Про удосконалення протихолерних заходів в Україні

Тяжка форма чи алгідна стадія характеризується розвитком ексикоза III ступеня (дефіцит маси тіла 10 і більше %). Діарея більше 15 разів на добу, блювота може бути нестримною, спрага може бути відсутня. Загальний стан погіршується. Дитина знаходиться в прострації. Нарастає синюшність шкірних покровів, риси обличчя загострюються, шкіра вкривається холодним липким потом (від латин. algus - холодний). Виникають судоми в ікроножних м'язах, в пальцях рук та ніг, а у дітей раннього віку - загальні судоми. При судомах діафрагми з'являється болюча ікота. Пульс ледве відчувається, тони серця глухі. АТ низький, різко знижена еластичність шкіри. Із-за різкого обезводнення можливий шум тертя перикарда (псевдоперикардит) і шум тертя плеври (псевдоплеврит). Олігурія може перейти в анурію. Із-за різкого дефіциту солей калія може розвинутися і динамічна кишкова непроходимість (стійкий парез кишечнику). Описані прояви розвиваються дуже швидко: стан алгіда іноді настає через 2-4 години від початку захворювання, іноді через 12-24 години і рідше в більш пізніші строки. Алгідна фаза при вірному лікуванні переходить в реактивну фазу - поступове покращання стану та відновлення діурезу. При відсутності адекватної терапії чи наявності неблагоприємного преморбідного стану, особливо у дітей раннього віку, настає асфіктична фаза. З'являються уремічний та азотемічний синдроми та летальний наслідок. В крові відмічається збільшення кількості еритроцитів до 7-8х10.12/л, лейкоцитів до 15-20х10.9/л та більше з палочкоядерним зсувом, збільшення індекса гематокріта до 60-70 %, тромбоцитопенія.

До атипових форм відносять гіпертоксичну, так звану суху холеру, а також стерті та субклінічні форми.

Суха холера виникає раптово. Поносу та блювоти немає, але відмічається парез кишечнику. Захворювання починається з асфіктичного періоду (цианоз, серцева недостатність, задишка, судоми). При розтині виявляється накопичення великої кількості рідини в кишечнику, яка внаслідок парезу останнього не могла бути виведена наружу. Клініка ендо- та екзотоксичного шоку.

Стерта форма. Кишкові розлади незначні. Перебіг абортивний. Стул 2-5 разів, іноді і більше, але кількість води в калових масах не значна, ознаки обезводнення відсутні.

Субклінічна - немає клініки, відмічається тільки приріст вібріоцидних антитіл.

Ускладнення. Специфічні ускладнення у дітей спостерігаються дуже рідко: гостра ниркова та серцево-судинна недостатність. Частіше ускладнення обумовлені приєднанням вторинної бактеріальної інфекції (пневмонія). У ослаблених дітей можуть спостерігатися абсцеси, флегмони різноманітної локалізації, сепсис, який в минулому був описаний як "холерний тифоід".

1. Гострий початок з появи рідкого стула. Випорожнення в перші години носять каловий характер, а потім приймають характер "рисового відвару". В тяжких випадках вони можуть приймати кров'янисте забарвлення по типу м'ясних помиїв.

2. У половини хворих можуть відмічатися приступоподібні болі в животі.

3. Блювота характерна тільки для тяжких форм холери. Часто вона розвивається після початку діареї. З'являється спрага, але випита рідина посилює блювоту.

4. Масивна втрата рідини протягом 1-4 годин призводить до обезводнювання, ступінь вираженості якого залежить від тяжкості захворювання. Швидко розвиваються порушення з боку нервової та серцевосудинної систем. Часто відмічаються судоми.

5. Температура тіла знижена до 35-36 град. C, з'являється олігурія. У дітей першого року життя холера починається з підвищення температури тіла.

6. У дітей першого року життя летальність при тяжких формах холери може досягати 15-20 %.

7. Часті комбінації холери з іншими кишковими інфекціями, що змінює клініку захворювання (приєднуються симптоми коліту, гемоколіту, інтоксикація).

8. У дітей частіше зустрічаються легкі та стерті форми холери, які характеризуються помірною кишковою дисфункцією та абортивним перебігом.

При призначенні патогенетичної терапії при холері у дітей слід враховувати слідуюче:

- в організмі дитини вміст води відносно більший, ніж у дорослих;

- у дитини має місце перевага позаклітинної рідини над внутрішньоклітинною з низьким процентом фіксованої рідини в інтерстіціальному просторі;

- в функціональному відношенні організм дитини бідний на воду. Значно більша поверхня, яка приходиться на одиницю маси тіла, обумовлює відповідно більший основний обмін, а також підвищене виведення сечі. Необратимі втрати води у дитини досягають 1/5 величини дорослої людини. Обмін рідини у дітей відбувається в 3-14 разів швидше. Для повного виділення рідини з позаклітинного простору дитині теоретично потребує 7 днів, а дорослому - 10 днів. Таким чином, шансів вижити у дитини менше;

- в перерахуванні на масу тіла діти раннього віку містять на 50 % більше натрію і на 20 % менше калію, ніж дорослі. Для дітей першого року життя характерний стан фізіологічної гіперосмолярності;

- у дітей відносно більша активність АТФ-ази та менший запас макроергів, тому в них швидше виснажуються натрійовий насос з втратою калія та має місце здатність до внутрішньоклітинного набряку;

- буферні системи, які забезпечують постійний КЛС у дітей менш ефективні, тому при виведенні продуктів обміну дитина втрачає більшу кількість води;

- враховуючи низьку концентраційну здатність нирок дитини, його організм не здатний швидко вивести натрій і хлор при їх надмірному введенні;

- функціональна здатність нирок у дітей формується в процесі розвитку з різною швидкістю. При цьому функція канальців відстає від функції клубочків, внаслідок чого діти з більшими труднощами компепсують втрати води;

- у дітей має місце схильність до розвитку гіпоглікемії, яка пов'язана з недостатнім визволенням глюкози з глікогена при підвищеній її периферійній потребі та недостатнім глюконеогенезом;

- витрата енергії значно вища, ніж у дорослих. Потреба в білках особливо підвищується при втраті кишкового секрету, запальних процесах в шлунковокишковому тракті;

- діти при холері з калом втрачають менше натрію, хлору, бікарбонатів та більше калію, ніж дорослі.

Лікування проводиться на основі патогенетичних механізмів холери та будується на відновленні водно-електролітного балансу організму.

Необхідно враховувати, що хворі на холеру підлягають обов'язковій госпіталізації до спеціалізованого інфекційного відділення, а з тяжкими тяжкими формами до реанімації. Хворі з підозрою на холеру повинні госпіталізуватися до провізорного госпіталю. Згідно рекомендації ВООЗ підозрілими на холеру є випадки у дітей старше 5 років з гострими кишковими захворюваннями, які супроводжуються тяжким обезводненням організму в результаті гострої водянистої діареї та рвоти чи у всіх пацієнтів більше 2-х років з гострою водянистою діареєю в місцях, де мають місце випадки холери.

Терапія хворого на холеру повинна розпочинатися негайно після госпіталізації. Але для правильного її проведення, по-перше, необхідна визначити ступінь обезводнення хворого, та зміни у електролітному балансі хворого. Для цього визначається вага хворого, вимірюються в крові рівень гематокріту, гемоглобіну, основних електролітів крові, глюкози, загального білка, альбумінів крові, по можливості, питома вага плазми крові, коагулограма, кислотно-лужний стан крові.

В разі неможливості скорого проведення необхідних лабораторних досліджень ступінь дегідратації визначають за клінічними даними. Важливіші критерії клінічної діагностики ступеня обезводнення представлені в таблиці 3.

Другим етапом перебування хворого на холеру в стаціонарі є проведення невідкладної регідратації з обов'зковим поточним контролем стану пацієнта, визначенням поточних втрат води та електролітів.

При проведенні регідратаційної терапії у дітей необхідно знати, що водно-сольові рідини, які використовуються у дорослих (трисоль, дісоль, хлосоль, ацесоль, розчин Рінгера, Філіпса, "Дакка") в дитячому віці краще не використовувати. Це обумовлено тим, що електролітний баланс цих розчинів не відповідає електролітному складу випорожнень дитини. Як правило, всі ці розчини вміщують в собі надлишок натрію, бікарбонатів, та недостатню кількість калію. Крім того, такий широко розповсюджений у нас в країні розчин як "Трісоль" вміщує 50 г глюкози, що є надлишком. При такому вмісту глюкози підвищується осмотичність розчину, що небажано у дітей. Крім цього, проведені нами дослідження вмісту глюкози в крові дітей, хворих на холеру, показали, що її рівень знаходиться в межах нормальних величин. Найбільш оптимальними за своїм складом для проведення регідратаційної терапії при холері у дітей є такі розчини як Рінгера-лактат, 5 % розчин декстрози на 0,45 % розчині хлориду натрію, розчин PCRS (Pediatric cholera replacement Solution).

Можливе в педіатричній практиці використання розчину "Квартасоль" (натрію хлорид - 4,75 г, калію хлорид - 1,5 г, натрію бікарбонат - 1,0 г, натрію ацетат 2,6 г). Але осмолярність цього розчину є також підвищеною, тому при проведенні регідратаційної терапії у дітей його необхідно розводити 5 % розчином декстрози на 0,45 % розчині натрію хлориду чи 5 % розчином глюкози в співвідношенні 1:1.

Широке застосування при лікуванні холери у дітей знаходить розчин Рінгера-лактат. Але він не придатний для тривалого використання, тому що також містить надлишок натрію. Якщо розчин Рінгера-лактат вводиться протягом декількох днів, то його кількість повинна бути на 25 % менше ніж об'єм патологічних втрат за предостанній інтервал. Ця різниця доповнюється пероральним введенням рідини, яка містить в 1 л води 20 г глюкози та 2,0 хлориду калію.

При використанні 5 % розчину декстрози на 0,45 % розчині хлориду натрію необхідно безпосередньо перед його введенням додати 32 мМ/л бікарбонату натрію. Ця рідина без врахування втрат калію близька до складу випорожнень дитини.

Розчин PCRS (в 1 л апірогенної води 2,5 хлориду натрію, 1,1 хлориду калію, 3,7 натрію ацетату, 0,05 хлориду кальцію, 0,04 г хлориду магнію) - розчин гіпотонічний, містить достатньо калію, а також такі необхідні мікроелементи як кальцій та магній. Перевагою розчину PCRS є також те, що він містить натрію ацетат, який легко стерилізується і може зберігатися в складних розчинах.

Згідно нашим дослідженням в 60 % випадків холери у дітей має місце зниження загального білка крові до 43-50 г/л. Це може бути пов'язано з підвищеними енергетичними затратами, відсутністю поступання білку з їжею, з втратами його через нирки (рівень білка у цих дітей в сечі становив 0,33- 0,99 г/л).

Враховуючи сказане, визначення рівня білка в крові у дітей з холерою є обов'язковим аналізом, і в разі його зниження для покриття енергетичних потреб організму, підвищення онкотичного тиску крові показано внутрішньовенне введення 5-10 % розчину альбуміну. При проведенні інфузійної терапії дітям з холерою необхідно враховувати, що іони калію швидко можуть переходити із клітин в судинне русло, що, по-перше, потребує визначення рівня калію як в плазмі так і в ерітроцитах не менше 4 разів на добу, а, по-друге, вводити хлорид калію в дозі не менше 5-6 мМ/кг на добу.

Враховуючи важливість іонів магнію для підтримки енергетичного балансу організму (участь в процесах гліколізу, окисного фосфорілювання), а також для регуляції активності мембранної АТФ-ази, транспорту калію в середину клітини, в перші три доби хворим з холерою показано введення 25 % розчину сульфату магнію в дозі 0,5-0,76 мМ/кг маси тіла (1 мл розчину містить 1 мМ магнію).

У новонароджених дітей оптимальним розчином для регідратаційної терапії при холері є суміш фізіологічного розчину з 5 % розчином глюкози у співвідношенні 1:1 під постійним контролем вмісту калію і натрію в крові.

Дітям з холерою при наявності ексикозу II та III ступеню внутрішньовенне введений рідини починають негайно. Для пацієнтів у віці до 1 року рідину вводять в долі 100 мл/кг маси тіла протягом 6 годин. В першу годину вводять 30 мл/кг маси тіла, а в наступні 5 годин 70 мл/кг маси тіла. Дітям у віці більше 1 року об'єм рідини, яка вводиться внутрішньовенно, складає 100 мл/кг маси тіла. В перші 30 хвилин вводять 30 мл/кг маси тіла, в наступні 2 години 30 хвилин вводять 70 мл/кг маси тіла. Після введення перших 30 мл/кг маси тіла необхідно перевірити стан гемодинаміки (наповнення пульсу, артеріальний тиск, стан мікроциркуляції). Якщо гемодинамічні розлади утримуються, то необхідно продовжити введення рідини протягом наступних 30 хвилин з тією ж швидкістю та призначити симпатоміметичну підтримку гемодинаміки допміном в дозі 1-3 мкг/кг/хв з наступним збільшенням її до 6 мкг/кг/хв, якщо первинна доза препарату не дає бажаного ефекту. У випадках, коли симпатоміметична підтримка неефективна, зберігаються гемодинамічні розлади, хворого необхідно перевести на штучну вентиляцію легень. На прикінці 3-6-ї години введення рідини необхідно повторно оцінити стан гемодинаміки. Слід пам'ятати, що при проведенні регідратаційної терапії на першому етапі можуть зрости втрати рідини з калом, блювотою. Тому протягом 3-6-ї години регідратації об'єм патологічних втрат необхідно додати до розрахованої кількості рідини. Якщо регідратація проведена правильно, то вага тіла досягає первинної, але ні в якому разі не повинна перевищувати її більш, ніж на 13 %. Другим етапом проведення регідратаційної терапії у дітей є етап відновлення поточних патологічних втрат, які враховуються кожні 4 години. При цьому, об'єм рідини, який втрачається з перспірацією та сечею розраховується як 75 мл/кг маси тіла на добу. Найбільш оптимальними розчинами для підтримуючої регідратації є розчин 5 % декстрози на 0,45 % розчині хлориду натрію та розчин PCRS.

Всі розчини підігрівають до 37-38 град C. Після припинення блювоти та при ексикозі I ступеня відновлення втрат рідини проводять оральним шляхом. Для цієї мети використовують глюкозо-сольові розчини для оральної регідратації (Таблиця 4).

* Використовуйте вік тільки у випадках, коли невідома вага хворого. Приблизний об'єм може бути розрахований шляхом перемноження ваги хворого (в кг) на коефіцієнт 75.

У випадках, коли у хворого немає ознак обезводнення, розчини для оральної регідратації дають в об'ємі 50-200 мл після кожного випорожнення.

При проведенні оральної регідратації стан хворого необхідно контролювати кожні 4 години.

Водно-сольова терапія хворим на холеру припиняється при появі випорожнень калового характеру, відсутності блювоти та перевищенні кількості сечі над випорожненнями на протязі 6-12 годин.

В періоді реконвалесценції при холері показано призначення солей калію (панангін, оротат калію).

Антибактеріальну терапію холери призначають після першого етапу регідратації, через 3-6 годин після госпіталізації. Препаратами вибору у дітей є еритроміцин, невіграмон, фуразолідон (ніфуроксазід), бісептол, які призначаються протягом 5 днів. Годування хворих на холеру починається зразу після припинення блювоти. Призначаються ті ж продукти, якими хворого годували до госпіталізації. Дітям старшого віку призначають харчові продукти багаті на вміст калію: печена картопля, курага, ізюм, банани.

Реконвалесцента холери виписують із стаціонару після клінічного видужання та 3-х негативних бактеріологічних досліджень випорожнень, проведених через 24-48 годин після закінчення антибактеріальної терапії. Реконвалесценти холери підлягають диспансерному нагляду протягом 3-х місяців. Контрольні бакобстеження проводять кожного місяця. При виявленні бактеріоносійства реконвалесцента госпіталізують.

В системі протихолерних заходів значне місце займають лабораторні методи дослідження, основним з яких є бактеріологічний.

Дослідження проводяться з метою:

- виявлення хворих на холеру і вібріоносіїв ;

- встановлення заключного діагнозу при розтині померлих від ГКЗ і підозрілих на холеру захворювань;

- контроль за ефективністю лікування хворих на холеру і вібріононосіїв;

- контроль за забрудненням об'єктів довкілля;

- підозрілих на холеру захворювань;

- виявлення джерел і факторів передачі інфекції.

Серологічні методи досліджень, як правило, мають допоміжне значення і тільки в окремих випадках результати їх можуть бути вирішальними для ретроспективної діагностики захворювання або вібріононосійства.

Для бактеріологічного аналізу можуть бути використані:

- матеріал від людей (випорожнення, блювотні маси, жовч, трупний матеріал та ін.);

- проби із об'єктів довкілля (вода: питна, поверхневих водоймищ, стічна; мул, гідробіонти, предмети забруднені випорожненнями, змиви з об'єктів довкілля, харчові продукти та ін.).

1. Забір матеріалу на дослідження від людей

1.1. Матеріал забирають:

- від хворого - медичний персонал лікувально-профілактичних закладів (ЛПЗ) негайно після виявлення і до початку лікування антибіотиками;

- при обстеженні на вібріононосійство в ЛПЗ, при масових обстеженнях медичний персонал ЛПЗ;

- при обстеженні вогнищ - помічники епідеміологів;

- трупний матеріал - паталогоанатоми і судмедексперти в спеціалізованих закладах.

1.1.1. Для відбору проб використовують чистий стерильний посуд, який не має слідів дезинфікуючих розчинів. В ємкості (горшки, судна і ін.) підкладають чашки Петрі або вощаний папір, щоб уникнути контакту досліджуваного матеріалу з посудом, який оброблявся дезрозчином. Використані алюмінієві петлі знезаражуються тільки кип'ятінням в 2 % розчині соди протягом 15-30 хв. з подальшим миттям і стерилізацією.

1.1.2. В залежності від конкретних завдань і умов матеріал може бути направлений в лабораторію:

- в нативному вигляді;

- в 5 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 (транспортне середовище);

- в 10-50 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 або pH 9,3+/-0,2 (1-е середовище збагачення);

- в 10-50 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 з консервантом - телуріту калію, препарат "Прогрес" та ін. (1-е середовище збагачення).

Варіанти відбору та доставки матеріалу.

На флаконах, пробірках з 1 % пептонною водою, чашках з лужним агаром, які передаються в ЛПЗ для відбору проб, повинні бути зазначені назва середовища і дата виготовлення. В ЛПЗ пептонну 1 воду для відбору проб рекомендується зберігати не більше 7 діб при температурі не вище 10 град. C при умові збереження прозорості середовища, для середовищ з телурітом калію - не більше 2 діб, лужного агару - не більше 5 діб.

1.1.3. Від хворих з підозрою на холеру і тяжкими формами гастроентеритів, ентеритів, гастроентероколітів в лабораторію направляють:

- нативний матеріал;

- посів матеріалу в 50 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2.

При багаторазовому відборі матеріалу проміжки між відборами визначаються лікарем-інфекціоністом в залежності від стану хворого.

1.1.4. Від хворих ГКЗ, контактних і на вібріононосійство - посів матеріалу на середовище збагачення, транспортне середовище або середовище з консервантом.

1.1.5. Обстеження перехворілих, вібріононосіїв перед випискою із стаціонару проводиться не раніше 24 годин після закінчення лікування антибіотиками трикратно з добовим інтервалом. У осіб, що відносяться до груп ризику (декретовані та інші контингенти), досліджують жовч одноразово.

1.1.6. При диспансерному нагляді за перехворілими холерою, вібріоносіями матеріал забирають протягом першого місяця один раз в 10 днів (перший раз обов'язково з використанням послаблюючих засобів), а потім щомісяця, на період спостереження.

1.2. Засоби відбору проб.

1.2.1. Випорожнення, блювотні маси, промивні води в кількості 10-20 мл стерильними ложками переносять в стерильний скляний посуд.

1.2.2. Жовч беруть при дуоденальному зондуванні в лікувальній установі. В окремі пробірки збирають дві порції із жовчного міхура і жовчних протоків (проби B і C).

Ректальний:

1.2.3. Стерильний тампон вводять в пряму кишку на глибину 5-6 см, збирають вміст із стінок кишечнику і вносять у флакон або пробірку з 1 % пептонною водою. Дерев'яний стрижень використовують одноразово.

1.2.4. Стерильну алюмінієву петлю змочують стерильним фізіологічним розчином або 1 % пептонною водою, вводять в пряму кишку на 8-10 см і переносять забраний матеріал у флакон або пробірку з 1 % пептонною водою.

1.2.5. Від померлих з підозрою на холеру беруть 3 відрізки тонкого кишечника довжиною близько 10 см кожен, які вирізають між двійними лігатурами, що накладені на два кінці ділянки кишечнику. Жовчний міхур після перев'язки протока забирають цілком. Забрані взірці (ділянки верхньої, середньої і нижньої частин кишечника і жовчний міхур) поміщають окремо в стерильні банки.

2. Відбір проб із об'єктів довкілля.

2.1. Воду (питну, із поверхневих водоймищ та ін.) для дослідження беруть в кількості 1 л на одну пробу у двох об'ємах по 500 мл в стерильний посуд з непромокаючими пробками. При збільшенні обсягу досліджень (епідускладнення, проведення масових досліджень, збільшення кратності і точок забору проб на обмеженій території - пляж, водозабір та ін.) допускається відбір проб води в обсязі 100-500 мл. З водопровідних кранів забір проб води проводиться після попереднього обпалювання їх спиртовим факелом і спуску води протягом 10 хвилин при повному відкритті крану.

2.2. Господарсько-побутові стічні води забирають на дослідження одним з двох методів: в об'ємі 1 л в двох ємкостях по 500 мл або тампонами, виготовленими із марлевих серветок розміром 10х15 см у 10-15 шарів. Останні закріплюють в місцях забору води, через добу кладуть в стерильну банку і доставляють в лабораторію.

2.3. Гідробіонти (риб, жаб та ін.) відловлюють із водоймищ будь-яким методом і в закритих банках, відрах або інших ємкостях доставляють в лабораторію. Малі екземпляри досліджують груповим методом, в одну пробу об'єднують вміст кишечнику, жабр від 10-15 екземплярів, які відловлені на одній ділянці водоймища. В цьому випадку вони можуть бути доставлені в одній ємкості.

2.4. Змиви з різних об'єктів довкілля у вогнищі і за показаннями беруть ватним або марлевим тампоном, змоченим в 1 % пептонній воді, з поверхні 0,5х0,5 м^2. Тампон вміщують у флакон або пробірку з 1 % пептонною водою.

2.5. Залишки харчових продуктів у вогнищі і харчові продукти за показаннями забирають в кількості 200 г твердих і 0,5 л рідких, вміщують у скляний посуд і закривають.

3. Доставка матеріалу на дослідження в лабораторію.

3.1. Банки, пробірки, флакони та ін. ємкості з матеріалом надписують, кладуть у бікс або іншу металеву тару і транспортують і на службовому транспорті з супроводжуючим. Направлення не повинні знаходитись в транспортній тарі з досліджувальним матеріалом.

3.2. Термін доставки проб в лабораторію залежить від виду матеріалу, часу забору і режиму роботи лабораторії (додаток 1).

4. Порядок дослідження.

При бактеріологічному дослідженні на холеру використовують різні поживні середовища: рідкі середовища збагачення, лужний агар, елективні, диференціально-діагностичні середовища і набір середовищ для ідентифікації.

Поживні середовища, діагностичні препарати, які використовуються для діагностики холери, повинні бути зареєстровані і дозволені до використання Комітетом по імунобіологічним препаратам МОЗ України.

Виготовлені в лабораторії поживні середовища, консерванти, інгібітори сторонньої мікрофлори, які використовуються для діагностики холери, підлягають бактеріологічному контролю.

Посіви досліджуваного матеріалу на різних етапах вирощуються при 37 град.C в 1 % пептонній воді з pH 7,8+/-0,2 - 6-8 годин, з pH 9,3+/-0,2 - не менше 14 годин, а в 1 % пептонній воді з телурітом калію - 12-18 годин, на лужному агарі - не менше 14-16 годин, на інших елективних середовищах - 18-24 години.

pH основного пептону і 1 % пептонної води встановлюється тільки на іономірі. Використання індикаторних папірців не допускається.

Телуріт калію слід додавати в 1 % пептонну воду до внесення в неї досліджуваного матеріалу. Термін зберігання робочого розчину телуріту калію (1:1000) - 7 діб, а поживних середовищ з телурітом калію - не більше 2 діб при умові зберігання їх в холодильнику. Використання середовищ з консервантами допускається тільки один раз (1-е або 2-е середовище збагачення).

4.1. Дослідження матеріалу від людей (трупів).

I етап

а) випорожнення, блювотні маси, промивні води, жовч - від хворих; вміст кишечнику жовчного міхура і суспензію шматочків слизової кишечнику - від трупів засівають у 10-50 мл 1 % пептонної води;

б) при дослідженні нативного матеріалу від хворих з підозрою на холеру, трупного матеріалу:

- використовується тільки 1 % пептонна вода з pH 7,8+/-0,2;

- проводиться прямий посів на тверде елективне середовище;

- застосовуються експрес-методи дослідження: імунофлюоресцентний та реакція непрямої гемаглютинації (РНГА);

в) матеріал, що відібрано в 10-50 мл 1 % пептонної води (1-е середовище збагачення), інкубують при температурі 37 град. C в інфекційному відділенні і/або лабораторії 6-8 годин сумарно при pH 7,8+/-0,2; 14-20 годин при pH 9,3+/-0,2 (в вихідні і святкові дні до 48 годин);

г) матеріал, відібраний в 5 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 (транспортне середовище), зберігається при кімнатній температурі не більше 24 годин, після надходження до лабораторії засівають в 50 мл 1 % пептонної води pH 7,8+/-0,2 або 9,3+/-0,2 у повному об'ємі (1-е середовище збагачення).

II етап

Висів з 1-го середовища збагачення проводиться на лужний агар або інші елективні середовище і в 5-8 мл 2-го середовища збагачення. Пересіви в рідкі і на тверді середовища проводять з поверхні рідкого середовища великою бактеріологічною петлею діаметром 5 мм.

III етап

Висів з 2-го середовища збагачення проводять на лужний агар або інші елективні середовища через 5-6 годин при pH 7,8+/-0,2 і через 14-20 годин при pH 9,3+/-0,2.

IV етап

Відбір підозрілих на холерний вібріон колоній з твердих поживних середовищ проводиться через 16-24 години інкубації посівів.

Переглядають чашки з посівами в проходячому світлі неозброєним оком, за допомогою лупи, під стереоскопічним мікроскопом в косопроходячому світлі і відбирають підозрілі колонії для виділення та ідентифікації.

Колонії холерних вібріонів в типовій S-формі на лужному агарі круглі, гладкі, плоскі, голубуваті, гомогенні з рівними краями, прозорі в проходячому світлі і сіро-голубі під стереоскопічним мікроскопом. Колонії на елективному середовищі TCBS мають яскраво жовте забарвлення на зеленому фоні середовища, напівпрозорі. На середовищі Монсур колонії без кольору, напівпрозорі з темним центром. Розміри колоній через 10-12 годин інкубації в основному не перевищують 1 мм; а до 18-24 годин інкубації досягають 2-3 мм в діаметрі.

В окремих випадках в посівах можуть також зустрічатися атипові колонії: мутні з щільним центром, пігментовані (коричневі або світло-жовті), дрібні, кокоподібні, шерехуваті.

При відборі колоній можна використовувати пробу на індофенолоксидазу з однокомпонентним реактивом (без альфа-нафтолу) або індикаторні паперці (СІП-1 - набір для ідентифікації вібріонів). Колонії відсівають негайно після появлення позитивної реакції. З колоніями, які виросли на елективних середовищах, не рекомендується ставити пробу на оксидазу.

Оксидазопозитивні колонії перевіряють в реакції аглютинації на склі (далі "слайд-аглютинація") з сироваткою холерною 01, RO в розведенні 1:100. При позитивній реакції і достатній кількості підозрілих колоній ставлять слайд-аглютинацію з варіантоспецифічними сироватками Інаба і Огава в розведенні 1:50, готують мазки для фарбування по Граму і оброблення люмінісцентною сироваткою.

Позитивна орієнтовна реакція аглютинації з холерною 01 або RO сироватками в розведенні 1:100 і варіантоспеціфічними в розведенні 1:50 або позитивна реакція з люмінісцентними антитілами в поєднанні з морфологічними, культуральними ознаками і специфічною імобілізацією дозволяють видати на відповідному етапі попередню відповідь про виявлення в досліджуваному матеріалі холерного вібріона 01.

Підозрілі на вібріони колонії, що аглютинуються і не аглютинуються холерними 01, RO сироватками, відсівають на одне із полівуглеводних середовищ (лактозо-сахарозне, Ресселя, Кліглера або ін.) і на сектор пластинки лужного агару для виділення чистої культури та її ідентифікації.

V етап

Ідентифікація. Відбирають культури з типовим для вібріонів характером росту на полівуглеводних середовищах:

- на двувуглеводних середовищах (лактозо-сахарозному, глюкозолактозному) спостерігається характерна для кислої реакції зміна кольору стовпчика при збереженні кольору скошеної частини без утворення газу;

- тривуглеводне середовище Кліглера повністю жовтіє без утворення газу і сірководню.

Культури, які виросли на лужному агарі, перевіряють на наявність індофенолоксидази. Визначають морфологію мікроорганізмів і чистоту відібраних по цих ознаках культур, які виросли на лужному агарі і полівуглеводних середовищах за допомогою мазків, пофарбованих по Граму.

Культури, які дали характерні зміни на полівуглеводних середовищах і позитивні в пробі на оксидазу, перевіряють в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01, RO, Інаба і Огава. При негативних результатах з цими сироватками, ставлять слайд- аглютинацію з холерною сироваткою 0139.

На основі позитивних результатів аглютинації з сироватками 01 серогрупи (01, Інаба, Огава) видають попередню або остаточну позитивну відповідь про виділення із досліджуваного матеріалу культури холерного вібріону 01 відповідного серовару.

Якщо виділена культура реагує з холерною сироваткою 0139 при негативних результатах з сироватками 01 серогрупи, видають відповідь про виділення холерного вібріону 0139 серогрупи.

Проводять ідентифікацію виділених на полівуглеводних середовищах або на лужному агарі, які аглютинуються і не аглютинуються сироватками 01 і 0139 серогруп оксидазопозитивних культур по скороченій або повній схемі.

VI етап

Враховують результати ідентифікації і видають остаточну відповідь про виділення культури холерного вібріону відповідної серогрупи: 01, RO (Інаба, Огава, Гікошима) або 0139 з зазначенням гемолітичної активності, чутливості до антибіотиків. Для культур холерних вібріонів 01 вказують належність до біовару.

При виділенні від хворого або вібріононосія культури холерного вібріону, яка не аглютинується з сироватками, видають відповідь про виділення холерних вібріонів не 01 (так званих НАГ-вібріонів). При наявності вібріонних аглютинуючих діагностичних сироваток визначають належність до інших серогруп.

4.2. Дослідження матеріалу з об'єктів довкілля.

Етапи дослідження об'єктів довкілля відрізняються від схеми дослідження матеріалу від хворих тільки на I етапі. II-VI етапи подані в розділі 4.1.

4.2.1. Вода поверхневих водоймищ, водопровідна і господарсько-побутові стічні води.

В залежності від часу доставки проби можливі варіанти посівів з метою первинного збагачення вібріонів:

а) до води, що досліджується, додають розчин основного пептону до 1 % концентрації.

Визначають pH, в випадку необхідності підлужують 10 % розчином їдкого натрію до pH 8,3+/-0,1. Аналіз проби (1 л) проводять у двох об'ємах по 500 мл. Час інкубації в таких об'ємах - 8-10 годин, II середовище збагачення - в об'ємі 10 мл. Час інкубації в 1 % пептонній воді без телуріту калію pH 7,8+/-0,2 5-6 годин, з підвищенням лужністю або з телурітом калію - 14-20 годин.

б) в досліджувану воду (в двох об'ємах по 500 мл) додають розчин основного пептону до 1 % концентрації, встановлюють pH 9,3+/-0,2 або додають телуріт калію із робочого розведення 1:1000 до концентрації 1:100000 або 1:200000 у відповідності з даними перевірки, pH 8,3+/-0,1. Час інкубації 18-24 години; II середовище збагачення - 10 мл 1 % пептонної води, pH 7,8+/-0,2 без телуріту калію, час інкубації 6-8 годин.

в) після установлення лужної реакції і додання розчину основного пептону до 1 % концентрації проби зберігають при кімнатній температурі до ранку (1-е середовище збагачення). На початку наступного дня засівають 5 мл поверхневого шару в 100 мл 1 % пептонної води (II середовище збагачення) і роблять висів на лужний агар; висіви з II середовища збагачення через 6 годин інкубації.

г) воду фільтрують через мембранні фільтри N 2 або 3, змив з яких засівають в середовище збагачення та на агарові пластинки. Із змиву з фільтру можна робити мазки для фарбування холерною люмінісцентною сироваткою, а також ставити РНГА та інші реакції.

При інтенсивному бактеріальному забрудненні проб можливе використання III середовища збагачення.

При заборі стічних вод марлевими тампонами останні кладуть в широкогорлі колби або банки з 1 % пептонною водою (500 мл).

4.2.2. Гідробіонти.

Жабу безпосередньо перед дослідженням знедвижують уколом голки в спинний мозок. Тварину фіксують за лапки на препарувальній дошці черевом догори. Поверхню живота обробляють спиртом, ножицями роблять медіальний розріз від анального отвору до грудної порожнини. Пінцетом беруть жовчний міхур, відсікають від печінки, розрізають стерильними ножицями і роблять відбиток на пластинці лужного агару. Решту жовчі разом з жовчним міхуром кладуть у флакони з 50-100 мл 1 % пептонної води (1-е середовище збагачення). Стерильними ножицями розрізають шлунок, вміст якого засівають в 1 % пептонну воду, а внутрішньою поверхнею стінки роблять відбитки на агарові пластинки. Посів матеріалу кишечника роблять таким же чином, відсікаючи декілька петель ножицями в верхньому, середньому та нижньому відділах кишечника.

У великих риб в тому ж порядку засівають в 1 % пептонну воду жабри, вміст жовчного міхура, шлунку, кишечника. Дрібних риб (мальків) подрібнюють ножицями по 10-20 екз. в одній пробі і роблять посів суспензії петлею на чашку з агаром і в 1 % пептонну воду.

Дафній і рачків розтирають у ступці і засівають петлею в 1 % пептонну воду. У раків досліджують кишечник, посів вмісту проводять в середовище збагачення, а з слизистої - відбиток на агарове середовище.

4.2.3. Харчові продукти.

4.2.3.1. Безалкогольні напої досліджують тим же методом, що і воду.

4.2.3.2. Молоко в кількості 5 мл засівають в 50-100 мл 1 % пептонної води або до 0,5 л молока додають основний розчин пептону до 1 % його концентрації. Інші молочні продукти (кефір, сметану, сир, морозиво та ін.) в кількості 5-10 мл засівають в 1 % пептонну воду.

4.2.3.3. Тверді харчові продукти подрібнюють і розтирають в ступці з фізіологічним розчином і засівають в кількості 10 г в 100 мл 1 % пептонної води та на агарові середовища.

4.2.3.4. Масло засівають в 1 % пептонну воду - рідке середовище збагачення в кількості 5-10 г, пом'якшивши його в термостаті, або проводять посів змиву з поверхні його кусків. Після посіву продукту встановлюють pH середовища 8,3+/-0,1.

4.2.4. Змиви з об'єктів довкілля та мух засівають в 1 % пептонну воду і досліджують по звичайній схемі.

4.3. Ідентифікація культур холерних вібріонів.

4.3.1. Культури, виділені на різних етапах, ідентифікують з метою визначення їх належності до виду Vibrio cholerae відповідної серогрупи (01, 0139 або інших).

4.3.2. До виду V.cholerae відносять грамнегативні, аспорогенні, поліморфні палички, злегка зігнуті або прямі, активно рухливі, з одним полярно розташованим джгутиком, які утворюють індофенолоксидазу, ферментують глюкозу в аеробних і анаеробних умовах до кислоти (без газу), декарбоксилізують: лізин і орнітин, але не мають дигідролази аргініну, відносяться до 1-ї (рідше до 2-ї) ферментативної групи по Хейбергу. Таксономічне положення холерних вібріонів і ознаки, які відрізняють їх від родинних мікроорганізмів, наведені в таблицях 5-7.

4.3.3. Збудниками холери є V.cholerae серогрупи 01 (біоварів холери ельтор; сероварів Інаба, Огава і Гікошима) і 0139 серогрупи.

4.3.4. Токсигенні (які містять ген холерного токсину - vct+/-) варіанти холерних вібріонів 01 і 0139 серогруп викликають захворювання холерою, які схильні до широкого епідемічного розповсюдження.

Умовні позначення: I та II - середовища збагачення; ЛА - лужниний агар; ЕС - елективне середовище; ОП - оксизазна проба; ОРА - орієнтовна реакція аглютинації; АГ - аглютинація; Ф-П - рекція Фогес-Проскауера на визначення ацетиметилкарбінолу; ж - у випадку застосування для відбору колоній ПВС або ЛА; ПВС - полівуглеводне середовище

4.3.5. Нетоксигенні (які не містять ген холерного токсину vct-) варіанти холерних вібріонів 01 та інших серогруп можуть викликати спорадичні (поодинокі) або групові захворювання (при спільному джерелі інфікування), які не схильні до широкого епідемічного розповсюдження.

4.3.6. Попередню ідентифікацію проводять по комплексу ознак, включаючи морфологію колоній, морфологію і рухливість мікробних клітин, пробу на оксидазу і аглютинацію на склі (слайд-аглютинація) з сироватками 01 (1:100), RO (1:50) і 0139 (в розведенні, відповідно позначенню на етикетці). Для культур, які позитивно реагують з сироваткою 01, RO, встановлюють належність до серологічного варіанту (Інаба і Огава) також в слайд-аглютинації.

4.3.7. Остаточну ідентифікацію виділених на полівуглеводному середовищі або лужному агарі культур, які аглютинуються на склі, проводять по скороченій або повній схемі.

4.3.7.1. Скорочена ідентифікація передбачає вивчення культури в розгорнутій реакції аглютинації з холерними сироватками 01, Інаба, Огава і RO, визначення чутливості до діагностичних монофагів належність до біохімічної групи Хейберга. Культури, які аглютинуються не менше ніж до 1/2 титра сироватками 01 і однією із варіантоспецифічних сироваток, відносяться до V.cholerae 01 серовара Огава або Інаба. Культури, які аглютинуються сироватками обох сероварів не менше 1/2 титра, відносять до серовару Гікошима.

Для підтвердження виділеної культури холерних вібріонів до 0139 серогрупи досить позитивного результату в слайд-аглютинації з відповідною сироваткою.

4.3.7.2. При проведенні масових досліджень у вогнищі захворювання холерою, коли перші культури холерних вібріонів вже були ідентифіковані, позитивні результати тестування в слайд-аглютинації з холерними сироватками 01 або 0139 серогруп у поєднанні з морфологією і рухомістю клітин культур, виділених від хворих діареями або при обслідуванні на вібріоносійство, слід вважати остаточними для вирішення питання про проведення протиепідемічних заходів.