Під час досліджень у напівстатичному режимі (режиміоновлення), якщо відомо, що концентрація дослідної сполуки невідрізнятиметься від номінальних величин більше, ніж на 20%,рекомендується аналізувати принаймні найвищі та найнижчіконцентрації одразу після приготування та перед оновленням води напочатку дослідження, а також щонеділі під час дослідження. Якщоочікується, що коливання концентрації дослідної речовиниперевищуватиме +- 20% від номінальної, необхідно аналізувати всідослідні концентрації, дотримуючись такого ж режиму, як і длябільш стійких сполук.
Рекомендується розраховувати результати на основіконцентрацій, отриманих після вимірювання. Проте, якщо єпереконливі свідчення того, що протягом дослідження концентраціядослідної речовини в розчині підтримувалась в межах +- 20% відномінального значення або отриманого після початковоговимірювання, результат дозволяється розраховувати, відштовхуючисьвід номінальних або початкових величин.
Може виникнути необхідність пропустити проби через фільтр(напр. з діаметром пори 0,45 мю м) або центрифугу. Переваганадається центрифугуванню. Проте, якщо дослідна речовина непоглинається фільтрами, їх використання також допускається.
Під час дослідження у всіх ємностях необхідно вимірюватизначення розчиненого кисню, рН та температури. Загальну жорсткістьта, якщо потрібно, солоність води необхідно вимірювати уконтрольних розчинах та в ємності з найвищою концентрацією. Вмістрозчиненого кисню та солоність, якщо потрібно, необхідновимірювати щонайменше тричі (на початку, приблизно в середині та вкінці дослідження). Під час досліджень в напівстатичному режимірекомендується частіше вимірювати кількість розчиненого кисню,бажано, до та після оновлення води або принаймні щотижня. РівеньрН потрібно вимірювати на початку та в кінці кожного оновленняводи під час досліджень у режимі статичного оновлення, тащонайменше щотижня для досліджень у проточному режимі. Жорсткістьта лужність вимірюється один раз протягом дослідження. Бажанобезперервно контролювати температуру принаймні у одній досліднійємності.
1.8.6. Спостереження
Вага: в кінці дослідження вимірюється сира вага (післяпротирання насухо) всієї риби, що вижила, або дослідними групами,або окремо кожної рибини. Перевага надається зважуванню задослідними групами, оскільки зважування окремих особин вимагаємаркування риби. У випадку, якщо вимірювання ваги окремих особинпотрібне для визначення питомого темпу росту, методика маркуванняне повинна бути стресогенною для риби (придатними можуть бутиальтернативи маркуванню за допомогою замороження, напр.використання кольорової риболовної волосіні).
Щодня протягом дослідження рибу необхідно перевіряти нанаявність будь-яких відхилень у зовнішньому вигляді (таких яккровотеча або втрата кольору) та поведінці. Смерть риби повиннафіксуватись, а мертва риба якомога швидше видалятись з резервуару.Не потрібно завантажувати рибу замість померлої, оскількиінтенсивність та густина завантаження дозволяють уникати впливузміни кількості риби у резервуарі на темп росту. Проте кількістькорму повинна бути відповідно змінена.
2. ДАНІ ТА ЗВІТУВАННЯ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Рекомендується участь фахівця зі статистики у плануванні тааналізі дослідження, оскільки даний метод допускає суттєвіваріювання плану дослідження, наприклад, кількості досліднихкамер, дослідних концентрацій, риби тощо. З огляду на великукількість можливих варіантів плану дослідження, конкретні вказівкищодо порядку статистичної обробки тут не подаються.
Темпи росту не враховуються для дослідних ємностей, у якихсмертність перевищила 10%. Проте, рівень смертності повиненфіксуватись для усіх дослідних концентрацій.
Незалежно від методу, що використовується для аналізу даних,основним поняттям є питомий темп росту r між часом t і t . Його
1 2
можна визначити багатьма способами, залежно від того, чи була риба
промаркована і чи потрібні дані про питомий ріст по акваріуму.
log w - log w
e 2 e 1
r = ---------------- x 100
1 t - t
2 1
log w - log w
e 2 e 1
r = ---------------- x 100
2 t - t
2 1
log w - log w
e 2 e 1
r = ---------------- x 100
3 t - t
2 1
де:
r = питомий темп росту особини
1
r = питомий темп росту по акваріуму
2
r = "псевдо" питомий темп росту
3
w , w = значення ваги окремої риби у час t та t відповідно 1 2 1 2
loge w = логарифм ваги окремої риби на початку періоду 1дослідження
loge w = логарифм ваги окремої риби в кінці періоду 2дослідження
loge w = середнє значення логарифмів w для риби в акваріумі 1 1на початку періоду дослідження
loge w = середнє значення логарифмів w для риби в акваріумі 2 2в кінці періоду дослідження
t , t = час (дні) на початку та в кінці періоду дослідження 1 2
значення r , r , r можна підрахувати за період з нульового 1 2 3по 28-ий день та якщо потрібно (напр. коли вимірювання проводилисьу 14-ий день) за періоди з нульового по 14-ий та з 14-го по28-ий дні.
2.1.1. Аналіз результатів за регресією (моделювання реакціїна концентрацію)
У цьому методі аналізу встановлюються відповідні математичніспіввідношення між питомим темпом росту та концентрацією, щодозволяє підрахувати "EC ", тобто будь-яке значення ЕС. За
x
використання цього методу не потрібно підраховувати значення r для
окремих особин (r ), натомість аналіз базується на середньому
1
значенні питомого темпу збільшення ваги по акваріуму r (r ).
2
Даному методу надається перевага. Він також краще підходить для
дрібних видів риби.
Темпи середнього питомого росту по акваріуму (r ) потрібно 2графічно нанести в залежності від концентрації, з метоюдослідження залежності між концентрацією та реакцією.
Для вираження залежності між r та концентрацією необхідно 2підібрати належну модель та обґрунтувати вибір.
Якщо кількість риби, що вижила у кожному акваріумівідрізняється, під час підбору моделі, незалежно від того чи євона простою чи нелінійною, необхідно задавати вагові коефіцієнтидля врахування різних розмірів груп.
Метод підбору моделі повинен давати змогу підрахувати,наприклад, значення ЕС та його дисперсію (стандартну похибку або
20
довірчий інтервал). На основі даних необхідно створити графік
підібраної моделі таким чином, щоб була видною її адекватність
(8)(18)(19)(20).
2.1.2. Аналіз результатів визначення НСЕК
У випадку, якщо дослідження передбачало дублюваннярезервуарів з усіма концентраціями, визначення НСЕК можепроводитись на основі аналізу дисперсії (ANOVA) середньогопитомого темпу росту по акваріуму (див. Розділ 2.1), якийсупроводжується відповідним аналітичним методом (напр. тестДюннета або Вільямса (12)(13)(14)(21)), що полягає у порівняннісереднього значення r для кожної концентрації із середнімзначенням r для контролів, з метою визначення найнижчоїконцентрації, за якої між цими значеннями спостерігається суттєварізниця, за рівня ймовірності 0,05. Якщо для параметричних методівне виконуються потрібні припущення - розподілення відрізняєтьсявід нормального (напр. тест Шапіро-Вілка) або неодноріднадисперсія (тест Барлета), доцільно звести дані до одноріднихдисперсій перед виконанням дисперсійного аналізу, або ввестикоефіцієнти ваги.
Якщо ж у дослідженні не використовувались дублюючі резервуарикожної концентрації, аналіз дисперсії за резервуарами буденечутливим або неможливим. У такій ситуації допустимим рішенням єпобудувати аналіз дисперсії на інтенсивності псевдо-питомого ростуr для кожної особини.
3
Тоді середнє значення r можна порівняти із середнім r 3 3контролів. НСЕК можна визначити як описано вище. Потрібно визнати,що такий метод не враховує і не захищає від можливості дисперсіїміж резервуарами, окрім того, що враховує дисперсію між окремимиособинами. Проте, як показав досвід (8), дисперсія міжрезервуарами є незначною, в порівнянні з дисперсією в межахрезервуару (між особинами). Якщо окремі особини не враховуютьсяпід час аналізу, необхідно надати метод визначення аномальнихзначень та обґрунтування використання такого методу аналізу.
2.2. ПОЯСНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати дослідження потрібно пояснювати з обережністю,якщо виміряні концентрації токсинів у дослідному розчинінаближаються до межі визначення або, у напівстатичних режимах,коли концентрація дослідної речовини падає після додавання щойноприготованого розчину та перед оновленням води.
2.3. ЗВІТ ПРО ДОСЛІДЖЕННЯ
- Звіт про дослідження повинен включати наступні дані:
2.3.1. Дослідна речовина
- фізична природа та фізико-хімічні властивості;
- дані про хімічну ідентифікацію, включаючи чистоту тааналітичний метод кількісного визначення дослідної речовини, якщопотрібно.
2.3.2. Дослідні види
- наукова назва, можливо
- вид, розмір, постачальник, будь-яка попередня обробка тощо.
2.3.3. Дослідні умови
- дослідна процедура, що використовувалась (напр.напівстатичний режим/оновлення, протічний режим, завантаження,густина завантаження тощо),
- план дослідження (напр. кількість дослідних ємностей,дослідні концентрації то дублюючі розчини, кількість риби уємностях)
- метод підготовки основних розчинів та частота оновлень води(необхідно вказувати розчинник та його концентрацію, якщовикористовується)
- номінальні дослідні концентрації, середні значеннявиміряних показників та їх стандартні відхилення у досліднихємностях, а також методи їх підрахунку та підтвердження того, щовимірювання стосуються концентрацій дослідної речовини у наявнихрозчинах,
- властивості води для розбавлення: рН, жорсткість, лужність,температура, концентрація розчиненого кисню, рівні хлорнихзалишків (якщо вимірювались), загальний вміст органічного вуглецю,суспендовані тверді частки, солоність дослідного середовища (якщовимірювалась) та будь-які інші виконані виміри,
- якість води у дослідних ємностях: рН, жорсткість,температура та концентрація розчиненого кисню,
- докладні відомості про годування (напр. тип корму (кормів),постачальник, раціон та частота годування).
2.3.4. Результати:
- підтвердження того, що виживання риби в контрольнихрозчинах відповідає критеріям якості, та дані про смертність увсіх дослідних концентраціях,
- статистична аналітична методика, що використовувалась,статистичні дані, що ґрунтуються на дублюючих резервуарах, абоокремих особинах, обробка даних та обґрунтування методик, щовикористовувались,
- табличні дані про питому та середню вагу риби у нульовий,14-ий (якщо вимірювалась) та 28-ий дні дослідження, значеннясереднього темпу росту по резервуару або, якщо потрібно,псевдо-питомого темпу росту за 0-28 або за 0-14 та 14-28 днідослідження,
- результати статистичного аналізу (тобто, аналізу дисперсіїабо ANOVA), бажано, у формі таблиць та графіків, а також значенняКНВЕ або EC , за можливості, стандартні похибки, якщо потрібно,
x
- випадки нетипової реакції риби або видимі відхиленнязовнішнього вигляду, спричинені дослідною сполукою.
3. ПЕРЕЛІК ДОВІДКОВОЇ ЛІТЕРАТУРИ
(1) Solbe J.F. de LG (1987) Environmental Effects ofChemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method forStudying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. WRcReport No PRD 1388-M/2.
(2) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J., (1990) EEC RingTest of a Method for Determining the Effects of Chemicals on theGrowth Rate of Fish. Final Report to the Commission of theEuropean Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
(3) Crossland N.O. (1985) A method to evaluate effects oftoxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, p. 1855-1870.
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M.,Munk R., Scholz N. and Hufte B.B., (1991) Effect of3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish(Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study.Ecotox. Environ. Safety, 21, p. 157-164.
(5) Yamamoto, Tokio., (1975) Series of stock cultures inbiological field. Medaka (killifish) biology and strains. KeigakuPublish. Tokio, Japan.
(6) Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E.,Leonard, E.N. and Johnson, R.D., (1995) Acute and long-termeffects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryziaslatipes).Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, p. 287-297.
(7) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L., (1991)Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanesemedaka (Oryzias latipes). Ecological Research SeriesEPA-600/3-91-063. U.S. Environmental Protection Agency, Duluth,Minesota. L 142/598 EN Official Journal of the European Union31.5.2008
(8) Stephan C.E. and Rogers J.W., (1985) Advantages of usingregression analysis to calculate results of chronic toxicitytests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium,ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, Eds., American Societyfor Testing and Materials, Philadelphia, p. 328-338.
(9) Environment Canada, (1992) Biological test method:toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbowtrout, coho salmon, or Atlantic salmon). Conservation andProtection, Ontario, Report EPS 1/RM/28, p. 81.
(10) Cox D.R., (1958) Planning of experiments. Wiley Edt.
(11) Pack S., (1991) Statistical issues concerning the designof tests for determining the effects of chemicals on the growthrate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts onAquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
(12) Dunnett C.W., (1955) A Multiple Comparisons Procedurefor Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist.Assoc., 50, p. 1096-1121.
(13) Dunnett C.W., (1964) New tables for multiple comparisonswith a control. Biometrics, 20, p. 482-491.
(14) Williams D.A., (1971) A test for differences betweentreatment means when several dose levels are compared with a zerodose control. Biometrics 27, p. 103-117.
(15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T., (1994) Atechnique using sequential feedings of different coloured food todetermine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchusmykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, p. 123-133.
(16) Quinton, J. C. and Blake, R.W., (1990) The effect offeed cycling and ration level on the compensatory growth responsein rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology,37, p. 33-41.
(17) Post, G., (1987) Nutrition and Nutritional Diseases ofFish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications,Inc. Neptune City, New Jersey, USA. p. 288.
(18) Bruce, R.D. and Versteeg D.J., (1992) A statisticalprocedure for modelling continuous toxicity data. Environ.Toxicol. Chem. 11, p. 1485-1494.
(19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L.,Reichenbach, J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O., (1989)Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival andgrowth test; intra and interlaboratory study. report EA-6189(American Petroleum Institute Publication, No 4468). ElectriсPower Research Institute, Palo alto, CA.
(20) Norbert-King T.J., (1988) An interpolation estimate forchronic toxicity: the ICp approach. US Environmental ProtectionAgency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. Tech. Rep.No 05-88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept.1988. p. 12.
(21) Williams D.A., (1972) The comparison of several doselevels with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510-531
Додаток 1
ВИДИ РИБИ, ЩО РЕКОМЕНДУЮТЬСЯ ДЛЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
ТА ПРИДАТНІ ДОСЛІДНІ УМОВИ
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
| Види |Рекомендований|Фотоперіод|Рекомендований| Потрібна |Інтенсивність| Густина | Раціон | Тривалість|
| | діапазон | (години) | діапазон | точність |завантаження |завантаження| |дослідження|
| | дослідної | | початкової |вимірювань| (г/л) | (на літр) | | (дні) |
| | температури | |ваги риби (г) | | | | | |
| | (С) | | | | | | | |
|---------------+--------------+----------+--------------+----------+-------------+------------+-----------+-----------|
|Рекомендовані | | | | | | | | |
|види | | | | | | | | |
|Oncorhynchus | 12,5-16,0 | 12-16 | 1-5 |з точністю| | 1,2-2,0 |Спеціальний| >= 28 |
|mykiss | | | |до 100 мг | | |сухий | |
|райдужна форель| | | | | | |піджарений | |
| | | | | | | |лососевий | |
| | | | | | | |корм | |
|---------------+--------------+----------+--------------+----------+-------------+------------+-----------+-----------|
|Інші види, | | | | | | | | |
|використання | | | | | | | | |
|яких | | | | | | | | |
|задокументовано| | | | | | | | |
|Danio rerio | 21-25 | 12-16 | 0,050-0,100 |з точністю| | 0,2-1,0 |Живий корм | >= 28 |
|даніо | | | |до 1 мг | | |(Brachionus| |
| | | | | | | |Artemia) | |
|Oryzias latipes| 21-25 | 12-16 | 0,050-0,100 |з точністю| | 0,2-1,0 |Живий корм | >= 28 |
|рисівка | | | |до 1 мг | | |(Brachionus| |
|(Медака) | | | | | | |Artemia) | |
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Додаток 2
ДЕЯКІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРИДАТНОЇ ВОДИ ДЛЯ РОЗБАВЛЕННЯ
------------------------------------------------------------------
| | Речовина | Граничний |
| | | вміст |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 1 |Тверді частки |< 20 мг/л |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 2 |Загальний вміст органічного вуглецю |< 2 мг/л |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 3 |Неіонізований аміак |< 1 мю г/л |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 4 |Залишковий хлор |< 10 мю г/л |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 5 |Загальний вміст фосфорорганічних пестицидів |< 50 нг/л |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 6 |Загальний вміст хлорорганічних пестицидів та |< 50 нг/л |
| |поліхлорованих біфенілів | |
|-----+---------------------------------------------+------------|
| 7 |Загальний вміст органічного хлору |< 25 нг/л |
------------------------------------------------------------------
Додаток 3
Логарифмічний ряд концентрацій, придатних
для дослідження токсичності (9)
------------------------------------------------------------------
|Колонка (Кількість концентрацій між 100 і 10 або між 10 та 1)(*)|
|----------------------------------------------------------------|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| 32 | 46 | 56 | 62 | 68 | 72 | 75 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | | 1,5 | 2,7 | 4,2 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | | 1,0 | 1,9 | 3,2 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | | | 1,4 | 2,4 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | | | 1,0 | 1,8 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | | | | 1,3 |
|--------+--------+--------+--------+--------+--------+----------|
| | | | | | | 1,0 |
|----------------------------------------------------------------|
|(*) З кожної колонки можна обрати послідовність з п'яти (або |
|більше) концентрацій. Проміжні значення між концентраціями у |
|колонці (х) знаходяться у колонці (2х+1). Вказані величини |
|можуть позначати концентрації, виражені у відсотках на одиницю |
|об'єму або ваги (мг/л або мю г/л). За потреби, значення можна |
|множити або ділити на будь-який степінь 10. Колонку 1 можна |
|використовувати, якщо спостерігалась суттєва невизначеність щодо|
|рівня токсичності. |
------------------------------------------------------------------
C.15. РИБА, ЕКСПРЕС-ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТОКСИЧНІСТЬ
ДЛЯ РІЗНИХ СТАДІЙ РОЗВИТКУ ЕМБРІОНІВ ТА ПЕРЕДЛИЧИНОК
1. МЕТОД
Цей метод експрес-дослідження на токсичність є аналогомдослідження ОЕСР TG 212 (1998).
1.1. ВСТУП
Цей метод експрес-дослідження на токсичність для різнихстадій розвитку ембріонів та передличинок охоплює стадії життя відщойно відкладених ікринок до кінцевої стадії розвиткупередличинок. У дослідженні не передбачається годування ембріонівта передличинок, тому дослідження припиняється, коли передличинкавсе ще одержує живлення із жовткового мішка.
Дослідження призначене для з'ясування летального, і внезначній мірі, сублетального впливу хімічних речовин напіддослідні види, що знаходяться на певних стадіях розвитку.Дослідження дозволяє одержати корисну інформацію і може:(а) послужити джерелом проміжної інформації між дослідженнямилетального та сублетального впливу; (b) використовуватися якпопереднє дослідження при проведенні комплексних досліджень дляранньої стадії розвитку або досліджень хронічної токсичності і (с)використовуватися для дослідження видів у разі, якщорибогосподарські технології є недостатньо досконалими, щоб охопитиперіод переходу від ендогенного до екзогенного живлення.
Необхідно мати на увазі, що лише дослідження, які охоплюютьусі стадії життя риби, можуть дати точну оцінку хронічноїтоксичності хімічних речовин для риби, і що в разі неповногоохоплення життєвих стадій може зменшитись чутливість досліджень,що в результаті призведе до недооцінки хронічної токсичності. Томуочікується, що дослідження ембріонів та передличинок буде меншчутливим, ніж комплексне дослідження для ранньої стадії розвитку,особливо, що стосується хімічних речовин з високою ліпофільністю(log P > 4) та хімічних речовин зі специфічною токсичною дією.
ow
Однак різниця між чутливістю обох досліджень буде менше
проявлятися для хімічних речовин з неспецифічним, наркотичним
ефектом (1).
До публікації цього дослідження для ембріонів та передличинокнайбільше досвіду щодо нього було одержано стосовно прісноводноїриби Danio rerio Гамільтона-Буханана (Teleostei, Cyprinidae,звичайна назва - смугастий даніо). Тому більш детальна інформаціящодо дослідження для цього виду наведена в Доповненні 1. Це невиключає використання дослідження для інших видів, щодо яких такожнаявний досвід (Таблиця 1).
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Найнижча спостережена ефективна концентрація (НСЕК): найнижчаконцентрація дослідної речовини, при якій спостерігається значнийефект (на рівні p < 0,05) у порівнянні з контролем. Проте всітестові концентрації, які є вищими за НСЕК, повинні мати шкідливийвплив, що дорівнює або вищий за той, який спостерігається приНСЕК.
Концентрація, що не призводить до видимих ефектів (КНВЕ):концентрація дослідної речовини, що безпосередньо нижча НСЕК.
1.3. ПРИНЦИП ДОСЛІДЖЕННЯ
Риба на стадіях ембріона та передличинки піддається дії низкиконцентрацій дослідної речовини, розчиненої у воді. За протоколомможливий вибір між напівстатичною та проточною процедурами. Вибірзалежить від характеру дослідної речовини. Дослідженнярозпочинається поміщенням запліднених ікринок у дослідні камери іприпиняється безпосередньо до того, як жовтковий мішок будь-якоїличинки в будь-якій із дослідних камер буде повністю поглинений,або до початку загибелі від голоду контрольних зразків. Летальнийта сублетальний ефект оцінюється та порівнюється з контролем,визначається найнижча концентрація, що призводить до видимихефектів, і відповідно, концентрація, що не призводить до видимихефектів. Як альтернатива, для оцінки концентрації, яка призведе дозаданого процентного відношення ефекту, може використовуватисяаналіз за допомогою регресійної моделі (наприклад, LC/EC , де x -
x
задане процентне відношення ефекту).
1.4. ІНФОРМАЦІЯ ЩОДО ДОСЛІДНОЇ РЕЧОВИНИ
Повинні бути наявними результати дослідження на гострутоксичність (див. Метод С.1.), бажано проведеного з видами,вибраними для цього дослідження. Ці результати можуть бутикорисними при виборі необхідного діапазону концентрацій длядослідження ранньої стадії розвитку. Повинні бути відомимирозчинність води (включаючи розчинність у дослідній воді) тапружність парів дослідної речовини. Повинен бути наявнимдостовірний метод аналізу кількості речовини в дослідних розчинахіз відомою і підтвердженою точністю та межею виявлення.
Інформація щодо дослідної речовини, яка може бути корисноюпри встановленні умов дослідження, включає в себе: структурнуформулу, чистоту речовини, стабільність на світлі, стабільність вумовах дослідження, pK , P та результати дослідження на повну
a ow
біологічну розкладність (див. Метод С.4.).
1.5. ДОСТОВІРНІСТЬ ДОСЛІДЖЕННЯ
Достовірність дослідження підтверджується такими умовами:
- загальний рівень виживання запліднених ікринок у контроліі, якщо прийнятно, в посудинах, що містять лише розчинник, більшийабо дорівнює межам, визначеним у Доповненнях 2 та 3;
- концентрація розчиненого кисню протягом всього дослідженняперебуває в межах від 60 до 100% показника насичення повітря(ASV);
- температура води не відрізняється більше ніж на+- 1,5 град.С між дослідними камерами або між послідовними днями убудь-який час протягом дослідження і перебуває в межахтемпературних діапазонів, визначених для дослідних видів(Доповнення 2 та 3).
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Дослідні камери
Можуть використовуватися будь-які скляні або інші хімічноінертні посудини. Розміри посудин повинні бути достатніми, щобвідповідати рівню завантаження (див. Секцію 1.7.1.2).Рекомендується довільно розміщувати дослідні камери в досліднійзоні. Довільне блочне розташування, при якому кожен варіантприсутній у кожному блоці, більш бажане, ніж повністю довільнерозташування, у разі якщо наявні систематичні прояви, які можнабуде контролювати за допомогою блочного розташування. Блочнерозташування, якщо воно використовується, повинне бути враховане вподальшому аналізі даних. Дослідні камери повинні бути захищенівід небажаного впливу.
1.6.2. Вибір видів риб
Рекомендовані види риб зазначені в Таблиці 1А. Це не виключаєвикористання інших видів (приклади подані в Таблиці 1В), але можебути необхідною адаптація дослідних процедур для забезпеченняприйнятних умов дослідження. У такому випадку повинні бутинаведені обґрунтування вибору видів та експериментальних методів.
1.6.3. Розведення риб-плідників
Інформацію щодо сприятливих умов розведення маточного стадаможна знайти в OECD TG 210(1) та посиланнях (2)(3)(4)(5)(6).
1.6.4. Поводження з ембріонами та личинками
Ембріони та личинки можуть поміщатися в невеликі посудини,розташовані в головній посудині, одна сторона чи кінчик якихзакриті сіткою, через яку в посудини може проходити досліднийрозчин. Нетурбулентний потік розчину через ці невеликі посудиниможе забезпечуватися шляхом підвішування їх до важеля, якийпід'єднаний до механізму руху вгору і вниз, причому організмиповинні завжди бути занурені; може також використовуватися сифоннасистема. Запліднені ікринки лососевих риб можна розміщувати нарешітках або сітках з апертурою достатньою для того, щоб личинкивипали після вилуплення. Доцільне використання пастерівськоїпіпетки для вилучення ембріонів та личинок у напівстатичнихдослідженнях з повним щоденним оновленням (див. частину 1.6.6).
У разі використання контейнерів для ікринок або решіток чисіток для підтримки ікринок, після вилуплення личинок(1) потрібноїх прибрати, крім випадків, коли сітки використовуються длязапобігання втечі риби. При переміщенні личинок потрібнозапобігати їх контакту з повітрям, а для звільнення риби ізконтейнерів для ікринок не можна використовувати сачки (цезастереження може не застосовуватися стосовно менш вразливихвидів, наприклад, коропа). Строки такого переміщення залежать відвиду і воно не завжди може бути необхідним. Для проведеннядослідження за напівстатичним методом можуть використовуватисялабораторні склянки або неглибокі контейнери, обладнані, в разінеобхідності, сітчастою перегородкою, розташованою трохи вище днапосудини. Якщо об'єм цих контейнерів достатній для задоволеннявимог щодо завантаження (див. 1.7.1.2), переміщення ембріонів чиличинок не потрібне.
----------------
(1) ОЕСР, Париж, 1992, Інструкція щодо проведення досліджень210, "Риба, дослідження на токсичність для ранньої стадіїрозвитку".
1.6.5. Вода
Для дослідження підходить будь-яка вода, яка відповідаєхімічним характеристикам розчинної води, зазначеним у Доповненні4, і в якій контроль виживання дослідних видів не гірший ніжописано в Доповненнях 2 та 3. Вода повинна бути незмінної якостіпротягом усього дослідження. Показник pH повинен залишатися вмежах +- 0,5 пунктів. Щоб запобігти негативному впливу розчинноїводи на результати дослідження (наприклад, комплексоутворення вдослідній речовині) або на продуктивність маточного стада,потрібно періодично брати проби води для аналізу. Дослідження водина вміст важких металів (наприклад, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd та Ni),основних аніонів та катіонів (наприклад, Ca, Mg, Na, K, Cl таSO ), пестицидів (наприклад, загальний вміст фосфорорганічних та
4
загальний вміст хлорорганічних пестицидів), загальний вміст
органічного вуглецю та твердих зависей повинні проводитися,
наприклад, кожні три місяці, якщо відомо, що розчинна вода має
відносно незмінну якість. Якщо вода показує незмінну якість
протягом принаймні одного року, аналізи можуть бути менш частими,
а періодичність їх проведення може бути подовжена (наприклад,
проводитись щопівроку).
1.6.6. Дослідні розчини
Дослідні розчини визначених концентрацій готуються шляхомрозбавлення базового розчину. Базовий розчин краще готувати шляхомпростого збовтування або змішування дослідного розчину в розчиннійводі за допомогою механічних засобів (наприклад, збовтування чиультразвукової обробки). Для одержання базового розчину необхідноїконцентрації можуть використовуватися сатураційні колони(розріджувальні колони). Наскільки можливо, потрібно уникативикористання розчинників або диспергаторів (розчинювальнихреагентів); однак у деяких випадках вони можуть бути потрібні дляприготування базового розчину необхідної концентрації. Доприйнятних розчинників належать: ацетон, етанол, метанол,диметилформамід та триетиленгліколь. До прийнятних диспергаторівналежать: Cremophor RH40, Tween 80, метилцелюлоза 0,01% та HCO-40.Потрібно особливо обережно застосовувати повністю біологічнорозкладні реагенти (наприклад, ацетон) та/або реагенти з високоюлеткістю, оскільки вони можуть призвести до проблем з накопиченнямбактерій у дослідженнях з проточною процедурою. При використаннірозчинювального реагенту, він не повинен мати істотного впливу навиживаність і видимого негативного впливу на стадії ранньогорозвитку, що аналізується за допомогою порівняння з контрольнимизразками, які перебувають лише в розчиннику. Однак потрібно робитивсе можливе для уникнення використання таких матеріалів.
Що стосується напівстатичного методу, можуть застосовуватисядві різні процедури оновлення середовища: (i) приготування новихдослідних розчинів у чистих посудинах і обережне перенесенняікринок та личинок, що вижили, в нові посудини в невеликійкількості старого розчину з недопущенням контакту з повітрям або(ii) збереження дослідних організмів у старих посудинах із зміноюпевної кількості (принаймні трьох четвертей) дослідної води.Періодичність оновлення середовища залежить від стабільностідослідного розчину, але рекомендується щоденне оновлення води.Якщо попередні дослідження стабільності (див. Секцію 1.4)показують, що концентрація дослідної речовини є нестабільною(тобто виходить за рамки 80-120% від номіналу або падає нижче 80%від виміряної початкової концентрації) протягом періоду оновлення,потрібно розглянути можливість проведення проточного дослідження.У будь-якому разі, потрібно запобігти завданню стресу личинкам підчас процесу оновлення води.
Що стосується досліджень за проточною методикою, для подачінизки концентрацій до дослідних камер використовується система,яка забезпечує постійну подачу та розрідження базового розчинудослідної речовини (наприклад, дозуючий насос, пропорційнийрозріджувач, сатураційна система). Рівень подачі базових розчинівта розчинної води повинен періодично перевірятись, бажано щодня, іне повинен відрізнятися більше ніж на 10% протягом усьогодослідження. Прийнятним був визнаний рівень подачі, який дорівнюєоб'ємам принаймні п'яти дослідних камер, за 24 години (2).
1.7. ПРОЦЕДУРА
Корисна інформація щодо ефективності досліджень натоксичність для ембріонів та передличинок риби наведена влітературі, деякі приклади якої включені в секцію "Посилання"цього тексту (7)(8)(9).
1.7.1. Застосування
1.7.1.1. Тривалість
Найкраще розпочинати дослідження протягом 30 хвилин післязапліднення ікринок. Ембріони занурюються в дослідний розчин до,або якнайшвидше після початку стадії дроблення бластодиска і убудь-якому разі до настання стадії гаструли. Над ікринками,одержаними від постачальника, може не бути можливості розпочатидослідження одразу після запліднення. Оскільки затримка початкудослідження може значно вплинути на його чутливість, дослідженняповинно розпочатись протягом восьми годин після запліднення.Оскільки личинки не одержують живлення протягом перебування всередовищі, дослідження повинно бути припинене безпосередньо дотого, як жовтковий мішок будь-якої личинки в будь-якій іздослідних камер буде повністю поглинений, або до початку загибелівід голоду контрольних зразків. Тривалість залежить від видів, щовикористовуються для дослідження. Деяка рекомендована тривалістьнаведена в Доповненнях 2 та 3.
1.7.1.2. Завантаження
Кількість запліднених ікринок на початку дослідження повиннабути достатньою для задоволення статистичних вимог. Вони повиннібути довільно розподілені між варіантами дослідження, а на кожнуконцентрацію повинно припадати принаймні 30 запліднених ікринок,розподілених порівну (або якомога більш рівномірно, оскількиодержання рівних кількостей може бути складним для деяких видів)між принаймні трьома аналогічними дослідними камерами. Рівеньзавантаження (біомаси на об'єм дослідного розчину) повинен бутидостатньо низьким, щоб витримувалася без аерації концентраціярозчиненого кисню принаймні 60% ASV. У разі використанняпроточного методу, рекомендований рівень завантаження, що неперевищує 0,5 г/л на 24 години і не перевищує 5 г/л розчину вбудь-який час (2).
1.7.1.3. Світло і температура
Світловий період та температура дослідної води залежать відпіддослідних видів (Доповнення 2 та 3). Для цілей контролютемператури може бути доцільним використання додаткової дослідноїпосудини.
1.7.2. Дослідні концентрації
Зазвичай достатнє використання п'яти концентрацій дослідноїречовини, інтервал між якими дорівнює постійному фактору, що неперевищує 3,2. Діапазон дослідних концентрацій вибирається,виходячи з кривої відношення LC до періоду перебування в
50
середовищі. У деяких випадках може бути доцільним використання
менше п'яти концентрацій, наприклад, у граничних дослідженнях, а
також менший крок концентрацій. У разі використання менше п'яти
концентрацій повинно надаватися обґрунтування. Дослідження з
концентраціями речовини, що вищі ніж LC протягом 96 годин або
50
100 мг/л, залежно від того, що менше, проводити не потрібно.
Речовини не потрібно досліджувати в концентрації, що перевищує
межу їх розчинності в дослідній воді.
У разі використання розчинювального реагенту для приготуваннядослідних розчинів (див. Секцію 1.6.6), його кінцева концентраціяв дослідних посудинах не повинна перевищувати 0,1 мл/л і повиннабути однаковою в усіх посудинах.
1.7.3. Контроль
Під час дослідження повинен використовуватися один контроль урозчинній воді (належним чином скопійований), а також, у разінеобхідності, один контроль із розчинювальним реагентом (належнимчином скопійований).
1.7.4. Періодичність аналітичних перевірок і вимірювань
Протягом усього дослідження періодично перевіряютьсяконцентрації дослідної речовини.
У напівстатичних дослідженнях, де сталість концентраціїдослідної речовини очікується на рівні +- 20% від номіналу (тобтов межах від 80 до 120%; див. Секцію 1.4 та 1.6.6), рекомендуєтьсяпроведення аналізу, як мінімум, найвищої та найнижчої концентраціїв щойно приготовленому розчині, а також концентрації безпосередньоперед оновленням - принаймні у трьох випадках, рівномірнорозподілених у часі протягом дослідження (тобто, аналізипроводяться на зразку із одного розчину - щойно приготовленого іпри оновленні).
У дослідженнях, де сталість концентрації дослідної речовинине очікується на рівні +- 20% від номіналу (на основі даних простабільність речовини), необхідно аналізувати усі дослідніконцентрації як у щойно приготовленому розчині, так і прионовленні, але в такому ж режимі (тобто принаймні в трьохвипадках, рівномірно розподілених у часі протягом дослідження).Визначення концентрації дослідної речовини до оновлення потрібнопроводити лише в одній реплікації посудини на кожну досліднуконцентрацію. Інтервал між перевірками не повинен перевищувати сімднів. Рекомендується, щоб результати дослідження ґрунтувались нарезультатах вимірювання концентрацій. Однак, якщо наявні дані, якісвідчать про те, що концентрація дослідної речовини в розчині булапротягом усього дослідження задовільним чином витримана в межах+- 20% від номіналу або виміряної початкової концентрації,результати можуть ґрунтуватись на номінальному та виміряномупочатковому значеннях.
