(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W.,Pechovitch, G. De Silva, O., Holzhutter, H.G., Clothier, R.,Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T.,Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D.,Steiling, W., and Brantom, P., (1998) The international EU/COLIPAIn vitro phototoxicity validation study: results of phase II(blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. ToxicologyIn Vitro 12, p. 305-327.
(9) OECD, (2002) Extended Expert Consultation Meeting on TheIn Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin,30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary Report, 15thMarch 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from theSecretariat.
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A., (1985) Toxicitydetermination in vitro by morphological alterations and neutralred absorption. Toxicology Lett., 24, p. 119-124.
(11) Hay, R.J., (1988) The seed stock concept and qualitycontrol for cell lines. Analytical Biochemistry 171, p. 225-237.
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A., (1996)Animal models for phototoxicity testing. In "Dermatotoxicology",edited by F.N.Marzulli and H.I.Maibach. Taylor & Francis,Washington DC. 5th Edition, p. 515-530.
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M., (1987) Action spectra for humanskin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middleultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight onepidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, p. 1825-1829.
(14) ISO 10977., (1993) Photography - Processed photographiccolour films and paper prints - Methods for measuring imagestability.
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE,International Commission on Illumnation, Publication No 90,Vienna, 1993, ISBN 3 900 734 275
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA - Standard Operating Procedure: InVitro 3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September,1998. p. 18.
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., DeSilva, O., Holzhutter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell,W.W., and Pfannenbecker, U., (1998) A study on UV filter chemicalsfrom Annex VII of the European Union Directive 76/768/EEC, in thein vitro 3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, p. 679-708. (18)Holzhutter, H.G., and Quedenau, J., (1995) Mathematical modelingof cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3,p. 127-138.
(18) Holzhutter, H.G., (1997) A general measure of in vitrophototoxicity derived from pairs of dose-response curves and itsuse for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals. ATLA,25, p. 445-462.
(19) htt://www.oecd.org/document/55/
0,2340,en_2649_34377_2349687_1_1_1_1,00.html
Додаток 1
Роль 3T3 NRU PT
у логічному підході до тестування хімікатів
на фото токсичність
-----------------------------------------------------------------
| Початкове оцінювання фізичних, хімічних та |
| токсилогічних властивостей тестованої речовини |
| * Фізико-хімічні властивості |
| * Хімічна структура, структурні сигнали тривоги |
| * UV/vis - поглинання |
| * QSAR - фотохімія |
| * Загальна токсичність (включаючи кінетику та |
| метаболізм |
-----------------------------------------------------------------
|
|
|
\/
--------------------------- -------------------
| UV/vis | | Тестування на |
| Спектр поглинання у | | Фототоксичність |
| відповідному розчиннику |-------------> | не вважається |
| | | за необхідне |
| Напр. ОЕСР TG 101 | | |
--------------------------- -------------------
|
|
| Поглинання
|
\/
-----------------------------------------------------------------
| In Vitro 3T3 NRU тест на фототоксичність та/чи інші методи |
| якщо необхідно |
-----------------------------------------------------------------
Додаток 2
Малюнок 1
Спектральний розподіл потужності
оснащеного фільтром імітатору сонячного світла
Малюнок 2
Чутливість до опромінення
клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3
(виміряна в діапазоні УФА)
B.42. ЧУТЛИВІСТЬ ШКІРИ: АНАЛІЗ РЕАКЦІЇ
ІЗОЛЬОВАНИХ ВУЗЛІВ
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 429(2002)
1.1. ВСТУП
Аналіз реакції ізольованих лімфовузлів (АРІЛ) є достатньозатвердженим та прийнятним для підтвердження його прийняття вякості нового методу (1)(2)(3). Це другий метод оцінюванняпотенціалу чутливості шкіри тварин до хімічних речовин. Іншийметод (B.6) використовує тести на морських свинках, особливо тестна максимізацію на морських свинках та тест Бюхлера (4).
АРІЛ є альтернативним методом для визначення хімічнихречовин, які викликають чутливість шкіри та підтверджує те, щохімічні речовини не мають значного потенціалу для спричиненняалергічних реакцій шкіри. Це не обов'язково означає, що у всіхвипадках необхідно використовувати аналіз реакції ізольованихлімфовузлів замість тесту на морських свинках, але, скоріше завсе, цей аналіз є еквівалентним та може застосовуватись в якостіальтернативи, коли позитивні та негативні результати вже непотребуватимуть подальшого підтвердження.
АРІЛ має певні переваги у відношенні як технічного прогресу,так і добробуту тварин. Він досліджує індуктивну фазусенсибілізації шкіри та надає кількісні дані, необхідні дляпроведення оцінки реакції на дозу. Детальна інформація прозатвердження АРІЛ та огляд праці, опублікованої у співавторстві,представлено у посиланнях (5)(6)(7)(8). Окрім того, слідзауважити, що слабкі/помірні сенсибілізатори, які булирекомендовані в якості речовин для позитивного контролю дляпроведення тесту на морських свинках, можуть такожвикористовуватись під час проведення АРІЛ (6)(8)(9).
АРІЛ - це метод in vivo, а отже, він не виключає використаннятварин для оцінювання алергічної реакції (активності чутливості)під час контактування із досліджуваною речовиною. Проте, він маєпотенціал для зменшення кількості тварин, які потребуються дляцього. Більш того, АРІЛ пропонує істотне вдосконалення способувикористання тварин для тестування на виникнення алергічнихреакцій при контактуванні з досліджуваною речовиною і засновуєтьсяна розгляді реакцій імунної системи, які стимулюються хімічнимиречовинами під час фази індукування чутливості. На відміну відтестів на морських свинках, АРІЛ не потребує виявлення викликанихіндукованих реакцій чутливості шкіри. До того ж, АРІЛ не потребуєвикористання допоміжних засобів, як у випадку з тестом намаксимізацію на морських свинках. Незважаючи на переваги АРІЛ надтрадиційними тестами на морських свинках, слід визнати, що існуютьпевні обмеження, що потребують використання традиційних тестів наморських свинках (наприклад, неправильні негативні дані АРІЛ зпевними металами, неправильні позитивні дані з окремимиподразниками шкіри) (10).
Див. також Вступ частину B.
1.2. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Основний принцип, в якому полягає аналіз реакції ізольованихлімфовузлів, те полягає в тому, що хімічні речовини які викликаютьалергічну реакцію шкіри, викликають початкову проліфераціюлімфоцитів у лімфатичному вузлі, який дренує ділянку шкіри, на якунаноситься речовина. Ця проліферація є пропорційною застосованійдозі (та потенціалу алергену) та забезпечує прості способиотримання об'єктивного та кількісного вимірювання чутливості.Аналіз реакції ізольованих лімфовузлів оцінює цю проліферацію, якспіввідношення реакції та дози, де проліферація векспериментальних групах порівнюється з контролями застосуваннярозчинника. Відношення проліферації в експериментальних групах,які використовують та у групах для контролів розчинникавизначається показником, який позначають як індекс стимуляції,який визначається і повинен бути принаймні три, до подальшогооцінювання речовини, яку тестують в якості потенціального алергенушкіри. Методи, які описані в цьому пункті, засновуються навикористанні радіоактивного мічення для визначення клітинноїпроліферації. Однак, можна використовувати інші основні положеннядля оцінки проліферації, за умови наявності обґрунтування тавідповідного наукового обґрунтування, включаючи повні посилання таопис методології.
1.3. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.3.1. Підготовка
1.3.1.1. Умови утримування та харчування
Тварини мають утримуватись окремо одна від одної. Температурав приміщенні, де утримуються піддослідні тварини, має становити22 град.C (+- 3 град.C). Незважаючи на те, що відносна вологістьповинна становити принаймні 30% та не перевищувати 70%, крім часуприбирання приміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітленнямає бути штучним, у наступній послідовності 12 год. світла,12 год. темряви. Стосовно годування, можливе використанняузгоджених лабораторних дієт з безперервним постачанням питноїводи.
1.3.1.2. Підготовка тварин
Тварин обирають навмання, позначають для індивідуальноїідентифікації (але в жодному разі не маркують на вухах) таутримують в клітках щонайменше протягом п'яти днів до початкувведення дози, що дозволяє їм пристосуватися до лабораторних умов.Перед початком дослідження всіх тварин перевіряють, щобзабезпечити відсутність помітних пошкоджень шкіри.
1.3.2. Умови проведення тесту
1.3.2.1. Піддослідні тварини
Миша є біологічним видом тварин, який використовують дляцього тесту. Використовують молодих дорослих самок мишей породиCBA/Ca або CBA/J, які не народжували та не чекають приплоду. Напочатку дослідження тварини вік тварини має становити від 8 до12 тижнів, а коливання ваги має бути мінімальним та неперевищувати 20% від середнього показника. Інші породи та самціможуть використовуватись коли отримана достатня кількість даних,для того щоб показати, що не існує істотних родових/чи особливихгендерних відмінностей у реакції при проведенні аналізуізольованих лімфовузлів.
1.3.2.2. Перевірка надійності:
Позитивні контролі використовуються для того, щоб показативідповідне проведення аналізу та здатність лабораторії успішноздійснити аналіз. Позитивний контроль має викликати позитивнуреакцію ізольованих лімфовузлів при рівні експозиції, якийпередбачає збільшення стимуляційного індексу (СІ) > 3 порівняно згрупою негативного контролю. Потрібно обирати таку дозупозитивного контролю, щоб індукція була чіткою, але ненадлишковою. Речовинами, яким надають перевагу, є гексил коричнийальдегід (N РСХ 101-86-0, N ЄРІКХР 202-983-3) тамеркаптобензотіазол (N РСХ 149-30-4, N ЄРІКХР 205-736-8).Можливими є і умови використання інших речовин, за наявностіобґрунтування та відповідності вище наведеним критеріям. Оскільки,зазвичай, при проведенні кожного аналізу може потребуватися групапозитивного контролю, то можуть бути випадки, коли лабораторії дляпроведення тестів будуть мати наявні історичні дані позитивногоконтролю, щоб показати послідовність задовільних реакцій протягом6-ти місяців або і довшого періоду. В таких випадках, будедоцільним менш часте тестування з позитивним контролем та зінтервалами, що не перевищують шість місяців. Хоча речовинапозитивного контролю має тестуватись у відомому розчиннику, длятого щоб досягнути постійної реакції (наприклад, ацетон, оливковаолія), можуть виникати ситуації, коли виникає необхідність упроведенні тестування у нестандартному розчиннику(клінічно/хімічно релевантний склад). У такому разі потрібноперевіряти можливу взаємодію позитивного контролю з цимнетрадиційним розчинником.
1.3.2.3. Кількість тварин, рівні дозування, вибір середовища
Мінімум по чотири тварини використовують на одну групувведення дози, та мінімум три концентрації досліджуваної речовини,додатково використовують групу негативного контролю лише зсередовищем для досліджуваної речовини та, за необхідності, групупозитивного контролю. В тих випадках, коли потрібно зібратиіндивідуальні дані тварин, використовують мінімум п'ять тварин. Завиключенням відсутності обробки досліджуваною речовиною, зтваринами в контрольних групах слід поводитись так само, як зтваринами, що входять до групи, яка розглядається.
Вибір дози та середовища має засновуватись на рекомендаціях,поданих у посиланні (1). Дози обирають з діапазону концентрацій100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% та ін. За наявності, даніпро існуючу гостру токсичність та подразнення шкіри мають бутирозглянуті при виборі трьох послідовних концентрацій таким чином,щоб було досягнуто максимальної експозиції найвищій концентрації іпри цьому уникалась систематична токсичність та гостре місцевеподразнення шкіри (2)(11).
Середовище слід обирати на основі збільшення тестованихконцентрацій до максимального рівня і приготуваннірозчину/суспензії, що підходить для застосування тестованоїречовини. Перевага надається рекомендованим середовищам -ацетону/оливковій олії (4:1 v/v), диметилформаміду,метилетилкетону, пропілен гліколю та диметил сульфоксиду (2)(10),але й інші розчинники можуть використовуватись за наявностідостатнього наукового обґрунтування. У деяких ситуаціях можевиникнути необхідність використання клінічно доцільного розчинникаабо купленого формулювання, у якому досліджувана речовинапродається в якості додаткового контролю. Особливу увагу слідзвернути на те, щоб забезпечити включення гідрофільних матеріаліву систему розчинника, які зволожують шкіру і які не витікаютьодразу. Таким чином, слід уникати повністю водних розчинників.
1.3.3. Умови процедури
1.3.3.1. Розклад проведення експерименту:
Розклад проведення експерименту є наступним:
День 1
Індивідуально визначити та записати вагу кожної тварини.Нанести 25 мл до тильної поверхні кожного вуха відповідногорозчину досліджуваної речовини або позитивний контроль (занеобхідністю).
День 2 та 3:
Повторити процедуру нанесення, здійснену у перший день.
День 4 та 5:
Нічого не застосовується.
День 6:
Записати вагу кожної тварини. Ввести 250 мл соляного буферуфосфату (PBS) що містить 20 мю Ci (7,4e + 8Bq) 3H-метил тимідинувсім мишам з піддослідної та контрольної груп через хвостову вену.В якості альтернативи ввести 250 мл PBS, який містить
125 -5
2 мCi (7,4e + 7Bq) I-іододеоксириудина та 10 M
флуородеоксиуридину всім мишам через хвостову вену.
Через п'ять годин тварин знищують. Дренуючі вушні лімфовузлиз кожного вуха вирізають та об'єднують у PBS для кожноїпіддослідної групи (підхід до об'єднаної групи, якувикористовують); в якості альтернативи може бути вирізані таоб'єднані у PBS пари лімфатичних вузлів окремих тварин. Детальнаінформація та діаграми ідентифікації вузлів та розтину можназнайти у Додатку 1 посилання 10.
1.3.3.2. Приготування клітинних суспензій
Одноразова клітинна суспензія клітин лімфоузлів (LNC) або зоб'єднаних груп обробки, або подвійна з окремих тварин, готуєтьсяшляхом легкої механічної дезагрегації через 200 мю м-нитки сіткиз нержавіючої сталі. Клітини лімфовузлів двічі промивають знадлишком PBS та занурюють у 5% розчин трихлорацетонової кислоти(TCA) при температурі 4 град.C протягом 18 год. (2). Осад абоповторно зважують у 1 мл TCA та переміщують в сцинтиляційніпробірки, які містять 10 мл сцинтиляційної рідини для обрахунку3
H, або переміщують безпосередньо до трубок, що вимірюють гамму,
125
для I-обрахунку.
1.3.3.3. Визначення розмноження клітин (включенарадіоактивність)
Включення 3H-метил тимідину вимірюється обрахункомбета-сцинтиляції, як дезінтеграція за хвилину (ДЗХ).
125 125
Включення I-іододеоксиридину вимірюються обрахунком I, а
також виражаються як ДЗХ. Залежно від використаного підходу,
включення буде виражатись як ДЗХ/піддослідна група (об'єднаний
підхід) або ДЗХ/тварина (індивідуальний підхід).
1.3.3.4. Результати наукових спостережень
1.3.3.4.1. Клінічні спостереження
Тварин слід ретельно оглядати раз на день на клінічні ознаки,або місцеве подразнення шкіри на ділянці, на яку наносився розчинабо на ознаки системної токсичності. Всі досліди систематичнореєструють з індивідуальними записами, отриманими для кожноїтварини.
1.3.3.4.2. Маси тіла
Як визначено у розділі 1.3.3.1, індивідуальна вага тілатварин повинна вимірюватись на початку дослідження та під часзапланованого знищення тварин.
1.3.4. Обрахування результатів
Результати виражаються як Стимуляційний індекс (СІ). Якщовикористовують загальний підхід, то СІ отримують шляхом діленняоб'єднаних радіоактивних включень для кожної групи, якувикористовують, шляхом включення групи об'єднаного контролюрозчинника, то це подає середнє значення СІ. Коли використовуютьіндивідуальний підхід, то СІ виводиться діленням середньогозначення ДЗХ/на тварину в межах кожної групи, яку тестують, тагрупи позитивного контролю на середнє значення ДЗХ/на тварину длягрупи контролю розчинника. Середнє СІ для розчинника, якийзастосовують для контролю, становить тоді 1.
Використання індивідуального підходу для обчислення СІ робитьможливим здійснення статистичного аналізу даних. При виборіпідходящого методу статистичного аналізу, дослідник повинен знатипро можливі відмінності у різних точках зору та інші пов'язані зцим проблеми, що можуть призвести до перетворення даних абостатистичного аналізу, що не відповідає певним параметрам.Відповідний підхід до обробки даних - це оцінювання всіхіндивідуальних даних, застосованих контролів та контроліврозчинника та встановлення найбільш відповідної кривої реакції надозу, враховуючи діапазон довіри (8)(12)(13). Проте, дослідник маєбути попереджений про виникнення можливих "побічних" реакцій уокремих тварин в межах групи, що може викликати потребу увикористанні альтернативного вимірювання реакції (наприклад,медіанного, а не середнього значення) або усунення побічногоефекту.
Вибір процесу, беручи до уваги позитивну реакцію, включаєстимуляційний індекс >= 3 разом із врахуванням реакції на дозу та,за необхідності, значення статистичних даних (3)(6)(8)(12)(14).
Якщо необхідно пояснити отримані результати, слід звернутиувагу на різноманітні властивості досліджуваної речовини ізврахуванням того, чи вона має структурні взаємовідношення ізвідомими сенсибілізаторами шкіри, та те, чи це викликає надмірнеподразнення шкіри і видимий характер реакції на дозу. Ці та іншіточки зору детально обговорюються в іншому місці документу (7).
2. ДАНІ
Дані мають підсумовуватись у формі таблиць і показуватисереднє та індивідуальне значення ДЗХ та стимуляційні індекси щодокожної дози (включаючи контроль розчинника).
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має містити наступнуінформацію:
Тестована речовина:
- ідентифікаційні дані (напр. N РСХЮ за наявності джерело,чистоту, відомі домішки та номер партії),
- фізичну природу та фізико-хімічні властивості (напр.леткість, стабільність, розчинність),
- у випадку суміші склад та співвідношення компонентів увідсотках.
Розчинник:
- ідентифікаційні дані (чистота, концентрація (де необхідно);об'єм, що використовується),
- обґрунтування вибору розчинника.
Піддослідні тварини:
- порода мишей, які використовуються,
- мікробіологічний статус тварин, якщо відомо,
- число, вік та стать тварин,
- походження тварин, умови утримування, харчування та ін.
Умови проведення тесту:
- докладна інформація про приготування та застосуваннядосліджуваної речовини,
- обґрунтування вибору доз, включаючи результати дослідженнящодо визначення діапазону, якщо воно проводилось, середовища таконцентрацій досліджуваної речовини, які використовувались тазагальна кількість застосованої речовини,
- докладна інформація щодо якості їжі та води (включаючиджерело/тип харчування, джерело води).
Перевірка достовірності даних:
- короткий виклад результатів останньої перевірки, включаючиінформацію про речовину, концентрацію та розчинник, щовикористовується,
- дані одночасного та/чи історичного позитивного танегативного контролю для лабораторії, що проводить тестування.
Результати:
- індивідуальні маси тіла тварин на початку дозування та призапланованому знищенні тварин,
- таблиця середніх (об'єднаний підхід) та індивідуальних(індивідуальний підхід) значень ДЗХ, так само як і діапазонзначень для обох підходів та індекси стимуляції для кожної дози(включаючи контроль розчинника),
- статистичний аналіз, де можливо,
- часовий перебіг початку та появи ознак токсичності,включаючи подразнення шкіри у місцях застосування, якщо вони є,для кожної тварини.
Обговорення результатів:
- короткий коментар про результати, аналіз реакції на дозу тастатистичні аналізи, де потрібно, з висновком щодо того чи слідвважати тестову речовину сенсибілізатором (алергеном) для шкіри.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Kimber, I. and Basketter, D.A., (1992) The murine locallymph node assay; collaborative studies and new directions: Acommentary. Food and Chemical Toxicology 30, p. 165-169.
(2) Kimber, I, Derman, R.J., Scholes E.W, and Basketter, D.A.(1994). The local lymph node assay: developments and applications.Toxicology, 93, p. 13-31.
(3) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F.,Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S.,Loveless, S.E., Hastings, K.L., (1998) Assessment of the skinsensitisation potential of topical medicaments using the locallymph node assay: An interlaboratory exercise. Journal ofToxicology and Environmental Health, 53, p. 563-79.
(4) Testing Method B.6.
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A., (1996) The locallymph node assay: status of validation. Food and ChemicalToxicology, 34, p. 999-1002.
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. andLoveless, S.E., (1996) The local lymph node assay-A viablealternative to currently accepted skin sensitisation tests. Foodand Chemical Toxicology, 34, p. 985-997.
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I., (1998)Strategies for identifying false positive responses in predictivesensitisation tests. Food and Chemical Toxicology. 36, p. 327-33.
(8) Van Och, F.M.M, Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel,R.J., Van Loveren, H., (2000) A quantitative method for assessingthe sensitising potency of low molecular weight chemicals using alocal lymph node assay: employement of a regression method thatincludes determination of uncertainty margins. Toxicology, 146,p. 49-59.
(9) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P.,Basketter, D.A. and Kimber, I., (1998) Temporal stability of locallymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde. Journal ofApplied Toxicology, 18, p. 281-4.
(10) National Institute of Environmental Health Sciences,(1999) The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method forAssessing the Allergic Contact Dermatitis Potential ofChemicals/Compounds: The Results of an Independent Peer ReviewEvaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committeeon the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the NationalToxicology Program Center for the Evaluation of AlternativeToxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494,Research Triangle Park, N.C. (http://iccvam.niehs.nih.gov).
(11) Testing method B.4.
(12) Basketter, D.A., Selbie, E., Scholes, E.W. Lees, D.Kimber, I. and Botham, P.A., (1993) Results with OECD recommendedpositive control sensitisers in the maximisation, Buehler andlocal lymph node assays. Food and Chemical Toxicology, 31,p. 63-67.
(13) Basketter D.A., Lea L.J., Dickens A., Briggs D., PateI., Dearman R.J., Kimber I., (1999) A comparison of statisticalapproaches to the derivation of EC3 values from local lymph nodeassay dose responses. J.Appl. Toxicology, 19, p. 261-266.
(14) Basketter D.A., Blaikie L., Derman R.J., Kimber I., RyanC.A., Gerberick G.F., Harvey P., Evans P., White I.R. and RycroftR.T.G., (2000) Use of local lymph node assay for the estimation ofrelative contact allergenic potency. Contact Dermatitis 42,p. 344-48.
B.43. ДОСЛІДЖЕННЯ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ НА ГРИЗУНАХ
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 424(1997).
Цей метод тестування був створений для отримання інформації,яка необхідна для підтвердження або подальшого визначенняпотенціалу нейротоксичності хімічних речовин на дорослих тваринах.Він може бути об'єднаний з існуючими методами тестування дляповторного дослідження токсичності, або здійснюватись як окремедослідження. Рекомендується ознайомитись з інструкцією OECP щодостратегій та методів тестувань нейротоксичності (1), щобдопомагати у моделюванні дослідження, що розроблене на основіцього методу тестування. Це особливо важливо, якщо спостерігаютьсямодифікації у спостереженнях та тестових процедурах, якірекомендуються для звичайного використання цього методу.Інструкція була підготовлена з метою полегшення вибору іншихпроцедур тестування для використання за особливих умов.
Оцінювання нейротоксичності, що розвивається, не є об'єктомцього методу.
1.1. ВСТУП
При дослідженні та оцінці токсичних характеристик хімічнихречовин важливо розглянути потенціал нейротоксичних впливів. Методтестування системної токсичності після введення повторних дозвключає спостереження, які демонструють потенціалнейротоксичності. Цей метод тестування може використовуватись зметою розробки дослідження для отримання подальшої інформації, абопідтвердження нейротоксичних впливів, що спостерігались удослідженні системної токсичності після введення повторних доз.Однак, розгляд потенційної нейротоксичності певних класів хімічнихречовин може висунути припущення про те, що вони можуть бутивизначені більш належним чином, використовуючи цей метод безурахування попередніх показників потенціалу нейротоксичності,отриманих з дослідження системної токсичності після введенняповторних доз. Такі судження включають, наприклад:
- спостереження неврологічних показників або
невропатологічних пошкоджень під час досліджень токсичності, окрім
досліджень системної токсичності введення повторних доз, або
- структурні відносини чи іншу інформація, пов'язану звизначенням нейротоксикантів.
Окрім цього, можуть бути інші випадки, коли використанняцього методу тестування може застосовуватись для подальшоїінформації див. (1).
Цей метод був розроблений таким чином, щоб він міг бутипристосований, для того щоб відповідати особливим потребам дляпідтвердження особливої гістопатологічної та поведінковоїнейротоксичності хімічної речовини, а також надати характеристикута кількісний підрахунок нейротоксичних реакцій.
В минулому, нейротоксичність прирівнювалась до невропатії,яка включає, невропатологічні розлади, такі як припадок, паралічта тремтіння. Хоча невропатія є важливим проявом нейротоксичності,на даний час вже виявлено, що існує багато інших ознак токсичностінервової системи (наприклад, втрата моторної координації,перцептивні дефіцити, розлади навчання та пам'яті), які можуть небути відображені у невропатії або в інших видах досліджень.
Цей метод тестування нейротоксичності розроблений длявиявлення основних впливів на нервову поведінку таневропатологічних впливів у дорослих гризунів. Тоді як вплив наповедінку, навіть за відсутності морфологічних змін, може матишкідливий вплив на весь організм, не всі зміни у поведінці єхарактерними для нервової системи. Отже, будь-які зміни, якіспостерігаються, мають оцінюватись разом з корелятивнимигістопатологічними, гематологічними чи біохімічними даними, таксамо як і разом з даними про інші види системної токсичності.Призначенням тестування в цьому методі є надання характеристики такількісної оцінки нейротоксичних реакцій, включаючи специфічніпроцедури з гістопатології та вивчення поведінки, які надаліможуть бути доведеними електрофізичними та/чи біохімічнимидослідженнями (1)(2)(3)(4).
Нейротоксиканти можуть діяти на декілька мішеней в межахнервової системи та за допомогою різних механізмів. Оскільки неіснує єдиного порядку проведення тестів, які могли б надатиостаточну оцінку нейротоксичного потенціалу всіх речовин, можевникнути необхідність у використанні інших in vivo чи in vitroтестів, специфічних для типу нейротоксичності, яка спостерігаєтьсяабо передбачається.
Цей метод тестування може також використовуватись разом зінструкціями, встановленими в методичних вказівках OECP щодостратегій та методів тестувань нейротоксичності (1) для розробкидосліджень, що призначаються для подальшого опису або збільшеннякількісних характеристик чутливості в залежності реакції на дози,для того, щоб краще оцінити невидимий рівень шкідливого впливу чипідтвердити відомі дані або дані, що припускаються, щодо небезпекихімічної речовини. Наприклад, дослідження може бути розроблене дляідентифікації та визначення нейротоксичного механізму(ів) абодоповнювати вже існуючі дані, які вже були отримані на основіспостереження за процедурами в невропатології та вивченніповедінки. Такі дослідження не потребують повторних даних, якібули отримані під час використання стандартних процедур, якірекомендуються в цьому методі, за умови, що такі дані вже єнаявними та не вважаються необхідними для обробки результатівдослідження.
Це дослідження нейротоксичності, якщо воно використане самопо собі або у поєднанні з іншими методами, надає інформацію, якаможе:
- визначити чи нервова система вражається постійно чиреверсивно досліджуваною хімічною речовиною;
- зробити внесок до характеристики змін в нервовій системі,які пов'язано з експозицією до хімічної речовини та розумінняосновного механізму;
- визначити залежність реакції від дози та часу для того, щобоцінити невидимий рівень шкідливого впливу (який можна використатидля того, щоб встановити критерії безпеки для хімічної речовини).
Цей тестовий метод використовує пероральне застосуваннятестованої речовини. Інші шляхи застосування (наприклад, черезшкіру чи інгаляцію) теж можуть використовуватись та можутьпотребувати зміни у рекомендованих процедурах. Підстави для виборушляху застосування залежать від результатів людської експозиції танаявної токсикологічної чи кінетичної інформації.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Шкідливий вплив: це будь-яка зміна, пов'язана іззастосуванням речовини від основного значення, яка зменшуєздатність організму до виживання, відтворення та пристосування донавколишнього середовища.
Доза: це кількість застосованої речовини, яку тестують. Дозавиражається як маса (г, мг) або як маса тестованої речовини наодиницю ваги піддослідної тварини (напр. мг/кг), або як постійнідієтичні концентрації (ppm).
Дозування: це загальний термін, що включає дозу, її частотута тривалість прийому дози.
Нейротоксичність: це шкідлива зміна в структурі або функціїнервової системи, яка є наслідком експозиції до хімічної речовини,біологічного чи фізичного агенту.
Нейротоксикант: це будь-який хімічний, біологічний чифізичний агент, який має потенціал викликання нейротоксичності.
NOAEL: це абревіатура для відсутнього рівня шкідливоговпливу, та є найвищим рівнем дози, за якої не спостерігаютьсяявища, пов'язані із застосуванням речовини.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Досліджувану хімічну речовину вводять перорально у різнихдозах семи групам піддослідних гризунів. Зазвичай, повторні дози єнеобхідними, а період введення дози може тривати 28 днів,підхронічний (90 днів), чи хронічний (1 рік або довше). Процедури,встановлені в цьому тестовому методі, можуть такожвикористовуватись для дослідження гострої нейротоксичності. Тваринтестують з метою виявлення та характеристики аномалій у поведінціта/чи неврології. Вияви поведінки, на які можуть вплинутинейротоксиканти, оцінюються під час періоду спостереження. Позакінченню тесту, підгрупа тварин кожної статі та кожної групиоббризкується in situ, далі готуються та досліджуються ділянкиголовного мозку, спинного мозку та периферійні нерви.
Коли дослід проведено в якості стандартного одиночногодослідження в галузі нейротоксикології чи з метою характеристикинейротоксичних впливів, тварини в кожній групі, які невикористовувались для оббризкування та подальшої гістопатології(див. Таблицю 1), можуть бути використані для окремих процедур угалузі вивчення поведінки, невропатології, нейрохімії таелектрофізіології, що може доповнити дані, отримані зі стандартнихдосліджень, проведення яких вимагає цей метод (1). Ці додатковіпроцедури можуть бути особливо корисними, якщо емпіричніспостереження, або прогнозовані впливи вказують на особливий типабо мішень нейротоксичності хімічної речовини. В якостіальтернативи, тварин, які залишилися, можна використати дляоцінювань, таких як досліджень токсичності повторної дози угризунів.
Коли процедури цього методу тестування поєднуються зпроцедурами інших методів, то необхідна достатня кількість тварин,щоб задовольнити вимоги, висунуті до спостережень в обохдослідженнях.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.4.1. Вибір виду тварин
Біологічний вид гризунів, якому надається перевага, це щур,хоча інші види гризунів, за умови обґрунтування, теж можутьвикористовуватись. Слід використовувати піддослідні породи молодихдорослих здорових тварин, які зазвичай використовуються. Особинижіночої статі мають бути невагітними та такими, що ще ненароджували. Введення дози має відбуватися якнайшвидше післявідривання від грудей, коли тваринам виповнилося шість тижнів, та,в будь-якому випадку, до того як тваринам виповниться дев'ятьтижнів. Однак, коли це дослідження поєднується з іншимидослідженнями, то ці вікові вимоги можуть потребувати погодження.На початку дослідження коливання маси тіла тварин, яківикористовуються, не мають перевищувати +- 20% середньої маси тілакожної статі. Коли проводиться короткотривале дослідженняповторної дози в якості попереднього до довготривалогодослідження, мають використовуватись тварини однієї породи та зодного джерела в обох дослідженнях.
1.4.2. Умови утримування та годування тварин
Температура у кімнаті, де знаходяться піддослідні тварини,має становити 22 град.C (+- 3 град.C). Хоча відносна вологістьповинна бути принаймні 30% та бажано не перевищувати 70%, крімприбирання приміщення, оптимальним значенням є 50-60%. Освітленнямає бути штучним, в послідовності - 12 год. світла,12 год. темряви. Голосний переривчастий шум повинен утримуватисьна мінімумі. Для годування, можуть використовуватись стандартналабораторна їжа із необмеженою кількістю води. На вибір їжі можевпливати потреба забезпечити відповідну домішку речовини, якатестується цим методом. Тварини можуть утримуватись в кліткахокремо, або невеликими групами однієї статі.
1.4.3. Підготовка тварин
Здорових молодих тварин навмання обирають до піддослідних таконтрольних груп. Клітки повинні бути розташовані таким чином, щобмінімізувати можливі впливи їх розташування. Твариниідентифікуються індивідуально та утримуються у своїх кліткахщонайменше протягом (5) п'яти днів до початку дослідження з метоюнадання їм можливості пристосуватися до лабораторних умов.
1.4.4. Спосіб застосування та приготування доз
Цей метод тестування зокрема передбачає пероральнезастосування досліджуваної речовини. Пероральне введення можепроводитись через шлунковий зонд, шляхом додавання до їжі, допитної води або через капсули. Інші способи введення (напр., черезшкіру або шляхом інгаляції) можуть використовуватись, але можутьпотребувати змін рекомендованих процедур. Підстави для виборуспособу введення залежать від графічного зображення результатівлюдської експозиції та наявної інформації в галузі токсикології чикінетики. Обґрунтування вибору способу введення речовини, так самояк і зміни до процедур у результаті цього методу тестування,повинні також вказуватись.
За необхідністю, речовина, яка тестується, може бутирозчинена або суспендована у відповідному середовищі.Рекомендується, щоб використання водного розчину/суспензіїаналізувалось спочатку та супроводжувалось аналізомрозчину/суспензії в маслі (наприклад, у кукурудзяному маслі), апотім можливим розчином/суспензією в іншому розчиннику. Токсичніхарактеристики розчинника повинні бути відомими. Окрім того,аналіз повинен надаватись щодо наступних характеристик розчинника:впливи розчинника на поглинання, розподіл, метаболізм абоутримання досліджуваної речовини, які можуть змінити свої токсичніхарактеристики; та впливати на споживання їжі або води, або станхарчування тварин.
1.5. ПРОЦЕДУРИ
1.5.1. Кількість та стать тварин
Коли дослідження проведено в якості окремого дослідження,щонайменше 20 тварин (10 особин жіночої статі та 10 особинчоловічої статі) мають використовуватися у кожній групі зприймання дози та кожній контрольній групі з метою оцінюваннядетальних клінічних та функціональних спостережень. Щонайменшеп'ять особин чоловічої статі та п'ять особин жіночої статі повинніобприскуватись in situ та використовуватись для проведеннядетальної нейрогістопатології наприкінці дослідження. В тихвипадках, коли обстежується на ознаки нейротоксичних впливів лишеобмежена кількість тварин у даній групі дозування, включення цихтварин до тих, що були обрані для обприскування, маєобмірковуватися. Коли дослідження проводиться у поєднанні здослідженням токсичності після прийому повторної дози, відповіднакількість тварин має використовуватись з метою виконання цілейобох досліджень. Мінімальна кількість тварин у групі длярізноманітних поєднань досліджень представлена у Таблиці 1. Якщоплануються попередні знищення тварин або формування відновлюючихгруп для спостереження оборотності, стійкості або появи ззатримкою токсичних впливів та планується подальша обробка, абоколи враховуються додаткові спостереження, кількість тваринпотрібно збільшити з метою забезпечення наявної кількості тварин,яке необхідне для дослідження та гістопатології.
1.5.2. Група обробки та контролю
Щонайменше три групи дозування та одна контрольна групамають, як правило, використовуватись, але якщо в оцінюванні іншихданих не очікується жодних впливів при повторній дозі 1 000 мг/кгмаси тіла/на день, то може проводитись тестування на визначенняграничного вмісту.
Якщо відповідні дані відсутні, то може проводитисьдослідження на визначення діапазону вимірювання, щоб допомогти увизначенні доз, які потрібно використовувати. За виключеннямвипадків, коли використовують тестовану речовину, тварин уконтрольній групі потрібно використовувати в однаковий спосіб повідношенню до особин піддослідної групи. Якщо ж розчинниквикористовується у застосуванні досліджуваної речовини, токонтрольна група повинна отримувати розчинник у найвищомувикористовуваному об'ємі.
1.5.3. Перевірка надійності отриманих результатів
Лабораторія, яка проводить дослідження, повинна представитидані, які показують її спроможність провести дослідження тапоказати чутливість використаних процедур. Такі дані маютьнадавати підтвердження здатності виявити та визначити кількість,де необхідно, змін в різних кінцевих точках, які рекомендуютьсядля спостереження, таких як автономні показники, сенсорнареактивність, міцність хватки кінцівок та моторна активність.Інформацію про хімічні речовини, які спричиняють різні видинейротоксичних реакцій та можуть використовуватись, як речовинидля позитивного контролю, можна знайти в посиланнях від 2 до 9.Історичні дані можуть використовуватись, якщо основні аспектиекспериментальних процедур залишаються незмінними. Рекомендуєтьсяперіодичне оновлення історичних даних. Потрібно розробляти новідані, що показують тривалу чутливість процедур, коли якусь основнускладову проведення тесту або процедур було змінено лабораторією,яка його здійснює.
1.5.4. Вибір дози
Рівні дозувань потрібно обирати із врахуванням будь-якихтоксичних та кінетичних даних, які спостерігались раніше, та єнаявними для складового компоненту тесту або пов'язаних з нимматеріалів. Потрібно обирати найвищий рівень дози з метоюстимулювання нейротоксичних впливів або усунення системнихтоксичних впливів. Після того, потрібно обрати спаднупослідовність рівнів дозувань для того, щоб показати будь-якіреакції, пов'язані з дозуванням та відсутністю шкідливого впливу(NOAEL) при найнижчому рівні дозування. В принципі, рівні дозуваньпотрібно встановлювати таким чином, щоб початкові токсичні впливина нервову систему можна було відрізнити від впливів, пов'язанихіз системною токсичністю. Від двох до трьох інтервалів, зазвичай,є оптимальним, а додаванню четвертої піддослідної групи зазвичайнадається перевага при використанні дуже великих інтервалів(наприклад, більше ніж фактор 10) між дозами. У випадкупрогнозування експозиції людини, цей факт також слід враховувати.
1.5.5. Тест на визначення граничної межі
Якщо при дослідженні на одному рівні дозування щонайменше1 000 мг/кг маси тіла/на день, з використанням вищеописанихпроцедур, не було виявлено помітних нейротоксичних впливів, таякщо токсичність не очікується на основі даних структурнопов'язаних компонентів, тоді проведення розгорнутого дослідження звикористанням трьох рівнів доз може не вважатися необхідним.Очікувана людська експозиція може вказувати на потребу увикористанні вищого рівня пероральної дози при проведенні тесту навизначення граничної межі. Що стосується інших видів застосування,таких як інгаляція або нанесення на шкіру, фізико-хімічнівластивості досліджуваної речовини, часто можуть вказувати намаксимально досяжний рівень експозиції. Для проведення дослідженняна гостру реакцію внаслідок перорального прийому доза для тесту навизначення граничної межі має становити щонайменше 2 000 мг/кг.
1.5.6. Застосування доз
Тваринам вводять дозами речовину, яку тестують, щоденно, сімднів на тиждень, протягом періоду щонайменше 28 днів; використанняп'ятиденного режиму застосування або коротшої експозиції потребуєпідтвердження. Коли речовина, яку тестують, вводиться черезшлунковий зонд, це потрібно робити однією дозою, використовуючишлункову трубку або відповідний інкубаційний катетер. Максимальнийоб'єм рідини, який можна вводити за один раз, залежить відрозмірів піддослідних тварин. Об'єм не повинен перевищувати1 мл/100 г маси тіла. Однак, у випадку водних розчинів, можнарозглянути використання до 2 мл/100 г маси тіла. За виключеннямподразнюючих чи роз'їдаючих речовин, які зазвичай виявляютьзагострені впливи за високих концентрацій, варіативність об'ємівслід максимально зменшити шляхом регулювання концентрацій з метоюзабезпечення постійного об'єму на всіх рівнях дозувань.
