| | | | | | |(23-27 днів)| | |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Gadus morhua | 5 +- 1 | 5-30 | 12 | 14-16 | 3-5 |Якнайшвидше | 60 | 80 |
|Тріска | | | | | |після | | |
| | | | | | |запліднення | | |
| | | | | | |(рання | | |
| | | | | | |стадія | | |
| | | | | | |гаструли), | | |
| | | | | | |до 3 днів | | |
| | | | | | |після | | |
| | | | | | |вилуплення | | |
| | | | | | |(18 днів) | | |
|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|
|Cyprinodon | 25 +- 1 | 15-30 | 12 | - | - |Якнайшвидше | > 75 | 80 |
|variegatus | | | | | |після | | |
|Мінливий | | | | | |запліднення | | |
|карпозубик | | | | | |(рання | | |
| | | | | | |стадія | | |
| | | | | | |гаструли), | | |
| | | | | | |до 4/7 днів | | |
| | | | | | |після | | |
| | | | | | |вилуплення | | |
| | | | | | |(28 днів) | | |
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Доповнення 4
ДЕЯКІ ХІМІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИЙНЯТНОЇ РОЗЧИННОЇ ВОДИ
------------------------------------------------------------------
| Речовина |Концентрація|
|---------------------------------------------------+------------|
|Тверді частинки | < 20 мг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст органічного вуглецю | < 2 мг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Неіонізований аміак | < 1 мкг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Залишковий хлор | < 10 мкг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст фосфорорганічних пестицидів | < 50 нг/л |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст хлорорганічних пестицидів плюс | < 50 нг/л |
|поліхлорбіфеніли | |
|---------------------------------------------------+------------|
|Загальний вміст органічного хлору | < 25 нг/л |
------------------------------------------------------------------
C.16. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ
ПЕРОРАЛЬНУ ТОКСИЧНІСТЬ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження на гостру токсичність є аналогомдослідження ОЕСР TG 213 (1998).
1.1. ВСТУП
Це дослідження на токсичність є лабораторним методом,призначеним для оцінки гострої пероральної токсичності продуктівзахисту рослин та інших хімічних речовин для дорослих робочихмедоносних бджіл.
При оцінці токсичних характеристик речовин може бутинеобхідним визначення їх гострої пероральної токсичності длямедоносних бджіл, наприклад, коли існує ймовірність потрапляннябджіл у середовище з певною хімічною речовиною. Дослідження нагостру пероральну токсичність проводиться для визначеннятоксичності, притаманної пестицидам та іншим хімічним речовинам,для бджіл. Результати цього дослідження використовуються длявизначення необхідності проведення подальших досліджень. Зокрема,цей метод може використовуватися у комплексних програмах оцінкинебезпеки пестицидів для бджіл з послідовним переходом відлабораторних досліджень на токсичність до напів-польових тапольових експериментів (1). Пестициди можуть досліджуватися як засвоїми активними речовинами, так і як складені продукти.
Для перевірки чутливості бджіл та точності процедуридослідження використовуються стандарти токсичності.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Гостра пероральна токсичність: негативні ефекти, щопроявляються протягом максимального періоду, який складає96 годин, після перорального введення однієї дози дослідноїречовини.
Доза: обсяг спожитої дослідної речовини. Доза виражається якмаса (мкг) дослідної речовини на одну піддослідну тварину(мкг/бджолу). Реальна доза для кожної бджоли не може бутирозрахована, оскільки бджоли годуються разом, натомість оцінюєтьсясередня доза (загальна кількість спожитої дослідної речовини накількість піддослідних бджіл у одній клітці).
LD (середня летальна доза), пероральна: статистично 50розрахована доза прийнятої перорально речовини, яка можеспричинити смерть 50% тварин. Значення LD виражається у мкг
50
дослідної речовини на бджолу. Для пестицидів дослідна речовина
може бути або активною речовиною, або складеним продуктом, який
містить одну або більше активних речовин.
Смертність: тварина вважається мертвою, якщо вона повністюнерухома.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дорослі робочі медоносні бджоли (Apis mellifera) піддаютьсявпливу низки доз дослідної речовини, розчиненої в розчині цукрози.Потім бджоли одержують таку ж дієту без дослідної речовини.Смертність фіксується щоденно протягом принаймні 48 годин іпорівнюється з контролем. Якщо рівень смертності збільшується вперіод між 24 та 48 годинами, тоді як у контролі смертністьлишається на прийнятному рівні, тобто <= 10%, доцільно продовжититривалість дослідження до максимум 96 годин. Для розрахунку LD
50
результати аналізуються станом на 24 годину та 48 годину, а якщо
тривалість дослідження була продовжена, то станом на 72 годину і
на 96 годину.
1.4. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Достовірність дослідження підтверджується такими умовами:
- на кінець дослідження середня смертність у контролі неперевищує 10% від загальної кількості бджіл у контролі;
- LD стандарту токсичності перебуває у встановлених межах. 50
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Збирання бджіл
Для дослідження використовуються молоді робочі бджоли однієїраси, тобто бджоли одного віку, харчового статусу тощо.Відбираються бджоли, які адекватно харчувалися, здорові, ізблагополучних і керованих королевою колоній з відомою історією тафізіологічним станом. Бджоли можуть збиратися вранці в деньдослідження або ввечері напередодні дослідження і утримуватися донаступного дня в умовах дослідження. Підходять бджоли, відібрані зрамок, без наприску. Потрібно уникати збирання бджіл ранньоювесною або пізньою осінню, оскільки в цей час у бджіл відбуваютьсяфізіологічні зміни. Якщо дослідження потрібно провести ранньоювесною або пізньою осінню, бджіл можна помістити в інкубатор іпротягом одного тижня годувати "бджолиним хлібом" (пилком,відібраним із стільників) і розчином цукрози. Бджіл, яких лікувалихімічними речовинами, такими як антибіотики, противаротозніпрепарати тощо, використовувати для дослідження на токсичність неможна протягом чотирьох тижнів після закінчення останньоголікування.
1.5.2. Умови утримання і годування
Використовуються легкі в прибиранні та добре вентильованіклітки. Можуть використовуватися клітки, виготовлені з будь-якогоприйнятного матеріалу, наприклад, нержавіючої сталі, дротяноїсітки, пластику або ж одноразові дерев'яні клітки тощо. Бажано водній клітці розміщувати групу з 10 бджіл. Розмір дослідних клітокповинен відповідати кількості бджіл, тобто забезпечувати достатньомісця для їх розміщення.
Бджоли утримуються у темряві в експериментальній кімнаті притемпературі 25 +- 2 град.C. Відносна вологість, зазвичай, повиннастановити близько 50-70% і повинна фіксуватися протягом усьогодослідження. Робота з бджолами, включаючи догляд за ними тапроведення спостережень, може виконуватися при (денному) світлі.Для годування бджіл використовується водний розчин цукрози зкінцевою концентрацією 500 г/л (співвідношення ваги і об'єму 50%).Після застосування дослідних доз годування здійснюється безобмежень. Система подачі корму повинна дозволяти проводитифіксацію прийому їжі для кожної клітки (див. Секцію 1.6.3.1).Можна використовувати скляну трубку довжиною приблизно 50 мм ішириною приблизно 10 мм, відкритий кінчик якої звужений додіаметру приблизно 2 мм.
1.5.3. Підготовка бджіл
Зібрані бджоли довільно розміщуються по дослідних клітках,які довільно розташовуються в експериментальній кімнаті.
Бджоли можуть бути позбавлені їжі за 2 години до початкудослідження. Рекомендується позбавляти бджіл їжі, щоб вони малиоднаковий стан наповнення кишечника до початку дослідження. Передпочатком дослідження вмираючі бджоли повинні бути вилучені ізамінені здоровими.
1.5.4. Підготовка доз
Якщо дослідна речовина є сполукою, розчинною у воді, її можнарозчинити безпосередньо в 50% розчині цукрози. Для технічнихпродуктів та речовин з низькою розчинністю у воді можнавикористовувати такі реагенти, як органічні розчинники,емульгатори або диспергатори з низькою токсичністю (наприклад,ацетон, диметилформамід, диметилсульфоксид). Концентрація реагентузалежить від розчинності дослідної речовини і повинна бутиоднаковою для всіх дослідних концентрацій. Однак, прийнятнаконцентрація реагенту, яка не повинна перевищуватися, складає 1%.
Потрібно підготувати відповідні контрольні розчини. Тобто,якщо для розчинення дослідної речовини необхідне використаннярозчинника або диспергатора, потрібно створити два контролі:водний розчин і розчин цукрози з додаванням розчинника/реагенту зтакою концентрацією, яка відповідає дослідним розчинам.
1.6. ПРОЦЕДУРА
1.6.1. Дослідні та контрольні групи
Кількість дослідних доз та реплікацій повинна відповідатистатистичним вимогам для визначення LD з 95% довірчим
50
інтервалом. Зазвичай для проведення дослідження достатнім є
використання п'яти доз в геометричній прогресії з множником не
більше 2,2, які б охоплювали необхідний для LD діапазон. Однак,
50
потрібно визначити коефіцієнт розрідження та кількість
концентрацій для підготовки доз залежно від нахилу кривої
токсичності (відношення дози та смертності) та з урахуванням
статистичного методу, вибраного для аналізу результатів. Необхідні
концентрації можна визначити за допомогою діапазонного
дослідження.
Дозу кожної дослідної концентрації повинні одержати мінімумтри реплікації дослідних груп по 10 бджіл кожна. Крім досліднихгруп повинні бути створені мінімум три контрольні групи по10 бджіл кожна. Контрольні групи також повинні бути створені звикористанням застосованих розчинників/реагентів (див.Секцію 1.5.4).
1.6.2. Стандарт токсичності
Дослідження повинно включати перевірку з використаннямстандарту токсичності. Потрібно вибрати принаймні три дози в межахочікуваного показника LD . Кожна дослідна доза повинна
50
застосовуватися мінімум у трьох реплікаціях кліток по 10 бджіл
кожна. Бажаний стандарт токсичності - диметоат, відносно якого
підтверджений пероральний LD /24 год. перебуває в діапазоні
50
0,10-0,35 мкг активної речовини на бджолу (2). Однак, можна
використовувати інші стандарти токсичності у разі наявності
достатніх даних для перевірки очікуваної реакції на дозу
(наприклад, паратіон).
1.6.3. Застосування
1.6.3.1. Застосування доз
Кожна дослідна група бджіл одержує 100-200 мкл 50% водногорозчину цукрози, який містить відповідну концентрацію дослідноїречовини. Для речовин з низькою розчинністю, низькою токсичністючи низькою концентрацією в продукті може бути потрібен більшийоб'єм, оскільки до розчину цукрози потрібно буде додати більшучастку таких речовин. Потрібно спостерігати за кількістю дослідноїїжі, спожитою в кожній групі. Після споживання (зазвичай протягом3-4 годин), годівниця видаляється із клітки і замінюєтьсягодівницею, яка містить лише розчин цукрози. Надалі його вже можнаспоживати без обмежень. Через максимум 6 годин неспожита досліднаїжа замінюється звичайним розчином цукрози. Стосовно деяких сполукв їх вищих концентраціях, відмова від дослідної дози можепризвести до незначного споживання або повної відсутностіспоживання їжі. Через максимум 6 годин неспожита дослідна їжазамінюється звичайним розчином цукрози. Обсяг спожитої дослідноїїжі потрібно оцінити (наприклад, шляхом вимірювання об'єму/вагидослідної їжі, що залишилася).
1.6.3.2. Тривалість
Бажана тривалість дослідження - 48 годин після замінидослідного розчину розчином, що містить лише цукрозу. Якщосмертність продовжує зростати більше ніж на 10% після перших24 годин, тривалість дослідження потрібно продовжити максимум до96 годин за умови, що в контролі смертність не перевищує 10%.
1.6.4. Спостереження
Смертність фіксується станом на 4 годину з моменту початкудослідження, а потім станом на 24 та 48 години (тобто післяодержання дози). У разі продовження періоду спостереження,подальша фіксація здійснюється з 24-годинними інтервалами домаксимум 96 години, за умови, що смертність в контролі неперевищує 10%.
Обсяг спожитої їжі по кожній групі потрібно оцінити.Порівняння рівнів споживання дослідної і звичайної їжі протягом6 годин може надати інформацію щодо смакової привабливостідослідної їжі.
Потрібно фіксувати всі прояви анормальної поведінки, поміченіпід час дослідження.
1.6.5. Граничне дослідження
У деяких випадках (наприклад, коли очікується, що досліднаречовина має низьку токсичність) може бути проведене граничнедослідження з дозою 100 мкг активної речовини на бджолу, щобпідтвердити, що показник LD більший за одержане значення.
50
Використовується така ж процедура, включаючи три реплікації
дослідних груп, відповідні контролі, оцінку обсягу спожитої
дослідної їжі та використання стандарту токсичності. У разі
наявності смертей, проводиться повне дослідження. У разі наявності
сублетальних проявів (див. Секцію 1.6.4), вони фіксуються.
2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Готуються підсумкові таблиці, які повинні містити дані покожній дослідній групі, а також групах контролю та стандартутоксичності, щодо кількості використаних бджіл, смертності накожен період спостереження та кількості бджіл з анормальноюповедінкою. Дані щодо смертності аналізуються за допомогоювідповідних статистичних методів (наприклад, пробіт-аналізу,змінного середнього, біноміальної вірогідності) (3)(4). Будуютьсякриві реакції на дозу станом на кожен рекомендований періодспостереження, розраховуються нахили кривих і середні летальнідози LD з 95% довірчим інтервалом. Корекція на смертність у
50
контролі може здійснюватися за допомогою методу Ебботта (4)(5). У
разі, якщо оброблена їжа спожита не повністю, потрібно визначити
дозу дослідної речовини, спожиту в групі. LD виражається в мкг
50
дослідної речовини на бджолу.
2.2. ПРОТОКОЛ ДОСЛІДЖЕННЯ
До протоколу дослідження включається така інформація:
2.2.1. Дослідна речовина:
- фізичний характер та відповідні фізико-хімічні властивості(наприклад, стабільність у воді, пружність парів),
- дані хімічної ідентифікації, включаючи структурну формулу,чистоту (тобто, для пестицидів, найменування та концентраціяактивної речовини/речовин).
2.2.2. Піддослідні види:
- наукова назва, раса, приблизний вік (у тижнях), методзбирання, дата збирання,
- інформація щодо колоній, використаних для збиранняпіддослідних бджіл, включаючи рівень здоров'я, будь-які хворобидорослих особин, будь-яке попереднє лікування тощо.
2.2.3. Умови дослідження:
- температура і відносна вологість у експериментальномуприміщенні,
- умови утримання, включаючи тип, розмір і матеріал кліток,
- методи підготовки базового та дослідного розчинів (у разівикористання, потрібно зазначити назву розчинника та йогоконцентрацію),
- структура дослідження, тобто кількість використанихдослідних концентрацій, кількість контролів; по кожнійконцентрації і контролю, кількість реплікацій кліток та кількістьбджіл на клітку,
- дата дослідження.
2.2.4. Результати:
- результати попереднього діапазонного дослідження, якщо вонопроводилося,
- вихідні дані: смертність по кожній дослідній дозі станом накожен період спостереження,
- графік реакції на дози станом на кінець дослідження,
- показники LD50 з 95% довірчим інтервалом станом на коженперіод спостереження стосовно дослідної речовини та стандартутоксичності,
- статистичні процедури, використані для визначення LD ,
50
- смертність у контролях,
- інші біологічні ефекти, помічені або виміряні, наприклад,анормальна поведінка бджіл (включаючи відмову від прийняттядослідної дози), рівень споживання їжі в групах, що одержувалидослідну і звичайну їжу,
- будь-які відхилення від процедур дослідження, описаних уцьому документі, та будь-яка інша доречна інформація.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) EPPO/Council of Europe (1993) Decision-Making Scheme forthe Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products -Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B., (1994) The useof dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicitytests on honeybees (Apis mellifera L.) 1981-1992. Journal ofApicultural Research, 22, p. 119-125.
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplifiedmethod of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. andExper. Ther., 96, p. 99-113.
(4) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge,London and New-York.
(5) Abbott, W.S., (1925) A method for computing theeffectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18,p. 265-267.
C.17. МЕДОНОСНІ БДЖОЛИ - ДОСЛІДЖЕННЯ НА ГОСТРУ
КОНТАКТНУ ТОКСИЧНІСТЬ
1. МЕТОД
Цей метод дослідження на гостру токсичність є аналогомдослідження ОЕСР TG 214 (1998).
1.1. ВСТУП
Це дослідження на токсичність є лабораторним методом,призначеним для оцінки гострої контактної токсичності продуктівзахисту рослин та інших хімічних речовин для дорослих робочихмедоносних бджіл.
При оцінці токсичних характеристик речовин може бутинеобхідним визначення їх гострої контактної токсичності длямедоносних бджіл, наприклад, коли існує ймовірність потрапляннябджіл у середовище з певною хімічною речовиною. Дослідження нагостру контактну токсичність проводиться для визначеннятоксичності, притаманної пестицидам та іншим хімічним речовинам,для бджіл. Результати цього дослідження використовуються длявизначення необхідності проведення подальших досліджень. Зокрема,цей метод може використовуватися у комплексних програмах оцінкинебезпеки пестицидів для бджіл з послідовним переходом відлабораторних досліджень на токсичність до напів-польових тапольових експериментів (1). Пестициди можуть досліджуватися як засвоїми активними речовинами, так і як складені продукти.
Для перевірки чутливості бджіл та точності процедуридослідження використовуються стандарти токсичності.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Гостра контактна токсичність: негативні ефекти, щопроявляються протягом максимального періоду, який складає96 годин, після місцевого нанесення однієї дози дослідноїречовини.
Доза: обсяг застосованої дослідної речовини. Доза виражаєтьсяяк маса (мкг) дослідної речовини на одну піддослідну тварину(мкг/бджолу).
LD (середня летальна доза), контактна: статистично 50розрахована доза місцево нанесеної речовини, яка може спричинитисмерть 50% тварин. Значення LD виражається у мкг дослідної
50
речовини на бджолу. Для пестицидів дослідна речовина може бути або
активною речовиною, або складеним продуктом, який містить одну або
більше активних речовин.
Смертність: тварина вважається мертвою, якщо вона повністюнерухома.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дорослі робочі медоносні бджоли (Apis mellifera) піддаютьсявпливу низки доз дослідної речовини, розчиненої у відповідномуреагенті, шляхом прямого нанесення на грудний відділ (краплями).Тривалість дослідження - 48 годин. Якщо рівень смертностізбільшується в період між 24 та 48 годинами, тоді як у контролісмертність лишається на прийнятному рівні, тобто < 10%, доцільнопродовжити тривалість дослідження до максимум 96 годин. Смертністьфіксується щоденно і порівнюється з контролем. Для розрахунку LD
50
результати аналізуються станом на 24 годину та 48 годину, а якщо
тривалість дослідження була продовжена, то станом на 72 годину і
на 96 годину.
1.4. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Достовірність дослідження підтверджується такими умовами:
- на кінець дослідження середня смертність у контролі неперевищує 10% від загальної кількості бджіл у контролі;
- LD стандарту токсичності перебуває у встановлених межах. 50
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Збирання бджіл
Для дослідження використовуються молоді робочі бджоли однієїраси, тобто бджоли одного віку, харчового статусу тощо.Відбираються бджоли, які адекватно харчувалися, здорові, ізблагополучних і керованих королевою колоній з відомою історією тафізіологічним станом. Бджоли можуть збиратися вранці в деньдослідження або ввечері напередодні дослідження і утримуватися донаступного дня в умовах дослідження. Підходять бджоли, відібрані зрамок, без наприску. Потрібно уникати збирання бджіл ранньоювесною або пізньою осінню, оскільки в цей час у бджіл відбуваютьсяфізіологічні зміни. Якщо дослідження потрібно провести ранньоювесною або пізньою осінню, бджіл можна помістити в інкубатор іпротягом одного тижня годувати "бджолиним хлібом" (пилком,відібраним із стільників) і розчином цукрози. Бджіл, яких лікувалихімічними речовинами, такими як антибіотики, противаротозніпрепарати тощо, використовувати для дослідження на токсичність неможна протягом чотирьох тижнів після закінчення останньоголікування.
1.5.2.Умови утримання і годування
Використовуються легкі в прибиранні та добре вентильованіклітки. Можуть використовуватися клітки, виготовлені з будь-якогоприйнятного матеріалу, наприклад, нержавіючої сталі, дротяноїсітки, пластику або ж одноразові дерев'яні клітки тощо. Розмірдослідних кліток повинен відповідати кількості бджіл, тобтозабезпечувати достатньо місця для їх розміщення. Бажано в однійклітці розміщувати групу з 10 бджіл.
Бджоли утримуються у темряві в експериментальній кімнаті притемпературі 25 +- 2 град.C. Відносна вологість, зазвичай, повиннастановити близько 50-70% і повинна фіксуватися протягом усьогодослідження. Робота з бджолами, включаючи догляд за ними тапроведення спостережень, може виконуватися при (денному) світлі.Для годування бджіл використовується водний розчин цукрози зкінцевою концентрацією 500 г/л (співвідношення ваги і об'єму 50%).Годування здійснюється без обмежень із використанням годівниці длябджіл. Для цього можна використовувати скляну трубку довжиноюприблизно 50 мм і шириною приблизно 10 мм, відкритий кінчик якоїзвужений до діаметру приблизно 2 мм.
1.5.3. Підготовка бджіл
Для нанесення дослідної речовини можна анестезувати зібранихбджіл за допомогою вуглекислого газу або азоту. Сила та часанестезії повинні бути мінімальними. Перед початком дослідженнявмираючі бджоли повинні бути вилучені і замінені здоровими.
1.5.4. Підготовка доз
Дослідна речовина наноситься як розчин у реагенті, тобтоорганічному розчиннику, або водному розчині зі змочувальнимзасобом. Як органічний розчинник бажано використовувати ацетон,але можна використовувати інші органічні розчинники, якімалотоксичні для бджіл (наприклад, диметилформамід,диметилсульфоксид). Щодо водорозчинних продуктів та високополярнихорганічних речовин, які не розчиняються в органічних розчинниках,розчини може бути легше наносити, якщо готувати їх у слабкомурозчині комерційних змочувальних засобів (наприклад, Agral,Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
Потрібно підготувати відповідні контрольні розчини. Тобто,якщо для розчинення дослідної речовини необхідне використаннярозчинника або диспергатора, потрібно створити дві контрольнігрупи: одну з застосуванням води і одну з застосуваннямрозчинника/диспергатора.
1.6. ПРОЦЕДУРА
1.6.1. Дослідні та контрольні групи
Кількість дослідних доз та реплікацій повинна відповідатистатистичним вимогам для визначення LD з 95% довірчим
50
інтервалом. Зазвичай для проведення дослідження достатнім є
використання п'яти доз в геометричній прогресії з множником не
більше 2,2, які б охоплювали необхідний для LD діапазон. Однак,
50
потрібно визначити кількість концентрацій для підготовки доз
залежно від нахилу кривої токсичності (відношення дози та
смертності) та з урахуванням статистичного методу, вибраного для
аналізу результатів. Необхідні концентрації можна визначити за
допомогою діапазонного дослідження.
Дозу кожної дослідної концентрації повинні одержати мінімумтри реплікації дослідних груп по 10 бджіл кожна.
Крім дослідних груп повинні бути створені мінімум триконтрольні групи по 10 бджіл кожна. У разі використанняорганічного розчинника чи змочувального засобу потрібно створититри додаткові контрольні групи, по 10 бджіл кожна, з додаваннямзастосованого розчинника/змочувального засобу.
1.6.2. Стандарт токсичності
Дослідження повинно включати перевірку з використаннямстандарту токсичності. Потрібно вибрати принаймні три дози в межахочікуваного показника LD . Кожна дослідна доза повинна
50
застосовуватися мінімум у трьох реплікаціях кліток по 10 бджіл
кожна. Бажаний стандарт токсичності - диметоат, відносно якого
підтверджений контактний LD /24 год. перебуває в діапазоні
50
0,10-0,30 мкг активної речовини на бджолу (2). Однак, можна
використовувати інші стандарти токсичності у разі наявності
достатніх даних для перевірки очікуваної реакції на дозу
(наприклад, паратіон).
1.6.3. Застосування
1.6.3.1. Застосування доз
На кожну окрему бджолу, яка перебуває під анестезією, місцевонаноситься дослідна доза. Бджоли довільно розподіляються міжрізними дослідними дозами та контролями. Розчин об'ємом 1 мкл ізвмістом дослідної речовини відповідної концентрації за допомогоюмікроаплікатора наноситься на задню частину грудного відділукожної бджоли. Якщо це виправдано, можуть наноситися інші об'ємирозчину. Після нанесення бджоли поміщаються до дослідних кліток іодержують розчин цукрози.
1.6.3.2. Тривалість
Бажана тривалість дослідження - 48 годин. Якщо смертністьзростає більше ніж на 10% у період від 24 до 48 години, тривалістьдослідження потрібно продовжити максимум до 96 годин за умови, щов контролі смертність не перевищує 10%.
1.6.4. Спостереження
Смертність фіксується станом на 4 годину з моменту початкудослідження, а потім станом на 24 та 48 години. У разі продовженняперіоду спостереження, подальша фіксація здійснюється з24-годинними інтервалами до максимум 96 години, за умови, щосмертність в контролі не перевищує 10%.
Потрібно фіксувати всі прояви анормальної поведінки, поміченіпід час дослідження.
1.6.5. Граничне дослідження
У деяких випадках (наприклад, коли очікується, що досліднаречовина має низьку токсичність) може бути проведене граничнедослідження з дозою 100 мкг активної речовини на бджолу, щобпідтвердити, що показник LD більший за одержане значення.
50
Використовується така ж процедура, включаючи три реплікації
дослідних груп на дозу, відповідні контролі та використання
стандарту токсичності. У разі наявності смертей, проводиться повне
дослідження. У разі наявності сублетальних проявів (див. Секцію
1.6.4), вони фіксуються.
2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ
2.1. ДАНІ
Готуються підсумкові таблиці, які повинні містити дані покожній дослідній групі, а також групах контролю та стандартутоксичності, щодо кількості використаних бджіл, смертності накожен період спостереження та кількості бджіл з анормальноюповедінкою. Дані щодо смертності аналізуються за допомогоювідповідних статистичних методів (наприклад, пробіт-аналізу,змінного середнього, біноміальної вірогідності) (3)(4). Будуютьсякриві реакції на дозу станом на кожен рекомендований періодспостереження (тобто 24 години, 48 годин і, якщо прийнятно,72 години і 96 годин), розраховуються нахили кривих і середнілетальні дози (LD ) з 95% довірчим інтервалом. Корекція на
50
смертність у контролі може здійснюватися за допомогою методу
Ебботта (4)(5). У разі, якщо оброблена їжа спожита не повністю,
потрібно визначити дозу дослідної речовини, спожиту в групі. LD
50
виражається в мкг дослідної речовини на бджолу.
2.2. ПРОТОКОЛ ДОСЛІДЖЕННЯ
До протоколу дослідження включається така інформація:
2.2.1. Дослідна речовина:
- фізичний характер та відповідні фізико-хімічні властивості(наприклад, стабільність у воді, пружність парів),
- дані хімічної ідентифікації, включаючи структурну формулу,чистоту (тобто, для пестицидів, найменування та концентраціяактивної речовини/речовин).
2.2.2. Піддослідні види:
- наукова назва, раса, приблизний вік (у тижнях), методзбирання, дата збирання,
- інформація щодо колоній, використаних для збиранняпіддослідних бджіл, включаючи рівень здоров'я, будь-які хворобидорослих особин, будь-яке попереднє лікування тощо.
2.2.3. Умови дослідження:
- температура і відносна вологість у експериментальномуприміщенні,
- умови утримання, включаючи тип, розмір і матеріал кліток,
- методи застосування дослідного розчину, наприклад,використання розчинного засобу, об'єм нанесеного дослідногорозчину, використані анестетики,
- структура дослідження, наприклад, кількість використанихдослідних доз, кількість контролів; по кожній дослідній дозі іконтролю, кількість реплікацій кліток та кількість бджіл наклітку,
- дата дослідження.
2.2.4. Результати:
- результати попереднього діапазонного дослідження, якщо вінпроводився,
- вихідні дані: смертність по кожній дослідній дозі станом накожен період спостереження,
- графік реакції на дози станом на кінець дослідження,
- показники LD з 95% довірчим інтервалом станом на кожен 50період спостереження стосовно дослідної речовини та стандартутоксичності,
- статистичні процедури, використані для визначення LD ,
50
- смертність у контролях,
- інші біологічні ефекти, помічені або виміряні, та будь-якаанормальна поведінка бджіл,
- будь-які відхилення від процедур дослідження, описаних уцьому документі, та будь-яка інша доречна інформація.
3. ПОСИЛАННЯ
(1) EPPO/Council of Europe (1993) Decision-Making Scheme forthe Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products -Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B., (1994) The useof dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicitytests on honeybees (Apis melliferaL.) 1981-1992. Journal ofApicultural Research, 22, p. 119-125.
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., (1949) A simplifiedmethod of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. andExper. Ther., 96, p. 99-113.
(4) Finney, D.J., (1971) Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge,London and New-York.
(5) Abbott, W.S., (1925) A method for computing theeffectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18,p. 265-267.
C.18. АДСОРБЦІЯ/ДЕСОРБЦІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ
МЕТОДУ РІВНОВАГИ
1. МЕТОД
Цей метод є аналогом методу ОЕСР TG 106 щодо визначенняадсорбції/десорбції ґрунту з використанням методу рівноваги(2000).
1.1. ВСТУП
Цей метод передбачає проведення кільцевого дослідження таописує процедури відбору ґрунту для проведення дослідження наадсорбцію (1)(2)(3)(4), а також враховує існуючі на національномурівні правила (5)(6)(7)(8)(9)(10)(11).
Дослідження адсорбції/десорбції потрібне для одержаннябазової інформації щодо руху та розповсюдження хімічних речовин уґрунтовій, водній та повітряній частинах біосфери(12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21). Інформація можевикористовуватися для прогнозування або оцінки, наприклад,можливості розпаду хімічної речовини (22)(23), її трансформації тапоглинання організмами (24); вилужнювання ґрунтового профілю(16)(18)(19)(21)(25)(26)(27)(28); леткості із ґрунту (21)(29)(30);стікання із поверхні землі в природні води (18)(31)(32). Дані щодоадсорбції можуть використовуватися для цілей порівняння тамоделювання (19)(33)(34)(35).
Поширення хімічної речовини між ґрунтовою та водною фазами єкомплексним процесом, на який впливає низка різних факторів:хімічний характер речовини (12)(36)(37)(38)(39)(40),характеристики ґрунту(4)(12)(13)(14)(41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48)(49) та кліматичніфактори, такі як дощ, температура, сонячне світло та вітер. Такимчином, численні феномени та механізми, які впливають на процесадсорбції хімічної речовини в ґрунті, не можуть бути повністювизначені за допомогою спрощеної лабораторної моделі, такої як цейметод. Однак, навіть якщо це дослідження не може охопити всіможливі в довкіллі випадки, воно є джерелом цінної інформації щодовпливу адсорбції певної хімічної речовини на довкілля.
Дивіться також Загальний вступ.
1.2. МАСШТАБ
Цей метод призначений для оцінки адсорбційної/десорбційноїповедінки речовини в ґрунті. Метою дослідження є одержанняпоказника сорбції, який може використовуватися для прогнозуваннярозпаду залежно від різних умов довкілля; з цією метою коефіцієнтиадсорбційної рівноваги хімічної речовини в різних типах ґрунтувизначаються як функція характеристик ґрунту (тобто вмісторганічного вуглецю, вміст глини, текстура ґрунту та pH). Дляохоплення якомога більшого діапазону взаємозв'язків певноїречовини з ґрунтами, що зустрічаються в природі, в дослідженнівикористовуються різні типи ґрунтів.
У цьому методі адсорбція являє собою процес, при якомувідбувається зв'язування хімічної речовини з поверхнею ґрунту; вметоді не розрізняються різні процеси адсорбції (фізична тахімічна адсорбція) і такі процеси як поверхнева каталізованадеградація, масова адсорбція або хімічні реакції. Адсорбція, щовідбувається на колоїдних частинках ґрунту (діаметром < 0,2мікрона), не враховується.
Параметри ґрунту, які вважаються найбільш важливими длядослідження адсорбції: вміст органічного вуглецю(3)(4)(12)(13)(14)(41)(43)(44)(45)(46)(47)(48); вміст глини татекстура ґрунту (3)(4)(41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48), а також pHдля сполук, що іонізуються (3)(4)(42). Інші параметри ґрунту, якіможуть мати вплив на адсорбцію/десорбцію певної речовини, - цеефективна ємність поглинання ґрунту (ECEC), вміст аморфних оксидівзаліза та алюмінію, особливо у вулканічних та тропічних ґрунтах(4), а також особливі характеристики поверхні (49).
Дослідження покликане оцінити адсорбцію хімічної речовини врізних типах ґрунту зі змінним вмістом органічного вуглецю таглини, змінними текстурою ґрунту та pH. Воно складається з трьохетапів:
Етап 1: попереднє дослідження для визначення:
- співвідношення ґрунту та розчину,
- час досягнення адсорбційної рівноваги та обсяг дослідноїречовини, адсорбованої на момент рівноваги,
- адсорбція дослідної речовини на поверхнях дослідних посудинта стабільність дослідної речовини протягом дослідження.
Етап 2: відбірне дослідження: досліджується кінетикаадсорбції на п'яти різних типах ґрунту з використанням однієїконцентрації речовини і визначається коефіцієнт розповсюдження K
d
та K .
oc
Етап 3: визначення ізотерм адсорбції Фрейндліха длявстановлення впливу концентрації речовини на ступінь адсорбції вґрунті.
Дослідження десорбції за допомогою кінетики десорбції/ізотермдесорбції Фрейндліха (Доповнення 1).
1.3. ВИЗНАЧЕННЯ ТА ОДИНИЦІ
----------------------------------------------------------------------
| Позначення | Визначення | Одиниця |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|At |відсоток адсорбції на |% |
| i |момент часу t | |
| | i | |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
|A |відсоток адсорбції на |% |
| eq |момент адсорбційної | |
| |рівноваги | |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads |маса дослідної речовини, |мкг |
|m (t ) |адсорбованої в ґрунті на | |
| s i |момент часу t | |
| | i | |
|----------------+---------------------------+-----------------------|
| ads |маса дослідної речовини, |мкг |
|m (Дельта t )|адсорбованої в ґрунті | |
