- кількість, вік та стать тварин,
- місце походження тварин, умови утримування, корм та ін.,
- вага окремих тварини на початку тесту.
Умови проведення дослідження:
- докладна інформація про введення досліджуваного препарату(ділянка нанесення, методи аналізу, окклюзія/неокклюзія, об'єм,видалення та виявлення),
- докладна інформація про якість води та їжі.
Результати:
- будь-які ознаки токсичності,
- табличні дані абсорбції (виражені в діапазоні, кількості тавідсотках),
- загальні характеристики відновлювання експерименту,
- інтерпретація результатів, порівняння з будь-якимидоступними даними про підшкірну абсорбцію досліджуваногоскладового компоненту.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption: In vitro Method.
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of SkinAbsorption Studies. OECD, Paris.
(3) ECETOC, (1993) Percutaneous Absorption. European Centrefor Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No 20.
(4) Zendzian R.P. (1989) Skin Penetration Method suggestedfor Environmental Protection Agency Requirements. J.Am.Coll.Toxicol. 8(5), p. 829-835.
(5) Kemppainen, B.W., Reifenrath WG (1990) Methods for skinabsorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
(6) EPA, (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles andApplications. Exposure Assessment Group, Office of Health andEnvironmental Assessment.
(7) EPA, (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticidesand Toxic Substances.
(8) Bronaugh, R.L., Wester, R.C., Bucks, D., Maibach H.I. andSarason, R., (1990) In vivo percutaneous absorption of fragranceingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28,p. 369-373.
(9) Feldman, R.J. and Maibach, H.I., (1970) Absorption ofsome organic compounds through the skin in man. J. InvestDermatol. 54, p. 399-404.
Малюнок 1
Зразок конструкції типового приладу,
який використовується для визначення та захисту
ділянки нанесення на дерму під час дослідження
підшкірної абсорбції in vivo
B.45. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VITRO
1. МЕТОД
Цей метод тестування еквівалентний TI OECP 428 (2004).
1.1. ВСТУП
Цей метод був розроблений щоб отримати інформацію проабсорбцію досліджуваної речовини, яка наноситься на виокремленушкіру. Він може, як поєднуватись з методом дослідження абсорбціїшкіри: методом in vivo в (1), так і проводитись окремо.Рекомендується дотримуватись методичних вказівок з дослідженняшкірної абсорбції OECD в (2) щоб сприяти розробці дослідження, якебазується на цьому методі. Методичні вказівки були підготовані длятого, щоб полегшити вибір придатних процедур in vitro длявикористання в конкретних обставинах, щоб забезпечити надійністьрезультатів отриманих цим методом.
Методи для вимірювання абсорбції через шкіру татранспортування препарату через шкіру можна поділити на двікатегорії: in vivo та in vitro. Методи абсорбції шкіри in vivo єміцно закріпленими та надають фармакокінетичну інформацію про рядвидів тварин. Метод in vivo окремо описаний в іншому тестовомуметоді (1). Методи in vitro також використовуються вже багатороків, для вимірювання абсорбції через шкіру. Незважаючи на те, щоформальний аналіз неупередженої вибірки методів in vitro включенедо цього тестового методу, не проводиться, експерти OECPпогодились в 1999 р., що повинна бути достатня кількість даних,щоб підтримувати метод in vitro в (3). Решта деталей, якіпідтверджують цю підтримку, включають значну кількість прямихпорівнянь методів in vitro та in vivo, наведені в методичнихвказівках (2). Існує ряд монографій, які оглядають цю тему танадають детальну основу використання методу in vitro в(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Методи In vitro вимірюють дифузіюхімікатів в/та через шкіру до рідинного резервуару та можутьвикористовувати не життєздатну шкіру лише для вимірювання дифузії,або свіжої, метаболічно активної шкіри до одночасного вимірюваннядифузії та метаболізму. Такі методи особливо застосовуються якскринінг для порівняння подачі хімікату в/та через шкіру з різнихформулювань, а також можуть надавати корисні моделі для оцінкипідшкірної абсорбції у людини.
Метод in vitro може не підходити для всіх ситуацій тахімічних класів. Використання методу in vitro є можливим дляпочаткового кількісного оцінювання проникності шкіри. В деякихвипадках, може бути необхідним завершення даними методу in vivo.Потрібно звертатись до методичних вказівок (2) для подальшоїрозробки ситуацій, в яких метод in vitro не придатний. Додатковадетальна інформація на підтримку цього рішення наведена у (3).
Цей метод представляє загальні принципи вимірювання абсорбціїдерми та подачу тестової речовини з використанням виокремленоїшкіри. Можна використовувати шкіру багатьох видів ссавців,включаючи людей. Проникні властивості шкіри зберігаються після їївиокремлення з тіла тому що, основним бар'єром для проникнення єнежиттєздатний роговий шар шкіри, активне переміщення хімікатівчерез шкіру не визначається. Шкіра показує здатність засвоюватидеякі хімікати під час підшкірної абсорбції (6), але цей процес неє обмеженням діапазону в межах фактично поглинутої дози, хоча цеможе вплинути на матеріал, який входить до кровообігу.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Доза, яка не поглинулась: це та доза, що була змита зповерхні шкіри після піддавання дії та будь-яке неокклюзивнепокриття, включаючи будь яку дозу того вказану, як така, щовипаровується зі шкіри під час піддавання дії.
Поглинута доза (in vitro): маса досліджуваної речовини, якадосягає рідини рецептора або системної циркуляції протягомвизначеного періоду часу.
Доза, що поглинається (in vitro): це доза, присутня на/або вшкірі після змивання.
1.3. ПРИНЦИП ТЕСТОВОГО МЕТОДУ
Тестова речовина, яка може бути мічена радіо ізотопом,застосовується до поверхні зразка шкіри, який розділяє дифузор надві камери. Хімікати залишаються на шкірі на визначений періодчасу за визначених умов, перед видаленням через відповіднупроцедуру очищення. Рідина рецептора береться на пробу протягомексперименту та аналізується на тестовий хімікат та/чи метаболіти.
Коли використовуються метаболічно активні системи, тометаболіти тестового хімікату можуть аналізуватись відповіднимиметодами. В кінці експерименту вимірюється розподіл тестовогохімікату та його метаболітів, якщо застосовно.
При використанні відповідних умов, описаних в цьому методі таметодичних вказівках в (2), поглинання досліджуваної речовинивимірюється протягом даного часового періоду за допомогою аналізурідини рецептора та обробленої шкіри. Досліджувану речовину, яказалишилася в шкірі, потрібно розглядати як абсорбовану, крімвипадків коли абсорбцію можна визначити з самої рідини рецептора.Аналіз інших компонентів (матеріалу, який змили зі шкіри, та якийзалишився в шарах шкіри) дозволяє подальшу оцінку даних, включаючизагальний розподіл досліджуваної речовини та відсоток відновлення.
Для того, щоб продемонструвати дію та надійність тестовоїсистеми в лабораторії, яка проводить дослід, повинні бути доступнірезультати для відповідних хімікатів, які узгоджуються зопублікованою літературою про метод, який використовується. Щобвідповідати цій вимозі, потрібно тестувати відповідну еталоннуречовину (бажано із ліпофільністю близькою до досліджуваноїречовини) одночасно з еталонною речовиною або через забезпеченнявідповідних історичних даних для певних еталонних речовин з різноюліпофільністю (наприклад, кофеїн, бензольну кислоту татестостерон).
1.4. ОПИСАННЯ ТЕСТОВОГО МЕТОДУ
1.4.1. Дифузор
Дифузор складається з донорської камери та камери рецептораміж якими розміщується шкіра (приклад типової конструкціїнаведений в Малюнку 1). Камера повинна забезпечувати належнуізоляцію навколо шкіри, дати можливість легкого відбору проб тадостатнього перемішування розчину рецептора в контакті з нижньоючастиною шкіри та достатній контроль температури клітини та їїкомпонентів. Як статичні так і проточні дифузори є прийнятними.Зазвичай, донорські камери залишаються не закритими під часпіддавання дії кінцевої дози тестової речовини. Однак, дляпочаткових аплікацій та певних сценаріїв для кінцевих доз,донорські камери можуть бути закриті.
1.4.2. Рідина рецептора
Надається перевага використанню фізіологічно сприятливоїрідини рецептора, хоча інші можуть теж використовуватись, заумови, що їх використання є обґрунтованим. Потрібно наводититочний склад рідини рецептора. Необхідно демонструвати достатнюрозчинність тестового хімікату в рідині рецептора, таким чином,щоб вона не виступала в якості бар'єру для поглинання. До того ж,рідина рецептора не повинна впливати на цілісність препаратушкіри. В поточній системі, величина потоку не повинна перешкоджатипроникненню тестової речовини до рідини рецептора. У статичнійсистемі камери, потрібно безперервно розмішувати рідину тарегулярно брати її проби. Якщо досліджується метаболізм, то рідинарецептора повинна підтримувати життєздатність шкіри протягомексперименту.
1.4.3. Підготовка шкіри
Можна використовувати шкіру джерелом якої є тварина чилюдина. Визнано, що використання людської шкіри є предметомнаціональних та міжнародних етичних аналізів та умов. Хочаперевага надається життєздатній шкірі, не життєздатна шкіра тежможе використовуватись, за умови, що можна продемонструватицілісність шкіри. Або мембрани епідерми (розділені ензимно,нагріванням або хімічним способом), або розділена товщина шкіри(зазвичай 200-400 мю m товщиною) приготована з допомогоюдерматому, є прийнятною. Може використовуватись повна товщинашкіри, але слід уникати надмірної товщини (приблизно > 1 мм) крімвипадків коли це особливо необхідно для визначення досліджуваногохімікату в шарах шкіри. Вибір видів, анатомічна ділянка та технікипрепарування повинні бути обґрунтованими. Вимагаються дані якмінімум чотирьох повторів на один тестовий препарат.
1.4.4. Цілісність препарату шкіри
Важливо, щоб шкіра була підготовлена належним чином.Невідповідна обробка може спричинити пошкодження рогового шару,тому потрібно перевіряти цілісність шкіри. Коли досліджуєтьсяметаболізм шкіри, то повинна використовуватись свіжо виокремленашкіра настільки швидко наскільки це можливо, та за умов, якіпідтримують метаболічну активність. Для загальних вказівок, свіжовиокремлена шкіра повинна використовуватись протягом доби, алеприйнятний період зберігання може коливатись залежно від ензимноїсистеми, яка залучена у метаболізації та температурах зберігання(13). Якщо препарати шкіри зберігаються перед використанням, топовинні представлятись дані, які показують, що функція бар'єрувиконується.
1.4.5. Досліджувана речовина
Досліджувана речовина - це речовина, характеристикипроникності якої, повинні досліджуватись. В ідеалі, тестоваречовина повинна бути мічена радіоізотопом.
1.4.6. Підготовка тесту
Підготування тестової речовини (наприклад, чистий,нерозбавлений, складений матеріал, який містить тестову речовину,яка наноситься на шкіру) повинні бути такі ж (або реальнийзамінник) як ті, дії яких будуть піддаватись люди чи потенціальніцільові види. Будь-які варіації препарату "у використанні" повиннібути обґрунтовані.
1.4.7. Концентрації та склад досліджуваної речовини
Зазвичай використовується більше ніж одна концентраціятестової речовини вимірюючи найвищий потенціал піддавання людинидії препарату. Так само необхідно аналізувати тестування рядутипових рецептур.
1.4.8. Нанесення на шкіру
За нормальних умов піддавання людини дії хімікату, зазвичайзустрічаються кінцеві дози. Тому, повинна наноситись аплікація,яка імітує перше піддаванням людини дії, як правило 1-5 мг/кв.смшкіри для твердого тіла та до 10 мкл/кв.см для рідин. Кількістьповинна бути обґрунтованою згідно очікуваних умов, об'єктівдослідження чи фізичних характеристик. Наприклад, нанесення наповерхню шкіри може бути необжеменим, де наносяться великі об'ємина одиницю площі.
1.4.9. Температура
На пасивне проникнення хімікатів (а отже і їх шкірноїабсорбції) впливає температура. Дифузорна камера та шкіра повиннізберігатись при постійній температурі близькій до нормальноїтемператури шкіри 32 +- 1 град.C. Різні моделі клітин потребуютьрізний водний розчин або блокові температури підігріву, щобгарантувати, що рецептор/шкіра перебуває у фізіологічній нормі.Бажана вологість повинна бути між 30 та 70%.
1.4.10. Тривалість піддавання дії та вибірка
Піддавання шкіри дії досліджуваного препарату може триватипротягом всього експерименту або протягом коротших періодів(наприклад, для того, щоб імітувати особливий тип піддаваннялюдини дії препарату). Шкіру потрібно промити від надлишкутестового препарату відповідною очисною речовиною, речовина післяпромивання збирається для аналізу. Процедура підготовки тестузалежить від очікуваних умов використання та повинна бутиобґрунтованою. Як правило вимагається цілодобовий відбір зразків,щоб надати можливість для відповідної характеристики профілюабсорбції. Оскільки цілісність шкіри може пошкоджуватись черездобу, то тривалість відбору зразків не повинна перевищувати однудобу. Це може бути не потрібним для тестових речовин, які швидкопроникають через шкіру, але для тестових речовин, які проникаютьповільно можуть бути необхідні довші періоди. Частота зборузразків рідини рецептора повинна надати можливість для графічногопредставлення профілю абсорбції тестової речовини.
1.4.11. Кінцеві процедури
Всі компоненти тестової системи потрібно аналізувати тавизначати їхню відновлюваність. Це включає донорську камеру,промивання поверхні шкіри, підготовка шкіри та рідину/камерурецептора. В деяких випадках, шкіра може бути поділена на фракціїв ділянці шкіри, яка піддавалася дії препарату, та ділянці підфланцем клітини та в роговому шарі, у фракціях епідерми та дерми,для окремого аналізу.
1.4.12. Аналіз
У всіх дослідженнях потрібно досягнути адекватноговідновлення (за мету встановлюється 100 +- 10% радіоактивності, абудь-які відхилення потрібно обґрунтувати). Потрібнопроаналізувати кількість тестової речовини в рідині рецептора,препараті шкіри, обмивальних засобах для поверхні шкіри та апаратідля промивання, використовуючи відповідну техніку.
2. ДАНІ
Потрібно представити аналіз рідини рецептора, розподілречовини досліджуваного хімікату в тестовій системі та профільабсорбції із визначенням часу. Коли використовуються умовикінцевого дозування піддавання дії, то необхідно обрахуватикількість речовини, яку змивають зі шкіри, кількість речовинипов'язаної зі шкірою (та проаналізувати шари шкіри) та кількість,наявну в рідині рецептора (об'єм, кількість або відсотокзастосованої дози). Інколи абсорбція шкіри може виражатись черезвикористання лише даних рідини рецептора. Однак, якщо досліджуванаречовина залишається в шкірі в кінці дослідження, то її потрібновключити до загальної поглинутої кількості (див. параграф 66 впосиланні (3)). Якщо, використовуються початкові умови дозуванняпіддавання дії, то ці дані можуть дозволити обрахувати константупроникності (Kp). За останніх умов, відсоток абсорбції є нерелевантним.
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має включати вимоги,обумовлені в протоколі, включаючи обґрунтування тестової системи,яка використовувалась, та повинен включати наступне:
Досліджувана речовина:
- фізична природа, фізико-хімічні властивості (ринаймнімолекулярна вага та коефіцієнт розподілу), та чистота(радіохімічна чистота),
- ідентифікаційна інформація (наприклад, номер партії),
- розчинність в рідині рецептора.
Підготовка тесту:
- формулювання та обґрунтування використання,
- гомогенність.
Умови проведення дослідження:
- джерела та ділянки шкіри, метод препарування, умовизберігання перед використанням, будь-яка попередня обробка(очищення, застосування антибіотиків, та ін.), вимірюванняцілісності шкіри, метаболічний статус, обґрунтування використання,
- моделювання камери, склад рідини рецептора, об'єм потокурідини рецептора або час вибірки та процедури,
- докладна інформація про нанесення досліджуваного препаратута кількість дози, яка застосовується,
- тривалість піддавання дії,
- докладна інформація про видалення досліджуваного препаратузі шкіри, наприклад, промивання шкіри,
- докладна інформація аналізу шкіри та будь-яких технікподілу на фракції, які застосовуються, щоб продемонструватирозподіл шкіри,
- процедури промивання камер та обладнання,
- методи аналізу, техніки екстрагування, обмеження виявленнята аналітичні методи затвердження.
Результати:
- повний вихід експерименту (Застосована доза = Промиванняшкіри + Шкіра + Рідина рецептора + промивання клітин),
- складання таблиць індивідуального відновлення клітин вкожному відсіку,
- профіль абсорбції,
- дані абсорбції у формі таблиць (виражені в діапазоні,кількості та відсотках),
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Testing Method B.44. Skin Absorption: In Vivo Method.
(2) OECD, (2002) Guidance Document for the Conduct of SkinAbsorption Studies. OECD, Paris.
(3) OECD, (2000) Report of the Meeting of the OECD ExtendedSteering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 toENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G., (1990) Methods forskin absorption. CRC Press, Boca Raton.
(5) Bronaugh R.L. and Collier, S.W., (1991) Protocol for Invitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro PercutaneousAbsorption: Principles, Fundamentals and Applications, RL Bronaughand HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237-241.
(6) Bronaugh R.L. and Maibach H.I., (1991) In vitroPercutaneous Absorption: Principles, Fundamentals andApplications. CRC Press, Boca Raton.
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology ofChemicals, (1993) Monograph No 20, Percutaneous Absorption,ECETOC, Brussels.
(8) Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F., CourtellemontP., Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W.,(1999) Test Guidelines for In Vitro Assessment of DermalAbsorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients,Fd Chem Tox, 37, p. 191-205.
(9) Recommended Protocol for In vitro Percutaneous AbsorptionRate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No 65.
(10) Howes, D., Guy, R., Hadgraft, J., Heylings, J.R.etal.(1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAMWorkshop Report ATLA 24, 81 R10.
(11) Schaefer, H. and Redelmeier, T.E., (1996). Skin barrier:principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
(12) Roberts, M.S. and Walters, K.A., (1998). Dermalabsorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
(13) Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams,F.M. (2000). Percutaneous absorption and metabolism ofdinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74, p. 356-365.
Малюнок 1
Приклад типової конструкції статичного дифузора
для досліджень підшкірної абсорбції in vitro
Серія C: МЕТОДИ ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ЕКОТОКСИЧНОСТІ
ЗМІСТ
C.1. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РИБ.
C.2. DAPHNIA SP. ДОСЛІДЖЕННЯ ВИСОКОЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ
C.3. ДОСЛІДЖЕННЯ ІНГІБІЦІЇ ВОДОРОСТЕЙ
C.4. ВИЗНАЧЕННЯ "ПОВНОЇ" БІОРОЗКЛАДНОСТІ
PART I. ЗАГАЛЬНІ ПОЛОЖЕННЯ
PART II. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ РОЗКЛАДАННЯ РОВ
(Метод C.4-A).
PART III. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ МОДИФІКОВАНОГО РОЗКЛАДАННЯ
ОЕСР (Метод C.4-B)
PART IV. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ВИДІЛЕННЯ CO (Метод C.4-C). 2
PART V. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ МАНОМЕТРИЧНОЇ СПІРОМЕТРІЇ
(Метод C.4-D)
PART VI. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ЗАКРИТОЇ ПЛЯШКИ (Метод C.4-E)
PART VII. ДОСЛІДЖЕННЯ ЗА МЕТОДОМ ММТП (Метод C.4-F)
C.5. ДЕГРАДАЦІЯ (РОЗКЛАДАННЯ) - БІОХІМІЧНА ПОТРЕБА В КИСНІ
C.6. ДЕГРАДАЦІЯ - ХІМІЧНА ПОТРЕБА В КИСНІ
C.7. ДЕГРАДАЦІЯ - АБІОТИЧНА ДЕГРАДАЦІЯ: ГІДРОЛІЗ ЯК
ФУНКЦІОНУВАННЯ PH МЕТОДУ
C.8. ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ ДОЩОВИХ ЧЕРВ'ЯКІВ
C.9. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ - ТЕСТ ЗАН-ВЕЛЛЕНСА
C.10. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ - ДОСЛІДЖЕННЯ МОДЕЛЮВАННЯ
АКТИВНОГО МУЛУ
C.11. БІОЛОГІЧНА ДЕСТРУКЦІЯ - ДОСЛІДЖЕННЯ ЗАТРИМКИ
ІНТЕНСИВНОСТІ ДИХАННЯ АКТИВОВАНОГО МУЛУ
C.12. БІОЛОГІЧНИЙ РОЗПАД - МОДИФІКОВАНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ НБАМ
C.13. БІОЛОГІЧНЕ НАКОПИЧЕННЯ: ДОСЛІДЖЕННЯ НА РИБІ У
ПРОТОЧНОМУ РЕЖИМІ
C.14. ДОСЛІДЖЕННЯ РОСТУ МАЛЬКА
C.15. РИБА, ЕКСПРЕС-ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РІЗНИХ
СТАДІЙ РОЗВИТКУ ЕМБРІОНІВ ТА ПЕРЕДЛИЧИНОК
C.16. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ ПЕРОРАЛЬНУ
ТОКСИЧНІСТЬ
C.17. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ КОНТАКТНУ
ТОКСИЧНІСТЬ
C.18. АДСОРБЦІЯ/ДЕСОРБЦІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ МЕТОДУ РІВНОВАГИ
C.19. ВИЗНАЧЕННЯ КОЕФІЦІЄНТА АДСОРБЦІЇ (К ) НА ҐРУНТІ ТА НА ОС
ОСАДІ СТІЧНИХ ВОД З ВИКОРИСТАННЯМ ВИСОКОЕФЕКТИВНОЇ
РІДИННОЇ ХРОМАТОГРАФІЇ (ВЕРХ)
C.20. ТЕСТУВАННЯ РЕПРОДУКТИВНОЇ ФУНКЦІЇ ДАФНІЇ МАГНА
(DAPHNIA MAGNA)
C.21. ҐРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ
АЗОТУ
C.22. ҐРУНТОВІ МІКРООРГАНІЗМИ: ДОСЛІДЖЕННЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ
ВУГЛЕЦЮ
C.23. АЕРОБНЕ ТА АНАЕРОБНЕ ПЕРЕТВОРЕННЯ В ГРУНТІ
C.24. АЕРОБНІ І АНАЕРОБНІ ТРАНСФОРМАЦІЇ В СИСТЕМІ ВОДНИХ
ОСАДІВ
C.1. ГОСТРА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ РИБ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Мета цього тесту визначити гостру летальну токсичністьречовини для риб у прісній воді. Бажано мати, по мірі можливості,інформацію про розчинність у воді, тиск пари, хімічнустабільність, константи дисоціації та здатності речовини добіологічного розпаду, щоб допомогти у виборі найбільш придатноготестового методу (статичного, напівстатичного чи поточного) длязабезпечення задовільно сталих концентрацій досліджуваної речовинипротягом періоду тестування.
Додаткова інформація (наприклад структурна формула, ступіньчистоти, природа та відсоток важливих домішок, наявність такількість хімічних додатків, коефіцієнт розподілу n-октанолу/води)необхідно взяти до уваги як при плануванні тесту, так і приінтерпретації результатів.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
Гостра токсичність це видимий шкідливий ефект, що виникає ворганізмі протягом короткого періоду (днів) піддавання діїречовини в даному тесті, гостра токсичність виражається як середнялетальна концентрація (LC ) тобто, така концентрація у воді, що
50
вбиває 50% тестової групи риб протягом тривалого періоду
піддавання дії, що повинно встановлюватись.
Всі концентрації тестової речовини подаються у масі на об'єм(міліграм на літр). Вони також можуть виражатися як маса на масу
-1
(мг/кг ).
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Еталонна речовина може тестуватись, як засіб, що показує, щоза умов лабораторного тесту реакція видів, які тестують, значно незмінюється.
Для цього тесту еталонні речовини не визначаються.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Контроль по діапазону значень здійснюється при 100 мг на літрдля того, щоб показати, що LC більший ніж ця концентрація.
50
Рибу до піддають дії досліджуваної речовини, що додається доводи у вигляді певного спектру концентрацій за період 96 год.
Випадки смертності записуються принаймні з інтервалом в добу,та обраховують, якщо можливо, концентрації, які знищують 50% риб(LC ) при кожному періоді спостереження.
50
1.5. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Критерії якості повинні застосовуватись як до контролю подіапазону значень так і до повного методу дослідження.
Смертність в контрольних групах не повинна перевищувати 10%(або однієї риби, якщо використовується менше 10) на кінецьдослідження.
Концентрація розчиненого кисню повинна становити більше ніж60% величини насиченості повітря протягом всього періодудослідження.
Концентрації досліджуваної речовини повинні підтримуватись вмежах 80% початкових концентрацій протягом всього періодудослідження.
Стосовно речовин, які легко розчиняються в досліджуваномусередовищі та утворюють стабільні розчини, тобто ті, які не будутьзначною мірою випаровуватись, розкладатись, піддаватись гідролізуабо поглинатись, початкову концентрацію можна вважатиеквівалентною номінальній концентрації. Докази мають показувати,що концентрації зберігались протягом всього дослідження тавідповідали критеріям якості.
Для речовин які:
(i) погано розчиняються в досліджуваному середовищі, або
(ii) здатні утворювати стабільні емульсії чи дисперсії,
(iii) нестабільні у водних розчинах,
За початкову концентрацію потрібно брати концентраціювиміряну в розчині (або, якщо технічно не можливо, то виміряну уводомірній колонці) на початку дослідження. Концентрацію необхідновизначати після періоду врівноважування, але до початкудослідження риб.
В будь-якому з цих випадків, подальші вимірювання потрібноздійснювати під час дослідження, щоб підтвердити дійсніконцентрації піддавання дії або відповідність критеріям якості.
Рівень pH не повинен змінюватись більше ніж на 1 одиницю.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Три види процедур можуть використовуватись:
Статичне дослідження.
Дослідження токсичності, в якому не відбувається витікдосліджуваних речовин. (Розчини залишаються незмінними протягомвсього дослідження.)
Напівстатичне дослідження:
Дослідження без витоку досліджуваної речовини, але зрегулярним періодичним відновленням досліджуваної речовини післятривалих періодів. (наприклад, 24 год).
Проточний метод дослідження:
Дослідження токсичності, в якому вода постійно відновлюєтьсяв досліджуваних відсіках, хімікат, який під час дослідженнятранспортується з водою, використовується для відновленнядосліджуваного середовища.
1.6.1. Реагенти
1.6.1.1. Розчини досліджуваних речовин
Вихідні розчини необхідної концентрації готують за допомогоюрозчинення речовини в деіонізованій воді або воді згіднопункту 1.6.1.2.
Обрані концентрації для дослідження готують через розчиненнявихідного розчину. Якщо досліджуються високі концентрації, торечовину можуть розчиняти безпосередньо в розбавленій воді.
Речовини зазвичай досліджують лише до ліміту розчинності.Стосовно деяких речовин (наприклад, речовин, які мають низькурозчинність у воді, або високу величину P , або ті, які утворюють
ow
радше стабільні дисперсії аніж чистий розчин у воді), допускається
використовувати досліджувану концентрацію, яка є вищою за ліміт
розчинності речовини, для того, щоб отримати максимально
розчинну/стабільну концентрацію. Важливо, однак, щоб ця
концентрація не порушувала іншим чином систему дослідження
(наприклад, плівка речовини на поверхні води перешкоджає насиченню
води киснем та ін.).
Ультразвукова дисперсія, органічні розчинники, емульгаториабо дисперсанти можуть використовуватись, як допоміжні дляприготування вихідних розчинів речовин з низькою розчинністю уводі, або ж для того щоб допомогти диспергувати ці речовини вдосліджуваному середовищі. Якщо використовуються такі допоміжніречовини, то всі досліджувані концентрації повинні міститиоднакову кількість допоміжної речовини, риба для додатковогоконтролю повинна піддаватися впливу такої ж концентраціїдопоміжної речовини, яка використовується в серії досліджень.Концентрація таких допоміжних речовин повинна бути мінімальною,але ні в якому разі не перевищувати 100 мг на літр вдосліджуваному середовищі.
Дослідження має здійснюватись без регулювання рівня pH. Якщоє ознаки змін в рівні pH, то рекомендується повторити дослідженняз регулюванням рівня pH та відзвітувати про результати. В цьомувипадку, значення pH вихідного розчину потрібно погодити зізначенням pH розчиненої води, за винятком якщо є особливі причинине робити цього. Для цієї мети віддають перевагу HCl та NaOH. Церегулювання рівня pH повинно виконуватись таким чином, щобконцентрація досліджуваної речовини у вихідному розчині незмінювалася значною мірою. Якщо трапиться так, що будь-яка хімічнареакція або фізичний осад складового компоненту дослідження будевикликаний регулюванням, то про це слід звітувати.
1.6.1.2. Вода утримування та розчинення
Може використовуватись запас питної води (не зараженапотенційно шкідливими концентраціями хлору, важких металів чиінших речовин) природна вода належної якості або відновлена вода.Надається перевага воді з загальною жорсткістю від 10 до 250 мг налітр (як CaCO ) та pH від 6,0 до 8,5.
3
1.6.2. Прилади
Всі прилади повинні бути виготовлені з неінертного матеріалу:
- автоматична система розчинення (для проточного тесту),
- апарат для вимірювання кисню,
- обладнання для визначення жорсткості води,
- відповідний прилад для контролю температури,
- прилад для вимірювання рівня pH.
1.6.3. Піддослідна риба
Риба повинна бути здоровою та не мати жодних очевиднихдефектів.
Біологічні види необхідно обирати на основі практичнихкритеріїв, таких як наявність протягом року, легкість вутримуванні, зручність для досліджень, відносна чутливість дохімікатів, та будь-які економічні, біологічні чи екологічніфактори, які до них відносяться. Потрібно звертати увагу напотребі порівняння отриманих даних та існуючих міжнароднихузгоджень (посилання 1), коли обираються біологічні види.
Список видів риб, які рекомендовані для здійснення цьогодослідження надається в Додатку 2, перевага надається; Смугастійперцині та Райдужній форелі.
1.6.3.1. Утримування
Піддослідна риба повинна бути з одного запасу, однаковоїдовжини та віку. Риба повинна утримуватись щонайменше 12 днів внаступних умовах:
завантаження:
відповідно до системи (рециркуляція або проточність) табіологічних видів риб,
вода:
див. пункт 1.6.1.2,
освітлення:
12-16 годин освітлення щоденно,
Концентрації розчиненого кисню:
принаймні 80% значення насиченості повітря,
Годування:
Тричі на тиждень або щоденно, годування припиняється за24 години до початку дослідження.
1.6.3.2. Смертність
Після 48-ми годинного періоду заселення, випадки смертностізаписують та використовують наступні критерії:
- більше ніж 10% популяції за 7 днів:
відхилення всієї групи,
- між 5 та 10% популяції:
період утримування подовжується на сім додаткових днів.
Якщо подальших випадків смертності не трапляється, то група єприйнятною, в іншому випадку групу потрібно відхилити.
- менше ніж 5% популяції:
Прийняття партії.
1.6.4. Адаптація
Всіх риб потрібно піддати впливу води такої якості татемператури, яка має використовуватись в дослідженні, принаймніпротягом семи днів до того, як їх будуть використовувати.
1.6.5. Процедура дослідження
Дослідження на визначення діапазону значень може передуватикінцевому дослідженню, для того щоб отримати інформацію продіапазон концентрацій, які використовуються в основномудослідженні.
Проводиться один контроль без досліджуваної речовини та, якщонеобхідно, один контроль, який містить допоміжну речовину, надодаток до ряду досліджень.
Залежно від фізичних та хімічних властивостей складовогокомпоненту, що досліджується, статичне, напівстатичне та проточнедослідження обирається відповідно, щоб задовольнити критеріїякості.
Рибу піддають дії речовини, як описано нижче:
- тривалість 96 годин,
- кількість тварин: щонайменше 7 на одну концентрацію,
- резервуари: відповідної ємності відносно рекомендованогозавантаження,
- завантаження: рекомендується максимальне завантаження 1 гна літр для статичного та напівстатичного дослідження, дляпроточних систем може використовуватись більше завантаження,
- досліджувана концентрація: Щонайменше 5 концентрацій, щовідрізняються на незмінний коефіцієнт, який не перевищує 2,2, танастільки, наскільки можливо охоплює область значень від 0 до 100%смертності,
- вода: див. пункт 1.6.1.2,
- світло: 12-16 годин освітлення на день,
- температура: та що підходить для біологічних видів(Додаток 2) але в межах +- 1 град.C в межах будь-якого конкретноготесту,
- концентрація розчиненого кисню: не менше ніж 60% значеннянасиченості повітря при обраній температурі,
- годування: відсутнє.
Риб оглядають після перших 2-4 годин та з інтерваламищонайменше в добу. Риба вважається мертвою, якщо відсутня реакціяна дотик до хвостового стебла та відсутні видимі дихальні рухи.Якщо помічають мертву рибу, то її видаляють та записуютьсмертність. Ведуться записи видимих аномалій (наприклад, втратарівноваги, зміна плавальної поведінки, дихальної функції,пігментації та ін.).
Вимірювання pH, розчиненого кисню та температури повинноздійснюватись щоденно.
Дослідження на граничний вміст
Використовуючи процедури, описані в цьому методі, дослідженняна граничний вміст може здійснюватись при 100 мг на літр для того,щоб продемонструвати, що LC більше ніж ця концентрація.
50
Якщо природа цієї речовини така, що не можливо отриматиконцентрацію 100 мг на літр, то дослідження на граничний вмістповинно здійснюватись при концентрації, що дорівнює розчинностіречовини (або при максимальній концентрації, що утворює стабільнудисперсію) в середовищі, яке використовується (див. також пункт1.6.1.1).
Дослідження на граничний вміст повинно проводитись звикористанням 10 риб, з таким же числом в контрольному зразку(зразках). (Біноміальна теорія проголошує, що коливикористовується 10 риб з нульовою смертністю, то можна бутивпевненим на 99,9%, що LC більше ніж концентрація, яка
50
використовувалась в дослідженні на граничний вміст).
Якщо трапляються випадки смертності, то слід проводити повнедослідження. Якщо спостерігається сублетальні впливи, то цепотрібно записувати.
2. ДАНІ ТА ОЦІНЮВАННЯ
Для кожного періоду, для якого записувались спостереження(24, 48, 72 та 96 годин), наноситься на графік відсоток смертностів залежності від концентрації на папері для ймовірногологарифмічно нормального розподілу.
Якщо можливо та для кожного періоду спостереження, LC та 50границі достовірності (p = 0,05) повинно оцінюватись звикористанням стандартних процедур; ці значення повинні бутиокруглені до одиниці, або при двох найбільш значних показниках(приклади округлення до двох цифр: 170 для 173,5; 0,13 для 0,127;1,2 для 1,21).
В тих випадках де нахил кривої співвідношенняконцентрація/процент занадто крутий для того, щоб надатиможливість обрахувати кривої реакції LC , достатньо графічної
50
оцінки значення.
Коли дві послідовні концентрації, з коефіцієнтом 2,2 даютьлише 0 та 100% смертності, то ці два значення є достатніми длятого щоб визначити діапазон в межах якого LC спадає.
50
Якщо спостерігається той факт, що стабільність абогомогенність досліджуваної речовини не може бути збережена, то проце слід відзвітувати та потурбуватись про інтерпретаціюрезультатів.
3. ЗВІТУВАННЯ
Звіт про дослідження повинен, якщо це можливо, включатинаступну інформацію:
- інформацію про піддослідну рибу (наукову назву, вид,постачальника, будь-яку попередню обробку, розмір та кількість,використані для кожної досліджуваної концентрації),
- джерело води для розчинення та основні хімічніхарактеристики (рівень pH, жорсткість, температура),
- якщо речовина має низьку розчинність у воді, то методприготування вихідного та досліджуваного розчину,
- концентрацію будь-яких допоміжних речовин,
- перелік концентрацій, які використовуються та будь-якудоступну інформацію про стабільність при цих концентраціяхдосліджуваного хімікату в досліджуваному розчині,
- якщо проводяться хімічні аналізи, то методи, яківикористовувались, та отримані результати,
- результати дослідження граничного вмісту, якщо вонопроводилось,
- обґрунтування вибору та деталі процедури дослідження, якавикористовувалась (наприклад, статична, напівстатична, нормадозування, норма протікання, чи газоване, завантаження рибою, таін.),
- опис обладнання для досліду,
- режим освітлення,
- концентрації розчиненого кисню, значення pH та температуридосліджуваних розчинів кожні 24 години,
- докази того, що були виконані критерії якості,
- таблиця, яка показує сукупну смертність при кожнійконцентрації та контроль (та контроль з допоміжними речовинами,якщо необхідно) при кожному рекомендованому періоді спостереження,
- графік кривої співвідношення концентрація/процент реакції вкінці тестування,
- якщо можливо, значення LC у кожному рекомендованому 50періоді спостереження (з 95% границею довірчого інтервалу),
- статистичні процедури, що використовуються для визначеннязначень LC ,
50
- якщо використовується еталонна речовина, вказати отриманірезультати,
- найвища досліджувана концентрація, яка не викликаєсмертності протягом всього періоду дослідження,
