(13) OECD, (2002) Extended Expert Consultation Meeting on TheIn Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2ndNovember 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
(14) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R. D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M., (1998) AnEvaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for SkinCorrosion. ATLA 26, p. 709-720.
(15) Mosmann, T., (1983) Rapid colorimetric assay forcellular growth and survival: application to proliferation andcytotoxicity asssays. J.Immunol. Meth. 65, p. 55-63.
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J.,and Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancytesting. Toxicology In Vitro 8, p. 889-891.
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A.,Boutwstra, J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructuralcharacterisation of reconstructed skin models. InternationalJournal of Pharmaceutics. 203, p. 211-225.
(18) Tinois, E., Gaetani, Q., Gayraud, B., Dupont, D.,Rougier, A., Pouradier, D.X., (1994) The Episkin model: Successfulreconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro SkinToxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach,p. 133-140
(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M,Thivolet J (1991). In vitro and post-transplantationdifferentiation of human keratinocytes grown on the human type IVcollagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental CellResearch 193, p. 310-319
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., andRosenberg, H., (1992) The organotypic culture of human skinkeratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.Cytotechnology 9, p. 163-171.
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier,S.F., Parentau, N.L., (1994) Development of a bilayered livingskin construct for clinical applications. Biotechnology andBioengineering 43/8, p. 747-756.
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J., (1995) Acritical assessment of the use of microculture tetrazolium assaysto measure cell growth and function. Growth Regulation 5,p. 69-84.
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C., Elliot, G.R.,Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van deSandt, J.J.M., and Botham, P.A., (2001) A prevalidation study onin vitro tests for acute skin irritation: results and evaluationby the Management Team. Toxicology In Vitro 15, p. 57-93.
B.41. ТЕСТ НА ФОТОТОКСИЧНІСТЬ 3T3 NRU IN VITRO
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 432(2004).
1.1. ВСТУП
Фототоксичність визначається як токсична реакція на речовину,яку застосовують до тіла, яка або виявляється або збільшується(очевидно, при нижчих рівнях дозування) після піддавання світлу,або спричиняється опроміненням шкіри після систематичногозастосування речовини.
Тест на фототоксичність 3T3 NRU in vitro використовується длявизначення фототоксичного потенціалу тестованої речовини,викликаного збудженням хімічного реагенту після експозиції досвітла. Тест оцінює фотоцитотоксичність через відповідне зменшенняжиттєздатності клітин, які піддаються дії хімічного реагента заумови присутності/відсутності світла. Речовини, що розпізнають зацим тестом, є ймовірно фототоксичними in vivo, після системногозастосування та розподілу по шкірі або після місцевогозастосування.
Повідомляють, що багато видів хімічних речовин викликаютьфототоксичні впливи (1)(2)(3)(4). Їхньою спільною властивістю єздатність поглинати енергію світла в межах діапазону сонячногосвітла. За першим законом фотохімії (законом Гротгуса Дрейпера),фотореакція потребує достатнього поглинання світлового кванта.Таким чином, перед тим, як розглянути біологічне тестування,УФ/видимий спектр поглинання тестованої хімічної речовини маєвизначатись згідно Інструкцій щодо проведення тесту ОЕСР 101. Булозапропоновано, що якщо молярний коефіцієнт екстинкції /поглинання
-1 -1
є меншим, ніж 10 літрів x mol x cm , то хімічна речовина
вірогідно не є фотореактивною. Таку хімічну речовину не потрібно
тестувати за допомогою 3T3 NRU-тесту in vitro на фототоксичність
або із використанням будь-якого іншого біологічного тесту на
шкідливий вплив фотохімічних реакцій (1)(5). Див. також Додаток 1.
Надійність та значимість тесту на фототоксичність 3T3 NRU invitro була нещодавно оцінена (6)(7)(8)(9). Тест на фототоксичність3T3 NRU in vitro виявився пророкуючим гострі фототоксичні явища утварин та людей in vivo. Цей тест не призначено для прогнозуванняінших зворотних ефектів, що можуть виникнути внаслідок поєднаноїдії хімічної речовини та світла, наприклад, він не спрямований навиявлення фотогенотоксичності, фотоалергії абофотоканцерогенності, а також не дозволяє оцінити фототоксичнийпотенціал. До того ж, тест не було призначено для виявленнянепрямих механізмів фототоксичності, впливів метаболітів тестовоїречовини, або впливів сумішей.
Тоді як, на теперішній момент використання метаболічнихсистем є загальною вимогою до всіх тестів in vitro дляпрогнозування генотоксичного та канцерогенного потенціалу, щостосується фототоксикології, існують лише поодинокі приклади, колинеобхідна метаболічна трансформація для хімічної речовини для тогощоб діяти у якості фототоксину in vivo або in vitro. Таким чином,здійснення цього тесту з метаболічною системою активації невважається ні необхідним, ні науково виправданим.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Опромінювання: інтенсивність ультрафіолету (УФ) або видимевідбите світло на поверхні, що вимірюється в Вт/кв.м абомВт/кв.см.
Доза світла: кількість (= інтенсивність x час) ультрафіолету(УФ) або видимого відбитого випромінювання на поверхні, щовідображається у Джоулях (= Вт x S) на ділянку поверхні, напр.Дж/кв.м або Дж/кв.см.
УФ діапазони хвиль світла: позначення, рекомендовані МКО(Міжнародна комісія по освітленню), є УФА (315-400 нм), УФВ(280-315 нм) і УФС (100-280 нм). Також використовуються іншіпозначення; розподіл між УФВ та УФА зазвичай ставлять при 320 нм,а УФА може поділятись на УФ-А1 і УФ-А2 з розподілом при приблизно340 нм.
Життєздатність клітин: параметр для вимірювання загальноїактивності популяції клітин (наприклад, поглинання життєздатногобарвника нейтрального червоного у клітинних лізосомах), який,залежить від виміряної кінцевої точки та плану проведення тесту,що використовується, і співвідноситься із загальною кількістюта/чи з життєздатністю клітин.
Відносна життєздатність клітин: життєздатність клітин,виражена відносно контролів розчинника (негативних), якіпроводяться протягом всієї процедури тестування (або +Irr або-Irr), але не обробляються досліджуваною хімічною речовиною.
ФПФ (Фото-Подразнюючий-Фактор): фактор, спричиненийпорівнянням двох однаково ефективних цитотоксичних концентрацій(IC ) тестованої речовини, отриманий за відсутності (-Irr) та у
50
присутності (+Irr) не цитотоксичного опромінювання з УФА/vis
світла.
IC : концентрація досліджуваної хімічної речовини, при якій 50життєздатність клітини зменшується на 50%.
СФЕ (Середній показник Фото Ефекту): вимірювання походить відматематичного аналізу кривих реакції на концентрацію, якіотримують за відсутності (-Irr) та у присутності (+Irr) нецитотоксичного опромінювання з УФА/vis світла.
Фототоксичність: гостра токсична реакція, яка з'являєтьсяпісля першого контакту шкіри з певними хімічними речовинами таподальшого піддавання дії світла, або, яка провокуєтьсяопроміненням шкіри після систематичного введення хімічноїречовини.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Тест на фототоксичність 3T3 NRU in vitro має за основупорівняння цитотоксичності хімічної речовини, коли вона тестуєтьсяу присутності і за відсутності дії не цитотоксичної дози штучногосонячного світла. Цитотоксичність в цьому тесті виражається, якзалежне від концентрації зменшення поглинання життєздатногобарвника, нейтрального червоного, що вимірюється коли проходить24 години після обробки тестованою хімічною речовиною таопроміненням (10). НЧ - це слабкий катіоноактивний барвник, якийлегко проникає до мембран клітини через відсутність дифузії,накопичуючись в середині клітин в лізосомах. Зміни поверхнічутливої мембрани лізосом призводять до крихкості лізосом та доінших змін, які поступово стають безповоротними. Такі зміни,викликані дією ксенобіотиків, призводять до зменшення поглинання ізв'язування НЧ. Все ж можливо відрізнити життєздатні, пошкодженіабо мертві клітини, на чому і засновується цей тест.
Клітини фібробластів лінії Balb/c 3T3 зберігаються вкультурному середовищі впродовж 24 годин, для формуваннямоношарів. Для проведення тестування хімічної речовини двіпосудини з 96 комірками попередньо інкубуються у 8 різнихконцентраціях досліджуваної речовини протягом 1 години. Одразупісля цього одна з двох посудин піддається дії найвищої нецитотоксичної дози опромінювання, тоді як інша посудиназберігається у темряві. В обох посудинах засіб для обробки потімзамінюється культурним середовищем та після проходження ще24 годин інкубації, життєздатність клітин визначається поглинаннямбарвника нейтрального червоного. Життєздатність клітин виражаєтьсяяк відсоткове співвідношення контролів необробленого розчинника іобраховується при кожній тестованій концентрації. Дляпрогнозування фототоксичного потенціалу, порівнюються реакції наконцентрацію, отримані у присутності та за відсутностіопромінювання; зазвичай при рівні IC , тобто, при концентрації,
50
що зменшує життєздатність клітин до 50%, порівнюється з
необробленими контролями.
1.4. ОПИС МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
1.4.1. Приготування
1.4.1.1. Клітини
Постійна лінія фібробластових клітин мишей, Balb/c 3T3, клон31, або з американської колекції Типів культури (АКТП), Менасес,В.А, США, або з Європейської колекції типів культур (ЄКТК),Селісбері, Вільтшир, ОК використовувалась при проведенні аналізунеупередженої вибірки, та була рекомендована для їх отримання зодного високоякісного сховища клітин. Інші клітини або лініїклітин можуть використовуватись для тієї самої процедуритестування, якщо умови для культури пристосовані до потребклітини, проте, має бути продемонстрована їх рівноцінність.
Клітини слід постійно перевіряти на відсутність зараженнямікоплазмою, і використовувати лише тоді, коли його не виявлено(11).
Важливо, щоб УФ чутливість клітин постійно перевірялась,відповідно до процедури контролю якості, яка описана в цьомуметоді. Оскільки УФА чутливість клітин може зростати з кількістюпроходжень, мають бути використані, отримані при найменшійкількості проходжень, переважно менше ніж 100. (Див. розділ1.4.2.2.2 та Додаток 2).
1.4.1.2. Засіб та умови культури
Відповідне культурне середовище та умови інкубації повиннівикористовуватись для звичайного проходження клітин та під часпроцедури тестування, наприклад, для клітин фібробластів лініїBalb/c 3T3, це є клітини ДМСО (Дулбекко Модифіковане СередовищеОрла) з додаванням 10% сироватки новонародженого теляти, глютаміну4 мМ, пеніциліну (100 МО), та стрептоміцину (100 мкг/мл), тавологій інкубації при температурі 37 град.C, 5-7,5% CO в
2
залежності від буферного розчину (Див. Розділ 1.4.1.4, другий
пункт). Особливо важливо, щоб умови культури клітин забезпечували
цикл їхнього розвитку в межах нормального історичного діапазону
клітин чи ліній клітин, що використовуються.
1.4.1.3. Приготування культури
Клітини з заморожених культур для зберігання сіють укультурному середовищі за відповідної щільності та інокулюють,принаймні, ще раз перед тим, як їх почнуть використовувати у тестіна фото токсичність 3T3 NRU in vitro.
Клітини, що використовують для тестування на фототоксичністьсіють в середовищі культури з відповідною щільністю таким чином,щоб культури не злилися до закінчення проведення дослідження,тобто, коли життєздатність клітин визначається впродовж 48 годинпісля посіву клітин. Для клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3,вирощених у 96-ти пластинках, рекомендована щільність посівуклітин є 1 104 клітин на комірку.
Для кожного досліджуваного хіміката клітини сіють однаково удві окремі 96-ти коміркові плати, які потім беруть одночасно,впродовж всієї процедури, за однакових культурних умов, крімперіоду коли одна плата опромінюється (+Irr), а інша зберігаєтьсяв темряві (-Irr).
1.4.1.4. Приготування досліджуваної речовини
Досліджувані речовини повинні бути щойно приготованими,безпосередньо перед використанням, якщо дані не демонструютьстабільності у зберіганні. Рекомендується, щоб обробка всіххімічних речовин та початкове застосування клітин проводилось заумов освітлення, що дозволить уникнути фотоактивації чи деградаціїдосліджуваної речовини відносно опромінення.
Досліджувані хімічні речовини повинні бути розчинені вбуферних сольових розчинах напр. збалансований сольовий розчинЕрла (EBSS), або інші фізіологічно збалансовані буферні розчини,які не мають містити протеїнових компонентів, компонентів, якіпоглинають світло (напр. pH-індикаторів кольорів та вітамінів) длятого щоб уникнути втручання під час опромінення. З того часу якклітини під час опромінення зберігаються приблизно протягом50 хвилин ззовні CO інкубатора, слід потурбуватись про те, щоб
2
уникнути алкалізації. Якщо використовуються слабкі буфери такі, як
EBSS, то це можна забезпечити через інкубацію клітин при 7,5% CO .
2
Якщо клітини інкубують лише при 5% CO , то слід обирати міцнішого
2
буфера.
Досліджувані хімічні речовини з обмеженою розчинністю у водіповинні бути розчинені у відповідному розчиннику. Якщо розчинниквикористовується, то він повинен бути наявний в незмінному об'ємів усіх культурах, тобто в негативних контролях (розчиннику) таксамо як і у всіх концентраціях досліджуваної хімічної речовини таповинен бути не цитотоксичним у всіх концентраціях. Концентраціїдосліджуваної хімічної речовини повинні бути обрані для того, щобуникнути випадіння осаду або мутних розчинів.
Рекомендованими розчинниками є Диметилсульфоксид (ДМСО) таетанол. Можуть використовуватись й інші розчинники з низькоюцитотоксичністю. Перед використанням, всі розчинники повинніоцінюватись за особливими властивостями, напр. реакція здосліджуваною хімічною речовиною, подавлення фототоксичногоефекту, основні очисні властивості та/чи хімічна стійкість урозчиннику.
Обробка ультразвуком, та/чи нагрівання до відповіднихтемператур може використовуватись для сприяння розчинення, якщо цене вплине на стійкість досліджуваної хімічної речовини.
1.4.1.5. Умови опромінення
1.4.1.5.1. Джерело світла
Вибір придатного джерела світла та фільтрів є вирішальнимфактором у тестуванні на фототоксичність. Світло УФА та видимихділянок зазвичай асоціюють з фототоксичними реакціями in vivo(3)(12), тоді як загалом УФВ є менш релевантним, але високоцитототоксичним; цитотоксичність зростає в 1000 разів з довжиноюхвилі від 313 до 280 нм (13). Критерії вибору потрібного джереласвітла мають включати вимоги щодо виділення джерелом світладовжини хвилі, яка поглинається досліджуваною речовиною (спектрпоглинання) та дози світла (яка доступна при достатньому періодіпіддавання впливу) і вони повинні бути в достатній кількості длявиявлення відомих фототоксичних хімікатів. Більше того, довжинахвилі та дози, які використовуються не повинні бути надмірношкідливими для системи дослідження, напр. виділення теплоти(інфрачервона ділянка).
Симуляція сонячного світла сонячними імітаторами вважаєтьсяоптимальним штучним джерелом світла. Розподіл сили опроміненнясонячного імітатора з фільтром має бути близьким до зовнішньогоденного світла (14). Як дуги Ксенона так і (з добавками) дугиртутно-залізного галогеніду, які використовуються як сонячніімітатори (15). Останній має перевагу, він виділяє менше теплоти ідешевший, але він менше походить на сонячне світло якщопорівнювати з дугами Ксенону. Оскільки всі сонячні імітаторивиділяють значну кількість УФВ, їх потрібно фільтрувати належнимчином для того, щоб зменшити довжину хвиль високо цитотоксичнихУФВ. Оскільки пластичні матеріали культури клітин містятьстабілізатори УФ, то спектр повинен вимірюватись через той самийтип 96-ти коміркових плат, і використовуватись для аналізу.Незалежно від проведених вимірювань для того, щоб зменшитичастинки спектра шляхом фільтрування, або через неминучі явищафільтрування обладнання, спектр, що записується нижче цих фільтрівне повинен відхилятися від стандартизованого денного світла (14).Приклад спектрального розподілу іррадіації сонячного стимулятора зфільтром, що використовується у затвердженому дослідженні нафототоксичність методом in vitro 3T3 NRU поданий в (8)(16). Див.також Додаток 2 Малюнок 1.
1.4.1.5.2. Дозування
Потужність світла (опромінення) має регулярно перевірятися,перед кожним тестуванням на фототоксичність з використаннямналежного широкого діапазону вимірювального приладу УФ. Потужністьсвітла повинна вимірюватись з використанням такого ж типу 96-тикоміркових пластинок, які будуть використовуватись в дослідженні.Прилад для вимірювання УФ повинен бути калібрований до джерела.
Експлуатаційні якості приладу для вимірювання УФ слідперевіряти, для цього рекомендується використання другого приладудля вимірювання УФ такого ж типу з ідентичною калібрацією. Відеалі, при великих інтервалах, слід використовуватиспектрорадіометр для вимірювання спектрального опромінення джереласвітла з фільтром та для перевірки калібрації приладу широкогодіапазону для вимірювання УФ.
Доза 5 Дж/кв.см (як вимірюється величина УФА ) визначена нетоксичною для клітин фібробластів лінії Balb/c 3T3 та достатньосильною, щоб стимулювати хімікати проявляти фототоксичні реакції,(6)(17) напр. щоб досягнути 5 Дж/кв.см впродовж 50 хвилин,встановлене опромінення 1,7 мВт/кв.см. Див. Додаток 2 Малюнок 2.Якщо використовується інша клітинна лінія або інше джерело світла,то може буде необхідним калібрування дози опромінення таким чином,щоб обрати систему дозування, яка є не шкідливою для клітин аледостатньою щоб викликати стандартний фототоксин. Період піддаваннявпливу світла обраховується наступним чином:
доза опромінення (Дж/кв.см) x 1000 (1 Дж = 1 Втсек)
t(мін) = ----------------------------------
опромінення (мВт/кв.см) x 60
1.4.2. Умови тестування
1.4.2.1. Концентрація тестових речовин
Величини концентрацій хімічних речовин за наявності (+Irr) іза відсутності (-Irr) світла повинні бути точно визначені під часекспериментів, що визначають величину дозування. Це може бутикорисним для оцінювання розчинності на початковій стадії тавпродовж 60 хвилин (або який би час обробки не використовувався),оскільки розчинність може змінюватись під час перебігу піддаваннявпливу. Для того щоб уникнути токсичності викликаноїневідповідними умовами культури чи високо кислотними та лужнимихімічними речовинами, pH культур клітин з доданими досліджуванимихімічними речовинами повинне бути в межах 6,5-7,8.
Найвища концентрація досліджуваної речовини повинна бути вмежах фізіологічних умов тесту, напр. потрібно уникати осмотичногота pH тиску. Залежно від досліджуваної хімічної речовини, можебути необхідним і розгляд інших фізико-хімічних властивостей,таких як фактори, що обмежують найвищу тестову концентрацію. Длявідносно нерозчинних речовин, які не токсичні при концентраціях доточки поглинання, необхідно досліджувати найвищу концентрацію,якої можна досягнути. Загалом, слід уникати випадання в осаддосліджуваної хімічної речовини при будь яких концентраціяхдослідження. Максимальна концентрація досліджуваної речовини неповинна перевищувати 1 000 мкг/мл та 10 М. Має бути використанийряд геометричних розчинень досліджуваної речовини у восьмиконцентраціях з постійним фактором розчинення. (Див. Розділ 2.1,другий пункт).
Якщо є інформація (з ряду дослідницьких експериментів) проте, що досліджувана хімічна речовина не є цитотоксичною в межахконцентрації експерименту, що проводиться в темряві (-Irr), алевисоко цитотоксичний при опроміненні (+Irr), то межі концентрації,які слід обирати для (+Irr) експерименту, можуть відрізнятися відтих, що обрані для (-Irr) експерименту, з метою виконання вимогиякості точних даних.
1.4.2.2. Групи контролю
1.4.2.2.1. Радіаційна чутливість клітин, встановленняісторичних даних:
Клітини слід постійно перевіряти на чутливість до джереласвітла через оцінювання їхньої життєздатності після піддаваннявпливу, для збільшення доз опромінення. Декілька доз опромінення,включаючи набагато більші ступені ніж, ті що використовувались для3T3 NRU тесту на фототоксичність, мають бути використані удослідженні. Ці дози найлегше оцінювати через вимірювання частинокУФ джерела світла. Клітини сіють при густоті використаній уin vitro 3T3 NRU тесті на фототоксичність та опромінюються нанаступний день. Життєздатність клітин визначається на наступнийдень шляхом оцінки поглинання нейтрального червоного. Необхіднопоказати, що отримана найвища не цитотоксична доза (напр. увалідованому дослідженні: 5 Дж/кв.см(UVA)) була достатньою, щобправильно класифікувати уже згадані хімічні речовини (Таблиця 1).
1.4.2.2.2. Чутливість до радіації, перевірка поточного тесту
Тест відповідає критеріям якості, якщо перевіркиопромінювання негативного контролю (розчинника) показуютьжиттєздатність більше ніж 80% в порівнянні з негативним контролем(розчинником), який не опромінюється.
1.4.2.2.3. Ефективність перевірок розчинника:
Абсолютна оптична щільність (ОГ540 NRU) барвника нейтральногочервоного екстрагованого під час перевірок розчинника показує чипосів 1.104 клітин на комірку зростає з нормальною подвійноюшвидкістю протягом двох днів аналізів. Тест відповідаєзатвердженим критеріям, якщо середнє значення OD540 NRU необробленого контролю >= 0,4 (тобто приблизно у 20 разів основногопоглинання розчинника).
1.4.2.2.4. Позитивний контроль
Відома фототоксична хімічна речовина повинна тестуватисьодночасно з кожним in vitro 3T3 NRU тестом на фото токсичність.Рекомендується Хлорпромазан (ХПЗ). Для тестованого ХПЗ зістандартним протоколом in vitro 3T3 NRU тесту на фототоксичність,були визначені наступні критерії: ХПЗ опромінений (+Irr):IC = 0,1 до 2,0 мкг/мл, ХПЗ не опромінений (-Irr): IC = 7,0 to
50 50
90,0 мкг/мл. фото подразнюючий фактор (PIF), повинен бути > 6.
Слід проконтролювати історію здійснення позитивного контролю.
Інші фототоксичні хімічні речовини, що належать до хімічногокласу речовин або володіють розчинною властивістю хіміката, якийдосліджують, можуть використовуватись як конкурентний позитивнийконтроль замість хлорпромазану.
1.4.3. Процедура дослідження (6)(7)(8)(16)(17):
1.4.3.1. Перший день:
Розподіл 100 мкл культурного середовища у периферійнихкомірках 96-ти коміркової пластинки мікротитру культури тканини(= контроль). В тих комірках, що залишилися, дозування 100 мкл
5
клітинної суспензії 1 x 105 клітин/мл в культурному середовищі
(= 1.104 клітин/комірку). Дві пластинки повинні бути приготовані
для кожної серії індивідуальних тестувань, та для контролю
розчинника та позитивного контролю.
Клітини інкубують на добу (Див. Розділ 1.4.1.2) поки вони несформують єдиний моношар. Цей інкубаційний період передбачаєвідновлення клітин, адгезію та експоненціальний ріст.
1.4.3.2. Другий день:
Після інкубації, клітини фільтрують від культурногосередовища та ретельно промивають у 150 мкл буферного розчину,який використовується для інкубації. Додають 100 мкл буферу, якиймістить потрібну концентрацію досліджуваної речовини аборозчинника (контроль розчинника). Застосовують вісім різнихконцентрацій розчину досліджуваної речовини. Клітини інкубують удосліджуваній речовині в темряві впродовж 60 хвилин (Див. Розділ1.4.1.2 та 1.4.1.4 другий абзац).
З поміж двох пластинок приготованих для кожної серіїконцентрацій та контролів досліджуваної речовини, обирається одна,як правило, методом випадкового відбору, для визначенняцитотоксичності (-Irr) (тобто, контрольна пластинка), і одна(оброблена пластинка) для визначення фототоксичності (+Irr).
Для виконання піддавання дії +Irr, клітини опромінюють прикімнатній температурі впродовж 50 хвилин через кришку 96-тикомірчастої пластинки з найвищою дозою радіації, яка є нетоксичною (див. також Додаток 2). Зберігають не опроміненіпластинки (-Irr) при кімнатній температурі в темній коробцівпродовж 50 хв. (= період піддавання впливу світла).
Досліджуваний розчин фільтрують та ретельно промивають двічіу 150 мкл буферного розчину, який використовувався для інкубації,але не містить досліджуваного матеріалу. Буфер замінюютькультурним середовищем та здійснюють інкубацію (Див.Розділ 1.4.1.2.) протягом ночі (18-22 год).
1.4.3.3. Третій день:
1.4.3.3.1. Мікроскопічне оцінювання
Клітини повинні перевірятись на ріст, морфологію тацілісність моношару використовуючи фазово-контрастний мікроскоп.Зміни в морфології клітин та впливи на їхній ріст мають бутизаписані.
1.4.3.3.2. Тест NRU
( метод на культурах клітин)
Клітини промивають в 150 мкл попередньо нагрітого буферу.Миючий розчин видаляють легким постукуванням. Додають 100 мклнейтрального червоного 50 мкг/мкл (НЧ)(3-аміно-7-диметиламіно-2-метилфеназин гідрохлорид, N ЄРІКХР209-035-8; N РСХ 553-24-2; C.I. 50040) в середовище безсироватки(16) та культивують, як описано в абзаці 1.4.1.2.,протягом 3 год. Після культивування, видаляють середовище НЧ, тапромивають клітини в 150 мкл буфера. Надлишок буферу зціджують тавидаляють промоканням або центрифугою.
Додають лише 150 мкл видобутого розчину НЧ (свіжо приготовані49 частин води + 50 частин етанолу + 1 частина оцтової кислоти).
Мікротитрову пластинку злегка струшують на шейкермікротитрової пластинки протягом 10 хв. поки НЧ не буде видаленийз клітин та не утвориться однорідний розчин.
Вимірюють оптичну щільність екстракту НЧ при 540 нм успектрофотометрі, використовуючи пусті місця як еталон. Зберігаютьдані у відповідному форматі електронного файлу для подальшогоаналізу.
2. ДАНІ
2.1. КІЛЬКІСТЬ ТА ЯКІСТЬ ДАНИХ
Дані дослідження повинні передбачати ґрунтовний аналізреакції на концентрацію, отриману за наявності та за відсутностіопромінення, та, якщо можливо, концентрацію досліджуваногохімікату, при якій життєздатність клітин зменшується до 50%(IC ). Якщо виявлено цитотоксичність, то як об'єм концентрацій,
50
так і відрізки індивідуальних концентрацій повинні встановлюватись
таким чином щоб криві співпадали з даними дослідження.
Як для чітко позитивного так і чітко негативного результату(Див. Розділ 2.3, перший абзац) може бути достатньо первинногоексперименту, що супроводжується ще одним або більше підготовчимиекспериментом(ами) на визначення величини дозування.
Двозначні чи нечіткі результати слід з'ясувати черезпроведення подальшого дослідження (див. також в розділі 2.4,другий абзац). В таких випадках, потрібно зважати на зміну умовпроведення дослідження. Умови проведення дослідження, які можутьбути змінені включають величину концентрації або розподіл,передінкубаційний період, та період опромінення - піддавання дії.Для коротшого періоду піддавання впливу можуть бути придатнінестійкі до води хімікати.
2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Провести обрахування оцінок даних, фото подразнюючого фактору(PIF) або середнього значення фото ефекту (MPE).
Для обрахування значень фототоксичності (див. нижче) рядокремих значень реакцій на концентрацію має бути апроксимованийчерез відповідну криву (модель) постійної реакції на концентраціюкриву. Відповідність кривої даним здійснюється зазвичай методом нелінійної регресії (18). Для того щоб оцінити вплив варіативностіданих придатній кривій рекомендують процедуру застосуваннябутстрапу.
Фото подразнюючий ефект (PIF) обраховується за наступноюформулою:
IC (-Irr)
50
PIF = ------------
IC (+Irr)
50
Якщо за наявності чи відсутності світла не можна обрахуватиIC , то не можна визначити ФПФ для тестованого матеріалу.
50
Значення фото ефекту (MPE) базується на дугах повних
концентраційних-рекцій (19). Це визначається як середня вага
відносно представленого ряду значень фотоефектів.
n
S w PE
i=1 i C
i
MPE = -----------
n
S w
i=1 i
S - знак суми.
Фотоефект PEc при будь-якій концентрації C визначається якпродукт ефекту реакції REc та ефект дози DEc тобтоPEc = REc x DEc. Вплив реакції REc це різниця між реакціями, якіспостерігаються за наявності та за відсутності світла, тобтоREc = Rc (-Irr) - Rc (+Irr). Вплив дози визначається за формулою:
C/C* - 1
DE = |----------|
c C/C* + 1
де C* означає еквівалентність концентрації, тобтоконцентрація при якій +Irr реакція дорівнює -Irr реакції приконцентрації C. Якщо C* не можна визначити через те, що значенняреакції +Irr дуги є систематично вище або нижче ніж RC(-Irr) тоефект дози встановлюється до 1. Фактори зважування w визначають
i
при найвищому значенні реакції, тобто wi = MAX {Ri (+Irr),
Ri (-Irr)}. Сітка концентрацій C обирається так, що однакова
i
кількість точок знижується в кожному інтервалі розсіювання, що
визначається за значеннями концентрацій, які використовуються в
експерименті. Обрахунок MPE обмежується до максимального значення
концентрації при якому принаймні одна з двох кривих все ще
проявляє значення реакції принаймні 10%. Якщо ця максимальна
концентрація вища ніж найвища концентрація, що використовується в
+Irr експерименті, то для залишкової частини +Irr кривої
встановлюється величина реакції '0'. Залежно від того чи величина
МТТ більша ніж обране належним чином середнє значення
(MPEc = 0,15) або ні, хімікат класифікують як фототоксичний.
Пакет програмного забезпечення для обрахування ФПФ та МТТпредставлено у посиланні (20).
2.3. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
На основі дослідження аналізу неупередженої вибірки(8),досліджувана речовина з ФПФ < 2 або МТТ < 0,1 передбачає:"відсутність фототоксичності". ФПФ > 2 та < 5 чи МТТ > 0,1 та< 0,15 передбачає: "можливу фототоксичність"; та ФПФ> 5 чи МТТ> 0,15 передбачає: "фототоксичність".
Будь-яка лабораторія, яка попередньо запроваджує цедослідження, має перевірити еталонні матеріали, перелічені уТаблиці 1 до початку проведення оцінки тестування досліджуванихречовин на фототоксичність. Показники ФПФ та МТТ мають бутинаближеними до показників, вказаних у Таблиці 1.
Таблиця 1
-----------------------------------------------------------------------------
| Назва | N | NPCX | ФПФ | МТТ | Найвища |Розчинник N|
| хімічної | ЄРІКХР | | | | точка | |
| речовини | | | | |поглинання| |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Аміодарон |243-293-2 |(19774-82-4)|> 3,25 |0,2- |242 нм |етанол |
|HCL | | | |0,54 |300 нм | |
| | | | | |(плече) | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Хлоропромазан|200-701-3 |(69-09-0) |> 14,4 |0,33-|309 нм |етанол |
|HCL | | | |0,63 | | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Норфлоксацин |274-614-4 |(70458-96-7)|> 71,6 |0,34-|316 нм |ацетонітрил|
| | | | |0,90 | | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Антрацен |204-371-1 |(120-12-7) |> 18,5 |0,19-|356 нм |ацетонітрил|
| | | | |0,81 | | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Протопорфирін|256-815-9 |(50865-01-5)|> 45,3 |0,54-|402 нм |етанол |
|IX, | | | |0,74 | | |
|Двонатрієвий | | | | | | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|L-Гістідин | |(7006-35-1) |no PIF |0,05-|211 нм |вода |
| | | | |0,10 | | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Гексахлорофен|200-733-8 |(70-30-4) |1,1-1,7|0,00-|299 нм |етанол |
| | | | |0,05 |317 нм | |
| | | | | |(плече) | |
|-------------+-----------+------------+-------+-----+----------+-----------|
|Лаурилсульфат|205-788-1 |(151-21-3) |1,0-1,9|0,00-|поглинання|вода |
|Натрію | | | |0,05 |відсутнє | |
|---------------------------------------------------------------------------|
|(N) Розчинник, який використовувався для вимірювання поглинання |
-----------------------------------------------------------------------------
2.4. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ ДАНИХ
Якщо фототоксичні впливи спостерігаються лише при найвищійдосліджуваній концентрації, (особливо для досліджуваних хімічнихречовин, що розчиняються у воді), то тоді може виникнутинеобхідність у проведенні подальшої оцінки ризику. Це можевключати дані про поглинання та накопичення хімічної речовини вшкірі та/чи дані інших досліджень, наприклад, тестування хімічноїречовини методом in vitro на шкірі тварин чи людей, або на моделяхшкіри.
Якщо токсичність не проявляється (+Irr та -Irr), або якщослабка розчинність обмежує величину концентрацій, які могли бтестуватись, то відповідність тестованої речовини дослідженню можебути під питанням, і має бути розглянута можливість застосуванняпідтверджувального дослідження із використанням, наприклад, іншоїмоделі.
3. ЗВІТУВАННЯ
ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ТЕСТУ
Звіт про проведення тесту має містити, у будь-якому випадку,наступну інформацію:
Досліджувана речовина:
- ідентифікаційні дані, загальні назви та реєстраційний номерЄРІКХР і РСХ, якщо вони відомі,
- фізичні властивості та чистоту,
- фізико-хімічні властивості, що важливі для проведеннядослідження,
- УФ/vis спектр поглинання,
- стабільність та фото стабільність, якщо вони відомі.
Розчинник:
- обґрунтування вибору розчинника,
- розчинність досліджуваної хімічної речовини у розчиннику,
- кількість розчинника, наявного у обробленому середовищі, увідсотках.
Клітини:
- вид та джерело клітин,
- відсутність мікоплазми,
- кількість проходжень клітин, якщо відомо,
- чутливість клітин до випромінювання, що визначається звикористанням опромінюючого обладнання, яке застосовується у тестіна фототоксичність 3T3 NRU in vitro.
Умови проведення дослідження (1); інкубація перед та післяобробкою:
- тип та склад культурного середовища,
- умови культивування (CO концентрація; температура; 2вологість),
- тривалість культивування (попередня обробка, кінцеваобробка).
Умови проведення дослідження (2); обробка хімічною речовиною:
- логічне пояснення вибору концентрацій тестової речовини,яка використовується за наявності та за відсутності опромінення,
- у випадку обмеженої розчинності досліджуваної хімічноїречовини та відсутності цитотоксичності: логічне пояснення длянайвищої концентрації, що використовується,
- тип та склад середовища для обробки (буферний сольовийрозчин),
- тривалість застосування хімікату.
Умови проведення дослідження (3); опромінення:
- обґрунтування вибору джерела світла, що використовується,
- товаровиробник та тип джерела світла та радіометра,
- особливості спектрального опромінення джерела світла,
- властивості трансмісії та поглинання фільтру, щовикористовується,
- характеристики радіометру та деталі щодо його калібрації,
- відстань джерела світла від системи дослідження,
- УФА опромінення при цій відстані, виражене у мВт/кв.см,
- тривалість УФ/віз експозиції світла,
- доза УФА (опромінення x час), виражена у Дж/кв.см,
- температура клітинних культур під час опромінення тасупутньо клітинних культур, які зберігають в темряві.
Умови проведення дослідження (4); тест на життєздатністьбарвникомнейтральним червоним:
- склад середовища, обробного нейтральним червоним,
- тривалість інкубації нейтрального червоного,
- умови тесту (CO концентрації; температура; вологість),
2
- умови екстрагування нейтрального червоного (екстрагант;тривалість),
- довжина хвилі, що використовується для
спектрофотометричного зняття показників оптичної щільності
барвника нейтрального червоного,
- друга довжина хвилі (посилання), якщо використовується,
- вміст бланку спектрофотометру, якщо використовується.
Результати:
- життєздатність клітин отримана при кожній концентраціїхімікату, який досліджується, виражена у відсотках життєздатністьзасобу, супутні контролі розчинника,
- дуги реакцій концентрацій (концентрація досліджуваногохіміката відносно релятивної життєздатності клітин), отримана підчас +Irr та -Irr екпериментів,
- аналіз концентраційно-реакційних дуг, якщо можливорозрахунок /обчислення IC (+Irr) та IC (-Irr),
50 50
- порівняння двох концентраційно-реакційних дуг отриманих занаявності та відсутності опромінення, чи обрахунком фотоподразнюючого фактору (ФПФ), чи методом обрахунку значення фотоефекту (МТТ),
- критерії прийняття дослідження; одночасний контрольрозчинника:
- цілковита життєздатність (оптична щільність екстрактубарвника нейтрального червоного) опромінених чи неопроміненихклітин,
- історичні дані негативного контролю та контролю розчинника,засоби та стандартні відхилення,
- критерії прийняття дослідження; супутній позитивнийконтроль,
- IC (+Irr) та IC (-Irr) та ФПФ/МТТ хімікату з позитивним 50 50контролем,
- дані позитивного контролю хімікату: IC (+Irr) та 50IC (-Irr) та ФПФ/МТТ; значення та відхилення від стандарту
50
Обговорення результатів.
Висновки.
4. Посилання
(1) Lovell W.W., (1993) A scheme for in vitro screening ofsubstances for photoallergenic potential. Toxicology In Vitro 7,p. 95-102.
(2) Santamaria, L. and Prino, G., (1972) List of thephotodynamic substances. In "Research Progress in Organic,Biological and Medicinal Chemistry" Vol. 3 part 1. North HollandPublishing Co. Amsterdam. p. XI-XXXV.
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Holzle, E., Johnson, B.E.,Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., andSladowski, D., (1994) In vitro phototoxicity testing: The reportand recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, p. 314-348.
(4) Spikes, J.D., (1989) Photosensitisation. In "The scienceof Photobiology" Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New York. 2ndedition, p. 79-110.
(5) OECD, (1997) Environmental Health and SafetyPublications, Series on Testing and Assessment No 7 "GuidanceDocument On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water"Environment Directorate, OECD, Paris.
(6) Spielmann, H., Balls, M., Doring, B., Holzhutter, H.G.,Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell,W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W.,Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., andWillshaw, A., (1994) EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicitytesting: First results obtained with a Balb/c 3T3 cellphototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, p. 793-796.
(7) Anon, (1998) Statement on the scientific validity of the3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), EuropeanCommission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November1997, ATLA, 26, p. 7-8.
