---------------
* На цій стадії обертають потік через колонку в протилежну сторону.
Хроматограму записують 35 хвилин.
Розрахунок вмісту натрію каприловокислого (октаноату) (у г/л) проводять за формулою:
m x S x 10
0
X = -------------
S
0
де,
m - маса наважки, г
0
S - середнє значення площ піків натрію каприловокислого,
0
розраховане з хроматограм розчину порівняння;
S - середнє значення площ піків натрію каприловокислого, розраховане з хроматограм розчину препарату;
10 - коефіцієнт перерахування в літри.
Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи".
Примітки:
1. Приготування розчину порівняння. Близько 0.15 г (точна наважка) октаноата натрію для розчину альбуміну 5%; 0.3 г (точна наважка) октаноата натрію для розчину альбуміну 10%; 0.6 г (точна наважка) октаноата натрію для розчину альбуміну 20% поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 50 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують. Розчин використовують свіжоприготованим.
2. Приготування рухомої фази А. 1.5 г натрію ацетату Р поміщають у колбу місткістю 1 л, розчиняють у воді для хроматографії Р, доводять об'єм розчину до 1 л. По краплях додають кислоту оцтову Р до рН від 2.9 до 3.1. Розчин фільтрують через мембрану з діаметром пор 0.45 мкм і дегазують будь-яким зручним способом. Термін придатності розчину - 3 доби.
3. Приготування рухомої фази Б. 50 мл рухомої фази А поміщають у мірний циліндр місткістю 500 мл, додають 1 мл кислоти оцтової Р і доводять об'єм ацетонітрилом для хроматографії Р1 до 500 мл. Термін придатності розчину - 1 міс.
4. Приготування рухомої фази C. У колбу місткістю 50 мл поміщають 0.5 мл кислоти трифтороцтової, розчиняють у 20 мл води для хроматографії Р, доводять об'єм до 50 мл водою для хроматографії Р і перемішують. 50 мл отриманого розчину поміщають у мірний циліндр місткістю 500 мл і доводять об'єм ацетонітрилом для хроматографії Р до 500 мл.
Термін придатності розчину - 1 міс.
5. Перевірка придатності хроматографічної системи. Хроматографічна система вважається придатної, якщо виконуються наступні вимоги:
- ефективність хроматографічної колонки, розрахована по піку натрію каприловокислого з хроматограми розчину порівняння, повинна бути не менше 20 000 теоретичних тарілок;
- коефіцієнт симетрії піка натрію каприловокислого з хроматограми розчину порівняння, повинен бути не менш 0.7 і не більше 1.5;
- відносне стандартне відхилення площ піків натрію каприловокислого, розраховане з трьох хроматограм розчину порівняння, не повинне перевищувати 2%.
3.16. Пакування. По 10, 20, 50, 100, 250 або 400 мл в пляшки скляні у відповідності до вимог ДФУ, вид. 1, доповнення 1, р. 3.2.1. Закорковані гумовими закупорювальними засобами для контейнерів з водними лікарськими засобами для парентерального застосування, для порошків і ліофілізованих продуктів у відповідності до вимог ДФУ, вид. 1, р. 3.2.9 і обтисненні ковпачками алюмінієвими типу К-1, К-3 та К-5 за ТУ У 14257180.003-98 або за ТУ У 30883300.001-2000.
На пляшки наклеюють етикетки із паперу етикеткового або для письма.
Кожну пляшку разом з інструкцією по застосуванню пакують в індивідуальну пачку з картону.
За домовленості із споживачем пляшки можуть пакуватися в групову тару без використання індивідуальних пачок.
На пачку наклеюють етикетку із паперу етикеткового або для письма або ж текст етикетки наносять на пачку друкарським способом.
3.17. Маркування. На етикетці і пачці українською або українською та російською мовою вказують: найменування підприємства-виробника, його товарний знак та адресу; назву препарату українською мовою та латиною або українською, російською мовою та латиною; концентрацію альбуміну людини у відсотках; об'єм препарату в мілілітрах; вміст іонів натрію та калію; умови зберігання, номер серії, реєстраційний номер, термін придатності, штриховий код. Маркування передбачає нанесення написів: "Стерильно"; "Застосовувати за призначенням лікаря".
Номер серії та термін придатності препарату дозволяться наносити на бічній стороні пачки методом тиснення.
На етикетці групової тари додатково вказують кількість пакувань.
Транспортне маркування відповідно до ГОСТ 14192-96.
Транспортування. Всіма видами критого транспорту при температурі від 2 до 8 град. С.
Зберігання. У сухому, захищеному від світла місці при температурі від 2 до 8 град. С.
Термін придатності. За результатами вивчення стабільності
Примітка. Реактиви, титровані розчини і індикатори, наведені в даному керівництві, описані у ДФУ, 1 вид.
| Перший заступник Голови Державної служби лікарських засобів і виробів медичного призначення | І.Б.Демченко |
ЗАТВЕРДЖЕНО
Наказ Міністерства охорони
здоров'я України
02.06.2005 N 247
Державний Герб України
МЕДИЧНІ ІМУНОБІОЛОГІЧНІ ПРЕПАРАТИ
Настанова з якості
Керівництво по складанню аналітично-нормативної
документації на імуноглобулін людини нормальний, рідкий
Настанова 42-3002-003-2005
| Київ |
Міністерство охорони здоров'я України
| 2005 |
ЗМІСТ
1. Сфера застосування та основні вимоги
2. Специфікація
3. Методи контролю
3.1. Опис
3.2. Автентичність (ідентифікація)
3.3. Прозорість
3.4. Кольоровість
3.5. Механічні включення
3.6. рН
3.7. Білок
3.8. Склад білків. (Електрофоретична однорідність)
3.9. Фракційний склад
3.10. Гліцин
3.11. Молекулярні параметри
3.12. Об'єм, що витягається
3.13. Стерильність
3.14. Пірогенність
3.15. Аномальна токсичність
3.16. Специфічна безпечність
3.17. Кількісне визначення специфічної активності
1. Сфера застосування та основні вимоги.
Це керівництво по складанню аналітично-нормативної документації поширюється на медичний імунобіологічний препарат Імуноглобулін людини нормальний, рідкий, що містить імуноглобуліни, переважно імуноглобулін G (IgG). Допускається присутність інших білків. Імуноглобулін людини нормальний містить антитіла G (IgG) нормальної людини. Препарат призначений для внутрішньом'язевого введення. Імуноглобулін людини нормальний отримують з плазми, яка відповідає вимогам нормативного документу "Плазма людини для фракціонування".
Імуноглобулін людини нормальний виробляють із суміші плазми або сироватки людини від не менше як 1000 донорів. При виготовленні препарату виробничі пули плазми повинні перевірятися методом полімеразної ланцюгової реакції на вміст нуклеїнових кислот вірусу гепатиту С, вірусу гепатиту В, парвовірусу В-19, ВІЛ 1 та 2.
Імуноглобулінову фракцію білків сироватки або плазми крові донорів виділяють, очищують і концентрують методом фракціонування спиртоводними осадниками при температурі нижче 0 град. С.
Кінцевий продукт:
- не переносить інфекцій;
- при концентрації білку 0,1 грам в одному мілілітрі містить відповідно до Міжнародного стандарту або стандартного препарату не менше двох типів антитіл (одне вірусне, одне бактеріальне).
Імуноглобулін людини нормальний виробляється як стабілізований розчин, наприклад в розчині 9 г/л розчину хлориду натрію, 22.5 г/л розчину гліцину. Розчин імуноглобуліну фільтрують в асептичних умовах через стерилізуючий фільтр з діаметром пор не більше 0.22 мкм.
Стабільність препарату підтверджується відповідними дослідженнями, які тривають протягом етапів розробки.
Засіб для профілактики вірусного гепатиту А, кору, кашлюку, менінгококової інфекції, поліомієліту, лікування гіпо- і агамаглобулінемій, для підвищення імунного статусу в період реконвалесценції при деяких інфекційних і неінфекційних захворюваннях.
2. Специфікація
СПЕЦИФІКАЦІЯ
3. Методи контролю
3.1. Опис. Прозора або злегка опалесцююча, безбарвна або жовтувата рідина. У процесі зберігання можлива поява незначного осаду, що зникає при струшуванні.
3.2. Автентичність (ідентифікація):
А) На електрофореграмі досліджуваного препарату, отриманої при електрофоретичному визначенні імуноглобуліну, основні компоненти білкових фракцій повинні бути ідентичні за електрофоретичною рухомістю основним білковим фракціям ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну людини 10%.
Б) У препараті повинні виявлятися білки, властиві тільки плазмі або сироватці крові людини, і відсутні білки тваринного походження. Визначення проводять методом імуноелектрофорезу відповідно до розділу "фракційний склад".
3.3. Прозорість. Вимірюють оптичну густину препарату на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. (ДФУ, 1 вид. і Доповнення 1, р. 2.2.25).
Оптична густина не повинна перевищувати 0.165.
3.4. Кольоровість. Вимірюють оптичну густину препарату на спектрофотометрі при довжині хвилі 400 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. (ДФУ, 1 вид. і Доповнення 1, р. 2.2.25).
Оптична густина не повинна перевищувати 0.5.
3.5. Механічні включення. Препарат має відповідати вимогам, зазначеним в Інструкції з контролю лікарських засобів для парентерального застосування на механічні включення (РД 42У-001-93).
3.6. рН. Від 5.0 до 7.2. Готують розведення препарату 9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білку 10 г/л. Визначення проводять потенціометрично, ГФ Х1, вип. 1, с. 113.
3.7. Білок. 1 мл препарату повинен містити від 0.09 до 0.11 г білку.
Метод А. 1 мл препарату поміщають в мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р, перемішують 5.0 мл отриманого розчину, поміщають в пробірку місткістю 20 мл, додають 5.0 мл біуретового реактиву Р і перемішують.
Через 30 хв вимірюють оптичну густину отриманого розчину на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву Р.
Паралельно, аналогічно випробуваному розчину, в тих же умовах вимірюють оптичну густину розчину, що містить 5.0 мл розчину порівняння і 5.0 мл біуретового реактиву Р, використовуючи в якості компенсаційного розчину розчин, що містить 5.0 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р і 5.0 мл біуретового реактиву.
Вміст білку (X) в 1 мл препарату, в грамах, розраховують за формулою:
D x C x 1 x 50 x 5 D x C
1 1
X = --------------------- = --------
D x 1 x 50 x 5 D
0 0
де:
C - вміст білку в ФСЗ розчину імуноглобуліну людини 10%, в грамах в 1 мл;
D - оптична густина випробуваного розчину;
1
D - оптична густина розчину порівняння
0
1 мл препарату повинен містити від 0.09 до 0.11 г білку.
Примітка. Приготування розчину порівняння. 1.0 мл ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% поміщають в мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 2 доби при температурі (6 +- 2) град. С.
Метод Б. Препарат розводять 0.9% розчином натрію хлориду Р до концентрації білка близько 15 мг в 2 мл. 2 мл приготовленого розчину поміщають в центрифужну пробірку і додають 2 мл розчину 75 г/л молібдату натрію Р і 2 мл суміші одного об'єму без азотної кислоти сірчаної Р і 30 об'ємів води Р. Обережно струшують та центрифугують 20 хвилин при 6000 об/хв. Надосадову рідину зливають, пробірку перевертають на фільтрувальний папір для дренування.
Визначають азот після мінералізації сірчаною кислотою згідно ДФУ 1 вид., р. 2.5.9. Кількість білка розраховують, помноживши кількість азоту на 6.25.
3.8. Склад білків. (Електрофоретична однорідність). Фракція імуноглобуліну повинна складати не менше 95% від загального білку.
В електродні секції розділювальної камери апарату для електрофорезу на попередньо підготовані плівки із ацетату целюлози наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.4 до риски, що позначена на камері. 4 мкл препарату наносять на зволожені плівки розміром 90 x 90 мм, які заправлені в спеціальні рамки. Паралельно для ідентифікації фракцій наносять ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну людини 10%. Попередньо зразки фарбують розчином бромфенолового синього Р, що дозволяє контролювати нанесення проб і рух фракцій.
Рамки поміщають в камері так, щоб лінія нанесення проб знаходилась ближче до катоду. Камеру закривають кришкою, включають джерело живлення (сила струму від 8 до 10 мА, напруга 110 В). Розділення проводять від 30 до 40 хвилин. Потім прилад вимикають. Рамки з плівками виймають із камери і підсушують на повітрі протягом 10 хвилин. Плівки виймають із рамок пінцетом, уникаючи контакту з ділянками, де проходив електрофорез препарату.
Плівки відрізають з двох сторін (близько 2.5 мм), поміщають в кювету з 50 мл розчину фарбника амідочорного 10 Б і витримують протягом 5 хвилин. Зменшуючи концентрацію фарбника, час фарбування можна збільшити до 10 хвилин. Плівку виймають із кювети, дають час на стікання надлишкової рідини і почергово на 5 хвилин поміщають в три кювети, які містять по 100 мл розчину для відмивання електрофореграм. Фон плівки після відмивання повинен бути білого кольору. Потім плівку промивають водою Р і сушать між листами фільтрувального паперу.
Ідентифікацію білкових фракцій препарату проводять шляхом порівняння його електрофореграми з електрофореграмою ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну людини 10%, отриманої при цьому ж розділенні.
Визначення білкового складу (імуноглобуліну) проводять:
- шляхом обробки електрофореграм методом денситометрування (TotaLab v2.01, Amersham Parmacia, США, або з використанням аналогічного обладнання) або елюції його з плівки з наступним спектрофотометруванням двох паралельних нанесень:
плівку розрізають на окремі електрофореграми. Вирізають окремі фракції з препаратом, поміщають кожний відрізок у пробірку і додають 3 мл елюючого розчину. Елюцію проводять в темному місці протягом 40 хвилин при багаторазовому струшуванні. Вимірюють оптичну густину елюату на спектрофотометрі при довжині хвилі 620 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм, використовуючи в якості компенсаційного розчину елюат незафарбованої ділянки електрофореграми. Суму значень оптичної густини приймають за 100% і визначають який процент по відношенню до неї складає оптична густина кожної фракції.
Вміст імуноглобуліну в препараті має бути не менше 95%, вміст інших білків - не більше 5%.
Примітки:
1. Підготовка плівки. В кювету поміщають 100 мл барбіталового буферного розчину рН 8.4, потім на поверхню буферного розчину гладкою стороною кладуть плівку із ацетату целюлози, витримують протягом 2 хвилин, після чого її поміщають за допомогою пінцету на дно кювети і витримують протягом 2 хвилин. Плівку виймають пінцетом, надлишок вологи видаляють, промокнувши її поміж двох листів фільтрувального паперу. На зволоженій плівці з матової сторони формують стартові канавки.
Плівки використовують свіжоприготовані.
2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.4. 8.5 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розводять в 600 мл води Р, додають 11 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину - 3 місяці.
3. Приготування розчину бромфенолового синього. 0.05 г бромфенолового синього Р поміщають у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у 2.0 мл оцтової кислоти льодяної, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину 6 місяців.
4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 0.5 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в колбу місткістю 250 мл, додають 10 мл кислоти оцтової льодяної Р, 3 г кислоти трихлороцтової Р, 90 мл 96% спирту Р і перемішують. Суміш залишають на 24 години, періодично струшуючи.
Термін придатності розчину - 6 місяців.
5. Приготування розчину для відмивки електрофореграм.
700 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 40 мл кислоти оцтової льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін придатності розчину - 6 місяців.
6. Приготування елюючого розчину. 50 мл 0,1 М розчину натрію гідроксиду Р поміщають у колбу місткістю 100 мл, додають 5 мл 0,1 М розчину натрію едетату Р і перемішують.
Термін придатності розчину - 3 місяці.
3.9. Фракційний склад. Визначення проводять методом імуноелектрофорезу, використовуючи комерційну антисироватку проти білків сироватки крові людини.
На імунофореграмі повинна виявлятися інтенсивна дуга преципітації Ig G та не більше 4 додаткових дуг, що відповідають Ig А, Ig М, та двом іншим імунологічно неактивним фракціям.
По 2 мкл препарату поміщають в лунки пластинки з агаровим гелем. Паралельно в одну з лунок поміщають 2 мкл нормальної сироватки або плазми.
В електродні камери апарату для електрофорезу наливають барбіталовий буферний розчин рН 8.2 і поміщають пластинки з агаровим гелем. На обидва кінці пластинок поміщають смужки хроматографічного або фільтрувального паперу, розміром 120 x 60 мм, складених у 6 шарів, які з'єднують з електродними камерами. Електрофорез проводять при силі струму 10 мА, напрузі 100 В протягом 1.5 год.
Після проведення електрофорезу між лунками в агаровому гелі вирізають траншеї (10 х 2 мм), в кожну з них вносять 60 мкл видоспецифічної антисироватки, яка преципітує сироваткові білки людини (ІмБіо, Росія, або аналогічної якості) та сироватки биків, кіз, овець, коней (Імтек, Росія або аналогічної якості). Пластинку поміщають в камеру, в яку ставлять бюкс з 100 мл води Р (для зволоження) і декількома кристалами фенолу Р (консервант). Через 24 години пластинку виймають з камери, занурюють в кювету з 250 мл ізотонічного 0,9% розчину натрію хлориду Р, що містить декілька кристалів фенолу Р, і відмивають протягом 2 діб від білку, який не прийняв участі в утворенні преципітату. Розчин замінюють 4 рази на добу.
Відмиту пластинку висушують на повітрі протягом 1 год, занурюють у розчин фарбника амідочорного 10 ВР (ЕР) на 2 год. Потім пластинку виймають, дають змогу стекти фарбнику і занурюють в 2% розчин кислоти оцтової Р на 2 доби для відмивання від надлишку розчину фарбника. 2% розчин кислоти оцтової Р замінюють 4 рази на добу.
Для тесту "ідентифікація" оцінюють локалізацію і число ліній преципітації препарату відносно ліній преципітації сироватки крові людини, яка повинна проявляти не менше 15 ліній преципітації зі своєю антисироваткою. Між лунками з препаратом і антисироватками до сироваток крові тварин лінії преципітації повинні бути відсутні.
Примітки:
1. Приготування 1.25% агарового гелю. 12.5 г агару (очищеного) поміщають в хімічний стакан місткістю 1 л, додають 500 мл води Р і залишають для набухання гелю протягом 1 години при температурі від 18 до 20 град. С. Стакан поміщають на водяну баню, що кипить, і витримують до повного розчинення агару. Об'єм розчину гелю доводять водою Р до 500 мл, додають 500 мл барбіталового буферного розчину рН 8.2, перемішують, фільтрують через марлю медичну, складену в 3 шари, додають мертіолят до концентрації 100 мкг/мл і розливають у флакони по 50 мл. Перед використанням агаровий гель розплавляють на водяній бані.
Термін придатності гелю - 2 доби.
2. Приготування барбіталового буферного розчину рН 8.2. 47.6 г барбітал-натрію (медінал; 5.5 - диетилбарбітурат натрію) поміщають у колбу місткістю 5 л, додають 69 мл 1 М розчину хлористоводневої кислоти Р, 4.3 л води Р та перемішують до розчинення солей. рН розчину визначають потенціометрично (ДФУ, 1 вид. р. 2.2.3) і при необхідності коректують 1 М розчином хлористоводневої кислоти Р.
Термін придатності розчину - 3 місяці.
3. Приготування пластинок з агаровим гелем. На скляні пластинки (краще використовувати фотопластинки) розміром 120 x 90 мм наносять піпеткою 10 мл розплавленого на водяній бані при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю і розтирають шпателем до отримання тонкого шару, щоб агаровий гель краще липнув до скла.
Пластинку висушують при температурі від 75 до 80 град. С протягом 5 хвилин.
Потім пластинку поміщають на горизонтальну поверхню і обережно, уникаючи утворення пухирців повітря, наливають 30 мл розплавленого при температурі від 60 до 80 град. С 1.25% агарового гелю до отримання шару товщиною 2-3 мм. Після застигання агарового гелю вирізають 7 лунок діаметром 2-3 мм, використовуючи для цього штамп.
Пластинки використовують протягом 1 доби.
4. Приготування розчину фарбника амідочорного 10 Б. 1.0 г амідочорного 10 Б (Мерк 2005-2007, К N 101167 або аналогічної якості) поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 450 мл 0,1 М розчину оцтової кислоти Р, доводять об'єм розчину 0.1 М розчином натрію ацетату Р до мітки і перемішують.
Термін зберігання розчину - 3 місяці.
5. Приготування 2% розчину кислоти оцтової Р. 300 мл води Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, додають 20 мл оцтової кислоти льодяної Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки і перемішують.
Термін зберігання розчину - 3 місяці.
6. Приготування ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р. 9.0 г натрію хлориду Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину - 7 діб.
7. Приготування 0,1 М розчину натрію ацетату Р. 9.8 г натрію ацетату Р поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину - 7 діб.
8. Приготування 0,1 М розчину оцтової кислоти Р. 6 г оцтової кислоти льодяної поміщають в мірну колбу місткістю 1 л, розчиняють в 500 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до мітки, перемішують.
Термін зберігання розчину - 7 діб.
3.10. Гліцин (Глікокол). Випробування проводять методом рідинної хроматографії (ДФУ, 1 вид., р. 2.2.29).
Об'єднаний вміст від необхідної кількості ампул поміщають у мірну колбу місткістю 5.0 мл і доводять об'єм розчину до позначки. Вміст мірної колби кількісно переносять водою Р у мірну колбу місткістю 50 мл, доводять об'єм розчину до позначки водою Р і перемішують. Усі наступні операції з розчинами виконують, захищаючи їх від дії світла. 0.50 мл отриманого розчину поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл зі скляною або фторопластовою пробкою, додають 0.05 мл розчину 2,4-динітро-1-фторбензола, 2 мл розчину натрію тетраборату, перемішують і витримують у термостаті при температурі (60 +-2.0) град. С протягом 60 хв. Розчин охолоджують до кімнатної температури, і доводять об'єм розчину рухомою фазою до позначки, перемішують (випробовуваний розчин).
По 20 мкл випробовуваного розчину і розчину порівняння поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ детектором, отримуючи не менше 3 хроматограм для кожного з розчинів, у наступних умовах:
- колонка розміром 4.6 x 125 мм, заповнена сорбентом LiChrosorb ODS з розміром часток 5 мкм (Merck) або аналогічна, для якої виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";
- рухома фаза: ацетонітрил Р - 0,1 М розчин натрію дигідрофосфату (з рН, доведеним до 2.5 +- 0.1) (25:75), дегазована будь-яким зручним способом;
- швидкість рухомої фази 1.0 мл/хв;
- детектування за довжини хвилі 360 нм;
- температура колонки 30 град. С.
На хроматограмі присутні наступні піки: динітрофенільне похідне гліцину - основний пік з відносним часом утримування 1.0, також можуть бути присутніми домішки реактиву (мінорні піки) з відносними часами утримування близько 1.3 і 2. При необхідності склад рухомої фази може бути відкоректованим: збільшення концентрації ацетонітрилу зменшує час утримування всіх піків; зміна концентрації натрію дигідрофосфату змінює селективність розподілу динітрофенільного похідного гліцину і домішок реактиву.
Вміст гліцину (X) у ампулі (флаконі), у грамах, обчислюють за формулою:
S x m 50 x 25 x 0.5 x 100 S x m x 20
0 0
X = --------------------------- = ------------
S x 5 x 0.5 x 50 x 25 S
0 0
де S - середнє значення площ піків динітрофенільного похідного гліцину, обчислене з хроматограм випробовуваного розчину;
S - середнє значення площ піків динітрофенільного похідного
0
гліцину, обчислене з хроматограм розчину порівняння;
m - маса наважки ФСЗ ДФУ гліцину, у грамах.
0
Вміст C H NO (гліцину) в рідині імуноглобуліну повинен бути
2 5 2
від 1.5% до 3.0%.
Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи".
Примітки:
1. Приготування розчину порівняння. Близько 0.117 г (точна наважка) ФСЗ ДФУ гліцину поміщають у мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють у 80 мл води Р з рН, доведеним кислотою фосфорною Р до 2.0 +- 0.1 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид., р. 2.2.3), доводять об'єм розчину цією ж водою до позначки та перемішують. Далі поступають аналогічно випробовуваному розчину, починаючи зі слів: "0.5 мл отриманого розчину ...".
Термін придатності розчину - 2 доби.
2. Приготування розчину 2,4-динітро-1-фторбензола. 0.60 г 2,4-динітро-1-фторбензолу (Фірма "Sigma", кат. N D1529, або реактив аналогічної якості) розчиняють на водяній бані в 20 мл 2-пропанола Р.
Термін придатності розчину 2 місяці при зберіганні в захищеному від світла місці при температурі від +2 град. С до +8 град. С.
3. Приготування 0,1 М розчину натрію дигідрофосфату. 15,7 г натрію дигідрофосфату Р поміщають у мірну колбу місткістю 1000 мл, розчиняють у 200 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до позначки і перемішують. Доводять рН фосфорною кислотою Р до 2,5 +- 0,1 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид., р.2.2.3).
Термін придатності розчину - 14 діб.
4. Приготування розчину натрію тетраборату. 3,82 г натрію тетраборату декагідрату ("Aldrich" 2004, кат. N 22,133-3) поміщають у мірну колбу місткістю 1000 мл, розчиняють у 200 мл води Р, доводять об'єм розчину водою Р до позначки і перемішують.
Термін придатності розчину - 3 міс.
5. Приготування розчину для перевірки придатності хроматографічної системи. Всі операції з розчинами виконують, захищаючи їх від дії світла. 0.50 мл води Р з рН, доведеним кислотою фосфорною Р до 2.0 +- 0.1 (потенціометрично, ДФУ, 1 вид., р. 2.2.3) поміщають у мірну колбу місткістю 25 мл зі скляною або фторопластовою пробкою, і далі виконують операції як з випробовуваним розчином, починаючи зі слів "додають 0.05 мл розчину 2,4-динітро-1-фторбензола ...".
Термін придатності розчину - 7 діб.
6. Перевірка придатності хроматографічної системи. Для перевірки придатності хроматографічної системи хроматографують 20 мкл розчину в умовах, описаних вище. На отриманих хроматограмах повинні спостерігатися два піки з часами утримування, що перевищують таке для динітрофенільного похідного гліцину (близько 8 хв). Селективність хроматографічної системи повинна бути відрегульована таким чином, щоб на хроматограмі розчину порівняння обидва піки домішок розділялися з піком динітрофенільного похідного гліцину і мали час утримування не більше 20 хв.
Хроматографічна система вважається придатною, якщо для хроматограм розчину порівняння виконуються наступні умови (ДФУ, 1 вид., р. 2.2.29):
- ефективність хроматографічної колонки, розрахована за піком динітрофенільного похідного гліцину, повинна бути не менше 3000 теоретичних тарілок;
- ступінь розподілу піка динітрофенільного похідного гліцину з будь-якими найближчими піками повинна бути не менше 1.5;
- відносне стандартне відхилення, розраховане для площі піка динітрофенільного похідного гліцину, повинне бути не більше 1.0%;
- коефіцієнт симетрії піка, розрахований за піком динітрофенільного похідного гліцину, повинний бути не менше 0.9 і не більше 1.5.
3.11. Молекулярні параметри. Відсотковий вміст фракцій у препараті повинен бути наступний:
полімери та агрегати - не більше 10%,
мономери та димери - не менше 85% ,
У пробірку місткістю 30 мл поміщають 1 мл препарату і додають 20 мл 0.9% розчину хлориду натрію.
По 50 мкл розчинів препарату і стандарту поперемінно хроматографують на рідинному хроматографі з УФ детектором, отримуючи не менше 3 хроматограм кожного з розчинів у наступних умовах:
- колонка TSKgel SW 3000 або інша, для якої виконуються
xl
вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної системи";
- рухома фаза: фосфатний буферний розчин, що містить 11.688 г хлориду натрію і 50 мг азиду натрію на 1 л, дегазована будь-яким зручним способом;
- швидкість рухомої фази - 0.5 мл/хв;
- детектування при довжині хвилі - 280 нм;
- температура колонки - +30 град. С;
На хроматограмі розчину калібрувального стандарту найбільший пік відповідає мономеру Ig G, пік з відносним часом утримання близько 0.85 відповідає димеру. Пік полімерів має відносний час утримання близько 0.70 відносно піку мономеру. Піки на хроматограмі досліджуваного розчину ідентифікують, порівнюючи їх з піками на хроматограмі розчину ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% для визначення високомолекулярних домішок. Відносний час утримання піків мономеру і димеру на хроматограмі досліджуваного розчину становить 1 +- 0.02 відносно піків мономеру і димеру на хроматограмі розчину стандарту, відносний час утримання піків полімерів і агрегатів на хроматограмі досліджуваного розчину становить 1 +- 0.03 відносно піків полімерів і агрегатів на хроматограмі розчину стандарту. Піки з часом утримання більшим, ніж час утримання мономеру відносять до фрагментів. Сума площ піків мономеру і димеру повинна бути не меншою 85% загальної площі всіх піків на хроматограмі, сума площ піків полімерів і агрегатів не повинна перевищувати 10% загальної площі всіх піків на хроматограмі. Результати аналізу вважаються достовірними, якщо виконуються вимоги тесту "Перевірка придатності хроматографічної смстеми".
Примітки:
1. Приготування рухомої фази. У мірній колбі місткістю 1 л зважують 4.873 г двозаміщеної натрієвої солі ортофосфорної кислоти двохводної, 1.741 г однозаміщеної натрієвої солі ортофосфорної кислоти одноводної, 11.688 г хлориду натрію і 50 мг азиду натрію. Доливають 500 мл води для ВЕРХ, обережно збовтують до повного розчинення солей і доводять водою для ВЕРХ до мітки. Розчин використовують свіжоприготованим.
2. Приготування розчину стандарту. 1 мл ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% для визначення високомолекулярних домішок поміщають у пробірку місткістю 30 мл і додають 20 мл 0.9% розчину хлориду натрію. Розчин використовують свіжоприготованим.
3. Перевірка придатності хроматографічної системи. Хроматографічна система вважається придатною, якщо виконуються наступні умови:
- відносне стандартне відхилення часу утримання піку мономеру, вирахуване з трьох хроматограм стандартного розчину, не перевищує 2%; ФСЗ ДФУ розчину імуноглобуліну 10% для визначення високомолекулярних домішок імуноглобуліну повинні бути чітко видимі чотири піки: димеру імуноглобуліну, мономеру імуноглобуліну, фрагментів і низькомолекулярних домішок.
3.12. Об'єм, що витягається. Препарат має відповідати вимогам ДФУ, 1 вид., р. 2.9.17.
3.13. Стерильність. Препарат має бути стерильним. Визначення проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид., р. 2.6.1.
Препарат в умовах дослідження не виявляє антимікробної дії.
3.14. Пірогенність. Препарат має бути апірогенним. Тест-доза 1.5 мл препарату на 1 кг маси кроля. Вводити внутрішньовенно протягом 2 хв. Дослідження проводять відповідно вимог до медичних імунобіологічних препаратів (ДФУ, 1 вид., р. 2.6.8).
3.15. Аномальна токсичність. Тест-доза 0.5 мл препарату на 1 мишу. Вводити внутрішньочеревно протягом 5 секунд. Час спостереження 3 доби. Дослідження проводять відповідно до вимог ДФУ, 1 вид., р. 2.6.9.
3.16.Специфічна безпечність.
3.16.1. Контроль на відсутність поверхневого антигену вірусу гепатиту В.
(HBsAg). Визначення проводять імуноферментним методом використовуючи комерційні тест-системами відповідно до інструкцій по застосуванню, що до них додаються. Чутливість методу повинна бути не нижче 0.1 нг/мл.
Препарат не повинен містити поверхневого антигену вірусу гепатиту В.
13.16.2. Антитіла до вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ-1, ВІЛ-2) Визначення проводять імуноферментним методом, використовуючи комерційні тест-системи відповідно до інструкцій по застосуванню, що до них додаються. Чутливість і специфічність повинна бути 98-100%. У випадку одержання позитивного результату необхідно повторити контроль препарату в розведеннях 1:200, 1:400, 1:800. При відсутності позитивного результату в трьох послідовних розведеннях препарат вважається таким, що не містить антитіл до ВІЛ-1, ВІЛ-2 . При одержанні позитивного результату в розведеннях 1:200 та вище, імуноглобулін необхідно досліджувати методом імунного блотингу для підтвердження наявності антитіл до ВІЛ-1, ВІЛ-2. Препарат не повинен містити антитіл до ВІЛ-1, ВІЛ-2.
3.17. Кількісне визначення специфічної активності.
Антитіла до вірусу кору. У препараті повинно бути не менш 1:480 антитіл до вірусу кору в титрі (не менше 37.5 МО на 1 мл). Визначення проводять методом реакції пасивної гемаглютинації відповідно до Інструкції по застосуванню діагностикума еритроцитарного коревого сухого (ФГУ "Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера МЗ РФ" або аналогічні).
Для постановки реакції використовують планшети полістиролові з лунками об'ємом 0.200-0.225 мл зі сферичним дном. Перед постановкою реакції лунки планшета протирають вологим тампоном, змоченим ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р. В усі лунки ряду багатоканальною піпеткою вносять по 0,05 мл розчину НКС 1%. У першу лунку вносять піпеткою 0,05 мл підготовленого розчину імуноглобуліну, і тією же піпеткою, починаючи з першої лунки, препарат перемішують 5 разів та послідовно переносять в усі лунки ряду. Розведення імуноглобуліну виходить від 1:10 до 1:1280. Потім в усі лунки багатоканальною піпеткою вносять по 0.025 мл добре перемішаної 1% суспензії діагностикума коревого еритроцитарного антигенного. Планшет ретельно струшують і залишають при кімнатній температурі на 2 год до повного осідання еритроцитів у контролі (в 4 лунки планшета вносять по 0.05 мл розчину НКС 1% й 0.025 мл 1% суспензії діагностикума). Результати реакції враховують по характеру осідання еритроцитів на дні лунок:
++++ - аглютиновані еритроцити утворюють перевернену "парасольку", краї якої обпадають;
+++ - аглютиновані еритроцити утворюють перевернуту "парасольку", краї якої рівні;
++ - по краю аглютинованих еритроцитів намічається тонке кільце з неаглютинованих еритроцитів;
+ - по краю аглютинованих еритроцитів намічається широке кільце з неаглютинованих еритроцитів.
У контрольних лунках із сенсибілізованими еритроцитами в 1% розчині нормальної кролячої сироватки не повинно бути аглютинації.
Титром імуноглобуліну вважають останнє розведення, що викликає аглютинацію еритроцитів, навантажених коревим антигеном на два хрести (++). Одночасно з випробуваним імуноглобуліном необхідно титрувати ФСЗ ДФУ імуноглобулін з визначеним титром коревих антитіл. Титр коревих антитіл ФСЗ ДФУ імуноглобуліну з визначеним титром коревих антитіл повинен відповідати титру антитіл, зазначених на ампулі.
Примітки:
1. Приготування НКС 1%. У флакон із сухою сироваткою нормальною кролячою (НКС) вносять 2 мл води Р й залишають при кімнатній температурі для розчинення протягом 1 хвилини. Потім додають 18 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р.
Термін придатності розчину - 1 доба при температурі зберігання від 4 град. С до 10 град. С. Сироватку, що погано розчинилася, для реакції не використовують.
2. Приготування розчину діагностикуму коревого еритроцитарного антигенного 1%.
У флакон з коревим діагностикумом вносять 2 мл води Р і залишають при кімнатній температурі на 2 год для набрякання еритроцитів. Потім додають 4 мл розчину НКС 1%.
Розчин використовують свіжоприготовленим.
3. Підготовка імуноглобуліну. Імуноглобуліни випробуваний і контрольний (ФСЗ ДФУ імуноглобулін з визначеним титром коревих антитіл) розводять 1:5 ізотонічним 0.9% розчином натрію хлориду Р до 0.1 мл імуноглобуліну додають 0.4 мл ізотонічного 0.9% розчину натрію хлориду Р.
Антиальфастафилолізин.
1 мл препарату повинен містити не менш 5 МО антиальфастафілолізина. Визначення проводять за допомогою реакції нейтралізації гемолітичних властивостей стафілококового альфатоксина.
Готують розведення імуноглобуліну за наступною схемою:
| Передбачу- вана кількість МО/мл | Розведення препарату | Отримання необхідних розведень | ||
| Кількість досліджуваного препарату (мл) | ізотонічний 0.9% розчин натрію хлориду Р (мл) | |||
У кожну пробірку додають по 0.5 мл робочого стафілококового альфатоксина, струшують круговими рухами, потім додають по 1 краплі (0.05 мл) 15% робочої суспензії еритроцитів кролика, струшують і витримують у термостаті при температурі 37 град. С 1 год. Після витримки в термостаті пробірки відразу ж охолоджують при температурі від 4 град. С до 6 град. С, потім центрифугують при 1500 об/хв протягом 5 хв.
Визначають оптичну густину надосадової рідини на фотоелектроколориметрі, при довжині хвилі 400 нм у кюветах з товщиною шару 1 мм, розчином порівняння служить ізотонічний 0.9% розчин натрію хлориду Р. Оптична густина, що відповідає 50% гемолізу еритроцитів - 0.3-0.4.
Одночасно для підтвердження точності робочої дози токсину, що використовується в дослідженні, титрують контрольний ряд з деякими ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізин.
ФСЗ ДФУ антиальфастафилолізин розводять до вмісту 1 МО в 1 мл, потім із цього розведення готують наступні розведення за схемою:
