Регламент Ради (ЄС) N 440/2008 "Що встановлює методи тестування відповідно до Регламенту Європейського Парламенту та Ради (ЄС) N 1907/2006 про реєстрацію, оцінку, авторизацію і обмеження хімічних речовин та препаратів (REACH)"

Що стосується дослідження з використанням проточного методу,застосовується режим відбору зразків, подібний до того, якийописується для напівстатичних досліджень (однак вимірювання"старих" розчинів у цьому випадку не є прийнятним). Однак, якщотривалість дослідження складає більше семи днів, рекомендуєтьсязбільшити кількість відборів протягом першого тижня (тобто тривимірювання), щоб гарантувати стабільність дослідних концентрацій.

Може бути потрібно центрифугувати або відфільтрувати зразки(з проникністю фільтра, наприклад, 0,45 мікрона). Однак, оскількині центрифугування, ні фільтрування, як виявляється, не завждидозволяють відокремити не біодоступні частки дослідного розчинувід біодоступних, зразки можна не піддавати такій обробці.

Під час дослідження в усіх посудинах потрібно вимірюватирівень розчиненого кисню, pH і температуру. В контролі й однійпосудині з найвищою концентрацією потрібно вимірювати загальнужорсткість і мінералізацію (якщо прийнятно). Як мінімум, необхіднотричі (на початку, в середині та в кінці дослідження) вимірятирозчинений кисень та мінералізацію (якщо прийнятно). Унапівстатичних дослідженнях рекомендується частіше вимірюватирозчинений кисень, бажано до і після кожного оновлення води абопринаймні один раз на тиждень. pH потрібно вимірювати на початкута в кінці кожного оновлення води в напівстатичних дослідженнях іпринаймні щотижня в проточних дослідженнях. Жорсткість потрібновимірювати один раз протягом кожного дослідження. Температурупотрібно вимірювати щодня, а принаймні в одній посудині -контролювати постійно.

1.7.5. Спостереження

1.7.5.1. Стадія ембріонального розвитку

Стадія ембріонального розвитку (тобто стадія гаструли) напочатку поміщення в середовище дослідної речовини повинна бутивстановлена якомога точніше. Це можна зробити шляхом виборурепрезентативного зразка ікринки, належним чином збереженого іочищеного. Опис та ілюстрацію стадій ембріонального розвитку можназнайти в літературі (2)(5)(10)(11).

1.7.5.2. Вилуплення та виживання

Спостереження за вилупленням та виживанням повинніпроводитися принаймні один раз на день, та відповідна кількістьповинна записуватися. Може бути бажаним робити спостереженнячастіше на початку дослідження (наприклад, кожні 30 хвилинпротягом перших трьох годин), оскільки в деяких випадкахінформація про тривалість виживання може бути більш корисною, ніжлише кількість смертей (наприклад, при наявності гострих токсичнихпроявів). Загиблі ембріони та личинки потрібно видаляти одразупісля їх виявлення, оскільки вони можуть швидко розкластися.Видалення загиблих особин потрібно робити з особливою обережністю,щоб не вдарити чи фізично пошкодити сусідні ікринки/личинки, які єнадзвичайно тендітними і чутливими. Критерії для визначення смертізалежно від стадії життя:

- для ікринок: особливо на ранніх стадіях, виражена втратапрозорості та зміна забарвлення, спричинена коагуляцією та/абопреципітацією білка, що призводить до набуття білого непрозороговигляду,

- для ембріонів: відсутність рухів тулуба та/або відсутністьсерцебиття, та/або втрата прозорості у видів, чиї ембріонизазвичай прозорі,

- для личинок: нерухомість та/або відсутність респіраторнихрухів, та/або відсутність серцебиття, та/або біле непрозорезабарвлення центральної нервової системи, та/або відсутністьреакції на механічні подразники.

1.7.5.3. Анормальний вигляд

Кількість личинок, у яких проявляється анормальна форматулуба та/або пігментація, та стадія поглинання жовткового мішка,повинні фіксуватися з адекватною періодичністю, залежно відтривалості дослідження та характеру виявленої анормальності.Потрібно відзначити, що присутність анормальних ембріонів таличинок є природною і в контролі може досягати порядку кількохвідсотків у деяких видів. Анормальні личинки видаляються іздослідних посудин лише після смерті.

1.7.5.4. Анормальна поведінка

Анормальності, такі як гіпервентиляція, некоординованеплавання та атипова нерухомість, повинні фіксуватися з адекватноюперіодичністю, залежно від тривалості дослідження. Ці прояви, хочаїх і важко порахувати, можуть у разі їх виявлення допомогти впоясненні даних щодо смертності, тобто є джерелом інформації щодохарактеру токсичної дії речовини.

1.7.5.5. Довжина

У кінці дослідження рекомендується провести вимірюванняіндивідуальної довжини зразків; може використовуватися методикавимірювання стандартної довжини, довжини за Шмідтом або загальноїдовжини. Однак, у випадках гниття хвостового плавника або ерозіїплавника потрібно використовувати метод вимірювання стандартноїдовжини. Загалом, у належно проведеному дослідженні коефіцієнтрозбіжності довжини серед реплікацій у контролях повинен становити<= 20%.

1.7.5.6. Вага

У кінці дослідження можна провести вимірювання індивідуальноїваги зразків; бажано проводити вимірювання ваги сухих зразків(висушених протягом 24 годин при 60 град.С), ніж мокрих (чивисушених промоканням). Загалом, у належно проведеному дослідженнікоефіцієнт розбіжності ваги серед реплікацій у контролях повиненстановити <= 20 %.

Ці спостереження послужать збору деяких або всіхнижчезазначених даних для статистичного аналізу:

- сукупна смертність,

- кількість живих личинок на кінець дослідження,

- час до початку вилуплення і до закінчення вилуплення(тобто, 90% вилуплень у кожній реплікації),

- кількість личинок, що вилуплюються щодня,

- довжина (і вага) тварин, що вижили на кінець дослідження,

- кількість личинок із спотвореним або анормальним виглядом,

- кількість личинок, що показують анормальну поведінку.

2. ДАНІ ТА ЗВІТНІСТЬ

2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ

Як до розробки, так і до аналізу результатів дослідженнярекомендується залучити спеціаліста зі статистики, оскільки методпередбачає велику кількість варіантів структури дослідження,наприклад, що стосується кількості дослідних камер, кількостідослідних концентрацій, початкової кількості запліднених ікринокта вимірюваних параметрів.

У зв'язку з існуванням різних варіантів структуридослідження, тут не подаються окремі інструкції щодо статистичнихпроцедур. Якщо необхідно оцінити НСЕК/КНВЕ, потрібнопроаналізувати відмінності в кожному наборі реплікацій звикористанням процедур дисперсійного аналізу (ANOVA) або таблицістатистичної структури. Для проведення множинного порівняння міжрезультатами за окремими концентраціями та контролями можевикористовуватися метод Даннетта (12)(13). Є також інші корисніприклади (14)(15). Ступінь впливу, який виявляється за допомогоюANOVA або інших процедур (тобто потужність критерію), повиненрозраховуватися і зазначатися в протоколі. Потрібно відзначити, щоне всі спостереження, перелічені в Секції 1.7.5.6 підходять длястатистичного аналізу з використанням ANOVA. Наприклад, сукупнусмертність та кількість живих личинок на кінець дослідженняпотрібно аналізувати за допомогою пробіт-методів.

Для оцінки LC/EC , до даних, що викликають інтерес, xпідбираються відповідні криві, наприклад, логістична крива, звикористанням статистичного метода, наприклад, метода найменшихквадратів або метода нелінійних найменших квадратів. Параметрикривих повинні бути такими, щоб можна було безпосередньо оцінитиLC/EC , які викликають інтерес, та їх середньоквадратичну помилку.

x

Це значно полегшить розрахунок меж довірчого інтервалу відносно

LC/EC . Крім випадків, коли є достатні підстави віддати перевагу

x

різним довірчим рівням, у протоколі потрібно зазначити

двосторонній 95% довірчий інтервал. Бажано, щоб процес підбору

кривих передбачав можливість оцінки значимості відсутності згоди.

Можна використовувати графічні методи підбору кривих. Регресійний

аналіз підходить для всіх спостережень, перелічених у Секції

1.7.5.6.

2.2. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

У разі, якщо виміряні концентрації токсичної речовини удослідних розчинах перебувають на рівні межі чутливостіаналітичного методу, до інтерпретації результатів потрібнопідходити з обережністю. Також з обережністю потрібно ставитися доінтерпретації результатів при концентраціях речовини, яка вищарівня розчинності води.

2.3. ПРОТОКОЛ ДОСЛІДЖЕННЯ

До протоколу дослідження включається така інформація:

2.3.1. Дослідна речовина:

- фізичний характер та відповідні фізико-хімічні властивості;

- дані хімічної ідентифікації, включаючи чистоту тааналітичний метод визначення кількості дослідної речовини, деприйнятно.

2.3.2. Дослідні види:

- наукова назва, різновид, кількість батьківської риби (тобтоскільки самок було використано для одержання необхідної кількостіікринок для дослідження), джерело і метод збору заплідненихікринок та наступне поводження з ними.

2.3.3. Умови дослідження:

- використана процедура дослідження (наприклад, напівстатичначи проточна, період часу від запліднення до початку дослідження,завантаження тощо);

- світловий період (періоди);

- структура дослідження (наприклад, кількість дослідних камерта реплікацій, кількість ембріонів на реплікацію);

- метод приготування базових розчинів та періодичністьоновлення (у разі використання, повинен бути зазначенийрозчинювальний реагент та його концентрація);

- номінальні дослідні концентрації, виміряні значення, їхсередні значення і середньоквадратичні відхилення в досліднихпосудинах та метод, за допомогою якого значення були одержані, атакож, якщо дослідна речовина розчинна у воді при концентраціях,що менші ніж досліджені, інформація про те, що вимірюваннястосуються концентрацій дослідної речовини в розчині;

- характеристики розчинної води: pH, жорсткість, температура,концентрація розчиненого кисню, рівні залишкового хлору (якщовимірювалося), загальний вміст органічного вуглецю, тверді зависі,мінералізація дослідного середовища (якщо вимірювалося) та іншіпроведені вимірювання;

- якість води в дослідних посудинах: pH, жорсткість,температура та концентрація розчиненого кисню.

2.3.4. Результати:

- результати будь-яких попередніх досліджень щодостабільності дослідної речовини;

- інформація про відповідність контролю стандарту загальноївиживаності дослідних видів (Доповнення 2 та 3);

- дані щодо смертності/виживаності на стадіях ембріона таличинки, а також загальна смертність/виживаність;

- днів до вилуплення личинок та їх кількість;

- дані щодо довжини (та ваги);

- кількість та опис морфологічних анормальностей, якщо такіє;

- кількість та опис поведінкових проявів, якщо такі є;

- статистичний аналіз та обробка даних;

- для досліджень, проаналізованих за допомогою ANOVA,найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК), при p = 0,05,та концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ), покожній оціненій реакції, включаючи опис використаних статистичнихпроцедур та інформацію про те, який за обсягом ефект міг бутивиявлений;

- для досліджень, проаналізованих за допомогою регресійнихметодів, LC/EC та довірчі інтервали, а також графік моделі,

x

вибраної для їх розрахунку;

- пояснення будь-яких відхилень від методу дослідження.

3. ПОСИЛАННЯ

(1) Kristensen P., (1990) Evaluation of the Sensitivity ofShort Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELSTest Methods. Final report to the Commission of the EuropeanCommunities, p. 60. June 1990.

(2) ASTM (1988) Standard Guide for Conducting EarlyLife-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society forTesting and Materials. E 1241-88. p. 26

(3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A., (1975) Acquisition andCulture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, ChannelCatfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series,EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.

(4) Brungs W.A. and Jones B.R., (1977) Temperature Criteriafor Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, EcologicalResearch Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.

(5) Laale H.W., (1977) The Biology and Use of the Zebrafish(Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review.J.Biol. 10, p. 121-173.

(6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time ofDaily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachydaniorerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, p. 328-330.

(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., RosanderB. and Viktor T., (1987) Ring Test of an Embryo-larval ToxicityTest with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium and Zinc asToxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, p. 61-71.

(8) Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G., (1985)Short-term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determiningthe Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and EstimatingChronic Values for Single Compounds and Complex Effluents.Environmental Toxicology and Chemistry 4, p. 807-821.

(9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) AquaticToxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds.III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri). J.Aquatic Toxicology, 9, p. 129-145.

(10) Kirchen R.V. and W.R. West (1969) TeleosteanDevelopment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological SupplyCompany.

(11) Kirchen R.V. and W.R. West (1976) The Japanese Medaka.Its care and Development. Carolina Biological Supply Company,North Carolina. p. 36.

(12) Dunnett C.W., (1955) A Multiple Comparisons Procedurefor Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist.Assoc., 50, p. 1096-1121.

(13) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisonswith a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.

(14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G., (1980)Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data.Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM,Philadelphia.

(15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J., (1990)Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early LifeStage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, p. 321-334.

(16) Environment Canada., (1992) Toxicity Tests Using EarlyLife Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon orAtlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS1/RM/28, December 1992, p. 81.

(17) Dave G. and Xiu R., (1991) Toxicity of Mercury, Nickel,Lead and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydaniorerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 21,p. 126-134.

(18) Meyer A., Bierman C.H. and Orti G., (1993) Thephylogenetic position of the Zebrafish (Danio rerio), a modelsystem in developmental biology - an invitation to the comperativemethods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231-236.

(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and RoubaudP., (1995) Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two ReferenceMolecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and EnvironmentalSafety 32, p. 19-28.

(20) US EPA, (1991) Guidelines for Culturing the JapaneseMedaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/ 064, Dec. 1991,EPA, Duluth.

(21) US EPA, (1991) Guidelines for Conducting Early LifeStage Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPAreport EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.

(22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre D.O., PoccocicT.L., Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D., (1991) Validityin the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephalespromelas) larval survival and growth test: an intra- andinterlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, p. 1189-1203.

(23) Calow P., (1993) Handbook of Ecotoxicology, Blackwells,Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing andconducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine andMarine fish.

(24) Balon E.K., (1985) Early life history of fishes: Newdevelopmental, ecological and evolutionary perspectives, JunkPubl., Dordrecht, p. 280.

(25) Blaxter J.H.S., (1988) Pattern and variety indevelopment, In: W.S.Hoar and D.J.Randall Eds., Fish Physiology,vol. XIA, Academic press, p. 1-58.

Таблиця 1А

Види риби, рекомендовані для проведення дослідження

------------------------------------------------------------------

| ПРІСНОВОДНІ |

|----------------------------------------------------------------|

|Oncorhynchus mykiss |

|Райдужна форель (9)(16) |

|Danio rerio |

|Смугастий даніо (7)(17)(18) |

|Cyprinus caprio |

|Короп звичайний (8)(19) |

|Oryzias latipes |

|Японський медак (20)(21) |

|Pimephales promelas |

|Товстоголов (8)(22) |

------------------------------------------------------------------

Таблиця 1В

Приклади інших документально підтверджених видів,

які використовувалися для дослідження

------------------------------------------------------------------

| ПРІСНОВОДНІ | СОЛОНОВОДНІ |

|--------------------------------+-------------------------------|

|Carassius auratus |Menidia peninsulae |

|Срібний карась (8) |Менідія (23)(24)(25) |

|Lepomis macrochirus |Clupea harengus |

|Синьозяберник (8) |Оселедець (24)(25) |

| |Gadus morhua |

| |Тріска (24)(25) |

| |Cyprinodon variegatus |

| |Мінливий карпозубик (23)(24) |

| |(25) |

------------------------------------------------------------------

Доповнення 1

ІНСТРУКЦІЇ ЩОДО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ

НА ТОКСИЧНІСТЬ ДЛЯ ЕМБРІОНІВ ТА ПЕРЕДЛИЧИНОК

СМУГАСТОГО ДАНІО (BRACHYDANIO RERIO)

ВСТУП

Смугастий даніо походить з Коромандельського узбережжя Індії,де він населяє швидкоплинні потоки. Це розповсюджена акваріумнарибка сімейства коропових і інформацію щодо догляду за нею та їїрозведення можна знайти у стандартних довідниках щодо тропічноїриби. Її біологія та використання в дослідженнях була описанаЛаалем (1).

Риба рідко перевищує 45 мм у довжину. Тулуб - циліндричний з7-9 горизонтальними темно-синіми та сріблястими смужками. Цісмужки досягають хвостової частини та анальних плавників. Спинка -оливково-зелена. Самці тонші за самок. Самки більш сріблясті, їхчеревна порожнина більш видовжена, особливо в період, що передуєікрометанню.

Дорослі риби можуть витримувати великі перепади температури,pH та жорсткості води. Однак, щоб одержати здорових риб, якіможуть метати ікру гарної якості, потрібно підтримувати оптимальніумови.

У період ікрометання самці переслідують і торкаються самок, апісля викидання ікри запліднюють її. Ікринки, які є прозорими танеклейкими, падають на дно, де їх можуть з'їсти батьки.Ікрометання залежить від світла. У разі наявності достатньогоранкового світла риба зазвичай мече ікру протягом кількох годинпісля світанку.

Самка може виробляти ікру порціями до кількох сотень ікринокз тижневою періодичністю.

УМОВИ УТРИМАННЯ БАТЬКІВСЬКОЇ РИБИ, ВІДТВОРЕННЯ ТА РАННІСТАДІЇ ЖИТТЯ

Необхідна кількість здорової риби утримується в прийнятнійводі (див. Додаток 4) протягом принаймні двох тижнів допланованого ікрометання. Група риби повинна принаймні один раздати потомство до вироблення порції ікри, яка будевикористовуватися для дослідження. Скупченість риби протягом цьогоперіоду не повинна перевищувати 1 грам риби на літр. У разірегулярної заміни води або використання очищувальних системскупченість може бути більшою. Температура в резервуарах, у якихутримується риба, повинна підтримуватися на рівні 25 +- 2 град.C.Риба повинна одержувати різноманітну дієту, яка може складатися з,наприклад, відповідного комерційного сухого корму, живих щойновилуплених артемій, хірономід, дафній, білих черв'яків(Enchytraeids).

Нижче наведені дві процедури, які на практиці дозволилиодержати достатню кількість здорових запліднених ікринок дляпроведення дослідження:

i) Вісім самок і 16 самців розміщуються в резервуарі з50 літрами розчинної води, захищені від прямого світла і залишенів якнайбільшому спокої протягом принаймні 48 годин. Увечерінапередодні початку дослідження на дно акваріума ставиться ящикдля ікри. Ящик для ікри складається з рамки (з плексигласу абоіншого придатного матеріалу) заввишки 5-7 см, а також крупноїсітки (2-5 мм) зверху рамки та дрібної сітки (10-30 мікрон) знизурамки. До крупної сітки приєднується низка мотузок із некрученогонейлону у вигляді "дерев для нересту". Після того, як риба провелав темряві 12 годин, вмикається слабке світло, що стимулює початокікрометання. Через дві-чотири години після ікрометання ящик дляікри вилучається, а ікра збирається. Ящик для ікри не дозволитьрибі з'їсти ікру і, водночас, дозволить легко її зібрати. До тогоікрометання, ікра від якого використовуватиметься для дослідження,група риби повинна провести принаймні одне ікрометання.

ii) Від п'яти до десяти самців та самок розміщуються окремопротягом принаймні двох тижнів до планованого ікрометання. Через5-10 днів черевні порожнини самок видовжуються, а їх статевігорбики стають видимими. У самців горбики відсутні. Ікрометаннявідбувається у резервуарах, на дні яких знаходиться сітка (якописано вище). Резервуар наповнюється розчинною водою таким чином,щоб глибина води над сіткою складала від 5 до 10 см. Одна самка ідва самці поміщаються в резервуар напередодні планованогоікрометання. Температура води поступово збільшується на одинградус вище, ніж температура акліматизації. Світло вимикається, арезервуар залишається в якнайбільшому спокої. Вранці вмикаєтьсяслабке світло, що стимулює початок ікрометання. Через дві-чотиригодини риба видаляється, а ікра збирається. У разі, якщо потрібнабільша кількість ікри, ніж може бути одержано від однієї самки,паралельно закладається кілька резервуарів. Якщо до початкудослідження фіксувати продуктивність (кількість та якість порціїікри) окремих самок, можна відбирати найпродуктивніших із них длярозведення.

Ікра переноситься до дослідних посудин за допомогою скляноїтрубки (внутрішній діаметр не менше ніж 4 мм), до якої приєднанийгнучкий ковпачок-насос. Ікринки потрібно переносити в якнайменшійкількості води. Ікринки важчі ніж вода і спливають на поверхнюводи в трубці. Потрібно запобігти контакту ікринок (і личинок) зповітрям. Для перевірки відсутності анормальностей на початковихстадіях розвитку потрібно провести дослідження зразка/зразківпартії/партій ікри за допомогою мікроскопа. Дезінфекція ікри недопускається.

Рівень смертності ікринок вищий протягом перших 24 годинпісля запліднення. Протягом цього періоду часто спостерігаєтьсясмертність на рівні 5-40%. Ікринки дегенерують в результатінеуспішного запліднення або вад розвитку. Якість партії ікри, якздається, залежить від самки, оскільки деякі самки продукують ікругарної якості постійно, тоді як деякі ніколи. Також, від однієїпартії до іншої різняться швидкість розвитку та швидкістьвилуплення. Успішно запліднені ікринки та передличинки мають гарнувиживаність, зазвичай на рівні вище 90%. При температурі 25 град.Свилуплення відбувається протягом трьох-п'яти днів післязапліднення, а жовтковий мішок поглинається приблизно через13 днів після запліднення.

Ембріональний розвиток був добре вивчений (Хісоака та Беттл)(2). Оскільки ікринки та личинки, що вилупилися, є прозорими, зарозвитком риби можна спостерігати і виявляти будь-які вадирозвитку. Приблизно через чотири години після ікрометаннянезапліднені ікринки можна відрізнити від запліднених (3). Дляцього ікринки та личинки поміщаються в дослідні посудининевеликого об'єму і вивчаються під мікроскопом.

Умови дослідження, які стосуються ранніх стадій життя,перелічені в Доповненні 2. Оптимальні показники pH та жорсткостірозчинної води складають 7,8 і 250 мг CaCO /л відповідно.

3

РОЗРАХУНКИ ТА СТАТИСТИКА

Пропонується підхід у два етапи. Спочатку проводитьсястатистичний аналіз даних щодо смертності, анормального розвиткута строків вилуплення. Потім, щодо тих концентрацій, за якими небуло виявлено жодних негативних ефектів за будь-яким із цихпараметрів, проводиться статистична оцінка довжини тулуба. Цейпідхід є рекомендованим, оскільки токсична речовина може вибіркововбивати меншу рибу, затримувати час вилуплення та спричинятизначні вади розвитку, що, таким чином, призводить до одержанняспотворених вимірювань довжини. Крім того, під час кожноїпроцедури вимірюватиметься приблизно однакова кількість риби, щозабезпечить достовірність статистичного аналізу.

ВИЗНАЧЕННЯ LC ТА EC

50 50

Відсоток ікринок та личинок, що вижили, підраховується ікоригується на смертність у контролях за формулою Ебботта (4):

C - P'

P = 100 - (------ x 100)

C

де:

P = скоригований % виживання

Р' = % виживання в дослідній концентрації

С = % виживання в контролі.

Якщо можливо, LC визначається прийнятним методом наприкінці 50дослідження.

Якщо потрібно включити морфологічні анормальності ізвикористанням методу EC , інструкції можна знайти у праці Стефана

50

(5).

ОЦІНКА НСЕК ТА КНВЕ

Метою дослідження для ікри та передличинок є порівнянняненульових концентрацій із контролем, тобто визначити НСЕК. Томунеобхідне використання процедур множинного порівняння(6)(7)(8)(9)(10).

ПОСИЛАННЯ

(1) Laale H.W., (1977) The Biology and Use of the Zebrafish(Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J.Fish Biol. 10, p. 121-173.

(2) Hisaoka K.K. and Battle H.I., (1958). The NormalDevelopment Stages of the Zebrafish Brachydanio rerio(Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, p. 311.

(3) Nagel R., (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beimZebrabarbling (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal ofApplied Ichthyology, 2, p. 173-181.

(4) Finney D.J., (1971). Probit Analysis, 3rd ed., CambridgeUniversity Press, Great Britain, p. 1-333.

(5) Stephan C.E., (1982). Increasing the Usefulness of AcuteToxicity Tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: FifthConference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E.Bishop, Eds., American Society for Testing and Materials,p. 69-81.

(6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure forComparing Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist.Assoc., 50, p. 1096-1121.

(7) Dunnett C.W., (1964) New Tables for Multiple Comparisonswith a Control. Biometrics, 20, p. 482-491.

(8) Williams D.A., (1971). A Test for Differences BetweenTreatment Means when Several Dose Levels are Compared with a ZeroDose Control. Biometrics, 27, p. 103-117.

(9) Williams D.A., (1972). The Comparison of Several DoseLevels with a Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519-531.

(10) Sokal R.R. and Rohlf F.J., (1981). Biometry, thePrinciples and Practice of Statistics in Biological Research, W.H.Freeman and Co., San Francisco.

Доповнення 2

УМОВИ ДОСЛІДЖЕННЯ, ТРИВАЛІСТЬ ТА КРИТЕРІЇ

ВИЖИВАННЯ ДЛЯ РЕКОМЕНДОВАНИХ

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

| | | | (годин) |--------------------|дослідження|-------------------------|

|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|

|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|

|Danio rerio | 25 +- 1 | - | 12-16 | 3-5 | 8-10 |Якнайшвидше| 80 | 90 |

|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|

|Oncorhynchus| 10 +- 1(1)| - | 0(a) | 30-35 | 25-30 |Якнайшвидше| 66 | 70 |

| | | | | | |(50-55 | | |

|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|

|Cyprinus | 21-25 | - | 12-16 | 5 | > 4 |Якнайшвидше| 80 | 75 |

|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|

|Oryzias |24 +- 1(1) | - | 12-16 | 8-11 | 4-8 |Якнайшвидше| 80 | 80 |

| | | | | | |(13-16 | | |

|------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+-----------+------------+------------|

|Pimephales | 25 +- 2 | - | 16 | 4-5 | 5 |Якнайшвидше| 60 | 70 |

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------

----------------

(1) Для ембріонів.

(2) Для личинок.

(a) Темрява для ембріона та личинки протягом одного тижня змоменту вилуплення за винятком часу на перевірку. Потім приглушенесвітло протягом усього дослідження.

Доповнення 3

Умови дослідження, тривалість та критерії

виживання для інших документально

підтверджених видів

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------

| | | | (годин) |--------------------|дослідження |-------------------------|

|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|

|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|

|Carassius | 24 +- 1 | - | - | 3-4 | > 4 |Якнайшвидше | - | 80 |

|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|

|Leopomis | 21 +- 1 | - | 16 | 3 | > 4 |Якнайшвидше | - | 75 |

|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|

|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|

|Menidia | 22-25 | 15-22 | 12 | 1,5 | 10 |Якнайшвидше | 80 | 60 |

|-------------+-----------+-------------+---------+-------+------------+------------+------------+------------|

|Clupea | 10 +- 1 | 8-15 | 12 | 20-25 | 3-5 |Якнайшвидше | 60 | 80 |

Усі документи

Відео

Головні новини

Головне за тиждень

Перевір свого контрагента:

Зараз коментують