Про затвердження методичних вказівок "Санітарно-мікробіологічний контроль якості питної води"

Умовні позначення:

+ - позитивна реакція

- - негативна реакція

+,- - не постійно позитивна реакція

-,+ - негативна реакція, але деякими варіантами ферментується

Х - різні типи реакції.

Крім наведених вище тестів ідентифікації виділених культур роблять також посів виділеної культури для дослідження її на чутливість до сальмонельозного О-бактеріофагу.

Для цього дві краплі 4-х або 18-годинної бульйонної культури досліджуваного штаму наносять тонко відтягнутою пастерівською піпеткою або петлею (діаметр 0,4-0,5 мм) на добре підсушений слабко лужний агар у чашці Петрі. Після підсихання на одну з крапель петлею або пастерівською піпеткою меншого діаметру наносять О-бактеріофаг, а на іншу, як контроль, - краплю бульйону. Фаг наносять у робочому розведенні, зазначеному на етикетці. На одній чашці, таким чином, можна випробувати одночасно 5-6 культур. Чашки з нанесеними культурами і О-бактеріофагом поміщають у термостат при (36 +- 1) град. С на 18-20 годин, після чого проводять облік результатів.

Поява на місці нанесення фагу чітко обмеженої зони зливного лізису або більшого чи меншого числа негативних колоній, чітко видимих неозброєним оком, свідчить про чутливість культур до О-бактеріофагу.

При відсутності лізису в місцях нанесення фагу буде суцільний ріст культури, як у контролі.

О-фаг може бути використаний для попереднього дослідження культури з чашки з диференційним середовищем.

Культура, що лізується О-фагом, є підозрілою на сальмонелу і може бути прямо з чашки випробувана в реакції аглютинації з полівалентними сальмонельозними О-сироватками.

Атипові сальмонельозні культури в більшості випадків чутливі до О-фагу, в той час як культури, подібні до сальмонел за біохімічними властивостями (наприклад, лактозонегативні E. coli), як правило, не лізуються цим фагом.

9.3.6. Серологічне підтвердження сальмонел.

Сальмонели мають два основні антигенні комплекси, що представляють різні структурні частини бактеріальної клітини:

- соматичні - О-антигени - термостабільні, зберігаються при кип'ятінні культури протягом 2-5 годин;

- джгутикові - Н-антигени - термолабільні.

О-антигени являють собою складні фосфоліпідо-полісахаридні комплекси, структура яких вивчена досить повно.

Н-антигени мають білкову природу, можуть існувати у двох серологічних фазах: першій і другій (або "специфічній" та "неспецифічній").

Vi - термолабільний соматичний антиген, є одним із компонентів О-антигену і відноситься до групи К-антигенів. Він властивий трьом серологічним варіантам сальмонел - S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin, а також зустрічається у деяких інших представників родини Enterobacteriaceae (Escherichia, Citrobacter).

Антигенна структура покладена в основу схеми Кауфмана-Уайта для ідентифікації серогруп і сероварів сальмонел, однак основними класифікаційними ознаками сальмонел, як і у всіх ентеробактерій, є біохімічні властивості, а не серологічна структура.

На підставі спільності будови О-антигенів сальмонели об'єднують в серологічні групи, які позначаються буквами латинського алфавіту (A, B, C, D, E, F, H та ін. до Z) і далі арабськими цифрами (від 51 до 67) і які містять серологічні типи, що відрізняються між собою структурою H-антигенів.

В даний час схема Кауфмана-Уайта містить у собі 67 О-груп, що відрізняються різними комбінаціями понад 20 комплексів Н-антигенів першої фази і більш 10 різних комплексів Н-антигенів другої фази. Бактерії Arizonae включені до роду Salmonella, ідентифікація їх сероварів здійснюється за схемою Кауфмана-Уайта.

Серологічну ідентифікацію сальмонел починають з випробовування їх у реакції аглютинації на склі з полівалентною сироваткою ABCDE, що включає в себе аглютиніни до О-антигенів 2, 4, 61, 62, 7, 8, 9 і 3-10, 12, Vi.

Для цього на предметне скло поміщають краплю ізотонічного розчину хлористого натрію і поряд краплю полівалентної аглютинуючої сальмонельозної сироватки. Потім в кожну з крапель, починаючи з ізотонічного розчину, вносять бактеріологічною петлею культуру, рівномірно розтирають, похитуючи предметним склом протягом 30-60 сек.

Скло поміщають на темне поле і розглядають за допомогою лупи. При позитивній реакції аглютинації через 0,5-2,0 хв. в краплі сироватки утворюються пластівці, рідина просвітлюється. В краплі з ізотонічним розчином залишається рівномірне помутніння.

При відсутності реакції аглютинації з зазначеною сироваткою культуру випробовують з полівалентною до рідких груп сальмонел сироваткою, що включає антитіла до антигенів 11, 13-22, 14-34, 15, 19, 23 тощо.

При одержанні позитивних результатів аглютинації з однією з полівалентних сироваток культуру випробовують з кожною з О-сироваток, що входять до її складу окремо, для визначення належності її до однієї з О-груп.

Після встановлення належності культури до зазначеної О-групи її випробовують з Н-сироватками спочатку першої фази, а потім - другої. Починати слід з Н-сироваток, що відповідають більш розповсюдженим серологічним типам сальмонел даної групи.

Після визначення Н-антигену першої фази визначають Н-антигенні компоненти другої фази і у такий спосіб встановлюють антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант. При позитивному результаті реакції аглютинації виділеної культури з відповідними сироватками можна видати попередню відповідь про вид сальмонел.

Для аглютинації з О-сироваткою культуру варто брати з верхньої частини росту на скошеному агарі, для аглютинації з Н-сироватками - з найнижчої частини росту культури чи з конденсату, де розташовуються мікроорганізми з найбільш розвинутим Н-антигеном.

9.3.7. Обробка результатів.

Результати оцінюють по кожній пробі окремо. Штами, що дають типові біохімічні властивості та позитивні серологічні реакції з полівалентною аглютинуючою сальмонельозною сироваткою, відносяться до сальмонел. Позитивні реакції аглютинації з О- та Н-сальмонельозними сироватками дозволяють встановити антигенну формулу виділеної культури, тобто її серологічний варіант.

Шигели - збудники гострих кишкових інфекцій, які можуть розповсюджуватися водним шляхом та виживати у водному середовищі. На відміну від сальмонел їм притаманна менша стійкість до дії фізико-хімічних факторів, що ускладнює розробку селективних середовищ накопичення, яке необхідне внаслідок низької концентрації шигел у навколишньому середовищі. Тому при їх виділенні використовують ті ж методичні підходи, що і при дослідженні наявності у воді сальмонел, з різницею у використанні середовищ.

10.1. Визначення поняття

Шигели - факультативно-анаеробні грамнегативні, неспороутворюючі палички, нерухомі, ферментують глюкозу без газу (за деяким винятком), як правило, не ферментують лактозу та сахарозу, не продукують сірководень. Ідентифікацію шигел проводять за рядом біохімічних тестів та серологічних реакцій.

10.2. Відбір проб

Проби відбирають і транспортують згідно з вимогами п. 3 в об'ємі 1-5 куб. дм у залежності від передбачуваної концентрації шигел у воді.

10.3. Метод визначення

Метод визначення шигел полягає у концентрації проб чи накопиченні шигел на середовищах збагачення, висіві на диференційно-селективні середовища з подальшою ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними та серологічними характеристиками.

При дослідженні води можлива комбінація декількох методичних прийомів:

- безпосередній посів води у середовища накопичення;

- концентрація шигел методом мембранної фільтрації з наступним збагаченням у середовищі накопичення;

- попереднє збагачення та селекція у середовищах накопичення за методом Ростовського-на-Дону НДІаЕМТ.

10.3.1. Безпосередній посів води у середовища накопичення

Пробу води ділять на два об'єми по 500 куб. см. В кожний об'єм вносять відповідне накопичувальне середовище: 500 куб. см селенітового бульйону подвійної концентрації (п. 5.2.14) та середовище з охміленим суслом (п. 5.2.17) або жовчний бульйон (п. 5.2.18). Інкубація при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Після цього з кожного флакону роблять висів на дві чашки з диференційно-селективними середовищами - агар ЕМС, агар Плоскірєва з антибіотиками (п. 5.2.24.) та без них (п.п. 5.2.23, 5.2.22.), середовище Мак-Конкі, SS-агар. Чашки з посівами інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. При відсутності росту чашки з посівами залишають у термостаті ще на 24 год.

На вказаних середовищах шигели ростуть у вигляді прозорих або напівпрозорих безкольорових або трохи забарвлених невеликих круглих колоній, які дещо підвищені над поверхнею агару, мають рівні краї, блискучу поверхню. Вони легко знімаються з агару і мають м'яку консистенцію. При дисоціації культур можуть одночасно знаходитися колонії гладкої, шорсткої та перехідної форми. Колонії шигел Зоне бувають іноді великі, білуваті, а через 48 год. можуть набувати злегка рожевого відтінку.

По 2-3 колонії кожного типу з підозрою на шигели засівають у пробірки з середовищем Олькеницького (п. 5.2.26.) або Кліглера (п. 5.2.25.). Інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Облік результатів проводять відповідно до ознак, наведених у табл. 3 Додатку 1.

Для подальшого вивчення відбирають культури грамнегативних безспорових паличок з характерними властивостями для шигел, а саме: не розщеплюють лактозу і сечовину, не утворюють сірководню, ферментують глюкозу з утворенням кислоти і без газу. Варто враховувати, що серед S. sonnei зустрічаються біохімічні варіанти, що ферментують лактозу до кислоти, а деякі варіанти S. flexneri VI розщеплюють глюкозу до кислоти і газу.

Для остаточної ідентифікації культури засівають на мінімальний диференційний ряд (таблиця 2).

Умовні позначення:

+ - ферментація середовища

- - середовище не ферментується

+,- - середовище ферментується, деякими варіантами не ферментується

-,+ - середовище не ферментується, деякими варіантами ферментується

X - варіанти стосовно даної ознаки.

Для прискорення досліджень, отримання відтворюваних результатів для біохімічної ідентифікації використовуються діагностичні системи та набори, зареєстровані в Україні, типу ЕНТЕРОтест (PLIVA-Lachema), АРІ (bioMereux) та системи індикаторні паперові (Росія).

Поряд з встановленням біохімічних властивостей проводиться серологічна ідентифікація шигел, заснована на вивченні їх антигенної структури шляхом виявлення типових і групових антигенів.

Культури, підозрілі як шигели, досліджують у реакції аглютинації на склі спочатку із полівалентною сироваткою S. flexneri I-VI, S. sonnei, а у випадку негативної реакції - з набором полівалентних сироваток до S. boydii, S. dysenteriae. При позитивній реакції аглютинації на склі однієї з полівалентних сироваток продовжують серологічну ідентифікацію культури з адсорбованими сироватками, що входять у полівалентну. При позитивному результаті аглютинацій з монорецепторними сироватками можна видати попередню відповідь про наявність у пробі води шигел.

Додатково доцільно досліджувати чутливість виділених культур до полівалентного дизентерійного бактеріофагу. Для цього використовують таку методику: на добре підсушену чашку зі слабко лужним агаром (pH 7,6) наносять пастерівською піпеткою краплю змиву 18-20-и годинної агарової культури. На підсохлі краплі відтягнутою пастерівською піпеткою наносять дизентерійний бактеріофаг; після підсушування чашки інкубують при 36 +- 1 град. С протягом 18-20 годин. При позитивному результаті спостерігається затримка росту культури на чашках з бактеріофагом.

Відповідь про наявність або відсутність шигел у пробі води дають за біохімічними та серологічними властивостями - за антигенною формулою та чутливістю до полівалентного дизентерійного бактеріофагу.

Для остаточної відповіді, що підтверджує не тільки виділення шигел із досліджуваної води, але й загальне джерело зараження та шляхи передачі інфекції, потрібне більш поглиблене вивчення виділених штамів з використанням методів внутрішньовидового типування. Для цього виділені культури шигел піддають більш детальному біохімічному вивченню, що дозволяє здійснити подальшу диференціацію збудника всередині серологічних типів і, крім того, використовують методи, засновані на феномені коліциногенії, а також визначення антибіотикограм.

10.3.2. Концентрація шигел методом мембранної фільтрації

Воду об'ємом 1 куб. дм ділять на два об'єми по 500 куб. см і кожний з них фільтрують через мембранний фільтр за п.п. 6.3.-6.5.

Один з фільтрів розміщують у 10 куб. см селенітового бульйону звичайної концентрації (п. 5.2.14), другий - у 10 куб. см середовища з охміленим суслом (п. 5.2.17).або жовчним бульйоном (п. 5.2.18).

Посіви інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. В подальшому досліджують як вказано у п. 10.3.1.

10.3.3. Посів води за методом Ростовського-на-Дону НДІ ЕМГ (за Р.С. Хомик та А.А. Риндич)

До 1 куб. дм досліджуваної води додають 5-10 куб. см 1%-го МПБ та інкубують при (36 +- 1) град. С протягом 18-24 год. Роблять висів на середовища Ендо, ЕМС-агар, агар Плоскірєва (п.п. 5.2.5., 5.2.22., 5.2.23), середовище Мак Конкі, SS-агар. У той же час проводять посів збагаченої проби в селективні середовища накопичення: 10%-ий жовчний бульйон (п. 5.2.18) та селенітовий бульйон (п. 5.2.14) таким чином:

Після інкубації передивляють ріст на чашках та роблять висів з розведень на два диференційно-селективних середовища. Подальше дослідження проводять, як вказано у п. 10.3.1.

Водопровідна вода підлягає бактеріологічному дослідженню на холерні вібріони при наявності епідеміологічних показань.

Бактеріологічні дослідження на наявність холерних вібріонів 01 та не 01 проводяться паралельно, в тих же самих пробах. Особливостями холерних вібріонів є відносно швидкий ріст в пептонній воді та здатність до розмноження в середовищах з високою лужністю (pH 9,5).

11.1. Визначення поняття показника

Холерні вібріони 01 - мікроорганізми, що на щільних середовищах утворюють типові колонії, проявляють відповідні біохімічні властивості та аглютинують з холерними діагностичними сироватками (01, R0, 0139), чутливі до холерних фагів (ельтор, класичний).

Холерні вібріони не 01 - мікроорганізми, що за морфологічними, культуральними та біохімічними властивостями аналогічні збуднику холери, але не аглютинують з холерними сироватками, не чутливі до холерних фагів.

11.2. Відбір проб

Проби відбирають і транспортують як описано вище (п. 3) в двох об'ємах по 500 куб. см.

11.3. Метод визначення

Метод полягає у накопиченні холерних вібріонів у двох послідовних середовищах збагачення, висіві на пластини лужного агару, пересіві характерних колоній на диференціальні середовища з подальшою ідентифікацією виділених мікроорганізмів за біохімічними, серологічними ознаками та фаголізабельністю.

11.3.1. Порядок дослідження

В залежності від часу доставки проби можливі декілька варіантів посівів з метою накопичення вібріонів.

1. У досліджувану воду (в двох об'ємах по 500 куб. см) додають розчин основного пептону до 1%-ої концентрації (п.п. 5.2.20.1-5.2.20.2). Визначають pH, у випадку необхідності підлужують 10%-им розчином їдкого натрію до pH (8,3 +- 0,1). Час інкубації - 8-10 год. У друге середовище збагачення (п. 5.2.20.3) в об'ємі 10 куб. см пересівають пробу з першого середовища збагачення. Час інкубації при pH (7,8 +- 0,2) без телуриту калію - 5-6 год., з підвищеною лужністю або з телуритом калію - 14-20 год.

2. В досліджувану воду (в двох об'ємах по 500 куб. см) додають розчин основного пептону до 1% концентрації (п. 5.2.20.1), встановлюють pH (9,3 +- 0,2) або додають телурит калію (п. 5.2.20.3) до концентрації 1:100000 або 1:200000 при pH (8,3 +- 0,1). Час інкубації 18-24 год. Друге середовище збагачення - 10 куб. см 1%-ої пептонної води, pH (7,8 +- 0,2) без телуриту калію, час інкубації 6-8 год.

3. Після встановлення лужної реакції і додавання розчину основного пептону до 1% концентрації проби зберігають при кімнатній температурі до ранку. На початку наступного дня 5 куб. см поверхневого шару засівають в 100 куб. см 1%-ої пептонної води (друге середовище збагачення) і роблять висів на лужний агар (п. 5.2.21). Висів з другого середовища збагачення - через 6 год.

4. Воду фільтрують через мембранні фільтр з діаметром пор 0,45 мкм, змив з яких засівають у середовище збагачення та на агарові пластинки.

I-ий етап

Висів на перше середовище збагачення (4 варіанти).

II-ий етап

Висів з першого середовища збагачення на пластини лужного агару і в друге середовище збагачення (4 варіанти).

III-ій етап

Висів з другого середовища збагачення на пластини лужного агару через 5-6 год. при pH (7,8 +- 0,2) і через 14-20 год. при pH (9,3 +- 0,2).

IV-ий етап

Відбір підозрілих колоній з твердих поживних середовищ проводиться через 16-24 год. інкубації. Переглядають чашки з посівами в прохідному світлі неозброєним оком, за допомогою лупи, можливо під стереоскопічним мікроскопом в косопрохідному світлі.

Колонії холерних вібріонів у типовій S-формі на лужному агарі - круглі, гладкі, плоскі, голубуваті, гомогенні з рівними краями, прозорі в прохідному світлі і сіро-голубі під стереоскопічним мікроскопом. Розміри колоній через 10-12 год. інкубації не перевищують 1 мм, а через 18-24 год. досягають 2-3 мм в діаметрі.

При відборі колоній можна використовувати пробу на наявність оксидази (п. 5.2.30).

Оксидазопозитивні колонії перевіряють в реакції аглютинації на склі з холерними діагностичними сироватками (01, R0, 0139) в розведенні 1:100. При позитивній реакції та достатній кількості підозрілих колоній ставлять слайд-аглютинацію з варіантоспецифічними сироватками Інаба і Огава в розведенні 1:50, готують мазки за Грамом (п. 5.2.32).

Позитивна орієнтовна реакція аглютинації з холерною 01 або R0 сироватками в розведенні 1:100 і варіантноспецифічними Інаба і Огава в розведенні 1:50 в поєднанні з морфологічними, культуральними ознаками і специфічною мобілізацією дозволяють видати на цьому етапі попередню відповідь щодо наявності в досліджуваній воді холерного вібріону 01.

Підозрілі на вібріони колонії висівають на одне з полівуглеводних середовищ (Олькеницького, Ресселя, Кліглера (п.п. 5.2.25, 5.2.26, 5.2.27)) та на лужний агар для виділення чистої культури та ідентифікації.

V-ий етап

Відбирають культури з типовим для вібріонів характером росту на полівуглеводних середовищах.

Культури, що виросли на лужному агарі, перевіряють на наявність оксидази. Визначають морфологію та чистоту культур, що виросли на лужному агарі та полівуглеводних середовищах, за допомогою мазків, забарвлених за Грамом.

Культури, які дали характерні зміни на полівуглеводних середовищах, позитивні в пробі на оксидазу, перевіряють в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01, R0, Інаба і Огава. При негативних результатах ставлять слайд-аглютинацію з холерною сироваткою 0139. При позитивних результатах культура терміново направляється до лабораторії відділу особливо небезпечних інфекцій санепідстанції, де проводиться розширена ідентифікація (люмінесцентна мікроскопія, фаголізабельність, наявність гемаглютинації тощо).

VI-ий етап

Враховують результати ідентифікації і видають остаточну відповідь щодо виділення культури холерного вібріону відповідної серогрупи: 01, R0 (Інаба, Огава, Гікошима) або 0139 з визначенням гемолітичної активності і чутливості до антибіотиків. Для культур холерних вібрінів 01 вказують належність до біовару (ельтор, класичний).

При виділенні культури холерного вібріону, яка не аглютинує з холерними сироватками, видають відповідь про виділення холерного вібріону не 01.

11.3.2. Облік результатів

До виду V. cholerae відносять грамнегативні, аспорогенні, поліморфні палички, злегка зігнуті або прямі, активно рухливі, що утворюють оксидазу, ферментують глюкозу в аеробних і анаеробних умовах до кислоти (без газу), декарбоксилізують лізин та орнітин, не мають гідролази аргініну, відносяться до 1-ої (рідше до 2-ої) ферментативної групи по Хейбергу.

Збудником холери є V. cholerae серогрупи 01 (біовари ельтор, класичний; серовари Інаба, Огава, Гікошима) і серогрупи 0139. Токсигенні варіанти холерних вібріонів 01, не 01 та 0139 серогруп викликають захворювання холерою (не 01 - холероподібні), які схильні до широкого епідемічного розповсюдження.

11.3.3. Організація лабораторних досліджень на холеру

Збудник холери відноситься до мікроорганізмів II-ої групи патогенності. Враховуючи особливості лабораторної діагностики та протиепідемічного режиму, лабораторії, що проводять дослідження на холеру питної води та іншого матеріалу, розподіляються за рівнем досліджень:

1-ий рівень - районні, міські лабораторії санепідслужби.

Можуть проводити дослідження на холеру у відповідності з нормативними документами за умов дотримання вимог протиепідемічного режиму роботи з мікроорганізмами III-ої групи патогенності та наявності дозволу на цю роботу.

Проводять лабораторні дослідження до встановлення негативного результату або виділення культури з характерним для вібріонів ростом на агарових та полівуглеводних середовищах, з позитивною реакцією на оксидазу. Культуру перевіряють в реакції слайд-аглютинації з холерними сироватками 01, R0 та 0139 в концентрації 1:100 та типоспецифічними сироватками Інаба, Огава в концентрації 1:50.

При позитивному результаті лабораторії терміново повідомляють територіальні санітарно-епідеміологічні станції про це. Культуру негайно направляють в лабораторії особливо небезпечних інфекцій Кримської республіканської, обласних, міських санепідстанцій для остаточної ідентифікації.

При негативному результаті слайд-аглютинації культуру ідентифікують за основними біохімічними ознаками: ферментація лактози, сахарози, манози, арабінози, інозиту, крохмалю, наявність декарбоксилази лізину, дигідролази аргініну, окислення та ферментації глюкози на середовищі Хью-Лейфсона.

2-ий рівень - лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій Кримської республіканської, обласних та міських санепідстанцій.

Проводять дослідження на холеру за умов дотримання вимог протиепідемічного режиму роботи з мікроорганізмами II-ої групи патогенності та при наявності дозволу на цю роботу:

- повне дослідження на холеру питної води при наявності епідеміологічних показань;

- ідентифікацію культур вібріонів (розширену), виділених в територіальних та відомчих лабораторіях області, додатково до обсягу робіт 1 рівня проводять: окислення маніту, саліцину, наявність декарбоксилази орнітіну, здатність росту на 1%-ій пептонній воді з 5% хлориду натрію, протеолітичні властивості, утворення індолу, сірководню, реакція MR, наявність уреази, а також чутливість до фагів (ельтор, класичний), ДДФ, ХДФ-3,4,5, наявність гемаглютинації, чутливість до поліміксіну (30 од.), утворення ацетилметилкарбінолу, люмінесцентна мікроскопія. В результаті визначають таксономічну належність до роду, виду, біовару, вірулентність та токсигенність, чутливість до антибіотиків;

- бактеріологічний контроль якості поживних середовищ;

- передачу в установленому порядку культур холерних вібріонів 01.

3-ій рівень - бактеріологічні лабораторії протичумних установ та лабораторія особливо небезпечних інфекцій Центральної санепідстанції МОЗ України:

- підтверджують таксономічну належність культур;

- вивчають особливості біологічних властивостей холерних вібріонів;

- визначають вірулентність та токсигенність штамів;

- проводять бактеріологічний контроль якості поживних середовищ у встановленому порядку;

- проводять моніторинг біологічних характеристик культур холерних вібріонів.

З багаточисельної групи фагів як санітарно-показових вірусів були вибрані постійно наявні у кишечнику людини та водних об'єктах соматичні коліфаги. Соматичні коліфаги - це бактеріальні віруси, котрі складаються з капсиду, який вміщує одно- або двониткову ДНК в якості геному. Соматичні коліфаги здатні інфікувати певні штами хазяїна E. coli та утворювати видимі бляшки (зони лізису, прозорі зони) різного розміру та морфології на зливному газоні бактеріального росту хазяїна за відповідних умов культивування.

Визначення коліфагів можна проводити двома методами:

- титраційним методом (метод накопичення, НВЧ);

- прямим методом у 2-х варіантах.

Титраційний метод дозволяє виявляти незначну кількість коліфагів в об'єкті. Найчастіше застосовується при дослідженні питної води після очистки та знезараження, а також води з розподільчої системи або інших малозабруднених об'єктів. Отримання результату можливе через 24-48 годин.

Застосування прямого методу визначення коліфагів у питній воді має технічну обмеженість внаслідок неможливості дослідження великих об'ємів. Пропонуються два варіанти методу. Варіант I доречно застосовувати при ускладненні епідситуації, коли необхідно якнайшвидше отримати результат. Варіант II застосовують при дослідженні води джерел водопостачання. Прямий метод дозволяє отримати результат через 6-24 годин.

12.1. Титраційний метод визначення коліфагів

Принцип методу визначення коліфагів у питній воді полягає у накопиченні їх у рідкому середовищі збагачення при наявності сприятливих умов та наступному виявленні зон лізису газону E. coli на поживному агарі.

Метод має декілька складових:

приготування тест-культури хазяїна;

посів об'ємів води, що досліджуються, у середовище накопичення з тест-культурою хазяїна;

контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, що використовуються (негативний контроль);

контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).

Як тест-культуру хазяїна соматичних коліфагів застосовують музейні штами E. coli С або E. coli В, які є більш чутливими до циркулюючих у водних об'єктах соматичних бактеріофагів.

12.1.1. Приготування посівної тест-культури E. coli

12.1.2. Проведення аналізу

При використанні титраційного методу досліджують такі об'єми води: 500, 200, 100, 50 та 20 куб. см, в які додають концентроване середовище накопичення (п. 5.3.2) в кількості 5% від загального об'єму та 4-18-годинну посівну бульйонну культуру E. coli (п. 12.1.1) в кількості 1% від загального об'єму засіяної проби (5 куб. см, 2 куб. см, 1 куб. см, 0,5 та 0,2 куб. см відповідно). Після (16 +- 2) годинної інкубації при (37 +- 1) град. С визначають бактеріофаги двошаровим агаровим методом.

Попередньо розливають у 5 стерильних чашок Петрі по 15-20 куб. см 2%-го МПА (п. 5.2.4.2), витримують до повного застигання агару, та у 5 стерильних пробірок по 5 куб. см розплавленого 1,0%-го МПА (п. 5.2.4.2), який має бути охолоджений до температури (45 +- 5) град. С. В кожну з пробірок з 1,0%-им МПА вносять по 5 куб. см відповідного збагаченого об'єму проби води та по 0,5 куб. см E. coli (п. 12.1.1). Обережно перемішують вміст пробірок, уникаючи утворення бульбашок повітря, і виливають на поверхню 2%-го МПА. Агар рівномірно розподіляють і залишають до застигання на горизонтальній прохолодній поверхні. Підсушують чашки з частково відкритими кришками, після чого їх закривають та інкубують у положенні вверх дном (не складають більше, ніж 6 чашок) при (36 +- 1) град. С протягом (4 +- 2) годин, після чого чашки з посівами виймають з термостату і залишають у темному місці при кімнатній температурі на (18 +- 2) години. Цей прийом запобігає негативному впливу на облік результатів супутньої мікрофлори.

12.1.3. Облік результатів

Перегляд результатів виконують у прохідному світлі. Облік проводять ретельно, фіксуючи появу хоча б на одній з чашок зон лізису. Кількість коліфагів в 1 куб. дм проби отримують, користуючись таблицею 2 Додатку 1.

Досліджувати всі об'єми води необхідно при первинному аналізі ще недосліджуваних проб, наявності нестабільних результатів або при введенні нових технологій на станціях водопідготовки. При стабільній роботі споруд водопідготовки з метою економії часу, посуду та поживних середовищ у поточних дослідженнях допускається досліджувати два об'єми води по 500 куб. см. У цьому разі дослідження є якісним.

12.1.4. Постановка негативного контролю.

Негативний контроль підтверджує відсутність контамінації фагом поживних середовищ, лабораторного посуду, устаткування на етапах підготовки та проведення аналізу, а також дозволяє підтвердити здатність E. coli давати рівномірний повноцінний газон.

Негативним контролем слугує дослідження стерильної водопровідної води, яке проводиться аналогічно аналізу проби води. При застосуванні титраційного методу додатково аналізують 20 куб. см стерильної водопровідної води, а при дослідженні прямим методом - 5 куб. см.

У випадку виявлення зон лізису на чашках з негативним контролем результати дослідження даної серії проб вважаються недійсними. Необхідно перевірити стерильність поживних середовищ, лабораторного посуду, устаткування та культуру хазяїна за п. 1.5.4. Додатку 2.

Кратність проведення негативного контролю - 1 раз на день.

12.1.5. Постановка позитивного контролю.

Див. п. 1.5.3. Додатку 2.

12.1.6. Підтвердження фагової природи лізісу

У сумнівних випадках при роботі як титраційним, так і прямим методом проводять контрольний висів для підтвердження фагової природи лізісу.

З цією метою бактеріологічною петлею виймають ділянку агару, на якій є колонії підозрілі на фаги, вносять її у 5 куб. см МПБ (п. 5.2.2.), куди додають 0,5 куб. см тест-культури E. coli (п. 12.1.1) та інкубують при (37 +- 1) град. С протягом (18 +- 2) годин. Отриману культуру досліджують на присутність коліфагів методом, вказаним у п. 12.3.1 (в якості дози посіву замість 5 куб. см використовують 1 куб. см).

12.2. Визначення коліфагів прямим методом (I-ий варіант)

Принцип прямого визначення коліфагів полягає в дослідженні 100 куб. см проби питної води шляхом його прямого посіву одношаровим агаровим методом і наступного підрахунку зон лізісу на газоні E. coli.

Метод складається з наступних складових:

приготування тест-культури хазяїна;

посів об'єму води, який досліджується, на поживний агар з тест-культурою хазяїна;

контроль можливої контамінації фагом середовищ і матеріалів, які використовуються (негативний контроль);

контроль чутливості тест-культури хазяїна до соматичних коліфагів (позитивний контроль).

12.2.1. Проведення аналізу

Флакон зі 100 куб. см 2%-го МПА (п. 5.2.4.2) розтоплюють і доводять до 48 град. С на водяній бані. Досліджувану пробу води у кількості 100 куб. см виливають у відповідний стерильний скляний посуд (наприклад, медичний флакон об'ємом 200 куб. см). Температуру проби води доводять до 48 град. С на водяній бані, після чого додають 10 куб. см культури E. coli (п. 12.1.1). Суміш проби води і бактеріальної культури залишають на 3 хвилини при 48 град. С, після чого її акуратно переливають у флакон з 2%-го МПА, обережно перемішують, щоб уникнути утворення пухирців повітря. Потім суміш розливають швидко, але обережно, у рівних об'ємах (по 20 куб. см) по 10 порожніх чашках Петрі. Чашки залишають до застигання з частково відкритими кришками. Закриті чашки інкубують у положенні догори дном (не складають більше, ніж 6 чашок) при (36 +- 1) град. С протягом (4 +- 2) годин, після чого виймають з термостату і залишають у темному місці при кімнатній температурі на (18 +- 2) години. Постановка контролів здійснюється за п.п. 12.1.4. та 12.1.5.

12.2.2. Облік результатів

Облік результатів проводять наступним шляхом: при наявності зон лізісу підраховують їх кількість на 10-ти чашках і множать на 10, що у підсумку дає вміст коліфагів в 1000 куб. см проби.

12.3. Визначення коліфагів прямим методом (II-ий варіант)

Принцип прямого визначення коліфагів полягає в дослідженні певного об'єму (20 куб. см) від усієї проби води шляхом його прямого посіву двошаровим агаровим методом і наступного підрахунку зон лізісу на газоні E. coli.

Складові методу вказані у п. 12.2.

12.3.1. Проведення аналізу

Попередньо розливають у 4 стерильні чашки Петрі по 15-20 куб. см 2%-го МПА (п. 5.2.4.2) (витримують до повного застигання агару) та у 4 стерильні пробірки по 5 куб. см 1,0%-го МПА, охолодженого до температури (45 +- 5) град. С. В пробірки з 1,0%-ним МПА додають по 5 куб. см проби води, попередньо нагрітої до кімнатної температури, та по 1 куб. см E. coli (п. 12.1.1). Обережно перемішують вміст пробірок, запобігаючи утворенню бульбашок повітря, і виливають на поверхню 2%-го МПА. Агар рівномірно розподіляють і залишають до застигання на горизонтальній прохолодній поверхні. Підсушують чашки шляхом інкубування з частково відкритими кришками, після чого їх закривають і інкубують у положенні вверх дном (не складати більше ніж 6 чашок) при (36 +- 1) град. С протягом (6 +- 2) годин, після чого чашки з посівами виймають з термостату і залишають у темному місці при кімнатній температурі на (18 +- 2) години. Цей прийом запобігає негативному впливу на облік результатів супутньої мікрофлори. Постановка контролів здійснюється за п.п. 12.1.4. та 12.1.5.

12.3.2. Облік результатів

При наявності зон лізісу підраховують їх кількість на 4-х чашках і множать на 50, що у підсумку дає вміст коліфагів в 1 куб. дм проби.

При відсутності коліфагів у пробі при прямому посіві застосовують титраційний метод в разі необхідності.

Мікробіологічні дослідження проводять з дотриманням вимог безпеки відповідно до ДСП 9.9.5.-080-2002 "Правила влаштування і безпеки роботи в лабораторіях (відділах, відділеннях) мікробіологічного профілю", затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 28 січня 2002 р. N 1.

При проведенні досліджень на збудники особливо небезпечних інфекцій дослідження проводять з дотриманням вимог безпеки відповідно до ДСП N 9.9.5.035-99 "Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп небезпеки", затв. Постановою Головного державного санітарного лікаря України від 01.07.99 за N 35.

Якщо при дослідженні води було посіяно більше 3-х десятикратних об'ємів води або розбавлень, то враховують 3 такі послідовні об'єми, в останньому з яких отримано один або декілька негативних результатів. Наприклад: 10 куб. см - три пробірки позитивні, 1 куб. см - те ж саме, 0,1 куб. см - те ж саме, 0,01 куб. см - те ж саме, 0,001 куб. см - позитивний результат тільки в одній пробірці. Враховують об'єми 0,1; 0,01 та 0,001 куб. см.

НВЧ і 95% вірогідні границі коліфагів для різних комбінацій позитивних і негативних результатів при використанні однократно об'ємів води: 500, 200, 100, 50 і 20 куб. см