінити імунний стан ВІЛ-інфікованого пацієнта. Основою методу є специфічне зв'язування поверхневих антигенів клітин крові з моноклональними антитілами, які кон'юговані з флуоресцентною міткою. При застосуванні проточних цитометрів відкритого типу використовують реагенти (моноклональні антитіла) будь-якого виробника. Реагенти повинні мати сертифікат якості і бути зареєстровані в Україні.

Матеріал для дослідження:

Для дослідження використовують цільну кров, яку відбирають стерильно, в спеціальні системи для забору крові (вакутайнери, моновети). При використанні гепарину як антикоагулянту, кров придатна для проведення аналізу протягом 48 годин при її зберіганні в умовах кімнатної температури. У разі використання К3 ЕДТА як антикоагулянту, кров придатна для аналізу протягом 4 годин після її отримання. На пробірці позначають дату, час забору крові і ідентифікаційний код пацієнта.

Транспортування зразка: зберігання і транспортування зразка здійснюють в температурному режимі 18-24 град. С. Збільшення температури до 37 град. С призводить до клітинної деструкції і робить неможливим подальші гематологічні і імунофенотипові дослідження.

Перелік необхідного обладнання:

- центрифуга лабораторна на 3000 об./хв.;

- струшувач типу "Вортекс";

- 1 комплект автоматичних дозаторів і наконечників до них:

0,5-10 мкл 1 шт;

5-50 мкл 1 шт;

50-200 мкл 1 шт;

200-1000 мкл 1 шт.

- степпер-автоматичний дозатор, призначений для багатократного дозування однакових об'ємів розчинів;

- штативи для пробірок 12х75 мм;

- штатив для дозаторів (на 5 місць);

- комплект лабораторного мірного посуду;

- дистилятор;

- холодильник на +4 град. С;

- бак для утилізації інфекційного матеріалу.

Всі дослідження проводяться лише разовими наконечниками.

Панелі моноклональних антитіл для дослідження імунного статусу ВІЛ-інфікованих пацієнтів:

1. Двоколірні панелі моноклональних антитіл

CD45/CD14 - визначення лімфоцитів, моноцитів, гранулоцитів;

CD3/CD4 - визначення CD4+-лімфоцитів;

CD3/CD8 - визначення CD8+-лімфоцитів;

CD3/CD19 - визначення CD19+-лімфоцитів.*

2. Триколірні панелі моноклональних антитіл

CD3/CD4/CD45 - визначення CD4+-лімфоцитів;

CD3/CD8/CD45 - визначення CD8+-лімфоцитів.

CD3/CD19/CD45 - визначення CD19+-лімфоцитів.*

Результати дослідження отримують у відносних показниках. При необхідності одержання абсолютних величин проводять перерахування відносних значень відносно до показника загальної кількості лімфоцитів, яка визначена попередньо в гематологічному дослідженні.

Альтернативні технології:

Тест-система "CD4+ for count by manual" фірми "Coulter Beckman". Кров на К3 ЕДТА інкубується з антитілами CD4+, які кон'юговані з латексними мікросферами. Облік результатів здійснюється в гемоцитометрі.

Методом одноетапного ІФА з використанням тест-систем "TRAX CD4", "Capcellia". Зразок суцільної крові змішують з суспензією парамагнітних часток, покритих антитілами до рецептора CD3+. Суміш вносять у лунки мікропланшета і встановлюють на магнітну рамку. Після видалення залишків плазми і клітин, що не прикріпилися, у лунки вносять мічені пероксидазою специфічні анти-CD4+ або анти-CD8+ моноклональні антитіла. Облік результатів проводять на спектрофотометрі при довжині хвилі 450-620 нм.

Визначення СД4+-лімфоцитів методом люмінесцентної мікроскопії.

В умовах, коли неможливо визначити рівень СД4+-лімфоцитів як критерій для призначення антиретровірусної терапії, використовують показник загальної кількості лімфоцитів (TCL) - 1200 клітин/мкл. Хоча встановлено, що загальна кількість лімфоцитів не завжди корелює з кількістю СД4+-клітин, але в поєднанні з клінічними симптомами цей показник є корисним маркером щодо прогнозу хвороби. Для пацієнтів, які не мають клінічних проявів СНІДу, в першу чергу визнається показник загальної кількості лімфоцитів. Якщо він менше 1200 клітин/мкл, кров пацієнта необхідно тестувати на визначення кількості СД4+-лімфоцитів для підтвердження результату аналізу і прийняття рішення щодо АРТ.

Значення.

Зниження або збільшення кількості СД4+-лімфоцитів вважається достовірним, якщо різниця дорівнює 30% від початкового для абсолютного показника і понад 3% від початкового рівня для відносного числа клітин.

При відсутності терапії кількість СД4+-лімфоцитів знижується в середньому на 4% у рік на кожний log10 РНК ВІЛ.

Періодичність тестування.

Обстеження проводять кожні 6 місяців для пацієнтів, які знаходяться на стадії вірусоносійства. При зниженні кількості лімфоцитів до 350 клітин/мкл - кожні 3 місяці.

Перед початком призначення АРТ проводиться визначення СД4+-лімфоцитів, але не пізніше ніж за 2 тижні до початку лікування. Пацієнтів, які знаходяться на антиретровірусній терапії, обстежують кожні 3 місяці. В разі необхідності лікар може призначити таке обстеження частіше.

Рівень СД4+-лімфоцитів збільшується на >= 50 клітин/мкл через 4-8 тижнів після пригнічення реплікації вірусу за допомогою АРТ, а потім на 50-100 клітин/мкл у рік для дорослих. При відміні терапії рівень СД4+-лімфоцитів швидко знижується, до 100-150 клітин/мкл через 12-16 тижнів.

Якщо результати аналізу не відповідають попереднім тенденціям, аналіз необхідно повторити.

Відповідно до керівних принципів ВООЗ на початку терапії або заміні схеми терапії рівень СД4+-лімфоцитів (як і вірусне навантаження) рекомендують досліджувати через 4, 8-12 і 16-24 тижні від початку терапії.

Фактори, що впливають на рівень СД4+-лімфоцитів:

1. Аналітична варіативність призводить до значної розбіжності нормальних значень (приблизно 500-1400 кл/мкл), оскільки показник СД4+-клітин залежить від трьох факторів: кількості білих кров'яних тілець, відсотка лімфоцитів і відсотка клітин з рецептором СД4+.

2. Добові коливання з найменшим значенням о 12:30 і піковим значенням о 20:30.

3. Незначне зниження рівня СД4+-лімфоцитів спостерігається при значних хірургічних операціях та гострих інфекціях.

4. Призначення кортикостероїдів призводить до значного зниження рівня СД4+-лімфоцитів з 900 клітин/мкл до 300 клітин/мкл.

5. Хибно високий рівень СД4+-лімфоцитів спостерігається при коінфекції HTLV-1 та вилученій селезінці.

3.2. Кількісний вміст РНК ВІЛ у плазмі крові (вірусне навантаження)

Показником кількісного вмісту ВІЛ в плазмі крові є так зване "вірусне навантаження", яке відображає активність реплікації ВІЛ в організмі та пов'язану з нею швидкість руйнування лімфоцитів СД4+.

Термін "вірусне навантаження" іноді використовується для позначення кількості ВІЛ в усіх органах і рідинах організму. Однак на практиці вірусне навантаження (ВН) частіше за все використовується для позначення кількісного вмісту вірусу в плазмі крові і визначається за допомогою підрахунку кількості копій РНК ВІЛ в плазмі.

Рівень ВН дозволяє оцінювати ризик прогресування ВІЛ-інфекції. Підвищення рівня ВН є несприятливою ознакою перебігу захворювання і потребує негайного призначення АРТ. У разі підвищення рівня ВН у пацієнтів, які проходять лікування АРТ, необхідно визначити резистентність штамів ВІЛ у такого пацієнта, оскільки підвищення рівня ВН може бути пов'язано з формуванням резистентних до препаратів штамів, що використовують для лікування.

ВН - це важливий лабораторний критерій для прийняття рішення щодо початку АРТ, контролю її ефективності, та своєчасної зміни схеми терапії.

Саме тому визначення рівня ВН ВІЛ вважається важливим показником при проведенні лікування ВІЛ-інфікованих і дозволяє контролювати ефективність дії препаратів.

Методи визначення рівня вірусного навантаження

1. Визначення рівня вірусного навантаження за методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Об'єктом дослідження є плазма крові ВІЛ-інфікованих пацієнтів. Кров відбирається стерильно в спеціальні системи для забору крові (вакутайнери, моновети) з використанням ЕДТА як антикоагулянту.

Гепарин інгібує ПЛР, тому для забору крові його не використовують (як наслідок - результат реакції може бути хибно негативний).

Полімеразна ланцюгова реакція є надзвичайно чутливим і специфічним методом, який дозволяє виявляти геномні послідовності вірусної РНК або провірусної ДНК. Висока чутливість методу вимагає дотримання певних умов: обов'язково повинно бути наявні три окремі приміщення, відмінна якість тест-систем, кваліфікований персонал.

Необхідне обладнання для проведення ПЛР:

- ампліфікатор;

- ламінарна шафа з вертикальним потоком повітря, II класу безпеки;

- бокс для ПЛР;

- лабораторна центрифуга до 3000 об./хв.;

- центрифуга до 14 000 об./хв. для пробірок типу "Епендорф";

- мікроцентрифуги-вортекси (для перемішування реакційної суміші);

- автоматичні дозатори змінного об'єму 1-канальні:

0,5-10 мкл - 2 шт;

5-50 мкл - 3 шт;

50-200 мкл - 2 шт;

200-1000 мкл - 2 шт;

8-канальні дозатори на 50-200 мкл - 5 шт.

- комплект обладнання для проведення імуноферментного аналізу (використовується для реєстрації результатів ПЛР):

інкубатор для мікропланшет;

промивач для мікропланшет;

спектрофотометр для мікропланшет (ридер);

- штативи для автоматичних дозаторів, штативи для пробірок на 2,0 мл і 0,2 мл;

- пробірки на 2,0 та 1,5 мл поліпропіленові, конічні, з маркіровкою "оброблені проти РНК-аз та ДНК-аз";

- пробірки 0,2 мл;

- наконечники для автоматичних дозаторів з фільтрами, різного об'єму, оброблені проти РНК-аз;

- дезінфікуючі засоби;

- 70% етиловий спирт;

- ізопропіловий спирт;

- гумові рукавички;

Перший етап - виділення РНК з плазми крові.

Другий етап - зворотна транскрипція з наступною ампліфікацією (специфічне розмноження геномної послідовності вірусу).

Облік результатів (третій етап) проводять імуноферментним методом. Кількість копій РНК ВІЛ в 1 мл підраховується співвідношенням оптичної щільності ампліфікату до оптичної щільності внутрішнього стандарту.

Рівень вірусного навантаження визначають за допомогою тест-системи фірми "Roche" "Amplicor HIV-1 Monitor Test", що мають дві версії (1.0 та 1.5). Версія 1.0 переважно виявляє субтип В ВІЛ-1, версія 1.5 виявляє всі субтипи ВІЛ-1.

Об'єкт дослідження: плазма крові у кількості 0,2-0,5 мл.

Цільну кров зберігають при температурі +2-8 град. С не більше 6 годин. Плазму отримують центрифугуванням при 800-1600 g протягом 20 хв. при кімнатній температурі; до проведення аналізу плазма може зберігатись при +4 град. С до 24 годин. Транспортують плазму при температурі +4 град. С 24 години, для тривалого зберігання заморожують при -20 град. С. На пробірці позначають дату, час забору крові і ідентифікаційний код пацієнта.

Динамічний діапазон тест-системи (межі значень, в яких дослідження проходить коректно) - 400-750000 копій/мл. У разі, якщо отримане значення нижче ніж 400 копій/мл, результат дослідження трактується як: < 400 копій/мл; при отриманні значення, яке перевищує 750000 копій/мл, результат дослідження трактується як: > 750000 копій/мл (так позначається результат аналізу у довідці).

Примітка. Слід зазначити, що визначення рівня вірусного навантаження з метою призначення антиретровірусної терапії, моніторингу ефективності АРТ було затверджено Управлінням по продуктах харчування і лікарських препаратах США (FDA) тільки з використанням тест-системи "Amplicor HIV-1 Monitor Test версія 1.5" (фірма Roche).

Аналогічний підхід для кількісної оцінки вмісту РНК ВІЛ було використано фірмою "Амплісенс" (Росія) у створенні набору реагентів "ВИЧ-1 Монитор тест". Набір реагентів призначено для науково-дослідних цілей. Вимоги для проведення дослідження аналогічні попередньому пункту.

Необхідний об'єм проби - 0,1 мл. Динамічний діапазон набору реагентів: 400-750000 копій РНК ВІЛ/мл.

2. Гібридизація ДНК за допомогою розгалуженого зонда або bДНК (Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay, Bayer;). Виявляє всі субтипи ВІЛ-1.

Динамічний діапазон: 75-500000 копій/мл.

Необхідний об'єм проби: 1 мл.

Вимоги: кров відбирається в пробірки з ЕДТА. Плазма має зберігатись не більше 4 годин при 4 град. С, перед транспортуванням заморожується при мінус 20 град. С.

3. Послідовна ампліфікація на основі повного геному (NASBA) (NucliSens HIV-1 QT "bioMerieux"). Виявляє всі субтипи ВІЛ-1. Може використовуватися для аналізу вірусного навантаження в усіх тканинах і рідинах організму.

Динамічний діапазон: 176-3500000 копій/мл

Необхідний об'єм проби: від 0,01 мл до 2 мл залежно від матеріалу.

Вимоги: використовується цільна кров, кров з ЕДТА та кров з гепарином. Аналізуватись може будь-яка рідина організму. Сироватку і плазму зберігають < 4 годин, перед транспортуванням заморожують при мінус 20 град. С.

Тест-набори та обладнання для проведення досліджень повинні мати відповідні сертифікати про їх реєстрацію в Україні.

Показання для призначення аналізу на визначення ВН. Його проводять з метою:

- лабораторного моніторингу перебігу ВІЛ-інфекції: у хворих, які не отримують терапії, рівень РНК ВІЛ в плазмі крові визначається на момент встановлення діагнозу і в подальшому рекомендується кожні 6 місяців;

- моніторингу лікування: після початку АРВ терапії спостерігається швидке зниження рівня РНК ВІЛ протягом 1-4 тижнів (альфа-спад), що є наслідком активності АРВ-препаратів, спрямованих на віріони ВІЛ, які вільно циркулюють в плазмі крові. Надалі відбувається друге зниження вірусного навантаження (бета-спад), більш тривале (місяці, роки), яке відображає активну дію препаратів на інфіковані ВІЛ макрофаги і дендритні клітини лімфатичних фолікулів. Максимальний противірусний ефект спостерігається на 4-6 місяць. Більшість спеціалістів вважає, що рівень РНК ВІЛ (тобто кількість копій РНК в 1 мл плазмі) це найважливіший барометр терапевтичної відповіді на ВААРТ.

Згідно з аналізом 12 лабораторій, є незначні розбіжності в рівні вірусного навантаження у чоловіків і жінок: в середньому рівень ВН приблизно в 2 рази (0,23 log10 копій/мл) нижче у жінок, ніж у чоловіків. Однак ці відмінності відсутні при рівні СД4+-лімфоцитів < 300 кл/мкл і не можуть впливати на рішення стосовно призначення терапії;

- визначення гострої стадії ВІЛ-інфекції: визначення рівня РНК ВІЛ в плазмі використовують для виявлення гострого ретровірусного синдрому в ранній період інфекції до початку сероконверсії. Більшість дослідників вказують на високі рівні концентрації вірусу (100000-1000000 копій/мл) у цей період;

- визначення прогнозу розвитку хвороби: вірусне навантаження корелює зі швидкістю зменшення кількості CD4+-лімфоцитів і є важливим прогностичним показником на ранній стадії захворювання, який дозволяє оцінити ризик розвитку СНІДу;

- визначення ризику опортуністичних інфекцій: кількість СД4+-лімфоцитів - кращий показник для прогнозування розвитку СНІД-обумовлених ускладнень, проте саме вірусне навантаження дозволяє передбачити швидкість зниження рівня СД4+-лімфоцитів;

- встановлення можливості передачі ВІЛ: можливість передачі ВІЛ при будь-якому контакті прямо корелює з вірусним навантаженням;

- оцінки ризику трансмісії ВІЛ від матері до дитини: дослідження показали, що рівень вірусного навантаження прямо пропорційний ступеню ризику передачі ВІЛ від матері до дитини.

Терапевтичний моніторинг.

У хворих, які отримують лікування, вірусне навантаження визначається безпосередньо на початку антиретровірусної терапії і через 2-8 тижнів після її початку. Друге визначення дозволяє клініцисту провести оцінку вихідної ефективності терапії, оскільки у більшості хворих при належному дотриманні режиму приймання антиретровірусної терапії за цей час призводить до значного зниження вірусного навантаження (приблизно на 0,75-1 log10 копій/мл). Протягом наступних тижнів вірусне навантаження продовжує знижуватися та через 16-20 тижнів досягає у більшості хворих невизначених значень (менш ніж 400 копій/мл - межа чутливості тест-системи). Неможливість знизити рівень вірусного навантаження на 1 log10 копій/мл до 8 тижня від початку АРТ вважається вірусологічною невдачею і потребує аналізу причин та оцінки можливості зміни схеми АРТ. Ефективність ВААРТ оцінюють у log10. Для цього отриманий результат, виражений у копіях РНК ВІЛ в 1 мл плазмі, перераховують у log10 згідно з математичною таблицею десяткових логарифмів.

Достовірним вважається трикратна зміна рівня вірусного навантаження в плазмі крові (0,5 log10) в бік збільшення або зменшення.

Швидкість зниження вірусного навантаження залежить від початкового рівня віремії, початкової кількості СД4+-лімфоцитів, ефективності схеми терапії, дотримання режиму приймання препаратів (прихильності пацієнта), попередньої історії застосування АРТ, наявності опортуністичних хвороб.

Зменшення рівня вірусного навантаження нижче 400 копій/мл пов'язано з повним і стійким пригніченням вірусної реплікації, проте слід зазначити, що навіть при цьому рівні вірусного навантаження в організмі постійно продовжується реплікація вірусу, але не в значній кількості.

У випадку, коли РНК ВІЛ продовжує визначатись в плазмі після 16-20 тижнів від початку терапії, проводять спостереження за розвитком хвороби в динаміці і розглядають можливість зміни схеми лікування.

Визначення рівня вірусного навантаження з метою моніторингу ефективності АРВ терапії проводять кожні 6 місяців. Дослідження проводяться в періоди клінічної стабільності щодо опортуністичних інфекцій та не менш ніж через 4 тижні після щеплення чи випадкових (інтеркурентних) інфекцій з використанням однієї лабораторії та технології.

Фактори, що впливають на зростання рівня вірусного навантаження:

1. Прогресія хвороби.

2. Невдача антиретровірусної терапії внаслідок неадекватної ефективності препаратів; неадекватного рівня вмісту, засвоєння препаратів в організмі; недотримання режиму лікування; формування резистентних штамів вірусу.

3. Наявність активних опортуністичних і випадкових (інтеркурентних) інфекцій.

4. Щеплення, в цьому випадку збільшення вірусного навантаження незначне і коливається від 2 до 4 тижнів.

Хибно низьке вірусне навантаження спостерігається при:

1. Інфікованості ВІЛ-2.

2. Одночасному інфікуванні ВІЛ-1 та ВІЛ-2.

3. Використанні тест-системи "Amplicor HIV-1 Monitor Test версія 1.0" для інфікованих не В-субтипами ВІЛ-1.

4. Порушенні правил забору крові (використання як антикоагулянту гепарину).

5. Некоректному зберіганні та транспортуванні зразка крові або плазми.

3.3. Визначення резистентності до антиретровірусних препаратів

Однією з найважливіших причин неефективності антиретровірусної терапії є виникнення резистентності ВІЛ, яке проявляється у спроможності вірусу активно репродукуватися в присутності застосованих препаратів. У пацієнтів, які отримують антиретровірусну терапію, розповсюдженість >= 1 крупної мутації становить приблизно 50%. Частота такої мутації у пацієнтів, які не отримують терапію, становить 5-20%. Аналіз на резистентність є важливим компонентом лікування ВІЛ-інфекції.

Тестування на наявність резистентності до антиретровірусних препаратів проводиться на центральному рівні, в референс лабораторії або науково-дослідному закладі.

ВООЗ рекомендує країнам, які планують застосування програм антиретровірусної терапії, одночасно застосовувати систему контрольного нагляду за резистентністю ВІЛ. Це дозволить виявляти потенційну резистентність до лікарських засобів на рівні популяції і, таким чином, своєчасно змінювати рекомендовані схеми лікування.

Лікарська резистентність проявляється:

- зростанням вірусного навантаження у плазмі крові;

- посиленням імуносупресії;

- клінічним прогресуванням хвороби.

Показання щодо визначення резистентності

Аналіз на резистентність до АРТ препаратів проводять у пацієнтів з хронічною ВІЛ-інфекцією у випадках, якщо:

- рівень вірусного навантаження впродовж 4 тижнів терапії не вдалося знизити більш ніж на 0,5-0,7 log10/мл;

- рівень вірусного навантаження впродовж 8 тижнів лікування не знизився більш ніж на 1 log10/мл;

- рівень вірусного навантаження після 16-20 тижнів терапії перевищує 1000 копій РНК/мл.

Тестування не рекомендовано:

- при хронічній ВІЛ-інфекції до початку АРВ терапії;

- після припинення приймання АРВ препаратів;

- у випадку, якщо вірусне навантаження нижче 1000 копій РНК ВІЛ/мл (результат дослідження буде недостовірний).

Лікарська резистентність може носити генотиповий і фенотиповий характер. Генотипова резистентність характеризується появою в геномі вірусу мутацій - точкових або множинних, що зумовлює фенотипову резистентність. Фенотипова резистентність характеризується можливістю репродукції вірусу в присутності АРВ препарату, така зміна чутливості виявляється in vitro (в культурі лімфоїдних клітин).