4.6.7.2. Метод серійних розведень в агарі.
Для визначення використовують сухий поживний агар (АПВ), сухий лужний агар на основі ферментативного пептону з дріжджовим екстрактом, сухий лужний дріжджовий агар. Наважку антибактеріального препарату або вміст флакону розчиняють в дистильованій воді і в разі необхідності додатково розводять з таким розрахунком, щоб основний розчин містив 2000 од. або мкг в 1 мл. Для розчинення деяких препаратів застосовують спеціальні розчини: для ріфампіцину, доксицикліну і нітрофуранів - диметилформамід, левоміцетин та еритроміцин попередньо розчиняють в мінімальній кількості етилового спирту, додаючи до необхідного об'єму дистильовану воду. У випадку використання таблеток їх розтирають та розчиняють повністю, або в цілях економії препарату, зважують, ділять величину ваги на активність і отримують поправочний коефіцієнт для визначення розміру ваги препарату, необхідної для розчину заданої активності. Наприклад, таблетка еритроміцину з активністю 100000 од. важить 160 мг (160000 мкг). При діленні ваги одержуємо величини поправочного коефіцієнту 1,6, який означає, що для одержання концентрації 2000 од./мл в об'ємі 10 мл потрібно взяти важку 32 мг (2000 мкг/мл х 10 мл х 1,6 = 32000 мкг = 32 мг). Основний розчин антибіотику титрують двократно в фізіологічному розчині окремими піпетками для отримання ряду концентрацій, які в 10 раз перевищують ті, які необхідно отримати в 1 мл агарового середовища. Потім, 1,5 мл кожного розведення антибіотику виливають в стерильну чашку Петрі, додають 13,5 мл розплавленого агару, ретельно перемішують, дають агару застигнути і підсушують. Для посіву використовують 3-4 - годинну агарову культуру або суспензію агарових культур в концентрації 10^8 м.кл./мл. Посів проводять петлею на сектори або штампом-реплікатором. На одну чашку можна нанести до 20-25 культур, чашки інкубують при температурі (37+/-0,5 град. C) - 16-20 годин. МПК визначають по найменшій концентрації, яка пригнічує ріст культури на поверхні агарового середовища. По розміру МПК оцінюють ступінь чутливості досліджуваних штамів до конкретного препарату.
Таблиця 9
Приграничні (критичні) значення діаметрів зон затримки росту, їх кореляція з МПК і рівняння регресії для визначення чутливості до антибіотиків вібріонів
4.7. Порядок контролю якості діагностичних поживних середовищ.
4.7.1. Готові поживні середовища, консерванти, інгібітори сторонньої мікрофлори, якими користуються в діагностиці холери, підлягають обов'язковій перевірці з метою контролю якості приготування на місцях (сухі середовища промислового виготовлення) або визначення їх чутливості, інгібуючих або консервуючих властивостей (середовища лабораторного приготування).
4.7.2. Бактеріологічний контроль якості твердих та рідких поживних середовищ можуть проводити лабораторії протичумних та інших закладів, які мають дозвіл на роботу із збудником холери, використовуючи для контролю тест-штами Vibrio cholerae cholerae P-1 (145) і Vibrio cholerae eltor M-878, а також лабораторії особливо небезпечних інфекцій обласних санепідстанцій, відомчих установ з використанням тест-штаму авірулентного холерного вібріону не 01 серогрупи Р-9741 (Ростов, Росія).
4.7.3. Бактеріологічному контролю підлягає кожна серія сухого середовища промислового випуску, яка має контрольний N ВБК і відповідний термін придатності, а також середовища лабораторного приготування.
4.7.4. При позитивному результаті контролю проби відповідна серія середовища вважається придатною до реалізації, при цьому серія промислового пуску тільки при тих же умовах виготовлення. Наступний контроль цієї серії середовища здійснюється щорічно, а також при зміні умов варки середовищ, незалежно від часу попередньої перевірки.
4.7.5. Термін зберігання готового лужного агару та розчину основного пептону - 12 місяців від часу перевірки. По закінченню цього терміну середовище підлягає додатковому контролю не рідше 1 разу на квартал. При позитивному результаті контролю промислової серії середовища по закінченню встановленого терміну зберігання термін пригодності його продовжують на 6 місяців.
4.7.6. Якщо при першому контролі середовище було непридатне, необхідно провести повторно бактеріологічний контроль цієї ж серії сухого середовища і взірець нової варки з нього:
- при отриманні негативного результату повторного контролю середовища, приготовленого на місці, і позитивного бактеріологічного контролю взірця цієї серії сухого середовища, звареного в лабораторії установи, яка веде контроль вважати дану серію сухого поживного середовища придатною і вжити заходи щодо усунення помилки в технології місцевого приготування;
- при отриманні негативного результату на взірець сухого середовища даної серії направляють рекламацію до адреси установи, яка готувала поживне середовище.
4.7.7. На перевірку надсилають частину загального об'єму середовища, яке призначене для проведення досліджень, в кількості 200 мл агару і 100 мл основного розчину пептону промислового виготовлення і в подвійному об'ємі для серій лабораторного приготування. На етикетці вказати назву середовища, номер серії, термія придатності сухого середовища і дату контрольної варки.
4.7.8. Оптимальний строк перевірки поживного середовища 10-14 днів після його приготування.
4.7.9. Лужний агар і основний розчин пептону, які приготовлені з сухих поживних середовищ промислового випуску, перевіряють з використанням однієї дози (10^6 м.кл.) одного тест-штаму (Vibrio cholerae cholerae P-l 145 або Vibrio cholerae не 01 9741).
Для контролю середовища використовують 3-годинну культуру тестштаму, яка вирощена на агаровому середовищі, розлитому в чашки за 30-40 хвилин до посіву 18-20 - годинної агарової культури II-IV пасажу.
З робочої культури готовлять суспензію в 0,9 % розчину хлористого натрію pH (7,1+/-0,1) концентрації 1 млрд. м.кл. в 1 мл по стандарту мутності 5 одиниць ІСК ім. Л.А. Тарасевича (Росія). Приготовлену суспензію поступово розводять переносом по 0,5 мл в 4,5 мл 0,9 % хлористого натрію до концентрації 100 м.кл. в 1 мл (8-а пробірка, розведення 10^7).
Для контролю лужного агару 10 м.кл. тест-культури (0,1 мл з розведення 10^7) засівають на кожну з 3 чашок (свіжовиготовлених і ретельно підсушених) середовища, яке перевіряється і контролюється, і 1000 м.кл. (0,1 мл з розведення 10^6) - тільки на контрольну. Для останньої використовують перевірений якісний лужний агар. Посівний матеріал розтирають шпателем і інкубують при температурі (37+/-0,5 град. C) на протязі 12 годин.
Результати перевірки оцінюють по показниках росту коловій тесткультури на досліджуваному контрольному середовищах з оцінкою фактичної величини посівної дози: - досліджуване тверде поживне середовище придатне для виділення збудника холери, якщо після 12 годин інкубації при температурі (37+/-0,5 град. C) на всіх чашках ростуть типові по морфології колонії діаметром не менше 1 мм.
4.7.10. Основний розчин виробничого випуску, який необхідно перевірити, і використаний в якості контрольного середовища, розводять до 1 % концентрації, встановлюють pH (8,3+/-0,1) і розливають в колби або флакони по 100 мл кількості 3 - для дослідного і 6 - контрольного. У всі робочі об'єми дослідного і 3 об'єми контрольного середовища наносять по 10 м.кл. тесткультури (0,1 мл пробірка N 8, розведення 10^7) і по 100 м.кл. (0,1 мл пробірка N 7, розведення 10^6) в другі 3 об'єми контрольного середовища.
Таблиця 10
Показники межевих значень мінімальних пригнічуючих концентрацій для визначення груп мікроорганізмів по ступеню чутливості до антибактеріальних препаратів в мкг/мл або ОД/мл
Для контролю посівної дози по 0,1 суспензії тест-культури розведення 10^7 і 10^6 (10 і 100 м.кл.) переносять на чашки контрольного лужного агару (по 3 на кожну дозу), рівномірно розподіляють і інкубують при температурі (37+/-0,5 град. C) 12-14 годин.
Посіви в 1 % пептонній воді інкубують на протязі 6 годин при температурі (37+/-0,5 град. C) з наступним висівом з поверхневого шару кожного петлею N 5 (5 мм) на агарові пластинки контрольного середовища і після вирощування при температурі (37+/-0,5 град. C) на протязі 12-14 годин враховують результати:
- перевірочний основний розчин пептону вважають придатним для виділення збудників холери, якщо з усіх посівів 10 м.кл. тест-культури в 1 % пептонну воду з 6-годинною інкубацією на агарових пластинках виростають типові по морфології колонії діаметром не менше 1 мм;
- у всіх посівах з контрольного середовища збагачення повинні рости типові колонії діаметром не менше 1 мм в кількості одиничних для посівної дози 10 м.кл. і не менше 10 для дози 100 м.кл.;
- в посівах, що контролюють величину використаної в дослідженні посівної дози тест-культури, повинні рости типові і поодинокі колонії (не більше 5) для посівної дози 10 м.кл. не менше 30, але не більше 50 (середнє число на 1 чашку) для дози 100 м.кл.;
- основний розчин пептону слід признати непридатним для виділення збудників холери, якщо при відповідності з вимогами величини посівної дози і якості контрольних поживних середовищ колонії тест-культур виростають менше ніж на 3 чашках або діаметром менше 1 мм;
- при невідповідності контрольних показників дослід повторюють.
4.7.11. Бактеріологічний контроль поживних середовищ з інгібіторами сторонньої мікрофлори, сольових консервантів по "Інструкції по бактеріологічному контролю діагностичних поживних середовищ для холерного вібріону" (Росія, 1983 р.).
4.7.12. При здійсненні всіх видів бактеріологічного контролю поживних середовищ обов'язково дотримуватися вимог до тест-штамів, порядку їх зберігання і підготовки робочої культури, які визначені вищеназваною інструкцією.
4.7.13. Полівуглеводні середовища, які використовують для відбору колоній для ідентифікації, перевіряють на місцях з використанням штамів холерних вібріонів не 01 або кишкової палички.
4.8. Забезпечення біологічної безпеки в лабораторіях, які виконують дослідження на холеру.
4.8.1. Діагностичні дослідження на холеру в регламентуючому об'ємі можуть проводити лабораторії, які мають дозвіл:
- бактеріологічні лабораторії територіальних санепідстанцій, лікувально-профілактичних та відомчих закладів - на роботу з мікроорганізмами III групи патогенності;
- лабораторії протичумних закладів та лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій санепідстанцій (республіканської, обласних, міських), - на проведення діагностичних досліджень на холеру та на роботу із збудниками холери;
- в умовах епідемічних ускладнень тимчасовий дозвіл на проведення діагностичних досліджень на холеру бактеріологічними лабораторіями територіальних санепідстанцій, які функціонують в складі лабораторної служби вогнища, видають територіальні режимні комісії.
4.8.2. Порядок отримання дозволу для всіх лабораторій визначений наказом МОЗ України "Про посилення роботи режимних комісій" N 183 від 14.12.1992 р..
5. Серологічні методи дослідження.
Для серологічної діагностики холери використовують імунологічні реакції, які виявляють в сироватці хворих, перехворілих, вібріононосіїв, а також у вакцинованих специфічні антитіла: аглютиніни, вібріоцидіни, антитоксини. Постановка реакцій проводиться в мікро- або макрооб'ємах (згідно з наставленням).
У хворих холерою на 5-7-й день після початку захворювання з'являються аглютиніни та вібріоцидні антитіла в високих титрах. Титри антитоксинів наростають більш повільно.
Досліджувати потрібно парні сироватки з інтервалом в 7-10 днів. Першу пробу потрібно забирати на 3-5 день хвороби.
Кров для серологічних досліджень забирають з вени, а при відсутності такої можливості або при роботі в польових умовах - з пальця. З вени беруть 1-5 мл крові і після згортання згусток відділяють від стінок пробірки стерильною скляною паличкою або платиновою петлею. Пробірки зберігають в холодильнику і транспортують в лабораторію охолодженими (в термосі, сумці- холодильнику та ін.). В лабораторії сироватку інактивують при температурі (56+/-0,5 град. C) 30 хв.
Якщо кров забирають в день постановки реакції, пробірки з кров'ю, що згорнулась, необхідно центрифугувати 10-15 хв. при 3000 об/хв. При відсутності можливості досліджувати сироватку терміново її зберігають в ампулах при температурі 4 град. C. Кров з пальця беруть в об'ємі 0,4 мл і вносять в стерильний пеніциліновий флакон або пробірку з 1,6 мл фізіологічного розчину (1:5).
При роботі в польових умовах декілька крапель капілярної крові з пальця наносять на стерильний папір, підсушують при кімнатній температурі поміщають в пробірку і направляють в лабораторію. При дослідженні кружальця паперу з краплями крові вирізають і кожен з них заливають 0,9 мл стерильного 0,9 % розчину хлористого натрію (розведення 1:10) і після 3-4 годин екстрагування в умовах холодильника інактивують 30 хв. при температурі (56+/-0,5 град. C) і досліджують.
5.1. Визначення аглютинінів в сироватці крові.
5.1.1. Виявлення протихолерних антитіл методом розгорнутої реакції аглютинації.
Сироватку, яку досліджують, розводять 1 % пептонною водою pH 7,3+/-0,1 в об'ємі 1 мл від 1:10 до 1:640. Як антиген використовують 3-годинну бульйонну культуру, яку виявили в даному вогнищі, або досліджують в 2-х рядах з культурами сероварів Огава і Інаба. В пробірку з розтитрованою сироваткою вносять по 1 краплі культури-антигена і ставлять на 1 годину в термостат, потім до ранку в холодильник при температурі (4+/-0,5 град. C), після чого реєструють результати. Реакція супроводжується контролями антигену та сироватки.
При визначенні титру реакції враховують розведення з аглютинацією на 3-4 хрести. Результат дослідження сироватки хворого при позитивній реакції аглютинації в розведенні 1:40 і вище вважається орієнтовано позитивною. Діагностичне значення має не менше чим 4- кратне нарощування титру антитіл.
5.1.2. Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) з антигенним холерним еритроцитарним діагностикумом. РНГА призначена для виявлення повних антитіл в сироватці крові. Це достатньо специфічна та чутлива двокомпонентна реакція. РНГА має значну перевагу над реакцією аглютинації. Необхідні інгредієнти, методика постановки в макро- та мікрооб'ємах подані в наставленні до діагностикуму холерного антигенного еритроцитарного.
5.1.3. Реакція нейтралізації антигену (РНАг) для виявлення антитіл в сироватці крові з використанням холерного імуноглобулінового еритроцитарного діагностикума. РНАг - високоспецифічна трикомпонентна реакція. Принцип реакції полягає в специфічній нейтралізації антигену, який додається повними та неповними антитілами, які знаходяться в сироватці. Необхідні інгредієнти, методика постановки в макро- і мікрооб'ємах подані в наставленні до діагностикуму холерного імуноглобулінового еритроцитарного. При використанні системи реакцій РНГА і РНАг необхідність постановки контролю специфічності з кожною досліджуваною сироваткою випадає, так як ці 2 реакції взаємно контролюють отримані результати. Діагностичне значення має не менше ніж 4-кратне наростання титрів антитіл при дослідженні парних сироваток в РНГА і РНАг.
5.2. Визначення токсиннейтралізуючих антитіл в сироватці крові.
РНГА з еритроцитарним холерним ентеротоксичним діагностикумом (ЕХЕД), призначеним для визначення в сироватці крові хворих холерою, вібріононосіїв та щеплених холероген-анатоксином антитіл, які нейтралізують холерний токсин. Токсиннейтралізуючі антитіла з'являються на 5-6-й день хвороби, досягають максимума на 14-21-й день, а потім їх титри знижуються. Діагностичним титром РНГА з ЕХЕД слід вважати 1:160. Доцільно досліджувати парні сироватки.
За допомогою цієї реакції можна також виявляти токсиннейтралізуючі антитіла в сироватці крові хворих та вібріононосіїв, у яких інфікування обумовлене холерним вібріоном 0139 серогрупи. Методика постанови РНГА і ЕХЕД додається до комплекту діагностикума.
5.3. Визначення вібріоцидних антитіл в сироватці крові (РВА).
Вібріоцини в крові хворих визначаються з 1-3-го дня захворювання в титрах 10^1 - 10^3 і досягають максимального значення 10^-4 - 10^-8 до 10-12 дня. Основа методу полягає в тому, що в присутності вібріоцидних антитіл не розмножуються холерні вібріони.
При проведенні серологічних досліджень у вогнищі, зумовленим збудником холери відповідного серовару, в реакції використовують один штам відповідного серовару, при відсутності цих даних - два штами обох сероварів.
У перехворілих титр вібріоцидних антитіл може бути від 10^-4 до 10^-6 в перші 3- 4 тижні, а вакцинованих - 10^-4 - 10^-7 та вище.
5.3.1. Матеріали та обладнання методу: - досліджуємі сироватки, інактивовані прогрівом 30 хв. при температурі (56+/-0,5 град. C); - сухий комплемент або свіжоотримана сироватка морської свинки в розведенні 1:20; - 0,9 % розчин хлориду натрію pH (7,2+/-0,1); - штами холерних вібріонів сероварів Огава та Інаба, типові, в S-формі, не чутливі до комплементу; - чашки Петрі з лужним агаром; посудина з льодом; - термостат на 37 град. C.
5.3.1.2. Методика постановки реакції. Комплемент, розведений фізіологічним розчином 1:20, розливають в 2 ряди пробірок по 0,9 мл. В першу пробірку вносять 0,1 мл досліджуваної сироватки і після ретельного перемішування послідовно переносять по 0,1 мл до розведення 10^-10, отримують десятикратні розведення в об'ємі 0,9 мл. Титрацію сироватки проводять на льоду, який кладуть в будь яку ємкість.
З однодобової агарової культури холерного вібріону готують суспензію в фізіологічному розчині, яка вміщує в 1 мл 10000-20000 м.кл. Стерильною градуйованою піпеткою отриману суспензію по 0,1 мл вносять в дослідні пробірки з розтитрованою сироваткою.
Необхідні контролі: а) контроль комплементу (0,9 мл комплементу і 0,1 мл культури); б) контроль сироватки (0,8 мл фізіологічного розчину, 0,1 мл сироватки і 0,1 мл культури); в) контроль культури (0,9 мл фізіологічного розчину і 0,1 мл культури).
Штатив з пробірками на 1 годину ставлять у водяну баню або термостат при температурі (37+/-0,5 град. C), завчасно роблять висів з пробірки контролю культури для визначення фактичної концентрації живих вібріонів в дослідній суспензії (контроль розведення), через 1 годину штатив знову ставлять на лід і з кожної пробірки окремою стерильною піпеткою 0,1 мл культури висівають на чашку з лужним агаром pH (7,7+/-0,1). Посів рівномірно розподіляють по поверхні чашки гойданням її або шпателем. Чашки ставлять на 18-24 години в термостат при температурі (37+/-0,5 град. C), після чого підраховують кількість вирощених колоній.
В посівах з контрольних пробірок повинна вирости кількість колоній, близька до контролю розведення.
5.3.1.3. Вібріоцидним титром вважають максимальне розведення сироватки, яке викликає загибель не менше чим 50 % клітин холерного вібріону, що виявляється при посіві на агарові пластинки в чашки Петрі в порівнянні з кількістю вирощених колоній з пробірки контролю комплементу.
Приклад обчислення: при посіві з дослідних пробірок з розведенням сироватки
10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7 т.п. на чашках відповідно виросло 0; 5; 10; 15; 30; 38 і т.д. колоній. При висіві з пробірки контролю комплементу також після годинної інкубації при температурі (37+/-0,5 град. C) виросло 36 колоній, 50 % від цього числа буде 18. З 5-ї пробірки виросло 15 колоній, тобто менше 50 % від кількості колоній в контролі (18), в наступній - 30, тобто більше 50 % цього показнику. Розведення сироватки в 5-й пробірці буде 10^-5, таким чином вібріоцидний титр в даному прикладі буде 10^-5.
5.3.2. Визначення вібріоцидних антитіл (ВА) в сироватці крові на основі ферментації вуглеводів. Про відсутність або наявність ВА судять по ферментації сахарози, що визначають за допомогою індикатору.
Матеріали та обладнання.
- сироватка крові, взята з вени або пальця, інактивована при (56+/-0,5 град. C);
- штами холерного вібріону сероварів Огава і Інаба,
- комплемент, розведений 1:20 1 % пептонною водою, який містить 1 % сахарози і 1 % індикатора Андреде;
- термостат на (37+/-0,5 град. C).
Методика постановки реакції. Комплемент, розведений 1:20 1 % пептонною водою з сахарозою та індикатором Андреде, розливають в пробірки по 0,45 мл. В першу пробірку добавляють 0,05 мл досліджуваної сироватки і після ретельного перемішування переносять 0,5 мл суміші в другу пробірку, з другої в третю і т.п. (до розведення 10^-8 - 10^-9). Готують суспензію з 18-20 - годинної агарової культури холерного вібріону і розводять 1 % пептонною водою до концентрації 10^3 м.кл. в 1 мл. У всі пробірки вносять по 0,45 мл суспензії і вміщують в термостат.
Постановку реакції супроводжують контролями.
- 0,45 мл 1 % пептонної води, яка містить 1 % сахарози і 1 % індикатора Андреде + 0,05 мл досліджуваної сироватки + 0,45 мл суспензії культури - контроль сироватки;
- 0,45 мл комплементу з сахарозою і індикатором + 0,45 мл культури - контроль комплементу;
- 0,45 мл 1 % пептонної води з сахарозою і індикатором + 0,45 мл культури - контроль культури;
- 0,45 мл 1 % пептонної води з сахарозою і індикатором + 0,05 мл досліджуваної сироватки - контроль стерильності сироватки.
Через 7-8 годин проводять облік реакції. При цьому в контролі (крім контролю стерильності сироватки) колір вмісту пробірок повинен перейти в червоний або рожевий. Зміна кольору індикатору в пробірках робочого ряду, пов'язаного з ферментацією сахарози розмноженими вібріонами, свідчить про відсутність вібріоцидних антитіл в досліджуваній сироватці. За вібріоцидний титр приймають те найбільше розведення сироватки, при якому колір вмісту пробірки залишається незмінним або інтенсивність його значно відрізняється від кольору контрольних проб. Результат виражають у вигляді десятичного логарифму розведення сироватки, взятого з протилежним знаком.
Примітка. Тест вібріоцидних антитіл при холері, обумовлених вібріонами 0139 серогрупи, в зв'язку резистентністю їх до комплементу не рекомендується використовувати.
6. Поживні середовища для виділення та ідентифікації холерних вібріонів.
6.1. Транспортні середовища:
- 1 % пептонна вода, pH 8,5+/-0,1, без інгібіторів росту посторонньої флори і з телуритом калію (див. середовища збагачення);
- 2 % розчин повареної солі: 20 г хлориду натрію і 0,1 г їдкого натрію розчиняють в 1 л дистильованої води; рідину фільтрують через паперовий фільтр, розливають по 10 мл в пробірки і стерилізують в автоклаві 20 хвилин при 0,7 атм.
6.2. Середовища збагачення.
6.2.1. Основний розчин пептону готують по наступному рецепту:
| Пептон Хлорид натрію Нітрат калію Карбонат натрію Дистильована вода pH 8,4+/-0,2 | - 100 г - 50 г - 1 г - 25 г - 1 л |
У холодну дистильовану воду вносять пептон, хлорид і карбонат натрію. Суміш кип'ятять при постійному помішуванні до повного розчину пептону, потім дають нітрат калію. Перевіряють реакцію середовища, якщо потрібно, pH доводять до 8,4+/-0,2. Розчин фільтрують через міткалевий або паперовий фільтр, розливають в посуду і стерилізують в автоклаві при 1 атм 20 хвилин.
Основний розчин пептону зберігається 2 роки.
6.2.2. 1 % пептонна вода. Для отримання 1 % пептонної води концентрований розчин розводять в 10 разів дистильованою водою. Після встановлення pH 8,4+/-0,2 розливають в пробірки або флакони і стерилізують під тиском 0,7 атм 20 хвилин. 1 % пептонну воду можна готувати безпосередньо із окремих компонентів, для цього потрібно взяти вагу в 10 раз меншу ніж в рецепті основного пептону. Технологія приготування така ж, як і основного пептону.
6.2.3. Елективні середовища збагачення.
Пептонна вода з телуритом калію. В 1 % пептонну воду (pH 8,5+/-0,1) після автоклавування додають телурит калію в кінцевому розчині 1:100000 або 1:200000. Передчасно готують робочий 0,1 % розчин телуриту калію.
Термін зберігання робочого розчину 7 днів, а поживних середовищ з телуритом - не більше 48 годин при умові їх зберігання в холодильнику.
6.3. Тверді середовища для виділення холерного вібріону.
6.3.1. Лужні середовища.
Лужний м'ясо-пептонний агар:
| М'ясна вода Пептон Хлорид натрію Агар-агар pH 7,8,0+/-0,2 | - 1 л - 10 г - 5 г - 20 г |
В м'ясну воду вносять пептон і хлорид натрію. Суміш перемішують і підлужують 20 % розчином їдкого натрію до pH 8,3+/-0,1. Потім додають агар-агар і ставлять в автоклав для варіння середовища спочатку текучою парою на протязі 30-40 хвилин при 1 атм. 20 хвилин. Якщо м'ясо-пептонний агар варять на плиті, середовище кип'ятять до повного розплавлення агар-агару при постійному помішуванні.
Для одержання прозорого агарового середовища його після варіння з метою відстою на 2-3 години залишають в автоклаві або поміщають в термостатну кімнату при температурі 43 град. C, можна продовжити до 18-20 - годин. В цей час грубі частини випадають в осад і агар освітлюється. Для запобігання швидкого остудження середовища посуд з агаром щільно обгортають ковдрою. Агар, який відстоявся, обережно, не змішуючи, сифоном або через край повільно зливають з осаду на щільний ватно-марлевий фільтр. У фільтраті уточнюють реакцію середовища, якщо потрібно, підкислюють її, але підлужувати агар на цьому етапі не рекомендується, тому що випадає осад при стерилізації готового середовища. Профільтрований агар розливають в посуд і стерилізують при 0,7 атм 20 хв. Лужний агар сухий:
- на основі ферментативного пептону з дріжджевим екстрактом;
- агар - лужний сухий - на поживній основі із казеїнового або дріжджового гідролізату;
- на поживній основі із гідролізату кормових дріжджів, повністю розчинений (засіб приготування вказаний на етикетці).
6.4. Середовища для ідентифікації вібріонів.
6.4.1. Середовища з вуглеводами.
Лактозо-сахарозне середовище.
| Пептон Хлорид натрію Лактоза Сахароза Агар-агар Індикатор Андреде Вода дистильована pH 7,3+/-0,1 | - 5 г - 5 г - 10 г - 1 г - 10 г - 40 мл - 1 л |
Середовище варять, фільтрують, розливають по 5-7 мл в стерильні пробірки і стерилізують під тиском 0,5 атм 20 хв. Готове середовище після стерилізації скошують так, щоб одержати стовпчик і косяк (по типу середовища Ресселя). Середовище світле.
При відсутності пептону середовище готують на 1-1,3 % агарі Хотингера (з амінним азотом 50-60 мг %) чи іншому поживному агарі, додаючи до нього в відповідних концентраціях індикатор Андреде в кількості 2 % .
Середовище Кліглера:
На початку в розплавленому поживному агарі pH 7,7+/-0,1 розчиняють вуглеводи, потім до нього додають свіжоприготовлені розчини заліза і солі натрію згідно пропису середовища (індикатор на сірководень). Крім того, для реєстрації кислотоутворення додають індикатор феноловий червовий. Середовище варять, фільтрують, розливають по 5-7 мл в стерильні пробірки, стерилізують 20 хв. під тиском 0,5 атм і скошують по типу середовища Ресселя. pH готового середовища (7,3+/-0,1).
Середовище Ресселя.
Готується так як лактозо-сахарозне середовище, але замість сахарози беруть глюкозу в тій же кількості.
Середовище Гісса:
| Пептон Хлорид натрію Вуглевод Дистильована вода Індикатор Андреде або 1,6 % розчин бромтимолового синього pH 7,3+/-0,1 | - 10 г - 5 г - 5-10 г - 1 л - 10 мл - 1 мл |
До 1 % пептонної води (pH 7,3+/-0,1) без селітри додають 0,5-1 % необхідного вуглеводу або спирту (L-арабіноза, D-маноза, D-сахароза, D-маніт, L-інозіт, D-глюкоза та інш.) і 1 % індикатору Андреде або 0,1 мл 1,6 % розчину бромтимолового синього на 100 мл середовища. Середовище розливають в стерильні пробірки з поплавками і стерилізують при 0,5 атм 20 хв.; середовище з L-арабінозою слід стерилізувати протягом 20 хв. при 0,1-0,2 атм. Для приготування середовищ Гісса можна застосувати тільки перераховані ізомери вуглеводів. Готові середовища Гісса з індикатором Андреде світлі, при кислотоутворенні - червоніють, середовища з бромтимоловим синім - зеленого кольору з трав'янистим відтінком, при кислій реакції - жовтого кольору, при лужній - синього.
Середовище Хью-Лейфсона:
| Пептон Хлорид натрію Двозаміщений фосфат калію Глюкоза Бромтимоловий синій Агар-агар Дистильована вода pH 7,1+/-0,1 | - 2 г - 5 г - 0,3 г - 10 г - 0,03 г - 3 г - 1 л |
До води додають пептон, хлористий натрій і агар-агар. Суміш підігрівають до розплавлення агару, потім вносять фосфат калію і глюкозу, продовжують кип'ятить 2-3 хв. Суміш підлужують 20 % розчином їдкого натрію до pH 7,4+/-0,1, доводять об'єм середовища до першопочаткового і додають 3 мл 1 % водного розчину бромтимолового синього. Потім середовище фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають по 4-5 мл в стерильні пробірки і стерилізують під тиском 0,5 атм 20 хв. Колір середовища до стерилізації синій, а після автоклавування трав'янисто-зелений (pH 7,1+/-0,1), але не жовтий. При кислій реакції середовище жовтіє.
Бульйон Кларка:
| Пептон Глюкоза Двохзаміщений фосфат калію Дистильована вода | - 5 г - 5 г - 5 г - 1 л |
Суміш інгредієнтів нагрівають до повного їх розчинення, потім фільтрують через паперовий фільтр і розливають по 5 мл в стерильні пробірки. Бульйон стерилізують під тиском 0,5 атм 20 хв.
Середовище з крохмалем і індикатором.
В 1 % пептонну воду для кольорового ряду додають 1 % розчинного крохмалю і 1 % індикатора Андреде. Середовище розливають в стерильні пробірки і стерилізують 20 хв. при 0,5 атм. Середовище світле, при наявності кислоти червоніє.
6.4.2. Середовище для вивчення розщеплення білка.
Желатин. До м'ясо пептонного бульйону або бульйону Хотингера додають дрібно нарізаний желатин із розрахунку 10-15 г на 100 мл (улітку концентрацію желатину збільшують до 20 %). Желатину дають набухнути на протязі 30 хв. і потім розчинитися при повільному нагріванні на водяній бані при температурі (45+/-0,5 град. C). Установлюють pH 7,1+/-0,1, додаючи до розплавленого желатину 10 % розчин вуглекислого натрію. При більш лужній реакції желатин застигає погано, а іноді і зовсім не застигає. В 1 л розчиненого желатину вносять для просвітлення 2 збитих з невеликою кількістю дистильованої води яєчних білків. Суміш перемішують і прогрівають текучим паром на протязі 20 хв. до повного згортання білка і просвітління середовища. Потім середовище фільтрують в гарячому стані через паперовий або ватномарлевий фільтр з великою поверхнею. Середовище, розлите по 5-8 мл в пробірки, стерилізують роздрібнено 3 дні по годині текучим паром або одноразово під тиском 0,5 атм 20 хв. Після стерилізації середовище охолоджується погруженням пробірок в холодну воду в суворо вертикальному положенні, щоб верхня частина стовпчика при застиганні залишалась зовсім рівною.
6.4.3. Середовища для визначення декарбоксилаз і дигідролаз амінокислот.
Середовище пептонно-дріжджове:
Середовище із сухих компонентів може бути приготовлене в сухому вигляді.
Всі інгредієнти по прописі вищевказаного середовища розчиняють при нагріванні, встановлюють pH 6,4+/-0,1, потім додають відповідний індикатор і ділять середовище на 4 рівні частина. В одну частину амінокислоти не додаються, ця порція служить контролем. В останні порції вносять відповідно: в першу - 1 % лізину, в другу - 1 % орнітину, в третю - 1 % аргініну. Амінокислоти повинні бути в L-формі, якщо D-амінокислоти, то додають 2 %, так як мікроорганізми активні тільки по відношенню до L-форм. Після додання амінокислот перед стерилізацією, в випадку необхідності, реакцію середовищ виправляють 0,1 % розчином соляної кислоти. Середовище розливають по 1-2 мл в хімічно чисті стерильні пробірки і стерилізують під тиском 0,1-0,2 атм 20 хв. Невелика кількість флокулята в середовищах не має значення. Пептонно-дріжджове середовище має трав'янисто-зелений колір, при кислій реакції середовище жовтіє, при лужній - синіє.
6.4.4. Приготування індикаторних папірців для виявлення утворення індолу і сірководню:
а) полоски фільтрувального паперу змочують насиченим водним розчином щавлевої кислоти і висушують в термостаті;
б) полоски фільтрувального паперу змочують розчином оцетокислого свинцю. Підсушують на повітрі.
Полоски індикаторних папірців занурюють під корок пробірки з засіяною культурою. В випадку утворення індолу полоски "а" червоніють, а при утворенні сірководню полоски "б" чорніють.
7. Засіб відбору колоній вібріонів за допомогою стереоскопічного мікроскопу в косопрохідному світлі.
Принцип методу полягає в тому, що при перегляді колоній різних мікробів під малим збільшенням мікроскопу або лупи при освітленні їх пучком світла, який косо падає на поверхню агару, колонії набувають здатності світитися і здаються забарвленими.
До стереоскопічного мікроскопу МБС-2 або МБС-1 прилаштовують пристрій для одержання вузького пучка світла і дзеркало від мікроскопу на рухомому шарнірі для освітлення чашки знизу під кутом 45 град.
При величині кута падіння променя світла на поверхність агару в 40-50 град. колонії вібріонів по своєму забарвленню помітно відрізняються від інших мікроорганізмів, чашки з посівами проглядають після 12-18 годин інкубації. Обладнання для проглядання колоній в косопрохідному світлі.
1. Столик стереоскопічного мікроскопу МБС-1 або МБС-2 заміняють спеціальним приладом для освітлення чашки знизу під кутом 45 град. Джерелом світла є освітлювач від мікроскопу, на який одягають кожух з отвором діаметром 5 мм проти спіралі лампочки для одержання вузького пучка світла. Вузький пучок світла направляють в центр увігнутого дзеркала, яке переміщується на рухливому шарнірі поворотом гвинта в залежності від необхідності кута падіння світла. Кут вичисляють по відношенню відстані від дзеркала до чашки, яке міняється довільно, і відстань від чашки до поверхні стола, яка залишається незмінною.
Для зручності дослідження освітлювач і дзеркало можна вмонтувати в ящик із скляною кришкою, на яку поміщають чашку з посівом. Це дає можливість швидко находити необхідний кут падіння світла, пересуваючи дзеркало поворотом гвинта по вмонтованій шкалі.
Колір колоній, які виросли на лужному агарі при косому освітленні
2. Пристосування, змонтоване із основних вузлів стереоскопічного мікроскопу МБС-1 і приладу для рахування колоній. Із розтруба верхньої кришки прибору для відрахування колоній вилучити обидва скла разом з опорним кільцем і зняти верхню кришку. Із скоби передньої панелі вигвинтити вертикальну вісь, після чого вилучити диск із світлофільтрами. Звільнити два гвинти, які прикріплюють патрон лампочки освітлення до кронштейну на задній панелі. В кришку знизу вставити вертикальну штангу від вузла лупи з таким розрахунком, щоб в робочому положенні приладу муфта з притиснутим гвинтом була на дні під кронштейном імпульсного лічильника. В муфту зажати держак з вугловими губками (з комплекту лабораторного штативу), попередньо вкорочений до 110 мм. Держаком закріпити патрон з лампочкою в вертикальному положенні. Кришку фіксувати гвинтами на своєму звичному місці.
Штатив мікроскопу МБС-1 разом з бінокулярною насадкою відокремити від столика і встановити безпосередньо на корпус приладу для підрахунку колоній так, щоб 3 сферичні ніжки основи штативу охватили розтруб кришки приладу, а вікно основи було повернуте до дослідника. Підготовлені до проглядання чашки з посівами встановлюють над відкритим вікном. Потрібну освітленість і кут падіння світла находять зміною положення лампи, яке досягається поверненням штанги, після чого останню фіксують цанговим зажимом.
Організація лабораторних досліджень на холеру
1. Загальні питання
1.1. В системі протихолерних заходів лабораторні дослідження мають важливе значення тому що:
1.1.1. В значній мірі, тільки на підставі позитивного аналізу, ставиться клінічний діагноз.
1.1.2. Чим швидше буде поставлений діагноз, тим раніше почнеться проведення протиепідемічних заходів по виявленню джерела збудника інфекції та його ізоляції.
1.1.3. Виявлення збудника в навколишньому середовищі, дає змогу виявити механізм передачі збудника інфекції і, що особливо важливо, шляхи його розповсюдження.
1.2. Задачі лабораторної служби по діагностиці холери визначаються заходами по боротьбі з холерою відповідно епідемічній ситуації. Враховуючи суттєві особливості в роботі лабораторій, які здійснюють дослідження на холеру в різній епідемічній обстановці доцільно розрізняти період відносного епідемічного благополуччя і період вогнища холери.
1.3. Всі лабораторії, які здійснюють бактеріологічні дослідження на холеру розподіляються за рівнем досліджень:
1 рівень - районні, міські лабораторії санітарно-епідеміологічної служби та діагностичні лабораторії лікувально-профілактичних закладів, медико-санітарних частин, інфекційних стаціонарів;
2 рівень - лабораторії відділів особливо небезпечних інфекцій республіканських, обласних та міських санепідстанцій;
3 рівень - бактеріологічні лабораторії протичумних установ та особливо небезпечних інфекцій Українського центру санепіднагляду. Методичні прийоми, які використовуються в роботі визначаються рівнем лабораторії.
2. Робота бактеріологічних лабораторій у різні періоди епідемічної ситуації
2.1. Період відносного епідемічного благополуччя.
2.1.1. Епідемічна ситуація, що склалася з холери у світі, недостатня ефективність санітарно-карантинних заходів та формування вогнищ холери на території України свідчать про можливість заносу холери на будь-які території.
Тому головними задачами на цей період є своєчасне виявлення збудника холери серед :
- хворих на діареї;
- померлих від невідомих причин;
- українських громадян, які повернулись з-за кордону з наявністю дисфункції шлунково-кишкового тракту;
- іноземних громадян, які звернулись за медичною допомогою з приводу дисфункції шлунково-кишкового тракту;
- в об'єктах довкілля, з метою виявлення шляхів циркуляції та розповсюдження.
Лабораторні дослідження, які проводяться у цей період, регламентуються діючими директивними документами, обсяги досліджень передбачені для відповідного типу території України по епідемічним проявам холери.
2.1.2. Лабораторні дослідження на холеру проводять бактеріологічні та спеціалізовані лабораторії санепідстанцій, лікувально-профілактичних, відомчих та протичумних установ.
2.1.3. Забезпечення біологічної безпеки в лабораторіях, які проводять дослідження на холеру.
2.1.3.1. Бактеріологічні лабораторії 1 рівня можуть проводить діагностичні дослідження матеріалу на холеру від людей та з об'єктів довкілля у відповідності з регламентованими нормативними документами, якщо в них дотримується протиепідемічний режим роботи з мікроорганізмами III групи ризику та мають дозвіл на цю роботу.
2.1.3.2. Бактеріологічні лабораторії 2 рівня проводять діагностичні дослідження на холеру та ідентифікацію підозрілих культур по розширеній схемі, якщо в них дотримується протиепідемічний режим роботи з мікроорганізмами II групи та є дозвіл на цю роботу.
2.1.3.3. Бактеріологічні лабораторії 3 рівня проводять діагностичні дослідження на холеру та працюють з чистими культурами холерних вібріонів. Такі лабораторії повинні мати дозвіл на роботу з мікроорганізмами II групи патогенності та експериментальну роботу із збудниками холери.
2.1.3.4. Порядок видачі дозволу визначає Центральна режимна комісія Міністерства охорони здоров'я України.
2.1.3.5. Лабораторії усіх рівнів працюють з патогенними мікроорганізмами відповідно "Правил будівництва, техніки безпеки, виробничої санітарії та особистої гігієни при роботі в лабораторіях (відділеннях, відділах) санітарноепідеміологічних установ системи МОЗ СРСР (1981 р.), інструкції "Про протиепідемічний режим роботи з матеріалом, зараженим або підозрілим на зараження збудниками інфекційних захворювань I-II груп" (1970 р.), "Положення про порядок обліку, зберігання, відпуску та пересілки культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактерійної отрути біологічного походження" (1980 р.).
2.1.3.6. Чинні правила по біологічній безпеці повинні виконувати всі бактеріологічні лабораторії незалежно від відомчого підпорядкування на всій території України.
2.1.3.7. Державний санітарно-епідеміологічний нагляд за дотриманням правил біологічної безпеки здійснюється Центральною режимною комісією Міністерства охорони здоров'я України та територіальними санепідстанціями - на території, яку вони обслуговують.
2.1.4. Організація роботи в лабораторії.
2.1.4.1. Дослідження матеріалу на холеру від хворих гострими кишковими захворюваннями проводяться одночасно з дослідженнями на інші кишкові інфекції в одній лабораторії. При цьому кожний бактеріолог може виконувати одночасно як дослідження на холеру, так і на інші інфекції. При значній кількості досліджень на холеру може бути виділена окрема група спеціалістів.
2.1.4.2. Профілактичні дослідження на холеру проводяться на протязі робочого часу з використанням поживних середовищ з консервантами і з чергуванням за графіком.
2.1.4.3. Дослідження матеріалу від хворого з підозрою на холеру, або померлого від шлунково-кишкового захворювання проводиться на поживних середовищах без консервантів.
2.1.5. Дослідження матеріалу.
2.1.5.1. Планові лабораторні дослідження в основному проводять лабораторії 1 рівня. Такі ж дослідження, з метою контролю роботи підлеглих лабораторій, можуть проводити лабораторії 2 та 3 рівня.
2.1.5.2. Дослідження трупного матеріалу проводиться, як правило, в лабораторіях 2 рівня, в окремих випадках до цієї роботи залучаються лабораторії 1 рівня.
2.1.6. Обсяг дослідження.
2.1.6.1. Лабораторії 1 рівня вирішують наступні задачі:
- проводять лабораторні дослідження до встановлення негативного результату, або виділення культури з характерними для вібріонів ростом на агарових та полівуглеводних середовищах з позитивною реакцією на оксидазу. Перевіряють чистоту культури в мазку, пофарбованому по Граму, її рухливість, слайд аглютинацію з холерними видоспецифічними сироватками О1. RO в концентрації 1:50 - 1:100 та типоспецифічними сироватками Огава та Інаба - 1:50.
