Про затвердження методичних вказівок "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води"

Розчини антибіотиків готують наступним чином.

Розчин левоміцетину:

Приготування: розчинити антибіотик у спирті і довести об'єм до 50 куб. см стерильною дистильованою водою. Розчин можна зберігати у холодильнику протягом місяця.

Розчин тетрацикліну (1000 мкг. см)

Приготування: розчин готують безпосередньо перед використанням.

Антибіотики вводять у поживні середовища, знижуючи концентрацію основного розчину у 4-5 разів.

5.2.25. Агар Кліглера

Середовище призначене для диференціації ентеробактерій, холерних вібріонів за їх здатністю ферментувати глюкозу та лактозу, а також утворювати сірководень.

Принцип дії: при ферментації вуглеводів утворюється кислота. Присутній у середовищі індикатор феноловий червоний забарвлює його у жовтий колір. Бактерії, які утилізують тільки глюкозу, забарвлюють середовище у жовтий колір. Подальше використання бактеріями пептону призводить до виділення аміаку, що проявляється у появі червоного кольору у скошеній частині середовища. Стовпчик залишається жовтим.

При ферментації бактеріями глюкози та лактози теж утворюється жовтий колір, але тому, що лактози у 10 разів більше, ніж глюкози, жовтий колір стовпчика та скошеної частини залишається, оскільки переважає кисла реакція. Однак через 48 годин інкубації також відбуватиметься почервоніння скошеної частини середовища за рахунок розщеплення пептонів.

При наявності у ентеробактерій здатності утворювати сірководень з неорганічних сполук сірки у середовищі, до якого входять тіосульфат та залізо, з'являється чорний колір у стовпчику середовища.

Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Після стерилізації середовище скошують так, щоб залишився стовпчик висотою 2-2,5 см.

Готове середовище має червоно-бурий або помаранчово-червоний колір.

5.2.26. Трицукровий агар з сечовиною (Олькеницького)

Принцип дії: стосовно ферментації вуглеводів та утворення сірководню принцип дії той же, що вказано для агару Кліглера. Уреазопозитивні бактерії ферментують сечовину з утворенням аміаку, під дією якого усе середовище набуває червоного кольору. Тому у такому випадку визначення ферментації неможливе і для визначення цукролітичної дії бактерій необхідно застосувати інші середовища.

Приготування: солі попередньо розчиняють у невеликій кількості дистильованої води. Вуглеводи і сечовину розчиняють таким же чином, але при підігріванні на водяній бані. Сухий поживний агар розплавляють у решті воді при нагріванні на вогні і перемішуванні. Потім всі інгредієнти об'єднують, перемішують з розплавленим агаром, фільтрують через марлевий фільтр, встановлюють pH 7,2-7,4. Додають індикатор, добре перемішують, розливають у пробірки по 6-7 куб. см. Стерилізують текучим паром 3 дні підряд по 20 хв. або при (112 +- 1) град. С 15 хв. Скошують, залишаючи стовпчик 2,0-2,5 куб. см.

Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці.

Готове середовище блідо-рожевого кольору.

5.2.27. Середовище Ресселя

Призначене для диференціації вібріонів за їх здатністю ферментувати глюкозу та лактозу.

Принцип дії: при ферментації вуглеводів спостерігається характерна для кислої реакції зміна кольору стовпчика і збереження кольору скошеної частини без утворення газу.

Середовище випускається у сухому вигляді. Склад та спосіб приготування вказані на етикетці. Готове середовище рожевого або зеленого кольору, в залежності від індикатора.

Елективні поживні середовища промислового виготовлення можуть використовуватись згідно з інструкціями виробника.

5.2.28. Реактив для визначення оксидазної активності бактерій

Оксидазний тест призначається для диференціації бактерій родини Enterobacteriaceae від родини Vibrionaceae, грамнегативних бактерій родини Pseudomonadaceae та інших водних сапрофітних бактерій, які мають активний фермент оксидазу та окислюють фенілендіамінові сполуки до індофенолу яскраво синього кольору.

Використовують готові індикаторні системи промислового виготовлення (системи індикаторні паперові (СІП-оксидаза), диски оксидази виробництва PLIVA-LACHEMA, bioMerieux) чи папірці, попередньо виготовлені за таким прописом:

30 мг альфа-нафтолу розчиняють в 2,5 куб. см 96%-вого етилового спирту, додають 7,5 куб. см дистильованої води з 50 мг фенілендіамінової сполуки. В отриманому розчині змочують фільтрувальні папірці, висушують і зберігають у темному місці в чорному папері не більше 6 місяців.

Використовують також таку методику:

Реактив N 1. 1%-ий спиртовий розчин альфа-нафтолу.

Реактив N 2. 1%-ий водний розчин фенілендіамінової сполуки.

Розчини зберігають в темних флаконах з притертими пробками: N 1 - до одного місяця, N 2 - один тиждень. Перед застосуванням до трьох частин розчину N 1 додають сім частин розчину N 2.

З кожною новою партією реактивів, а також періодично в процесі зберігання реактивів чи готових препаратів проводять контрольні дослідження з тест-культурами мікроорганізмів, які дають позитивну реакцію (Pseudomonas aeruginosa або Pseudomonas fluorescens) і негативну реакцію (E. coli).

Надійний результат оксидазного тесту може бути отриманий лише при використанні добової культури, вирощеної на неселективному поживному агарі. Слід зауважити, що при постановці оксидазного тесту шляхом нанесення мембранного фільтра на оксидазний реактив, постановці реакції з колонією, що вирощена на середовищі Ендо, типові темно-червоні колонії можуть давати нечітку реакцію.

Увага! Для постановки тесту використовують скляну паличку або платинову петлю.

5.2.29. Постановка оксидазного тесту при роботі методом мембранних фільтрів.

Мембранний фільтр, на якому виросли колонії бактерій, переносять пінцетом, не перевертаючи, на добре змочений реактивом кружок фільтрувального паперу дещо більшого діаметру ніж фільтр. Через 2-4 хв. визначають результат і фільтр негайно повертають на середовище Ендо. Всі колонії, що посиніли або мають синій обруч, не відносяться до родини Enterobacteriaceae і їх не враховують.

Колонії, що не змінили свого забарвлення, в більшості утворені бактеріями родини Enterobacteriaceae, але серед них можуть бути коки, спороутворюючі та грамнегативні палички, які не мають санітарно-показового значення,. Їх не враховують після мікроскопії та в разі відсутності утворення газу на напіврідкому середовищі з глюкозою при (36 +- 1) град. С.

Беручи до уваги бактерицидність реактиву для визначення оксидазної активності, рекомендують при достатньому розмірі колонії половину колонії використовувати для постановки оксидазного тесту та приготування мазку для мікроскопії. Залишок колонії пересівають у напіврідке середовище з глюкозою чи лактозою.

5.2.30. Постановка оксидазного тесту при роботі титраційним методом

З ізольованої колонії кожного типу, які виросли на секторах середовища Ендо, знімають частину колонії платиновою петлею або скляною паличкою і наносять штрихом на фільтрувальний папір, змочений реактивом. Якщо в місці нанесення бактеріальної маси папір не змінює кольору - оксидазний тест негативний, якщо папір синіє протягом 1 хв., значить бактерії мають активну оксидазу.

Дослідження ізольованих колоній є обов'язковим, інакше можна безпідставно відкинути належність досліджуваної колонії до кишкових паличок в разі посиніння за рахунок домішок оксидазопозитивних бактерій. При негативному оксидазному тесті залишок колонії при потребі пересівають на напіврідке середовище з глюкозою чи лактозою.

5.2.31. Реактиви для фарбування за Грамом

Карболовий розчин генціану фіолетового: 1 г генціану фіолетового, 10 куб. см ректифікованого етилового спирту, 5 г фенолу розтирають у ступці, додають 100 куб. см дистильованої води.

Розчин Люголя: 1 г йоду кристалічного, 2 г йодистого калію розчиняють в 300 куб. см дистильованої води. Зберігають у флаконі з темного скла.

Фуксин Ціля: 1 г основного фуксину, 10 куб. см спирту етилового ректифікованого, 5 г фенолу розтирають в ступці, додаючи 100 куб. см дистильованої води.

5.2.32. Фарбування за Грамом

Мазок на предметному склі фіксують трьохкратним проведенням через полум'я пальника. На препарат накладають смужку фільтрувального паперу і на нього наливають карболовий розчин генціану фіолетового на 0,5-1 хв. Потім знімають папір, наливають розчин Люголя на 0,5-1 хв., змивають розчин Люголя. Скло прополіскують в етиловому спирті протягом 0,5-1 хв., поки не перестане відходити фарба. Після чого скло ретельно промивають водою та забарвлюють фуксином Ціля, розбавленним 1:10 дистильованою водою, 1-2 хв. Після промивки і підсушування препарату мазок розглядають під мікроскопом.

При використанні набору для фарбування за Грамом промислового виробництва користуються інструкцією до набору.

6.1. Підготовка посуду і матеріалів

Лабораторний посуд ретельно миють у водопровідній воді з домішкою нейтрального миючого засобу, промивають дистильованою водою до повного видалення миючих засобів та інших сторонніх речовин і висушують у сухожаровій шафі при 100 град. С.

Пробірки, колби, пляшки, флакони закривають металевими, силіконовими або ватно-марлевими пробками і покривають ковпачками з фольги чи щільного паперу. Пробірки щільно закривають пробками без ковпачків.

Нові гумові пробки кип'ятять в 2%-ому розчині натрію двовуглекислого 30 хв. і 5 разів промивають водопровідною водою (кип'ятіння та промивання повторюють 2 рази). Гумові пробки, які використовували раніше, після знезараження кип'ятять 30 хв. у водопровідній воді з нейтральним миючим засобом, промивають у дистильованій воді, висушують і зберігають до використання.

Чашки Петрі, піпетки, у верхню частину яких вставлена вата, укладають у металеві пенали або обгортають у крафт-папір.

Підготовлений посуд стерилізують у сушильній шафі при 160 град. С протягом 2 годин або при 180 град. С - 1 години або паром в автоклаві при (128 +- 1) град. С протягом 1 години з наступним підсушуванням в сушильній шафі в разі відсутності вакуумної сушки в автоклаві.

Матеріали і лабораторний посуд, які мають деталі, що руйнуються при 160 град. С (гума, ватно-марлеві пробки тощо), стерилізують у паровому стерилізаторі при температурі (128 +- 1) град. С 30 хв.

Стерильний посуд зберігають до використання в закритій шафі або ящиках не більше 7 днів за умови, що упаковка не порушена.

Після охолодження видаляють залишки середовищ, потім чашки і пробірки замочують у водопровідній воді і миють з миючим засобом та наступним ополіскуванням дистильованою водою, як було вказано вище.

6.2. Підготовка проб води

Перед мікробіологічним дослідженням пробу ретельно перемішують. Край ємкості фламбують для запобігання можливого вторинного забруднення, яке може мати місце під час транспортування. На флаконах, пробірках і чашках, які використовуються для дослідження, позначають номер проби, об'єм, дату посіву. Перед кожним відбором нової порції води для аналізу зразок перемішують стерильною піпеткою.

Для фільтрації використовують мембранні фільтри діаметром від 35 до 50 мм з розмірами пор 0,45 мкм в стерильній та нестерильній упаковках.

Нестерильні фільтри стерилізують безпосередньо перед їх використанням: кип'ятінням або іншим способом, рекомендованим фірмою-виробником. Для кип'ятіння фільтри кладуть у склянку або медичний стерилізатор з дистильованою водою, нагрітою до 30 град. С, повільно доводять до кипіння на слабкому вогні, після чого воду міняють і кип'ятять 10 хвилин. Підготовлені фільтри використовуються протягом робочого дня.

6.3. Підготовка фільтрувального апарату

Лійку та столик фільтрувального апарату протирають ватним тампоном, змоченим спиртом, і стерилізують фламбуванням.

Після охолодження на нижню частину фільтрувального апарату (столик) кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний фільтр, притискують його верхньою частиною приладу (лійкою), яку закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією приладу.

6.4. Методика фільтрування води

Перед проведенням дослідження перевіряють правильність складання фільтрувального апарату. Для цього в лійку фільтрувального апарату, дотримуючись правил стерильності, наливають необхідну кількість води і утворюють вакуум у приймальному посуді. Вода не повинна виливатися за межі фільтра або проникати через фільтр до утворення вакууму. Після цього можна починати досліджувати пробу води.

При посіві декількох об'ємів однієї проби слід фільтрувати через один фільтрувальний апарат спочатку менші, а потім більші об'єми води, замінюючи кожного разу фільтри. При фільтрації невеликих об'ємів води (1 куб. см) у лійку спочатку наливають 10 куб. см стерильної води, а потім вносять досліджувану пробу води. При відсутності мірних міток у лійці проби об'ємом 100 куб. см і більше відбирають стерильними піпетками Мора, а об'ємом 10 та 1 куб. см - стерильними піпетками.

Після закінчення фільтрування лійку знімають, фільтр обережно піднімають за край профламбованим пінцетом при зберіганні вакууму для видалення залишків вологи на нижній поверхні фільтру, а потім переносять його, не перевертаючи, на поверхню відповідного середовища, розлитого в чашки Петрі, запобігаючи утворенню пухирців повітря між фільтром і середовищем. Поверхня фільтру з бактеріями, які осіли на неї, повинна бути повернена вгору. Вакуум відключається до внесення наступної порції води, що досліджується.

Під кожним фільтром на дні чашки роблять напис із зазначенням об'єму профільтрованої води, дати посіву і номера проби. На одній чашці можна розмістити 2-4 фільтри за умови, що фільтри не торкаються один одного.

Якщо досліджувана вода має велику кількість завислих речовин чи клітин фітопланктону, то її попередньо фільтрують через передфільтр для видалення зависі великих розмірів. Для цього передфільтр розташовують у фільтрувальному апараті над фільтром для бактеріологічного аналізу. Після закінчення фільтрування два фільтри (передфільтр і фільтр) переносять на середовище. При підрахунку результатів аналізу враховують ріст бактерій на обох фільтрах.

6.5. Підготовка тест-культур мікроорганізмів

Культивування еталонних культур та підготовка до використання викладені у Додатку 2.

7.1. Принцип методу

Визначення ЗМЧ проводять методом глибинного посіву води у поживний агар і враховують усі колонії мікроорганізмів, які можна побачити при 2-5-кратному збільшенні, що виросли при температурі (36 +-1) град. С протягом (24 +- 2) годин чи при (22 +- 1) град. С протягом 48 годин в глибині та на поверхні поживного агару.

7.2. Порядок дослідження

Поживний 1,5%-ий агар (п. 5.2.4.) розтоплюють на водяній бані і охолоджують до температури (45 +- 5) град. С. Стерильні чашки Петрі підписують і розташовують на строго горизонтальній поверхні столу. Воду ретельно перемішують. З кожної проби води роблять посів не менше 2 об'ємів по 1 куб. см натуральної проби або з 10-кратних розведень у дві паралельні чашки.

Після внесення води в чашки Петрі в кожну з них заливають 10-12 куб. см охолодженого поживного агару і, обережно обертаючи, перемішують вміст чашки на поверхні столу, запобігаючи утворенню бульбашок повітря, неповному заповненню дна чашки агаром, попаданню середовища на краї та кришку чашки. Чашки залишають на горизонтальній поверхні до застигання середовища, потім перевертають дном догори і ставлять в термостат.

Посіви вирощують при (36 +- 1) град. С протягом (24 +- 2) годин. При необхідності - при (22 +- 1) град. С протягом (48 +- 2) годин. Чашки з посівами розташовують в термостаті таким чином, щоб відстань між чашками та стінками термостату була не менше 3 см.

При дослідженні води з джерела водопостачання, на етапах водопідготовки або з розподільчої мережі, де передбачається високе обсіменіння, підбирають для посіву такі дози води, щоб на чашці виросло не більше 300 колоній мікроорганізмів.

7.3. Обробка результатів.

Колонії, які виросли як на поверхні, так і в глибині агару, підраховують за допомогою лупи з 2-5-кратним збільшенням або за допомогою пристрою для підрахунку колоній.

При посіві 1 куб. см нерозведеної проби води враховують всі колонії, що виросли, але не більше 300.

Підраховують кількість колоній мікроорганізмів в кожному з паралельних посівів одного розведення. За результатами визначають середньоарифметичне значення числа колоній в посівах одного розведення або натуральної проби. При підрахунку враховують кратність розведення проб.

Результат виражають у колонієутворюючих одиницях (КУО) в 1 куб. см досліджуваної проби води і заносять до протоколу.

Результат видають на основі підрахунку колоній на одній чашці, якщо інший підрахунок неможливий (при повзучому рості бактерій, який покриває всю поверхню чашки). Якщо на всіх чашках має місце ріст розпливчастих колоній, який не розповсюджується на всю поверхню чашки, чи виросло більше 300 колоній і аналіз не можна повторити, підраховують сектор чашки з наступним перерахунком на всю поверхню. У таких випадках в протоколі відмічають "число КУО в 1 куб. см - орієнтовно". Якщо підрахунок колоній на чашках неможливий, то в протоколі відмічають "зливний ріст".

Якщо результат знаходиться в межах чисел від 1 до 100, то записують отримане число. Якщо результат знаходиться в межах чисел від 101 до 1000, то результат закругляють до 10. Якщо результат знаходиться в межах чисел від 1001 до 10000, то результат закругляють до 100 і т. д.

Оскільки при дослідженні води на практиці не можливо вивчити всі важливі з точки зору диференційної діагностики ознаки для системного визначення мікроорганізмів, то у світовій практиці було розроблено сукупність окремих тестів, яка дозволяє спрощеним методом досягти надійного результату.

До бактерій групи кишкових паличок (БГКП) відносяться грамнегативні, що не утворюють спор, палички, які зброджують глюкозу з утворенням кислоти та газу при (36 +- 1) град. С протягом 24 годин і в яких відсутня оксидазна активність.

Поряд з цим, з загальної чисельності БГКП виділено наступні групи мікроорганізмів, які мають різне санітарно-показове значення:

Лактозопозитивні коліформні бактерії - представники БГКП, які, крім вказаного вище, ферментують лактозу з утворенням кислоти та газу при 36 +- 1 град. С за 24-48 годин інкубації.

Термотолерантні кишкові бактерії - мають ті ж ознаки, що і БГКП, але вони ферментують лактозу при 44 +- 0,5 град. С за 24-48 годин інкубації.

E. coli - мають ті ж ознаки, що і термотолерантні кишкові бактерії, але, крім того, вони утворюють індол з триптофану та не ростуть на цитратних середовищах.

Кількість бактерій групи кишкових паличок визначають методом мембранної фільтрації або титраційним методом (найбільш вірогідного числа - НВЧ).

Метод мембранної фільтрації полягає у фільтруванні певного об'єму води через мембранні фільтри, інкубації їх при (36 +- 1) град. С на середовищі Ендо, підрахунку кількості бактерій, що виросли, подальшій ідентифікації за культуральними та біохімічними властивостями та розрахунку індексу в 1 куб. дм води.

Суть титраційного методу полягає в посіві певних об'ємів води, що досліджується, в середовища накопичення (глюкозо-пептонне, лактозо-пептонне середовища), підрощуванні при (36 +- 1) град. С з подальшим висівом на середовище Ендо, ідентифікації бактерій, що виросли, та визначенні НВЧ БГКП в 1 куб. дм води за таблицями.

Обидва методи можуть застосовуватись, але кожен з них має свої переваги та недоліки.

Метод мембранної фільтрації дозволяє скоротити тривалість аналізу до 24-48 год., в залежності від ступеня чистоти досліджуваної води. Цей метод рекомендується для дослідження води на кінцевому етапі водопідготовки та води з розподільчої мережі при відсутності суттєвого вторинного мікробного обсіменіння в системі водопостачання.

Титраційний метод триває 48-72 годин і є більш затратним. Має переваги в разі дослідження води з високим рівнем гетеротрофної мікрофлори або завислих речовин та при великих дозах хлору або інших дезинфектантів. В останньому разі засів у середовище збагачення дозволяє мікроорганізмам вийти з стану сублетального стресу після дії дезинфектантів, що підвищує вірогідність отриманого результату.

8.1. Виконання методу мембранної фільтрації

Прилад для мембранної фільтрації та мембранні фільтри готують згідно з п.п. 6.3, 6.4. Техніка фільтрації описана у п. 6.5.

8.1.1. Дози посіву

Загальний об'єм водопровідної води, який повинен бути профільтрований, дорівнює 300 куб. см.

Окремі об'єми, які фільтрують через один фільтр, залежать від передбаченого ступеню обсіменіння води мікроорганізмами, але таким чином, щоб на одному з фільтрів виросло не більше 30 колоній бактерій групи кишкових паличок.

При дослідженні водопровідної води після повного комплексу очистки та знезараження, а також з розподільчої мережі фільтрують три об'єми по 100 куб. см. При наявності вторинного забруднення води в розподільчій мережі або при дослідженні води на етапах водопідготовки та води невідомої якості фільтрують менші об'єми (наприклад, 10; 40; 100; 150 куб. см).

В разі наявності водопровідної води стабільно високої якості можна фільтрувати 300 куб. см через один фільтр.

8.1.2. Порядок дослідження.

Після фільтрації кожен фільтр при збереженні вакууму для видалення надлишків вологи на нижній стороні фільтру профламбованим пінцетом переносять на середовище Ендо, виготовлене згідно з п. 5.2.5.1. При високому обсіменінні води сапрофітною мікрофлорою для попередження заростання фільтрів використовують середовище Ендо згідно з пп. 5.2.5.2., 5.2.5.3. Чашки з середовищем Ендо та фільтрами інкубують догори дном при (36 +- 1) град. С протягом (24 +- 2) год. На одну чашку можна помістити 3-4 фільтра за умови, щоб вони не торкалися.

Якщо на фільтрах ріст бактерій відсутній або виросли нетипові колонії (плівчасті, зморщені, губчасті з нерівними краями тощо), видають негативний результат - відсутність БГКП у досліджуваному об'ємі води.

При наявності на фільтрах колоній, характерних для БГКП (темно-червоних з металевим блиском чи без нього, рожевих з червоним центром, рожевих або блідо-рожевих, які дають відбиток зі зворотньої сторони фільтру або без нього - утворення або відсутність альдегіду), підраховують число колоній кожного типу.

Для подальшої ідентифікації відбирають не менше 3-4 колоній кожного типу. Ідентифікацію проводять за такою схемою:

- визначення оксидазної активності;

- мікроскопія препарату, фарбованого за Грамом;

- ферментація глюкози (визначення БГКП) або лактози (визначення ЛКБ, ТКБ та E.coli) в залежності від мети дослідження.

Визначення оксидазної активності проводять згідно з п. 5.2.29. В разі відсутності ферменту оксидази готують мазок для мікроскопії, фарбують за Грамом (п. 5.2.32). При наявності в мазку грамнегативних поліморфних паличок, які не утворюють спор, визначають ферментативну активність досліджуваних колоній.

Для цього 3-4 колонії кожного типу засівають уколом в напіврідке середовище з глюкозою (п. 5.2.8), яке бажано підігріти до 37 град. С. Попередній облік можна проводити через 4-6 год. інкубації посівів при (36 +- 1) град. С. В разі наявності кислоти та газу результат вважається позитивним. В разі наявності тільки кислоти або відсутності зміни середовища посіви продовжують інкубувати до 24 год. При утворенні кислоти та газу результат вважається позитивним. При наявності тільки кислоти або відсутності зміни середовища результат вважається негативним.

Якщо колонії, що виросли на фільтрах, замалі за розміром, то їх пересівають на середовище Ендо так, щоб отримати ріст окремих колоній, і в подальшому досліджують, як описано вище.

При наявності зливного росту на фільтрі роблять розсів на середовище Ендо (п.п. 5.2.5.2 або 5.2.5.3) для отримання ізольованих колоній. В подальшому типові колонії досліджують відповідно до вищеописаного. В такому разі результат вважається якісним.

При виявленні лактозопозитивних варіантів колоній (темно-червоні та червоні з металевим блиском або без нього, рожеві з червоним центром або іншого типу колонії з відбитком на зворотній стороні) проводиться і визначення їх належності до ТКБ.

Для цього 2-3 колонії кожного типу з кожного об'єму води засівають у напіврідке середовище з лактозою (п. 5.2.8), попередньо підігріте до 44 град. С. Посіви інкубують при (44 +- 0,5) град. С 24 год. При утворенні кислоти та газу через 24 год. інкубації результат вважається позитивним. При утворенні тільки кислоти інкубацію продовжують до 48 год. Якщо через 48 год. в середовищі не з'являються ознаки газоутворення, то досліджувана колонія не відноситься до ТКБ.

В окремих випадках необхідно визначити серед ТКБ наявність саме E. coli. Для цього, крім термостабільного тесту, паралельно визначають здатність мікроорганізмів утворювати індол та відсутність росту на середовищі, де єдиним джерелом вуглецю є цитрат натрію. Для цього залишки колоній засівають на середовище Сімонса (п. 5.2.12), у бульйон з триптофаном (п. 5.2.11). В разі недостатньої кількості посівного матеріалу проводять його накопичення на скошеному агарі (термін дослідження подовжується на 1 добу).

Пробірки з триптофановим бульйоном та чашки з цитратним середовищем інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. У пробірки з триптофановим бульйоном додають по краплям 0,5 куб. см реактиву Ерліха або Ковача (пп. 5.2.11.1-5.2.11.3).

Утилізація цитрату (позитивна реакція) встановлюється за наявністю росту мікроорганізмів та синього кольору середовища. При негативній реакції, характерній для E. coli, ріст відсутній, колір середовища залишається незмінним.

При дослідженні джерела водопостачання у відповідності з існуючими нормативними вимогами в Україні визначають наявність загальних коліформних бактерій, тобто лактозопозитивних кишкових бактерій (ЛКБ). Для цього лактозопозитивні, оксидазонегативні, грамнегативні бактерії, виявлені на фільтрах, засівають у напіврідке середовище з лактозою, інкубують при (36 +- 1) град. С 24 год. і враховують ті колонії, які ферментують лактозу з утворенням кислоти та газу.

Примітка. При виявленні лактозонегативних оксидазонегативних грамнегативних паличок необхідно провести їх ідентифікацію з метою виявлення патогенних ентеробактерій.

При виявленні лактозонегативних, оксидазопозитивних, грамнегативних паличок необхідно провести дослідження з метою визначення холерного вібріона.

Відомчі лабораторії в разі виявлення означених колоній направляють посіви для подальшого вивчення до закладів державної санепідслужби.

8.1.3. Облік результатів

Результат виражають у вигляді індексу, тобто кількості БГКП в 1 куб. дм води.

Індекс БГКП вираховують у такий спосіб: кількість характерних колоній, що виросли в проаналізованому об'ємі води, множать на 1000 і ділять на цей об'єм води.

При відсутності на фільтрах БГКП їх індекс буде меншим тієї величини, що була б визначена у випадку виявлення в проаналізованому об'ємі однієї клітини цих бактерій.

Приклад 1. При посіві 300 куб. см води не виросло жодної колонії. (1 х 1000) : 300 = 3. Індекс БГКП менше 3.

При наявності бактерій групи кишкових паличок обчислюють колі-індекс з огляду на весь об'єм проаналізованої води.

Приклад 2. При посіві трьох об'ємів води по 100 куб. см на одному фільтрі виросло три колонії БГКП, на двох інших немає росту: колі-індекс дорівнює (3 х 1000) : 300 = 10.

При посіві 10 і 100 куб. см води на одному фільтрі виросла одна колонія, на іншому виросло п'ять колоній; індекс БГКП дорівнює (6 х 1000) : 110 = 54.

Якщо на одному з фільтрів спостерігається суцільний ріст бактерій і підрахунок їх неможливий, тоді в розрахунок беруть той об'єм води, при фільтруванні якого на фільтрі виросли ізольовані колонії.

Приклад 3. У 100 куб. см - суцільний ріст, у 10 куб. см - 12 кишкових бактерій; колі-індекс дорівнює (12 х 1000) : 10 = 1200.

При підрахунку індексу БГКП в пробах незнезараженої води з великим фекальним забрудненням, коли для аналізу профільтровують обсяг води, менший 10 куб. см, або її розведення, то для обліку вибирають той фільтр, на якому виросло не менше 10 і не більш 30 ізольованих колоній кишкових бактерій. Кількість на ньому колоній, які відносяться до БГКП, перераховують на 1 куб. дм з урахуванням тільки того об'єму води, який профільтровано через цей фільтр.

Якщо на всіх фільтрах отримано більш густий ріст і аналіз неможливо повторити, то допускається підрахунок колоній на фільтрі з найменшим розведенням, але з відповідним записом у протоколі дослідження та у журналі реєстрації.

Результат у вигляді індексу БГКП заносять до журналу реєстрації і до протоколу аналізу, де позначають особливі обставини, що мали місце при аналізі води (відхилення в температурі інкубації, складі середовищ, що використовувались, особливих добавок в середовищі Ендо тощо).

У разі необхідності індекси ТКБ та E. coli вираховуються аналогічно.

8.2. Виконання титраційного методу

8.2.1. Дози посіву

Водопровідну питну воду після очистки та знезараження, а також з розподільчої системи засівають в об'ємі 333 куб. см (три об'єми по 100,0 куб. см, три об'єми по 10,0 куб. см та три об'єми по 1,0 куб. см). При наявності постійно високих результатів можна досліджувати три об'єми по 100,0 куб. см.

При контролі ефективності окремих етапів водопідготовки та якості води джерела водопостачання об'єми води зменшують в залежності від передбачуваного рівня мікробного забруднення так, щоб останній досліджуваний об'єм дав негативний результат (це можуть бути 100,0, 10,0, 1,0 та 0,1 куб. см води або 10,0, 1,0, 0,1 і 0,01 куб. см води).

8.2.2. Порядок дослідження

Дози води засівають у концентроване (п. 5.2.6.2) та нормальної концентрації (п. 5.2.6.1) глюкозо-пептонне середовище (ГПС) з поплавками. Дози 100,0 куб. см та 10,0 куб. см засівають у флакони з 10,0 куб. см і пробірки з 1,0 куб. см концентрованого середовища, дози 1,0 куб. см, 0,1 куб. см та менші - у пробірки з середовищем нормальної концентрації.

Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С 24 години. При обліку результатів відмічають наявність ознак росту мікроорганізмів: помутніння середовища або помутніння і утворення газу. Відсутность ознак росту через 24 години дозволяє отримати негативний результат - відсутність БГКП в об'ємі досліджуваної води.

При наявності росту з кожного флакона або пробірки, де відмічено помутніння, утворення кислоти або газу, роблять пересів на середовище Ендо (п. 5.2.5.1) так, щоб отримати ізольовані колонії (відсутність ізольованих колоній не дозволяє продовжувати аналіз і потребує розсіву для отримання росту ізольованих колоній).

Чашки з середовищем Ендо інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 16-18 год.

При урахуванні результату пересіву з середовища накопичення на середовище Ендо можливі три основні варіанти:

На чашках або окремих секторах відсутній ріст колоній або виросли нетипові для БГКП колонії (плівчасті, зморщені, губчасті з нерівними краями тощо). Відмічають відсутність БГКП в досліджуваному об'ємі води.

На чашках або секторах Ендо виросли типові для БГКП колонії: темно-червоні та червоні з металевим блиском або без нього, рожеві з червоним центром і відбитком на середовищі, що вказує на ферментацію лактози і утворення альдегіду. Якщо ріст цих мікроорганізмів на середовищі накопичення супроводжувався утворенням кислоти та газу, то їх належність до БГКП підтверджують мікроскопією і постановкою оксидазного тесту. При виявленні оксидазонегативних, грамнегативних паличок, що утворюють кислоту і газ у середовищі накопичення з глюкозою, видають результат про виявлення БГКП.

На секторах Ендо виросли колонії рожеві, блідо-рожеві з більш вираженим центром або без нього, а на середовищі накопичення відмічено помутніння, утворення газу або тільки помутніння. Колонії можуть відноситися до БГКП за наступними ознаками:

- відсутність ферменту оксидази;

- негативне забарвлення за Грамом;

- ферментація глюкози з утвореннями кислоти та газу при (36 +- 1) град. С.

Оксидазний тест виконують згідно з п. 5.2.30 з 2-3 колоніями кожного типу з кожного сектору. Колонії, які дали позитивний оксидазний тест, подальшому дослідженню на БГКП не підлягають - результат негативний.

З оксидазонегативних колоній кожного типу роблять мазки, забарвлюють за Грамом (п. 5.2.32) та розглядають під мікроскопом. Якщо в мазках виявлено грамнегативні палички, то для підтвердження необхідно виконати тест ферментації глюкози.

Колонії кожного типу засівають уколом в напіврідке середовище з глюкозою (п.п. 5.2.8, 5.2.9), яке попередньо бажано підігріти до 37 град. С. При цьому забирають як можна більше посівного матеріалу. Пробірки з посівами інкубують в термостаті при (36 +- 1) град. С 4-6 годин. При утворенні кислоти та газу дають позитивну відповідь. При відсутності чіткого росту або утворенні тільки кислоти продовжують інкубацію до 24 годин. Якщо виявлено тільки кислоту, то досліджувані колонії не належать до БГКП. Ферментація глюкози з утворенням кислоти та газу свідчить про наявність БГКП в досліджуваному об'ємі води.

При виявленні на середовищі Ендо лактозопозитивних, оксидазонегативних, грамнегативних паличок при необхідності проводять визначення належності їх до ТКБ або E. coli згідно з п. 8.1.2.

При дослідженні джерела водопостачання враховують тільки лактозопозитивні варіанти (п. 8.1.2.).

Примітка. При розсіві зливного росту мікроорганізмів для отримання ізольованих колоній їх ідентифікацію виконують за схемою, як вказано вище.

В разі сумніву щодо належності колоній до БГКП, не дивлячись на утворення альдегіду та газу на середовищі накопичення, виконують тест на оксидазу, роблять мікроскопію та засівають у напіврідку глюкозу, якщо це питна вода, або у напіврідку лактозу, якщо це вода джерела водопостачання.

В разі необхідності для швидшого встановлення наявності у воді ТКБ допускається висів з пробірок з середовищем накопичення, де є ріст з утворенням газу, у напіврідку лактозу з подальшою інкубацією при (44 +- 1,0) град. С.

Інші варіанти дивись примітку до п. 8.1.2.

8.2.3. Облік результатів

Результат дослідження вираховується у вигляді індексу БГКП (найбільш вірогідне число БГКП в 1 куб. дм води), величину якого визначають за таблицею 1 Додатку 1.

Індекси ТКБ та E. coli підраховують за тією ж таблицею.

Сальмонели відносяться до числа найбільш розповсюджених і в той же час стійких до дії фізико-хімічних факторів мікроорганізмів - збудників гострих кишкових інфекцій, які поряд з іншими мають водний шлях передачі. На сьогодні ідентифіковано понад 2500 сероварів сальмонел, і не існує жодного рівноцінного методу виділення для всіх відомих сероварів.

Запропоновані у даних МВ методи є досить ефективними для виявлення багатьох циркулюючих у воді сероварів.

Як правило, сальмонели присутні у воді в низьких концентраціях. Тому бажано проводити їх попереднє концентрування, що дозволяє уникнути ускладнень при роботі з великими об'ємами води. Крім того, сальмонели у водному середовищі зазнають ушкодження, і для відновлення їх фізіологічної активності доцільно використовувати неселективне попереднє збагачення, щоб відбулося відновлення фізіологічної активності сальмонел, але не відбулося інтенсивного розмноження супутньої мікрофлори. Наступне селективне збагачення створює більш сприятливі умови для розвитку сальмонел у порівнянні із супутньою мікрофлорою, що підвищує результативність аналізу.

9.1. Визначення поняття показника

Сальмонели - це факультативно-анаеробні грамнегативні неспороутворюючі палички, добре ростуть на простих поживних середовищах, рухливі, крім S. gallinarum-pullorum. При ферментації глюкози утворюють газ за невеликим винятком (S. typhi, S. typhisuis та ін.), не ферментують лактозу та сахарозу, продукують сірководень. Ідентифікацію сальмонел проводять за рядом біохімічних тестів та по антигенній структурі, що виявляється в реакції аглютинації на склі з О- та Н- аглютинуючими сироватками.

9.2. Відбір проб

Проби відбирають і транспортують як описано вище (п. 3) в об'ємі 1-5 куб. дм у залежності від передбачуваної концентрації сальмонел у воді та методу визначення.

Допускається зберігати проби води при +(6 +- 2) град. С до 24 год.

9.3. Метод визначення

9.3.1. Принцип методу

Метод полягає в концентрації проб, накопиченні сальмонел у середовищі попереднього збагачення з наступним збагаченням в елективних рідких поживних середовищах, селекцією на двох різних диференційно-діагностичних поживних середовищах та ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними і серологічними ознаками.

З метою підвищення результативності дослідження води на наявність сальмонел найчастіше викнують наступні послідовні методичні прийоми першого етапу дослідження:

концентрування,

попереднє збагачення,

елективне збагачення.

9.3.2. Варіанти першого етапу дослідження

У залежності від рівня передбачуваного забруднення води, наявності устаткування для фільтрації води можливі такі варіанти першого етапу дослідження:

- фільтри без попереднього збагачення проби відразу поміщають у рідкі елективні поживні середовища. У цьому випадку 1 куб. дм води поділяють на два об'єми по 500 куб. см і кожен об'єм фільтрують через окремий фільтр.

- досліджувану воду безпосередньо засівають у середовище попереднього збагачення подвійної концентрації у співвідношенні 1:1 (п. 5.2.13).

- досліджувану воду об'ємом по 500 куб. см відразу засівають у елективні рідкі середовища подвійної концентрації.

У робочих журналах обов'язково відзначають, яким способом виконано перший етап дослідження.

Подальший перебіг дослідження вказаних варіантів - аналогічно п. 9.3.3.

9.3.3. Виконання методу концентрування

Концентрування сальмонел здійснюється методом мембранної фільтрації відповідно до п.п. 6.3-6.5.

Воду об'ємом не менше 1 куб. дм фільтрують через один-два фільтри у залежності від кількості завислих речовин. Для дуже каламутних вод використовують передфільтри.

Фільтри стерильним пінцетом переносять у 100 куб. см буферної пептонної води нормальної концентрації (п. 5.2.13) для попереднього збагачення. Інкубацію всіх фільтрів та передфільтрів однієї проби проводять разом.

Інкубація при (36 +- 1) град. С не більше 16 год.

По 1 куб. см збагаченої проби переносять у 10 куб. см елективних рідких середовищ нормальної концентрації - селенітовий бульйон (п. 5.2.14.1-5.2.14.2), магнієве середовище (п. 5.2.15.1-5.2.15.2), середовище Мюллера (п. 5.2.16). При цьому використовують не менше двох середовищ збагачення. Флакони з посівами інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 16-24 год.

Після інкубації проводять висів на щільні диференційно-селективні середовища: чашки з вісмут-сульфіт агаром (п. 5.2.19), середовищами Ендо (п. 5.2.5.1), Плоскірева (п. 5.2.22), ксилозо-лізин-дезоксихолатним агаром, діамантово-зеленим агаром, SS-агаром тощо. При пересіванні на кожну пробу використовують не менше 2 чашок з селективними середовищами. Чашки із середовищами Ендо, Плоскірева, Мак-Конкі, ксилозо-лізин дезокси-холатним агаром, діамантово-зеленим агаром, SS-агаром інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 24 год., із вісмут-сульфіт агаром за умов тієї ж температури - 48 год.

Після інкубації чашки переглядають і відзначають підозрілі на сальмонели колонії. На середовищах Ендо, Плоскірєва, Мак-Конкі, SS-агарі - це безбарвні або блідо-рожеві злегка опуклі блискучі колонії.

На ксилозо-лізин-дезоксихолатному агарі сальмонели утворюють колонії червоного або рожевого кольору з чорним центром. Сальмонели, які не продукують сірководень, наприклад S. typhi, S. senftenberg, S. pullorum, можуть рости у вигляді червоних колоній.

На діамантово-зеленому агарі колонії, типові для сальмонел, викликають зміну кольору агару на рожевий або червоний. Колір колоній може бути від рожево-сірого до червоного.

На вісмут-сульфіт агарі колонії сальмонел сіро-чорні з металевим блиском навкруги. Середовище під колонією набуває чорного забарвлення. Можливий ріст колоній з чорним центром і напівпрозорим краєм, а також невеликих плоских колоній темно-зеленого кольору. В міру старіння колоній з'являється піднятий центр і валик навколо центру.

Колонії сальмонел легко знімаються з агару, їм не властива слизувата або клейка консистенція.

З чашок відбирають по 2-3 підозрілі колонії кожного типу і засівають у пробірки з середовищем Олькеницького (п. 5.2.26) або Кліглера (п. 5.2.25). Штрихом засівають скошену частину і уколом - стовпчик.

Пробірки із середовищем Олькеницького або Кліглера інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 24 год. Облік результатів проводять відповідно до ознак, наведених у таблиці 3 Додатку 1, які дозволяють зробити первинну ідентифікацію.

Якщо при первинному посіві і при висіві із середовищ збагачення підозрілих колоній не виявлено, може бути видана відповідь про негативний результат дослідження.

9.3.4. Концентрація проб методом осадження.

Рідину над осадом зливають, а осад із залишками води засівають у елективні середовища збагачення подвійної концентрації у співвідношенні 1:1. Подальший перебіг дослідження - аналогічно п. 9.3.3.

9.3.5. Біохімічне підтвердження наявності сальмонел

На середовищах Олькеницького або Кліглера оцінюють забарвлення та газоутворення. При рості сальмонел стовпчик забарвлюється в жовтий колір через ферментацію глюкози. Скошена частина середовища залишається блідо-рожевою при відсутності ферментації лактози, сахарози або обох вуглеводів. Газоутворення встановлюють по тріщинах та розривах у стовпчику агару. Утворення сірководню виявляють на основі почорніння середовища (від темної лінії по місцю проколу середовища до розлитого почорніння усього стовпчика). Гідроліз сечовини виявляється по відновленню рожевого кольору стовпчика середовища.

Культури, що не ферментують лактозу і не гідролізують сечовину, але ферментують глюкозу (з утворенням чи без утворення газу) та утворюють сірководень, підлягають подальшому вивченню.

Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу без газоутворення, не утворюють сірководень і не гідролізують сечовину, підозрілі на S. paratyphi та Shigella. Їх випробовують реакцією аглютинації з полівалентними сальмонельозними та шигельозними сироватками, і подальше вивчення роблять в залежності від результату аглютинації.

Культури, що не ферментують лактозу, ферментують глюкозу з утворенням газу, не утворюють сірководню і є позитивними в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними сироватками, можуть належати до роду Salmonella.

Усі підозрілі культури пересівають на поживні середовища мінімального диференційного ряду (таблиця 1) для підтвердження належності даної культури мікроорганізмів до роду Salmonella і проводять серологічну ідентифікацію.

Ферментативні властивості сальмонел різноманітні, при чому не тільки у окремих представників окремих підродів, але можуть змінюватись і в межах одного і того ж серовару. Вони звичайно утворюють сірководень і не утворюють індол, хоча іноді зустрічаються окремі серовари або їхні різновиди, які утворюють індол і не розкладають сечовину. Сальмонели, як правило, не ферментують лактозу, утилізують цитрат на середовищі Сімонса (S. typhi не утилізують).

Для сальмонел характерні також ферменти лізин-, орнітиндекарбоксилаза і аргініндегідролаза, хоча відомі штами S. typhimurium, S. enteritidis v. ratin та деякі інші серовари, які мають знижений вміст ферменту лізиндекарбоксилази або зовсім його не мають. Всі сальмонели дають позитивну реакцію з метиловим червоним (MR) і негативну реакцію Фогес-Проскауер (VP), редукують нітрати, ферментують маніт і глюкозу (з утворенням газу), але у таких серологічних типів як S. typhimurium, S. derby, S. thompson, S. enteritidis можуть зустрічатися і безгазові варіанти. Постійно не утворюють газу S. typhi і S. gallinarum. Не ферментують сахарозу і адоніт, хоча відомі випадки виділення штамів окремих сероварів, що ферментують сахарозу (S. newport, S. meleagridis, S. stenleyville та ін.). Майже всі сальмонели ферментують сорбіт і, як правило, не розріджують желатину.

Відношення сальмонел до арабінози, дульциту, інозиту, ксилози, рамнози, трегалози, гліцерину за Штерном, а також до d- та L-тартрату, цитрату і мукату неоднакове навіть у межах одного серологічного типу, що дозволяє підрозділяти їх на ряд стабільних біохімічних варіантів. Результати біохімічного типування використовуються в епідеміологічних дослідженнях.

Для прискорення досліджень, отримання відтворюваних результатів доцільно для біохімічної ідентифікації використовувати діагностичні системи та набори, що зареєстровані в Україні, типу ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ(bioMereux), системи індикаторні паперові (Росія).