- найнижча досліджувана концентрація, яка викликає 100%смертність протягом всього періоду дослідження.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of theCouncil C(81) 30 final and updates.
(2) AFNOR - Determination of the acute toxicity of asubstance to Brachydanio rerio- Static and Flow Through methods -NFT 90-303 June 1985.
(3) AFNOR - Determination of the acute toxicity of asubstance toSalmo gairdneri- Static and Flow - Through methods -NFT 90-305 June 1985.
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 - Water Quality - Determination ofthe acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan-Teleostei, Cyprinidae).Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3:Flow-through method.
(5) Eidgenossisches Department des Innern, Schweiz:Richtlinien fur Probenahme und Normung vonWasseruntersuchungsmethoden - Part II 1974.
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und1 (15).
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.
(8) NEN 6506-Water-Bepaling van de akute toxiciteit metbehulp van Poecilia reticulata, 1980.
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acutetoxicity tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. TheCommittee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Organisms,Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
(10) Environmental Protection Agency, Environmentalmonitoring and support laboratory, Office of Research andDevelopment, EPA-600/4-78-012, January 1978.
(11) Environmental Protection Agency, Toxic SubstanceControl, Part IV, 16 March 1979.
(12) Standard methods for the examination of water andwastewater, fourteen edition, APHA-AWWAWPCF, 1975.
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratorytest programme concerning the study of the ecotoxicityof achemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368,22 March 1979.
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akutenFisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grundlagenfur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemikalien nach demChemikaliengesetz, ecomed 1986.
(15) Litchfield, J. T.and Wilcoxon, F., A simplified methodfor evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap.,1949, vol. 96, 99.
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay.Griffin, Weycombe, U.K., 1978.
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish.Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3,793-821.
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish.II Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970,vol. 4, 3-32.
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC . In 50Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I.Mayer andJ.L.Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTMSTP 634, 1977, 65-84.
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. andAndrews, R.W. A computer program for calculating an LC . US EPA.
50
Додаток 1
Відновлена вода
Приклад придатного розчину води
Всі хімікати повинні бути аналітичної якості.
Вода повинна бути належної якості та дистильована, або -1деіонізована з провідністю менше ніж 5 мю Scm .
Апаратне забезпечення для дистиляції води не повинне міститижодних частин, які виготовлені з міді.
Вихідні речовини
CaCl . 2H O (кальцій хлорид дигідрат): 11,76 г
2 2
Розчинити в, та утворити до 1 л з водою
MgSO . 7H O (магній сульфат гептагідрат): 4,93 г
4 2
Розчинити в, та утворити до 1 л з водою
NaHCO (гідроксид карбонату натрію): 2,59 г
3
Розчинити в, та утворити до 1 л з водою
KCl (хлорид калію): 0,23 г
Розчинити в, та утворити до 1 л з водою
Відновлена вода для розчину
Змішати 25 мл кожного з чотирьох розчинів та утворити до 1 лз водою.
Насичувати киснем до рівня, коли концентрація розчиненогокисню не буде дорівнювати значенню насиченості повітрям.
Рівень pH повинен становити 7,8 +- 0,2.
Якщо необхідно, врегулювати рівень pH за допомогою NaOH(гідроксидом натрію) або HCl (соляною кислотою).
Розчинена вода, виготовлена таким чином, відставляється всторону на 12 годин та не повинна надалі насичуватись повітрям.
Кількість іонів Ca та Mg в цьому розчині становить 2,5 мольна літр. Співвідношення іонів Ca:Mg становить 4:1 та іонів Na:Kстановить 10:1. Загальна лужність цього розчину становить 0,8 мольна літр.
Будь-які відхилення в приготуванні водного розчину не повиннізмінювати співвідношення властивостей води.
Додаток 2
Види риб, рекомендовані для дослідження
--------------------------------------------------------------------------------------------
| Рекомендовані види |Рекомендований|Рекомендована|
| |ряд температур| загальна |
| | дослідження | довжина |
| | (град.C) | тварин (см) |
|-------------------------------------------------------------+--------------+-------------|
|Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan)| 20-24 | 3,0 +- 0,5 |
|Смугаста перцина | | |
| | | |
|Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) | 20-24 | 5,0 +- 2,5 |
|Товстоголовий гольян | | |
| | | |
|Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) | 20-24 | 6,0 +- 2,0 |
|Карп звичайний | | |
| | | |
|Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) Cyprinodontidae | 20-24 | 3,0 +- 1,0 |
|(Tomminck and Schlege 1850) Червоний фундулюс | | |
| | | |
|Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters 1859) | 20-24 | 3,0 +- 1,0 |
|Гуппі | | |
| | | |
|Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) | 20-24 | 5,0 +- 2,0 |
|(Rafinesque Linneaus 1758) Синьозяберний сонячник | | |
| | | |
|Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum 1988) | 12-17 | 6,0 +- 2,0 |
|Райдужна форель | | |
| | | |
|Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Linneaus 1758) | 20-24 | 6,0 +- 2,0 |
|Орфей золотий | | |
--------------------------------------------------------------------------------------------
Збір
Види риб, перелічені, вище легко розводяться та/чи широкодоступні протягом всього року. Їх можна розводити та культивуватина рибних фермах або в лабораторіях, за умов контролю хвороб тапаразитів, так щоб піддослідні тварини були здорові та з відомимпоходженням. Ці види тварин доступні у багатьох частинах світу.
Додаток 3
Приклад концентрації: процентне співвідношення
випадків смертності
Приклад визначення LC з використанням графіку
50
для запису одиниць вірогідності (лог-пробіт)
C.2. DAPHNIA SP. ДОСЛІДЖЕННЯ ГОСТРОЇ ІММОБІЛІЗАЦІЇ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження високої іммобілізації еквівалентнийTI OECP 202 (2004).
1.1. ВСТУП
Цей метод описує дослідження гострої токсичності, щоб оцінитивплив хімікатів на дафній. Існуючі методи дослідження буливикористані можливою мірою в (1)(2)(3).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
В контексті цього методу, використовувались наступнівизначення:
EC : це концентрація, визначена як така, за якої 50відбувається іммобілізація 50% дафній протягом встановленогоперіоду піддавання дії. Якщо використовуються інші визначення, топро це слід звітувати, разом з відповідними посиланнями.
Іммобілізація: ті тварини, які не можуть плавати протягом15 секунд після легкого збовтування посудини вважаютьсянерухомими. (навіть якщо вони все ж рухають своїми вусиками).
1.3. ПРИНЦИП ТЕСТОВОГО МЕТОДУ
Молоді дафнії, віком менше доби на початку дослідження,піддаються дії досліджуваної речовини в певному діапазоніконцентрацій на період 48 годин. Іммобілізація записується після24 годин та 48 годин та порівнюється з контрольними значеннями.Результати аналізуються для того, щоб вирахувати EC після
50
48 годин (визначення наведені у Розділі 1.2.). Визначення EC
50
після 24 годин не є обов'язковим.
1.4. ІНФОРМАЦІЯ ПРО ДОСЛІДЖУВАНУ РЕЧОВИНУ
Розчинність води та тиск пари досліджуваної речовини повиненбути відомий та повинен бути доступний надійний аналітичний методдля кількісного вимірювання речовини в досліджуваних розчинах іззаявленою відновлювальною ефективністю та лімітом визначення.Корисна інформація включає структурну формулу, відсутність домішокв речовині, стабільність у воді чи світлі, P та результати
ow
дослідження на готову біодеградацію (див. метод C.4).
Примітка: методичні вказівки для дослідження речовин зфізико-хімічними властивостями, які ускладнюють їхнє дослідження,наведені в (4).
1.5. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Еталонна речовина може досліджуватись на EC як засіб 50підтвердження надійності умов дослідження. Токсичні речовини, яківикористовуються в міжнародних кільцевих дослідженнях в (1)(5)рекомендуються з цієї метою(1). Дослідження з еталоннимиречовинами повинні проводитись щомісячно та щонайменше два рази нарік.
----------------
(1) Результати цих міжлабораторних досліджень та Технічнихпоправок до ISO 6341 надають EC - 24 години біхромату калію
50
(K Cr O ) в межах 0,6 мг/л до 1,7 мг/л.
2 2 7
1.6. КРИТЕРІЇ ЯКОСТІ
Для того щоб дослідження вважалось підтвердженим,застосовуються наступні критерії проведення:
- в контролях, включаючи контроль, який містить розчиннуречовину, не більше ніж 10% дафній повинні бути нерухомими;
- концентрація розчиненого кисню в кінці дослідження повиннастановити >= 3 мг/л в контрольних та досліджуваних ємностях.
Примітка: Для першого критерію, не більше ніж 10% дафнійконтролю повинні бути нерухомими або проявляти інші ознаки хворобичи стресу, наприклад, знебарвлювання, незвичну поведінку, таку якзатримка на поверхні води.
1.7. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.7.1. Прилади
Посудини для дослідження та інші прилади, які вступатимуть уконтакт з досліджуваним розчином, повинні бути виготовленівиключно зі скла або іншого хімічно інертного матеріалу. У якостіпосудин для дослідження зазвичай використовуються дослідніпробірки або колби; вони повинні бути очищені перед кожнимвикористанням у відповідності до стандартних лабораторнихпроцедур. Посудини для дослідів повинні бути нещільно накриті, щобзменшити втрату води через випаровування та уникнути попаданняпилу в розчини. Леткі речовини потрібно досліджувати у повністюзакритих посудинах, достатньо великих, щоб запобігти обмеженню абонизькому зниженню рівня кисню (див. в розділ 1.6 та перший абзац врозділі 1.8.3).
Окрім того, буде використовуватись деяке або все з наведеногодалі обладнання: прилад для вимірювання кисню (з мікроелектродомабо іншим необхідним обладнанням для вимірювання розчиненого киснюв зразках з низьким об'ємом); вимірювач рівня pH; відповіднийапарат для контролю температури, обладнання для визначеннязагальної концентрації органічного вуглецю (ЗОВ), обладнання длявизначення хімічної потреби у кисні (ХПК), обладнання длявизначення жорсткості), та ін.
1.7.2. Піддослідний організм
Daphnia magna Straus є біологічним видом, якому надаєтьсяперевага, хоча можна використовувати і інші біологічні види(наприклад, Daphnia pulex). На початку дослідження, твариниповинні бути віком принаймні добу та зменшувати варіативність,строго рекомендується, щоб вони не були першими виведенимипотомками. Вони повинні походити зі здорової породи (тобто не матижодних ознак стресу, таких як висока смертність, наявністьчоловічих особин та ефіпій, затримка у розмноженні та продукуванніпершого потомства, знебарвлення тварин та ін.). Всі організми, щовикористовуються для певного дослідження, повинні походити зкультур встановлених з того ж роду дафній. Тварини, якихутримують, повинні утримуватись в культурних умовах (освітлення,температура, середовище) схожих до тих, які використовуються вдослідженні. Якщо культурне середовище дафній, яке повинновикористовуватись в дослідженні, відрізняється від звичайногосередовища дафній, то хорошою практикою є виділенняакліматизаційного періоду перед дослідженням. З цією метою,виводок дафній повинен зберігатись у розчинній воді притемпературі дослідження, щонайменше 48 годин до початкудослідження.
1.7.3. Вода утримування та розчинення
Природна вода (поверхнева або ґрунтова вода), відновлена водаабо дехлорована водопровідна вода підходить як вода дляутримування та розчинення, якщо дафнії виживуть в ній протягомкультивування, акліматизації та дослідження без наявних ознакстресу. Будь-яка вода, яка відповідає хімічними властивостямиприйнятного водного розчину, як перераховано у Додатку 1, єприйнятною водою для дослідження. Вона повинна мати стабільнуякість протягом всього періоду дослідження. Відновлена вода можеготуватись з додаванням конкретної кількості реагентів аналітичноїякості. Приклади відновленої води подані у (1) (6) та в Додатку 2.Зверніть увагу, що слід уникати середовищ з хелатоутворюючимиагентами, такими як M4 та M7 в Додатку 2 для досліджуванихречовин, які містять метали. Рівень pH повинен бути в межах від 6до 9. Жорсткість між 140 та 250 мг/л (як CaCO ) рекомендований для
3
Daphnia magna та при нижчій жорсткості можуть також
використовуватись і інші біологічні види дафній. Вода для розчинів
може насичуватись повітрям перед використанням для дослідження
таким чином, що концентрація розчиненого кисню досягає
насиченості.
Якщо використовується природна вода, то параметри якостіповинні вимірюватись принаймні двічі на рік, та будь-коли, якщо єпідозри відносно того, що характеристики могли значно змінитись.(див. попередній параграф та Додаток 1). Вимірювання важкихметалів (наприклад, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) повинно такожздійснюватись. Якщо дехлорована водопровідна водавикористовується, то необхідний щоденний аналіз хлору. Якщорозчинена вода є поверхневою чи ґрунтовою, то потрібно вимірюватипровідність, загальний органічний вуглець (ЗОВ) та хімічну потребув кисні (ХПК).
1.7.4. Досліджувані розчини
Досліджувані речовини обраних концентрацій зазвичай готуютьчерез розбавлення вихідного розчину. Вихідні речовини повинні бутипідготовані через розчинення у воді для розчинів. По можливості,слід уникати використання розчинників, емульгаторів абодисперсантів. Однак, такі складові можуть бути необхідними вдеяких випадках для того, щоб виробляти вихідний розчин зпридатною концентрацією. Керівництво по необхідним розчинникам,емульгаторах та дисперсантах надається в посиланні (4). У випадку,якщо досліджувана речовина в досліджуваних розчинах не перевищуєобмеження розчинності у воді.
Дослідження повинне здійснюватись без регулювання pH. Якщо pHне залишається в межах 6-9, тоді потрібно провести другедослідження, з регулюванням pH вихідного розчину до того яке булов розбавленій воді до додавання досліджуваної речовини.Регулювання pH потрібно робити таким чином щоб концентраціявихідної речовини не змінювалась значною мірою та не спричинялажодної хімічної реакції або випадіння речовини в осад. Переваганадається HCl та NaOH.
1.8. ПРОЦЕДУРА
1.8.1. Умови піддавання дії
1.8.1.1. Піддослідні групи та контрольні зразки
Посудини для дослідження наповнюють відповідним об'ємомрозбавленої води та розчинами досліджуваного розчину. Коефіцієнтоб'єму повітря/води в посудині повинен бути такий самий як групідослідження та контролю. Потім дафнії поміщають в посудини длядосліду. Принаймні 20 тварин, які переважно ділять на чотири групипо п'ять тварин кожна, повинні використовуватись при кожнійдосліджуваній концентрації та контрольні зразки. Щонайменше 2 млдосліджуваного розчину повинно надаватись для кожної тварини(тобто об'єм 10 мл для п'яти дафній на посудину для досліду).Дослідження може здійснюватись з використанням напівстатичної абопроточної системи, якщо концентрація досліджуваної речовини є нестабільною.
Один ряд контролю розбавленої води а також, якщо застосовно,один ряд контролю з вмістом розчинного реагенту повиненпроводитись додатково до ряду обробок.
1.8.1.2. Досліджувані концентрації
Дослідження визначення показників може проводитись, для того,щоб визначити спектр концентрацій для певного дослідження, крімвипадків, коли інформація про токсичність досліджуваної речовини єдоступною. З цією метою, дафнії піддають впливу послідовностішироко рознесених між собою концентрацій досліджуваної речовини.П'ять дафній потрібно піддати впливу при кожній досліджуванійконцентрації для 48 годин або менше, а повторні дослідження не єнеобхідними. Період піддавання дії може бути скорочений(наприклад, до 24 годин і менше) якщо дані відповідають метідослідження визначення показників та можуть бути отримані закоротший період.
Необхідно використовувати принаймні п'ять досліджуванихконцентрацій. Вони повинні бути розташовані у геометричнійпрогресії з коефіцієнтом розподілу, який бажано не перевищує 2,2.Потрібно надавати обґрунтування, якщо використовується менше п'ятиконцентрацій. Найвищі досліджувані концентрації повиннізакінчуватись 100% іммобілізацією, а найнижчі досліджуваніконцентрації не повинні проявляти видимого впливу.
1.8.1.3. Умови інкубації
Температура повинна бути в межах від 18 град.C до 22 град.C,і для кожного дослідження вона повинна бути константою постійною вмежах +- 1 град.C. Рекомендується така послідовність освітлення:16 годин світла, 8 годин темряви. Повна темрява можливою також єприйнятною, особливо для досліджуваних речовин, нестійких насвітлі.
Посудини для дослідження не повинні насичуватись повітрям підчас дослідження. Дослідження здійснюється без регулювання pH.Дафній не потрібно годувати під час дослідження.
1.8.1.4. Тривалість
Дослідження триває 48 годин.
1.8.2. Спостереження
Кожна посудина для досліду повинна перевірятись на наявністьнерухомих дафній при 24 та 48 год. після початку дослідження(визначення наведені в Розділі 1.2). На додаток до нерухомості,будь-які аномалії поведінки або зовнішнього вигляду повинніподаватись у формі звіту.
1.8.3. Аналітичні вимірювання
Розчинений кисень та pH вимірюються на початку дослідження уконтрольному зразку (зразках) і у найвищій концентраціїдосліджуваної речовини. Концентрація розчиненого кисню у контроляхповинна відповідати критерію затвердження. (див. Розділ 1.6).Рівень pH як правило, не повинен коливатися більше ніж на 1,5одиниці в будь-якому окремому дослідженні. Температура зазвичайвимірюється в контрольних посудинах або у навколишньому повітрі івона повинна записуватись безперервно протягом усього дослідження,як мінімум, на початку та в кінці дослідження.
Концентрація досліджуваної речовини повинна вимірюватись, якмінімум, при найвищій та найнижчій концентрації, на початку та вкінці дослідження (4). Рекомендується щоб результати базувались навиміряних концентраціях. Однак, якщо наявні докази, щодосліджувана речовина була задовільно збережена в межах +- 20%номінальної чи виміряної початкової концентрації протягомдослідження, то результати можуть базуватися на номінальних тавиміряних початкових значеннях.
1.9. ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГРАНИЧНИЙ ВМІСТ
Використовуючи процедури описані в цьому методі, дослідженняна граничний вміст може здійснюватись при 100 мг/л досліджуваноїречовини або до її ліміту розчинності досліджуваному середовищі (взалежності від того, яке значення нижче) для того, щоб показати,що EC є більшим ніж ця концентрація. Дослідження на граничний
50
вміст повинне проводитись з використанням 20 дафній (які необхідно
поділити на 4 групи по п'ять тварин), з таким же числом в
контрольному зразку (зразках). Якщо виникає будь-яка
іммобілізація, то потрібно проводити повне дослідження. Будь-які
аномалії поведінки, які спостерігаються, потрібно записувати.
2. ДАНІ
Дані потрібно підсумовувати у формі таблиці та вказувати длякожної групи, яку застосовують і для контролю, число дафній, якевикористовувалось, іммобілізацію при кожному спостереженні.Процентне співвідношення нерухомих тварин після 24 та 48 годиннаноситься на графік по відношенню до досліджуваних концентрацій.Дані аналізують за допомогою відповідних статистичних методів(наприклад, пробіт-аналіз, та ін.) щоб обрахувати нахил кривих таEC з 95% границею довірчого інтервалу (p = 0,05) (7)(8).
50
Якщо стандартні методи обрахунку EC неможна застосувати до 50отриманих даних, то найвища концентрація, яка не викликаєнерухомість, та найнижча концентрація, що викликає 100%-вунерухомість повинна використовуватись як приблизне значення дляEC (це вважають геометричним середнім значенням цих двох
50
концентрацій).
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про дослідження повинен містити наступну інформацію:
Досліджувана речовина:
- фізична природа та відповідні фізико-хімічні властивості,
- хімічні ідентифікаційні дані, включаючи чистоту.
Піддослідні біологічні види:
- джерело та види дафній, постачальник джерела (якщо відомо)та умови культури, які використовуються (включаючи джерело, вид такількість їжі, частоту годування).
Умови дослідження:
- опис посудин для досліду, об'єм розчину, число дафній надосліджувану посудину, число посудин (реплікатів) на концентрацію,
- спосіб приготування вихідних та досліджуваних розчиніввключаючи використання будь-якого розчинника чи дисперсанта,концентрації, які використовуються,
- деталі води для розчину: джерело та характеристики якостіводи (pH, жорсткість, коефіцієнт Ca/Mg, коефіцієнт лужності Na/K,провідність та ін.); склад відновленої води, якщо вонавикористовується,
- умови інкубації: температура, інтенсивність освітлення таперіодичність, розчинений кисень, pH, та ін.
Результати:
- кількість та процентне співвідношення дафній, які булиіммобілізовані або не виявляли побічного впливу (включаючианомалії поведінки) в групах контролю та групах обробки, прикожному періоді спостереження, та опис природи впливів, якіспостерігаються,
- результати та дані дослідження проведеного з еталонноюречовиною, якщо доступні,
- номінальні досліджувані концентрації та результат всіханалізів, щоб визначити концентрацію досліджуваної речовини впосудинах для досліду; дієвість відновлення методу та визначенняліміту повинні також подаватись у звіті,
- всі фізико-хімічні вимірювання температури, pH тарозчиненого кисню, отриманий під час дослідження,
- EC після 48 годин для іммобілізації з довірчим інтервалом 50та графіками необхідної моделі, яку використовують для їхрозрахунку, нахили кривих реакцій на дозу та їх стандартнапохибка, статистичні процедури, які використовуються длявизначення EC ; (ці пункти даних для іммобілізації після 24 годин
50
повинні теж подаватись в звіті, якщо вони вимірюються),
- пояснення будь-якого відхилення від методу дослідження тачи вплинули ці відхилення на результати дослідження.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) ISO 6341. (1996). Water quality - Determination of theinhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera,Crustacea) - Acute toxicity test. Third edition, 1996.
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects TestGuidelines - Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, FreshwaterDaphnids.
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. AcuteLethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/ 11. EnvironmentCanada, Ottawa, Ontario, Canada.
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing ofDifficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health andSafety Publication. Series on Testing and Assessment. No 23. Paris2000.
(5) Commission of the European Communities. Study D8369.(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study ofthe ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. InAquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I.Mayer andJ.L.Hamelink). ASTM STP 634 - American Society for Testing andMaterials. p. 65-84
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in BiologicalAssay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
Додаток 1
ДЕЯКІ ХІМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИЙНЯТНОЇ
ВОДИ ДЛЯ РОЗЧИНІВ
------------------------------------------------------------------
| Речовина |Концентрація|
|---------------------------------------------------+------------|
|Тверді частки | < 20 мг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний органічний вуглець | < 2 мг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Неіонізований аміак | < 1 мю g/l |
|---------------------------------------------------+------------|
|Залишковий хлор |< 10 мю g/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальні фосфорорганічні пестициди | < 50 нг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальні органохоринові пестициди плюс | < 50 нг/л |
|поліхлоровані біфеніли | |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний органічний хлор | < 25 нг/л |
------------------------------------------------------------------
Додаток 2
ПРИКЛАДИ ПРИДАТНОЇ ВІДНОВЛЕНОЇ ДОСЛІДЖУВАНОЇ ВОДИ
ISO Досліджувана вода(1)
------------------------------------------------------------------
| Вихідні речовини | Приготувати |
| (єдина речовина) | відновлену воду, |
|------------------------------------------| додати наступні |
| Речовина | Кількість,яка | об'єми вихідних |
| | додається до 1 літр | речовин до 1 л води |
| | води(*) | (*) |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Хлорид кальцію | 11,76 г | 25 мл |
|CaCl , 2H O | | |
| 2 2 | | |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Сульфат магнію | 4,93 г | 25 мл |
|MgSO , 7H O | | |
| 4 2 | | |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Гідрокарбонат натрію| 2,59 г | 25 мл |
|NaHCO | | |
| 3 | | |
|--------------------+---------------------+---------------------|
|Хлористий калій | 0,23 г | 25 мл |
|KCl | | |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) Вода відповідної чистоти, наприклад, деіонізована, |
|дистильована або зі зворотнім осмосом з електропровідністю, яка |
| -1 |
|не перевищує 10 мю S.см . |
------------------------------------------------------------------
Середовище Елендт M7 та M4
Акліматизація до середовища Елендт M4 та M7
У деяких лабораторіях виникали труднощі у прямому переносіДафнії до середовища M4 та M7. Однак, було досягнуто певногоуспіху в поступовій акліматизації, тобто переміщенні з власногосередовища до 30% Елендту, потім до 60% Елендту та потім до 100%Елендту. Акліматизаційні періоди можуть тривати впродовж одногомісяця.
Підготовка
Мікроелемент
Окремі вихідні розчини (I) окремих мікроелементів спочаткуготують у воді відповідної чистоти, наприклад, деіонізованій,дистильованій або з оборотним осмосом. З цих різних вихіднихрозчинів (I) другий єдиний вихідний розчин (комбінований розчин),тобто:
------------------------------------------------------------------------
|Вихідний розчин(и)| Кількість додана | Концентрація | Для |
| I (єдина | до води (мг/л) | (відносно до | приготування |
| речовина) | | середовища M4) |комбінованого |
| | | | вихідного |
| | | | розчину II, |
| | | | додається |
| | | | наступна |
| | | | кількість |
| | | | вихідного |
| | | | розчину I до |
| | | | води (мл/л) |
| | | |--------------|
| | | | M4 | M7 |
|------------------+------------------+-----------------+------+-------|
|H BO | 57 190 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
| 3 3 | | | | |
|MnCl .4H O | 7 210 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
| 2 2 | | | | |
|LiCl | 6 120 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
|RbCl | 1 420 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
|SrCl .6H O | 3 040 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
| 2 2 | | | | |
|NaBr | 320 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
|Na MoO .2H O | 1 230 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
| 2 4 2 | | | | |
|CuCl2.2H O | 335 | 20 000-кратна | 1,0 | 0,25 |
| 2 2 | | | | |
|ZnCl | 260 | 20 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
| 2 | | | | |
|CoCl .6H O | 200 | 20 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
| 2 2 | | | | |
|KI | 65 | 20 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
|Na SeO | 43,8 | 20 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
| 2 3 | | | | |
|NH VO | 11,5 | 20 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
| 4 3 | | | | |
|Na EDTA.2H O | 5 000 | 2 000-кратна | - | - |
| 2 2 | | | | |
|FeSO .7H O | 1 991 | 2 000-кратна | - | - |
| 4 2 | | | | |
------------------------------------------------------------------------
Обидва розчини Na 2 EDTA та FeSO готуються окремо, 4зливаються в один та одразу стерилізуються в автоклаві.
Це надає:
------------------------------------------------------------------------
|Розчин 2 l Fe-EDTA| | 1 000-кратна | 20,0 | 5,0 |
------------------------------------------------------------------------
M4 та M7 середовище
Середовища M4 та M7 готуються з використанням вихідногорозчину II, макронутріентів та вітамінів, а саме:
---------------------------------------------------------------------------
| |Кількість |Концентрація (відносно до| Кількість |
| |додана до | середовища M4) | вихідного |
| | води | | розчину II |
| | (мг/л) | |додається для|
| | | | приготування|
| | | | середовища |
| | | | (мл/л) |
| | | |-------------|
| | | | M4 | M7 |
|----------------------+----------+-------------------------+------+------|
|Вихідний розчин II | | 20-кратна | 50 | 50 |
|(комбіновані | | | | |
|мікроелементи) | | | | |
|Вихідні розчини | | | | |
|макронутріентів (єдина| | | | |
|речовина) | | | | |
|CaCl · 2H 0 | 293 800 | 1 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
| 2 2 | | | | |
|MgSO · 7H O | 246 600 | 2 000-кратна | 0,5 | 0,5 |
| 4 2 | | | | |
|KCl | 58 000 | 10 000-кратна | 0,1 | 0,1 |
|NaHCO | 64 800 | 1 000-кратна | 1,0 | 1,0 |
| 3 | | | | |
|Na SiO · 9H O | 50 000 | 5 000-кратна | 0,2 | 0,2 |
| 2 3 2 | | | | |
|NaNO | 2 740 | 10 000-кратна | 0,1 | 0,1 |
| 3 | | | | |
|KH PO | 1 430 | 10 000-кратна | 0,1 | 0,1 |
| 2 4 | | | | |
|K HPO | 1 840 | 10 000-кратна | 0,1 | 0,1 |
| 2 4 | | | | |
|Комбінований запас | - | 10 000-кратна | 0,1 | 0,1 |
|вітамінів | | | | |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Комбінований вітамінний вихідний розчин готується через додавання 3-х |
|вітамінів до 1 л води, які наведено нижче: |
|-------------------------------------------------------------------------|
|Тиамін гідрохлорид | 750 | 10 000-кратна | | |
|Цианокобаломін (B ) | 10 | 10 000-кратна | | |
| 12 | | | | |
|Біотин | 7,5 | 10 000-кратна | | |
---------------------------------------------------------------------------
Запас сукупності вітамінів зберігається заморожений вмаленьких аліквотах. Вітаміни додають до середовища незадовго довикористання.
N.B: Щоб уникнути осаду солей, коли готуються остаточнісередовища, додають аліквоти вихідних розчинів до 500-800 млдеіонізованої води, а потім доводять об'єм до 1 л.
N.B: перша публікація середовища M4 знаходиться в Elendt,B.P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; anultrastructualapproach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma,154, 25-33.
C.3. ДОСЛІДЖЕННЯ ІНГІБІЦІЇ ВОДОРОСТЕЙ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Мета цього дослідження визначити впливи речовини на рістодноклітинних зелених видів водоростей. Відносно короткі(72 години) дослідження можуть оцінити впливи на декількапоколінь. Цей метод може бути адаптований для використання длядекількох видів одноклітинних видів водоростей, у випадку якогомає надаватись опис методу, який використовується зі звітом продослідження.
Цей метод найлегше застосовувати до речовин, які розчинні уводі, та які за умов дослідження зазвичай залишаються у воді.
Цей метод може використовуватись для речовин, які прямо невпливають на вимірювання росту водоростей.
Перед початком дослідження необхідно мати, по можливості,інформацію про розчинність у воді, тиск насиченого пару, хімічнустабільність, константи розпаду та здатність речовини добіологічного розпаду.
