Таблиця 3
Первинна ідентифікація ентеробактерій за біохімічними реакціями в комбінованому середовищі
Умовні позначення:
К - кислота, КГ - кислота та газ, Г - газ, - облік реакції важкоздійсненний, - реакція негативна, + реакція позитивна.
* - не включено відомостей по роду Erwinia, оскільки при звичайному (37 град. С) культивуванні посівів ці ентеробактерії, як правило, не ростуть або дають повільний скупий ріст.
Додаток 2
(рекомендований)
ВЕДЕННЯ
еталонних культур
Ведення еталонних культур забезпечує максимальне збереження типових властивостей штамів, що досягається дотриманням принципів їх культивування, контролю та збереження.
Збереження культур здійснюється відповідно до п. 2.7. "Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения".
Лабораторія повинна мати дозвіл на роботу з мікроорганізмами відповідних груп патогенності, оформлений згідно з ДСП N 9.9.5.064.2000.
1. Ведення бактеріальних культур аеробів і факультативних анаеробів Основні положення
Як контрольні тест-штами використовуються еталонні культури, отримані з офіційно визнаних колекцій мікроорганізмів (п. 4.5).
Зберігання запасів робочої культури здійснюється у стовпчику напіврідкого агару, термін зберігання 3 міс.
Для цільового використання придатна добова ("нічна") культура еталонного штаму, яка пройшла не більше 2 пасажів на поживних середовищах з моменту висівання з середовища для збереження запасів робочої культури.
Поповнення запасів робочої культури допускається не більше трьох разів. У зв'язку з цим термін використання еталонної культури з моменту розкриття ампули - 1 рік.
На етапах відновлення з ліофілізованого стану та поповнення запасів робочих культур здійснюється контроль збереження видових і паспортних властивостей тест-культури.
Культура зі зміненими властивостями в аналізі не використовується. До закінчення року необхідно отримати нову ліофілізовану еталонну культуру з колекції мікроорганізмів.
Процедура ведення культури включає такі етапи:
відновлення ліофілізованої культури;
створення та зберігання запасів робочої культури;
відновлення запасів робочої культури;
підготовка культури для цільового використання в аналізі;
контроль видових і паспортних властивостей.
1.1. Відновлення ліофілізованої еталонної культури.
Відтягнутий кінець ампули з ліофілізованою культурою нагрівають над полум'ям пальника. Вологим кінцем стерильного ватного тампону доторкуються до нагрітої частини, у результаті чого з'являються тріщини. Кінець ампули накривають змоченою 70-процентним етиловим спиртом і добре віджатою тришаровою марлевою серветкою та відламують пінцетом.
Після відкриття ампула залишається накритою тією ж самою серветкою протягом 1-2 хвилин. Потім серветку обережно знімають і разом із залишками скла занурюють у дезрозчин. В ампулу додають приблизно 0,5 куб. см поживного бульйону (п. 5.2.1) для регідратації. Вміст ампули перемішують, переносять стерильною пастерівською піпеткою чи шприцем у пробірку з поживним бульйоном та інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год.
Після інкубації з поживного бульйону роблять висів петлею на скошений поживний агар у дві пробірки (п. 5. 4.2).
Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год.
Одну пробірку з посівом використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму видовим паспортним властивостям (п.п. 1.5.2.-1.5.5 Додатку 2).
Другий посів на скошеному поживному агарі використовують для створення запасів робочої культури (п. 1.2 Додатку 2).
Бульйонну культуру E. coli М17-02, що залишилася, використовують для оцінки ступеня дисоціації еталонного штаму, як це описано в п. 1.5.1 Додатку 2.
У разі невідповідності штаму видовим і паспортним властивостям і (чи) при наявності понад 25% поліморфних (нетипових) колоній у R-формі отриману культуру для роботи не використовують.
1.2. Створення запасів робочої культури
При задовільному проходженні контрольних тестів (п.п. 1.5.1-1.5.5 Додатку 2) культуру зі скошеного поживного агару засівають уколом у стовпчик з напіврідким агаром (п. 5.2.4.2). В залежності від інтенсивності роботи лабораторії посів проводять у 4-10 пробірок із розрахунку по 1-3 пробірки на 1 місяць роботи та 1 пробірку для поповнення запасів робочої культури через 3 міс. на наступний квартал (п. 1.3 Додатку 2).
Посіви інкубують 18-24 год. при (36 +- 1) град. С. При наявності росту пробірки закривають гумовими (силіконовими) пробками та закладають на зберігання при температурі (6 +- 2) град. С.
Одну з пробірок з культурою, що призначена для поповнення робочих запасів, маркують і зберігають окремо. Запаси робочої культури бажано зберігати в окремому холодильнику.
1.3. Поповнення запасів робочої культури
Поповнення запасів робочої культури проводиться в кінці третього, шостого та дев'ятого місяця з моменту розкриття ампули (кожні 3 міс.).
Для поповнення запасів робочої культури використовується субкультура на середовищі збереження, що була отримана раніше при створенні запасів або при черговому їх поповненні.
Із пробірки з культурою, що призначена для поповнення запасів, проводиться посів у поживний бульйон п. 5.2.2. Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С 18-24 год.
Після інкубації з поживного бульйону роблять висів петлею у дві пробірки зі скошеним поживним агаром (п. 5.2.4.2). Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С (18 +- 2) год.
Один з посівів використовують для постановки тестів на відповідність отриманого штаму видовим, паспортним властивостям (п. 1.5.2-1.5.5 Додатку 2).
Другий посів на скошеному поживному агарі використовують для поповнення запасів робочої культури (п. 1.2 Додатку 2).
Бульйонну культуру E.coli М17-02, що залишилася, використовують для оцінки ступеню дисоціації еталонного штаму, як це описано в п. 1.5.1 Додатку 2.
При наявності понад 25% поліморфних (нетипових) колоній та (або) при невідповідності штама видовим і паспортним властивостям отриману культуру для подальшої роботи не використовують.
Необхідно отримати нову ампулу з еталонною культурою і розпочати процедуру ведення тестового штаму спочатку.
При задовільному проходженні контрольних тестів процедура закладки культури на зберігання здійснюється відповідно п. 1.2 Додатку 2.
Відновлення запасів робочої культури проводять тільки три рази.
До закінчення року використання необхідно отримати нову еталонну культуру з колекції мікроорганізмів.
1.4. Підготовка культури для цільового використання в аналізі
Напередодні використання культуру з напіврідкого агару висівають у 2 пробірки зі скошеним поживним агаром (п. 5.2.4.2). Посів інкубують 18-24 год. при (36 +- 1) град. С.
Культуру з однієї пробірки використовують за призначенням. Друга пробірка з культурою на скошеному поживному агарі використовується для отримання культури для роботи на наступний (другий) день.
При необхідності отримання культури тест-штаму на третій день висів знову проводять з напіврідкого агару.
1.5. Контроль еталонних бактеріальних культур
Постановка контролю включає:
оцінку ступеня дисоціації культури E. coli М17-02;
перевірку видових властивостей бактеріальних культур;
перевірку здатності E. coli С або E. coli В на однорідність і відсутність забруднення фагом.
1.5.1. Оцінка ступеня дисоціації культури E. coli М17-02
З 18-годинної бульйонної культури роблять 10-кратні розбавлення фізіологічним розчином. По 0,1 куб. см 5- і 6-кратного розбавлення засівають на 2 чашки поживного агару, попередньо підсушених у термостаті. Шпателем посіви розподіляють по поверхні агару до повного зникнення вологи та інкубують в термостаті при температурі (37 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Відбирають чашки, на яких виросло від 30 до 100 колоній. Перевірку тест-штамів на дисоціацію проводять шляхом візуального перегляду ізольованих колоній на чашках у прямому і косо направленому світлі крізь бінокулярну лупу або мікроскоп при малому збільшенні.
На поживному агарі бактерії виду E. coli утворюють колонії середнього розміру 3-5 мм, плоско-випуклі, круглі, гладкі з рівним краєм (S-форма), вологі, блискучі, прозорі у прямому і непрозорі (опалово-мутні) у косонаправленому світлі. У косонаправленому світлі колонії ешеріхій можуть мати рівномірну зернистість.
У R-формі колонії ешеріхій більш пласкі, більшого розміру, неправильної форми з нерівними краями і шорсткуватою матовою поверхнею.
При наявності дисоціації (за розміром, S-R-дисоціація, тощо) підраховують кількість змінених колоній і загальну кількість колоній, які було проглянуто.
Загальна кількість бактерій, які продивилися, не повинна бути меншою 30. Потім розраховують відсоток дисоціації за формулою:
кількість змінених колоній
% дисоціації = --------------------------------------- х 100%
загальна кількість колоній,
що було проглянуто
Якщо відсоток дисоційованих колоній більше 25%, то дана культура не придатна для подальшого використання.
1.5.2. Контроль видових властивостей E. coli С або E. coli В та E. coli М17-02
Після відновлення ліофілізованої культури проводиться типування культури за біохімічними властивостями до виду.
Ідентифікацію рекомендується проводити з використанням тест-систем для біохімічної ідентифікації родини Enterobacteriaceae, дозволених до застосування. Правомірною є постановка окремих біохімічних тестів.
Перед черговим щоквартальним створенням запасу робочої культури оцінку еталонного штаму E. coli проводять шляхом підтвердження наступних головних властивостей:
відсутності оксидазної активності;
негативності забарвлення за Грамом;
здатності утворювати на середовищі Ендо характерні темно-червоні (малинові) колонії з металевим блиском і відбитком на середовищі;
здатності утилізувати лактозу до кислоти і газу при температурі 37 град. С протягом 24-48 год. і 44 град. С протягом 24 год.;
здатності утилізувати глюкозу до кислоти і газу при температурі 37 град. С протягом 24 год.
Якщо культура не відповідає видовим властивостям, то вона непридатна для подальшого використання.
1.5.3. Контроль чутливості E. coli С або E. coli В (позитивний контроль)
Чутливість тест-культури E. coli С або E. coli В до ураження та лізування специфічним фагом є головною властивістю тест-культури, на якій базується метод визначення фагів у воді.
Перевірка чутливості здійснюється кожного разу, коли із запасів зберігання береться нова пробірка з робочою культурою, яка зберігається на агаровому косяку або стовпчику.
Бактеріальну суспензію готують за п. 12.1.1.
З фагової культури високого титру (еталонний контроль фагу
Т2) готують 10-кратні розбавлення і виконують посів на чашку по
1 куб. см розбавлень, в яких концентрація бактеріофагу складає
3 2 3
приблизно 10 - 10 БУО/см . Процедуру посіву проводять відповідно
до п. 12.3.1. (двошаровий агаровий метод), але кінцевий облік
результатів можна робити після 4-6 годин інкубації.
Культура вважається чутливою та придатною для проведення аналізу при наявності чітких зон лізису на повноцінному бактеріальному газоні. При відсутності зон лізису культура E. coli С або E. coli В не може бути використана в аналізі і підлягає заміні.
1.5.4. Контроль культури E. coli С або E. coli В на забруднення фагом
Бактеріальну суспензію готують за п. 12.1.1, вносять по 0,5 куб. см у пробірки з 5 куб. см розтопленого і охолодженого до 45 град. С 1,0%-го МПА, добре перемішують і виливають у чашку Петрі на поверхню застиглого 2%-го МПА. Посів інкубують при (36 +- 1) град. С протягом (4 +- 2) год.
Перегляд результатів виконують у прохідному світлі. Бактеріальна культура повинна давати рівномірний газон росту. Наявність зон лізису в контролі свідчить про забрудненість культури E. coli С або E. coli В фагами.
1.5.5. Контроль видових властивостей Pseudomonas aeruginosa і Pseudomonas fluorescens
Оцінку еталонного штаму Pseudomonas aeruginosa і Pseudomonas fluorescens проводять шляхом підтвердження наступних властивостей:
наявності оксидазної активності;
негативності забарвлення за Грамом;
росту на МПБ у вигляді сріблястої плівки на поверхні з утворенням кільця синьо-зеленого пігменту;
наявності синьо-зеленого пігменту при рості на МПА при (36 +- 1) град. С;
здатності росту на поживному агарі при (42 +- 1) град. С протягом 24 год. (для Pseudomonas aeruginosa);
здатності росту на поживному агарі при 4 град. С протягом 24 год. (для Pseudomonas fluorescens).
Якщо культура не відповідає видовим властивостям, то вона непридатна для подальшого використання.
2. Культивування, зберігання і контроль еталонних культур бактеріофагів
Як еталонний штам для проведення контролю культури хазяїна при проведенні дослідження на коліфаги використовується фаг Т2, який містить ДНК.
Процес культивування еталонного штаму коліфагу Т2 складається з 2 функціональних блоків:
відновлення ліофілізованної культури;
створення запасів еталонної культури і культур для цільового використання;
визначення титру фагу.
2.1. Відновлення ліофілізованої культури
Відтягнутий кінець ампули з ліофілізованою культурою нагрівають над полум'ям пальника. Вологим кінцем стерильного ватного тампона доторкуються до нагрітої частини, у результаті чого з'являються тріщини. Кінець ампули накривають змоченою 70-процентним етиловим спиртом і добре віджатою тришаровою марлевою серветкою та відламують пінцетом.
Після відкриття ампула залишається накритою тією ж серветкою протягом 1-2 хвилин. Потім серветку обережно знімають і разом із залишками скла занурюють у дезрозчин. В ампулу вносять 0,5 куб. см поживного бульйону (п. 5.2.1) для регідратації.
2.2. Створення запасів еталонної культури і культур для цільового використання
Використовують звичайні процедури для розмноження фагів, які описані у доступній літературі. Нижче подається один з методів (за Апельманом), котрий дозволяє отримувати задовільні результати.
Необхідну кількість пробірок, яка відповідає титру наявного в
6 7
лабораторії еталонного фагу Т2 (10 - 6 пробірок, 10 - 7 пробірок
і т.д.), з 4,5 куб. см МПБ ставлять у штатив у 2-х повторностях. В
першу пробірку вносять 0,5 куб. см наявного в лабораторії коліфага
Т2. Вміст пробірки перемішують і 0,5 куб. см рідини з першої
пробірки переносять у другу пробірку. Процедуру повторюють для
інших пробірок до отримання кінцевого розведення. В усі пробірки
вносять по 0,2 куб. см 4-годинної культури E. coli С або E. coli
В.
Окремо проводять:
контроль культури коліфага Т2: 5 куб. см МПБ та 0,2 куб. см бульйонної культури коліфага Т2;
контроль культури E. coli С або E. coli В: 5 куб. см МПБ та 0,2 куб. см бульйонної культури E.coli С або E. coli В;
контроль стерильності МПБ: 5 куб. см МПБ без додавання E. coli С або E. coli В та коліфага Т2.
Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 4-6 годин. Облік результатів виконують одразу після виймання пробірок з термостату. Титром фагу вважають те максимальне розведення, при якому спостерігається повний лізіс культури E. coli С або E. coli В. Практично це відповідає тій останній пробірці у ряду, в якій бульйон візуально виглядає прозорим.
Для отримання чистої культури еталонного коліфагу Т2 відбирають пробірки з прозорим МПБ і фільтрують через мембранний фільтр з розміром пор 0,2 мкм, який затримує бактерії, але пропускає фаги. Для тривалого зберігання отриманий фільтрат розподіляють по 2 куб. см у малі пробірки або флакончики і зберігають у морозильній камері при -20 град. С.
При відсутності можливості фільтрування через мембранний фільтр після інкубації вміст пробірок переливають в одну ємкість і додають хлороформ у співвідношенні 1:10, герметично закривають, інтенсивно струшують і залишають на ніч у холодильнику. Після цього відбирають бульйон над хлороформом і переносять у стерильні пробірки або флакони, герметично закривають і зберігають у холодильнику при мінус (20 +- 2) град. С.
В разі необхідності для перевірки титру фагу проводять прямий
посів десятикратних розбавлень коліфагу Т2 двошаровим агаровим
методом (п. 12.3.1) з використанням культури E. coli С або E. coli
В. 6
Титр фагової суспензії має бути вище 10/куб. см. З часом титр фагової вихідної суспензії може зменшуватися, особливо при повторному заморожуванні-розморожуванні. У цьому випадку може бути необхідним повторення циклу для отримання достатньо високого титру.
Після виконання робіт з культурами фагів для попередження внутрішньолабораторної контамінації проводять ретельну обробку робочих поверхонь деззасобами і УФО.
Додаток 3
НОРМАТИВНІ ПОСИЛАННЯ
1. ДСанПіН 383/1940 Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізо-ваного господарсько-питного водопостачання//Збірник важливих офіційних документів з санітарних і протиепідемічних питань. - К., 1999. - Т.5, Ч.3.
2. ГОСТ 18963-73 "Вода питьевая. Методы санитрно-бактериологического анализа" - М., 1973.
3. Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов: N 2285-81. - М., 1981.
4. Руководство по контролю качества питьевой воды. - Женева: ВОЗ, 1994. Ч. 1.
5. ИСО 9308-1: 1990. Качество воды. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых E.coli. - Ч. 1: Метод мембранной фильтрации.
6. ИСО 9308-2: 1990. Качество воды. Обнаружение и подсчет колиформных организмов, термотолерантных колиформных организмов и предполагаемых E.coli. - Ч. 2: Титрационный метод (определение наиболее вероятного числа).
7. ИСО 6222-2: 1986. Качество воды. Проведение анализа на наличие жизнеспособных микроорганизмов.
8. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. Методические указания: МУК 4.2.10.18-01. - Москва, 2001.
9. Методические указания по обнаружению возбудителей кишечных инфекций бактериальной природы в воде. - М., 1980.
10. Інструкція по організації та проведенню протихолерних заходів, клініці та лабораторній діагностиці холери: Наказ МОЗ України від 30.05.97 р. N 167.
11. Методические рекомендации по контролю и оценке вирусного загрязнения объектов окружающей среды: N 4146-86. - М., 1986.
12. Методические рекомендации по организации и проведению эпидемиологического и санитарно-вирусологического надзора за качеством воды водоисточников питьевой воды в системе водоснабжения с целью профилактики заболеваемости гепатитом A и другими кишечными вирусными инфекциями. - М., 1990.
13. ДСП N 9.9.5-064-2000 Порядок видачі дозволів на роботу з мікроорганізмами I-IV груп патогенності та рекомбінантними молекулами ДНК. - Затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 27.12.2000 за N 64.
14. ДСП N 9.9.5.-080-2002 Правила влаштування і безпеки роботи в лаборато-ріях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю. - Затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28.01.02. за N 1.
15. ISO 10705-2 Water quality. Detection and enumeration of bacteriophages. - Р. 2: Enumeration of somatic coliphages.
16. ISO 5667-2:1991 Water quality. Sampling. - P.2: Guidance on sampling techniques.
17. ISO 5667-3:1994 Water quality. Sampling. - P.3: Guidance on the preservation and handling of samples.
18. ISO 5667-5:1991 Water quality. Sampling. - P.5: Guidance on sampling of drinking water and water used for food and beverage processing.