Про затвердження документів з питань контролю якості препаратів крові

Відповідно до статті 18 Закону України "Про донорство крові та її компонентів" та постанови Кабінету Міністрів України від 15.01.96 N 73 "Про затвердження Положення про контроль за відповідністю імунобіологічних препаратів, що застосовуються в медичній практиці, вимогам державних та міжнародних стандартів" (із змінами), з метою приведення у відповідність до вимог державних та міжнародних стандартів показників якості препаратів крові, що виробляються в Україні

1. Затвердити та ввести в дію з 01.09.2005 року настанови з якості медичних імунобіологічних препаратів:

1.1. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на плазму людини для фракціонування" (додається);

1.2. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на розчин альбуміну донорського 5, 10 і 20%" (додається);

1.3. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий" (додається);

1.4. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини антирезус Rho (D) рідкий" (додається);

1.5. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини антистафілококовий, рідкий" (додається);

1.6. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини проти краснухи, рідкий" (додається);

1.7. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини проти гепатиту В, рідкий" (додається);

1.8. "Керівництво по складанню аналітично-нормативної документації на імуноглобулін людини проти вітряної віспи, рідкий" (додається);

2. Встановити, що заклади переливання крові України, які знаходяться у сфері управління Міністерства охорони здоров'я України, керуються затвердженими в пункті 1 документами при складанні аналітично-нормативних документацій на перелічені препарати при їх реєстрації. Іншим суб'єктам господарювання рекомендується керуватись затвердженими в пункті 1 документами при складанні аналітично-нормативних документацій на перелічені препарати при їх реєстрації.

3. Державній службі лікарських засобів і виробів медичного призначення Міністерства охорони здоров'я України у тримісячний термін забезпечити опублікування цього наказу в засобах масової інформації.

4. Контроль за виконанням наказу покласти на заступника Міністра Рибчука В.О.

1. Сфера застосування та основні вимоги

2. Специфікація

2.1. Свіжозаморожена плазма (СЗП)

2.2. Заморожена плазма (ЗП)

3. Методи контролю

3.1. Опис

3.2. Відсутність інфекцій, що переносяться при гемотрансфузіях

3.3. pH

3.4. Вміст білку

3.5. Колірність (гемпігменти)

3.6. Фактор VIII

3.7. Пакування

Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на - Плазму людини для фракціонування, що являє собою рідку частину донорської крові, яка пройшла контроль на відсутність інфекцій, що переносяться при гемотрансфузіях, відповідно до Інструкцій:

- Медичний огляд донорів крові, плазми, клітин крові;

- Порядок карантинізації донорської плазми;

- Заготівля крові;

- Інструкція по фракціонуванню донорської крові на її компоненти (плазма, еритроцити, тромбоцити, лейкоцити) та їх консервування;

- Інструкція з донорського плазмафереза;

Плазма отримується шляхом відділення від формених елементів крові центрифугуванням або методом плазмафереза в присутності антикоагулянта.

Плазма призначена для виробництва лікарських засобів.

За способом заготівлі плазма поділяється на:

свіжозаморожена плазма (СЗП) - отримана методом плазмафереза або виділена із цільної крові після відділення формених елементів центрифугуванням і заморожена якнайшвидше, але не пізніше 4 годин після взяття крові у донора при температурі, не вище мінус 30 град. С. Призначення - одержання факторів згортання крові (лабільні білки плазми).

заморожена плазма (ЗП) - виділена із цільної крові і заморожена при температурі, не вище мінус 30 град. С якомога скоріше, але не пізніше 24 годин після взяття крові у донора. Призначення - для одержання стабільних білків плазми (імуноглобуліни, альбуміни тощо).

Будь-яка плазма, яка містить титри специфічних антитіл, може використовуватись для виробництва специфічних імуноглобулінів. Кількісне визначення специфічних антитіл (титр, МО, УО) встановлюється нормативними та нормативно-технічними документами на специфічні імуноглобуліни та проводиться акредитованими лабораторіями. Така плазма повинна бути додатково промаркована як "специфічна", з вказанням титру специфічних антитіл.

Кожна поставка всіх видів замороженої плазми в гемоконах повинна супроводжуватись двома сегментами довжиною, не менше 7 см. Поставка плазми супроводжується документацією:

1. Списки донорів з чіткою ідентифікацією кожної донорської порції, включеної в відповідну поставку.

2. Сертифікатом на всю поставку, який повинний містити наступну інформацію:

Індивідуальний номер донора;

тип і кількість коагулянта;

група крові, резус;

дата заготівлі крові;

температурний режим зберігання та транспортування;

терміни карантинізації;

установа, що здійснила взяття крові;

вид плазми (специфічна/неспецифічна);

об'єм плазми в мл;

результати тестів на наявність збудників інфекцій, які переносяться при гемотрансфузіях, включаючи критерії придатності, та які тест-системи і види тестів використовувались.

2.1. Свіжозаморожена плазма (СЗП)

2.2. Заморожена плазма

3.1. Опис. В замороженому стані - щільна затверділа маса жовтуватого або з зеленуватим відтінком кольору.

В рідкому стані - прозора або злегка мутна рідина без явних ознак гемолізу від світло-жовтого до кольору з зеленуватим відтінком.

3.2. Відсутність інфекцій, що переносяться при гемотрансфузіях.

В плазмі не виявляються антитіла до ВІЛ 1 та 2, антитіла до гепатиту С, поверхневий антиген вірусу гепатиту В (HBsAg) та cor-антитіла до вірусу гепатиту В, збудника сифілісу, не виявляються збудники парвовірусу В19.

Визначення проводять імуноферментним методом з використанням комерційних вітчизняних чи зарубіжних тест-систем, зареєстрованих в Україні, відповідно до вимог інструкції по використанню.

Визначення антитіл до сифілісу, проводять в реакції преципітації або імуноферментним методом з використанням комерційних вітчизняних чи зарубіжних тест-систем, зареєстрованих в Україні, відповідно до вимог інструкції по використанню

3.3. рН. Від 6.5 до 7.7 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3).

3.4. Вміст білку. Не менше 4.5%.

В мірну колбу місткістю 25 мл поміщають 1 мл плазми, доводять об'єм розчину 0.9% розчином натрію хлориду Р ізотонічного і перемішують. В пробірку місткістю 20 мл поміщають 1 мл отриманого розчину, додають 4 мл біуретового реактиву і перемішують.

Через 30 хвилин вимірюють оптичну густину розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи як компенсаційний, розчин, що містить 1 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р ізотонічного і 4 мл біуретового реактиву.

Паралельно, в тих же умовах вимірюють оптичну густину розчину, що містить 1 мл РСЗ бичачого сироваткового альбуміну і 4 мл біуретового реактиву.

Вміст білка в плазмі, в процентах, обчислюють за формулою:

Примітка. Приготування РСЗ бичачого сироваткового альбуміну. 0.15 г бичачого сироваткового альбуміну поміщають в мірну колбу місткістю 25 мл, доводять об'єм розчину 0.9% розчином натрію хлориду Р до позначки і перемішують.

Термін придатності розчину 3 доби при температурі не вище 5 град. С.

3.5. Колірність (гемпігменти). Оптична густина не повинна перевищувати 0.25.

Готують розведення розмороженої плазми 1:4 в в 0.9% розчин натрію хлориду Р.

Вимірюють оптичну густину розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 403 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину ізотонічний 0.9% розчин натрію хлориду Р.

3.6. Фактор VIII. Не менше 0.7 УО/мл (70%). Визначення проводять з використанням набору реагентів для визначення активності фактору VIII "Фактор VIII-тест", НПО "Ренам", або аналогічним.

3.7. Пакування. Пластмасові контейнери для крові та її компонентів, що дозволені до використання у встановленому законодавством порядку. Поліетиленові контейнери в груповій тарі повинні розміщатись горизонтально. Контейнери, заповнені менше ніж на 100 мл, не приймаються.

Маркування. Назва донорського центру, найменування сировини, реєстраційний (індивідуальний) номер донора, дата заготівлі крові, тип і кількість коагулянта, група крові, резус, об'єм в мл, термін та температурний режим зберігання, штриховий код.

Умови зберігання та термін придатності.

Від мінус 30 до мінус 40 град. С - 12 місяців;

мінус 40 град. С і нижче - 24 місяці.

Плазма заморожена може використовуватись для фракціонування, якщо відбулося не більше одного випадку підвищення температури до -5 град. С, не більше, ніж на 72 години.

1. Сфера застосування та основні вимоги

2. Специфікація

3. Методи контролю

3.1. Опис

3.2. Автентичність

3.3. Прозорість

3.4. Відносна в'язкість

3.5. Кольоровість (гемпігменти)

3.6. Алюміній

3.7. рН

3.8. Об'єм, що витягається

3.9. Стерильність

3.10. Пірогени

3.11. Аномальна токсичність

3.12. Механічні включення

3.13. Термостабільність

3.14. Полімери і агрегати

3.15. Кількісне визначення

3.16. Пакування

3.17. Маркування

Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат - Розчин алюбуміну людини 5, 10 і 20%, який являє собою водний розчин альбумінової фракції плазми крові донорів, у відповідності до керівництва по складанню аналітично-нормативної документації на "Плазма людини для фракціонування".

При виготовленні медичних імунобіологічних препаратів виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1, 2.

Як стабілізатор може бути використаний натрій каприловокислий P (ЄР 1471) з розрахунку 1.5 г на 1 л розчину альбуміну 5%; 3 г на 1 л розчину альбуміну 10%, 6 г на 1 л розчину альбуміну 20%. Антимікробні консерванти не можуть використовуватися на будь якій стадії виробництва препарату.

Розчин пропускають через фільтр, який затримує бактерії та розливають в асептичних умовах в стерильні контейнери (пляшки), які потім укупорюють з метою запобігання забруднення. Препарат в кінцевому пакуванні пастеризують при температурі 60 +- 1.0 град. С не менш ніж 10 годин. Після цього контейнери інкубують при температурі від 30 град. С до 32 град. С не менше, ніж 14 діб або при температурі від 20 град. С до 25 град. С не менше, ніж 4 тижні та візуально контролюють мікробне забруднення.

Розчин альбуміну людини 5, 10 і 20% призначений для застосування як засіб гемодинамічної дії та парентерального живлення.

3.1. Опис. Прозора в'язка рідина від жовтого до світло-коричневого кольору, допускається зеленуватий відтінок.

3.2. Автентичність:

А) На електрофореграмі досліджуваного препарату, отриманої при кількісному визначенні альбуміну, сновні компоненти білкових фракцій повинні бути ідентичні за електрофоретичною рухомістю основним білковим фракціям ФСЗ ДФУ розчину альбуміну людини 10%.

Б) По 2 мкл препарату поміщають в лунки пластинки з агаровим гелем. Паралельно в одну з лунок поміщають 2 мкл плазми людини.

В електродні камери апарату для електрофорезу наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.2 і поміщають пластинки з агаровим гелем. На обидва кінці пластинок поміщають смужки хроматографічного або фільтрувального паперу, розміром 120 x 60 мм, складених у 6 шарів, які з'єднують з електродними камерами. Електрофорез проводять при силі струму 10 мА, напрузі 100 В протягом 1.5 годин.

Після проведення електрофорезу між лунками в агаровому гелі вирізають траншеї (10 x 2 мм), в кожну з них вносять 60 мкл видоспецифічної антисироватки, яка преципітує сироваткові білки людини (ІмБіо, Росія, або аналогічної якості) та сироватки биків, коней (Імтек, Росія або аналогічної якості). Пластинку поміщають в камеру, в яку ставлять бюкс з 100 мл води Р (для зволоження) і декількома кристалами фенолу Р (консервант). Через 24 години пластинку виймають з камери, занурюють в кювету з 250 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р, що містить декілька кристалів фенолу Р, і відмивають протягом 2 діб від білку, який не прийняв участі в утворенні преципітату. Розчин замінюють 4 рази на добу.

Відмиту пластинку висушують на повітрі протягом 1 години, занурюють у розчин фарбника амідочорного 10 В на 2 години. Потім пластинку виймають, дають змогу стекти фарбнику і занурюють в 2% розчин кислоти оцтової Р на 2 доби для відмивання від надлишку розчину фарбника. 2% розчин кислоти оцтової Р замінюють 4 рази на добу.

Оцінюють локалізацію і число ліній преципітації препарату відносно ліній преципітації сироватки крові людини, яка повинна проявляти не менше 15 ліній преципітації зі своєю антисироваткою. Між лунками з препаратом і антисироватками до сироваток крові тварин лінії преципітації повинні бути відсутні.

Примітки:

1. Приготування 1.25% агарового гелю. 12.5 г агару (очищеного) поміщають в хімічний стакан місткістю 1 л, додають 500 мл води Р і залишають для набухання гелю протягом 1 годин при температурі від 18 до 20 град. С. Стакан поміщають на водяну баню, що кипить, і витримують до повного розчинення агару. Об'єм розчину гелю доводять водою Р до 500 мл, додають 500 мл барбіталового буферного розчину рН 8.2, перемішують, фільтрують через марлю медичну, складену в 3 шари, додають мертіолят до концентрації 100 мкг/мл і розливають у флакони по 50 мл. Перед використанням агаровий гель розплавляють на водяній бані.

Термін придатності гелю 2 доби.

2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.2. 47.6 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають у колбу місткістю 5 л, додають 69 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, 4.3 л води Р та перемішують до розчинення солей. рН розчину визначають потенціометрично (ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3) і при необхідності коригують 1 М розчином хлористоводневої кислоти Р. Термін придатності розчину 3 місяці.

3. Приготування пластинок з агаровим гелем. На скляні пластинки розміром 120 x 90 мм наносять піпеткою 10 мл розплавленого на водяній бані при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю і розтирають шпателем до отримання тонкого шару, щоб агаровий гель краще липнув до скла.

Пластинку висушують при температурі від 75 до 80 град. С протягом 5 хвилин.

Потім пластинку поміщають на горизонтальну поверхню і обережно, уникаючи утворення пухирців повітря, наливають 30 мл розплавленого при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю до отримання шару товщиною 2-3 мм. Після застигання агарового гелю вирізають 7 лунок діаметром 2-3 мм, використовуючи для цього штамп.

Пластинки використовують протягом 1 доби.

4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 1.0 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 450 мл 0,1 М розчину оцтової кислоти Р, доводять об'єм розчину 0.1 М розчином натрію ацетату Р до мітки і перемішують.

Термін зберігання розчину 3 місяці.

5. Приготування 2% розчину кислоти оцтової Р. 300 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 20 мл оцтової кислоти льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.

Термін зберігання розчину 3 місяці.

6. Приготування 0.9% розчину натрію хлориду Р. 9.0 г натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.

Термін зберігання розчину 7 діб.

7. Приготування 0,1 М розчину натрію ацетату Р. 9,8 г натрію ацетату Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.

Термін зберігання розчину 7 діб.

8. Приготування 0,1 М розчину оцтової кислоти Р. 6 г оцтової кислоти льодяної поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.

Термін зберігання розчину 7 діб.

3.3. Прозорість. Препарат має бути прозорим в порівнянні з водою Р або ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р або його каламутність не перевищує каламутність еталону каламутності I ДФУ, 1 вид. р. 2.2.1.

3.4. Відносна в'язкість. Для 5% розчину - не більше 1,0; для 10% розчину - не більше 2,0; для 20% розчину - не більше 4,0.

Визначення проводять методом віскозиметрії відповідно до ДФУ 1 видання, р. 2.2.9.

3.5. Кольоровість (гемпігменти). Вимірюють оптичну густину 1% розчину альбуміну на спектрофотометрі при довжині хвилі 403 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину ізотонічний 0.9 % розчин натрію хлориду Р.

Оптична густина не повинна перевищувати 0.15.

3.6. Алюміній. Тест виконується, якщо технологією передбачена обробка гідроокисом алюмінію. Не більше 200 мкг/л. Випробування проводять відповідно ДФУ, 1 вид., метод 1, р. 2.2.23.

3.7. рН. Від 6.7 до 7.3 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3). Готують 1% розчин препарату, використовуючи у якості розчинника 0.9% ізотонічний розчин натрію хлориду Р.

3.8. Об'єм, що витягається. Препарат повинен витримувати вимоги ДФУ, 1 вид. р. 2.9.17

3.9. Стерильність. Препарат повинен бути стерильним. Випробування проводять методом мембранної фільтрації відповідно до вимог ДФУ, 1 вид. р. 2.6.1.

Препарат в умовах випробувань не проявляє антимікробної дії.

3.10. Пірогени. Препарат повинен бути апірогенним. Тест-доза становить 5 мл препарату на 1 кг маси кроля.

Вводять внутрішньовенно протягом 2 хвилин. Випробування проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид. р. 2.6.8.

3.11. Аномальна токсичність. Тест-доза становить 0,5 мл препарату на одну мишу. Вводять внутрішньовенно протягом 5 секунд. Термін спостереження - 3 доби. Випробування проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид. р. 2.2.6.9.

3.12. Механічні включення. Препарат повинен витримувати вимоги, вказані в Інструкції по контролю лікарських засобів для парентерального застосування на механічні включення (РД 42У-001-93).

3.13. Термостабільність. Розчин витримується 50 годин при температурі від 56,5 град. С до 57,5 град. С. Повинен відповідати тесту на прозорість.

3.14. Полімери і агрегати.

Випробування проводять методом рідинної хроматографії (ДФУ, 1 вид. р. 2.2.29). Площа піку (піків), що виходять перед основним піком не повинна перевищувати 10% суми площ всіх піків на хроматограмі (відповідає вмісту полімерів та агрегатів 5%). Пік стабілізатору (каприлату) в розрахунки не приймають.

По 50 мкл випробуваного розчину і розчину порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ-детектором, отримуючи не менше 3 хроматограм кожного з розчинів у наступних умовах:

- колонка TSKgel SW 3000 розміром 75 мм x 60 см, розмір часток 10 мкм, з передколонкою або інша, для якої виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";

- рухома фаза: фосфатний буферний розчин, що містить 11,688 г натрію хлориду Р і 50 мг натрію азиду Р на 1 л, дегазована будь-яким зручним способом;

- швидкість рухомої фази: 0.5 мл/хв.;

- детектування при довжині хвилі: 280 нм;

- температура колонки: 30 град. С.

Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи".

Примітки:

1. Приготування рухомої фази. У мірній колбі місткістю 1 л зважують 4,873 г натрію дигідрофосфату Р, 1,741 г динатрію гідрофосфату дигідрату Р, 11,688 г натрію хлориду Р і 50 мг натрію азиду Р. Додають 500 мл води Р, обережно збовтують до повного розчинення солей і доводять водою Р до мітки.

Розчин використовують свіжоприготованим.

2. Приготування випробуваного розчину. У пробірку місткістю 30 мл поміщають 1,0 мл препарату і додають 20,0 мл 0,9% розчину натрію хлориду Р.

Розчин використовують свіжоприготованим.

3. Приготування розчину порівняння. 1,0 мл ФСЗ ДФУ розчину альбуміну людського 10% для визначення високомолекулярних домішок поміщають у пробірку місткістю 30 мл і додають 20,0 мл 0,9% розчин натрію хлориду Р.

Розчин використовують свіжоприготованим.

4. Перевірка придатності хроматографічної системи. Хроматографічна система вважається придатною, якщо виконуються наступні умови:

- відносне стандартне відхилення часу утримання піку альбуміну, розраховане з трьох хроматограм розчину порівняння, не перевищує 1,0%;

- відносне стандартне відхилення площі піку (піків) високомолекулярних домішок, розраховане з трьох хроматограм розчину порівняння, не перевищує 5,0%.

3.15. Кількісне визначення:

3.15.1. Білковий склад. (Альбумін) Випробовування проводять методом зонного електрофорезу (ДФУ, р. 2.2.31). Препарат розводять 0.9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білка 2.0%. В електродні секції розділювальної камери апарату для електрофорезу на попередньо підготовані плівки із ацетату целюлози наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.4 до риски, що позначена на камері. 4 мкл випробуваного розчину препарату наносять на зволожені плівки розміром 90 x 90 мм, які заправлені в спеціальні рамки. Паралельно для ідентифікації фракцій наносять ФСЗ ДФУ розчин альбуміну людини 10% підготовленого аналогічно випробуваному розчину. Попередньо зразки фарбують розчином бромфенолового синього Р, що дозволяє контролювати нанесення проб і рух фракцій.

Рамки поміщають в камері так, щоб лінія нанесення проб знаходилась ближче до катоду. Камеру закривають кришкою, включають джерело живлення (сила струму від 8 до 10 мА, напруга 110 В). Розділення проводять від 30 до 40 хвилин. Потім прилад вимикають. Рамки з плівками виймають із камери і підсушують на повітрі протягом 10 хвилин. Плівки виймають із рамок пінцетом, уникаючи контакту з ділянками, де проходив електрофорез препарату.

Плівки відрізають з двох сторін (близько 2.5 мм), поміщають в кювету з 50 мл розчину фарбника амідочорного 10 Б і витримують протягом 5 хвилин. Плівку виймають із кювети, дають час на стікання надлишкової рідини і почергово на 5 хвилин поміщають в три кювети, які містять по 100 мл розчину для відмивання електрофореграм. Фон плівки після відмивання повинен бути білого кольору. Потім плівку промивають водою Р і сушать між листами фільтрувального паперу.

Ідентифікацію білкових фракцій препарату проводять шляхом порівняння його електрофореграми з електрофореграмою ФСЗ ДФУ розчин альбуміну людини 10%, отриманої при цьому ж розділенні.

Кількісне визначення альбуміну проводять:

- шляхом обробки електрофореграм методом денситометрування (TotaLab v2.01, Amersham Parmacia, США, або з використанням аналогічного обладнання);

- елюції його з плівки з наступним спектрофотометруванням двох паралельних нанесень:

Для елювання фракцій плівку розрізають на окремі електрофореграми. Вирізають окремі фракції з препаратом, поміщають кожний відрізок у пробірку і додають 3 мл елюючого розчину. Елюцію проводять в темному місці протягом 40 хвилин при багаторазовому струшуванні. Вимірюють оптичну густину елюату на спектрофотометрі при довжині хвилі 620 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину елюат незафарбованої ділянки електрофореграми. Суму значень оптичної густини приймають за 100% і розраховують який процент по відношенню до неї складає оптична густина кожної фракції.

Вміст альбуміну в препараті має бути не менше 95%, вміст інших білків - не більше 5%.

Примітки:

1. Підготовка плівки. В кювету поміщають 100 мл барбіталового буферного розчину рН 8.4, потім на поверхню буферного розчину гладкою стороною кладуть плівку із ацетату целюлози, витримують протягом 2 хвилин, після чого її поміщають за допомогою пінцету на дно кювети і витримують протягом 2 хвилин. Плівку виймають пінцетом, надлишок вологи видаляють, промокнувши її поміж двох листів фільтрувального паперу. На зволоженій плівці з матової сторони формують стартові канавки.

Плівки використовують свіжоприготовані.

2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.4. 8.5 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розводять в 600 мл води Р, додають 10 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.

Термін придатності розчину 3 місяці.

3. Приготування розчину бромфенолового синього. 0.05 г бромфенолового синього Р поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 2.0 мл оцтової кислоти льодяної, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.

Термін придатності розчину 6 місяців.

4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 0.5 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в колбу місткістю 250 мл, додають 10 мл кислоти оцтової льодяної Р, 3 г кислоти трихлороцтової Р, 90 мл 96% спирту Р і перемішують. Суміш залишають на 24 години, періодично струшуючи.

Термін придатності розчину 6 місяців.

5. Приготування розчину для відмивки електрофореграм.

700 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 40 мл кислоти оцтової льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.

Термін придатності розчину 6 місяців.

6. Приготування елюючого розчину. 50 мл 0,1 М розчину натрію гідроксиду Р поміщають у колбу місткістю 100 мл, додають 5 мл 0,1 М розчину натрію едетату Р і перемішують.

Термін придатності розчину 3 місяці.

3.15.2. Загальний білок.

Метод А. Готують 0.2% розчин препарату, використовуючи як розчинник 0.9% розчин натрію хлориду Р. 5.0 мл отриманого розчину поміщають в пробірку місткістю 20 мл, додають 5.0 мл біуретового реактиву Р і перемішують.

Через 30 хвилин вимірюють оптичну густину отриманого розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву Р.

Паралельно аналогічно розчину, що випробовується, в тих же умовах вимірюють оптичну густину розчину, що містить 5.0 мл розчину порівняння і 5.0 мл біуретового реактиву Р, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву.

Вміст білку (Х) в 1 мл препарату, в грамах, розраховують за формулою:

де:

P - вміст білку в ФСЗ розчин альбуміну людини 10%, в грамах в 1 мл;

а - розведення препарату при приготування випробуваного розчину.

S - кількість препарату, взятого для приготування випробуваного розчину, мл.

Примітка. Приготування розчину порівняння. 1.0 мл ФСЗ ДФУ розчин альбуміну людини 10% поміщають в мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину 0.9% розчином натрію хлориду Р до мітки і перемішують.

Термін придатності розчину 2 доби при температурі від 4 до 8 град. С.

Метод Б. Препарат розводять 0.9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білка близько 15 мг в 2 мл. 2 мл приготовленого розчину поміщають в центрифужну пробірку і додають 2 мл розчину 75 г/л молибдату натрія Р і 2 мл суміші одного об'єму без азотної кислоти сірчаної Р і 30 об'ємів води Р. Обережно струшують та центрифугують 20 хвилин при 6000 об/хв. Над осадову рідину зливають, пробірку перевертають на фільтрувальний папір для дренування.

Визначають азот після мінералізації сірчаною кислотою згідно ДФУ 1 вид., р. 2.5.9. Кількість білка розраховують, помноживши кількість азоту на 6,25.

1 мл препарату повинен містити:

від 0.045 до 0.055 білку для альбуміну розчину 5%;

від 0.09 до 0.11 г білку для альбуміну розчину 10%;

від 0.150 до 0.250 г білку для альбуміну розчину 20%.

3.15.3. Калій-іон. Випробування проводять згідно ДФУ, 1 вид. р. 2.2.22, вимірюючи інтенсивність емісії при 589 нм або нижченаведеним методом.

1.0 мл препарату поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. Вимірюють емісію отриманого розчину на полум'яному фотометрі типу ПАЖ, проводячи не менше 5 паралельних вимірювань. Калібровку приладу проводять як описано в примітках до п. 17.

Вміст калій-іону (К ) в 1 мл препарату повинен бути не більше 0.05 мМоль.

3.15.4. Натрій-іон. Випробування проводять згідно ДФУ, 1 вид. р. 2.2.22, вимірюючи інтенсивність емісії при 589 нм або нижченаведеним методом.

10,0 мл препарату поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. 1,0 мл отриманого розчину поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину до мітки і перемішують. Вимірюють емісію отриманого розчину на полум'яному фотометрі типу ПАЖ, проводячи не менше 5 паралельних вимірювань. Калібровку приладу проводять як описано в примітках.

Вміст натрій-іону (Na ) в 1 л препарату повинен бути не меншим 90 мМоль та більше 160 мМоль.

Примітки:

1. Підготовка до проведення випробування на полум'яному фотометрі. Перед випробуванням проводять калібровку приладу по розчинам порівняння К1, К2, К3, К4, К5 для визначення калій-іону або Na1, Na2, Na3, Na4, Na5 для визначення натрій-іону у відповідності з інструкцією до приладу. Результати калібровки виражають в ммоль/мл для калій-іону та в в ммоль/л для натрій-іону. Розраховують вміст калій-іону у відповідній наважці калія хлориду, використовуваючи коефіцієнт 0,524. Розраховують вміст натрій-іону у відповідній наважці натрію хлориду, використовуваючи коефіцієнт 0,393.

2. Приготування розчинів порівняння для визначення калій-іону. 0.31 г (точна наважка) калію хлориду Р і 7.8 г (точна наважка) натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 250 мл, розчиняють в 100 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. 10.0 мл отриманого розчину поміщають в мірну колбу місткістю 100 мл, доводять об'єм розчину водою Р до мітки та перемішують (розчин А).

Термін придатності розчину А 1 місяць.

1.0 мл, 2.0 мл, 3.0 мл, 4.0 мл і 5.0 мл розчину А поміщають в мірні колби місткістю 100 мл, доводять об'єми розчинів водою Р до мітки і перемішують, отримуючи розчини порівняння К1, К2, К3, К4, К5 з концентрацією калію 0.17 мМоль; 0.33 мМоль; 0.50 мМоль; 0.067 мМоль і 0.83 мМоль відповідно.

Термін придатності розчинів 1 доба.

3. Приготування розчинів порівняння для визначення натрій-іону. 2.0 мл, 4.0 мл, 5.0 мл, 6.0 мл і 8.0 мл розчину порівняння К3 для визначення калій-іону поміщають у мірні колби місткістю 50 мл, доводять об'єми розчинів водою Р до мітки і перемішують, отримуючи розчини порівняння Na1, Na2, Na3, Na4, Na5 з концентрацією натрію 0.64 мМоль; 1.28 мМоль; 1.6 мМоль; 1.92 мМоль і 2.56 мМоль відповідно.

Термін придатності розчинів 1 доба.

3.15.5. Натрій каприловокислий (октаноат). Вміст натрію каприловокислого (октаноату):

від 1.4 до 1.6 г/л для розчину альбуміну 5%;

від 2.8 до 3.2 г/л для розчину альбуміну розчину 10%;

від 5.6 до 6.3 г/л для розчину альбуміну 20%.

Виначення проводять методом рідинної хроматографії (2.2.29).

По 10 мкл розчину препарату і розчину порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ-детектором, одержуючі не менше ніж 3 хроматограми кожного з розчинів, у наступних умовах:

- колонка з нерухомою фазою октадецилсилил силікагель (С18), розміром 250 x 4.6 мм, з розміром часток 5 мкм або аналогічна, для якої виконуються умови тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";

- детектування при довжині хвилі 210 нм;

- температура колонки: 40 град. С;

- рухома фаза А: ацетатний буферний розчин;

Б: ацетонітрил для хроматографії Р1 : фосфатний буферний розчин (9:1)

C: ацетонітрил для хроматографії Р1 : 1% кислота трифтороцтова (9:1)

- програма градієнта: