|Сірчана кислота (10%) |231-639-5 |7664-93-9 |Роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Октанова |204-677-5 |124-07-02 |Роз'їдаюча |
|кислота (акрилова | | | |
|кислота) | | | |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|4-Аміно-1,2,4-триазол |209-533-5 |584-13- |Не роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Евгенол |202-589-1 |97-53-0 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Фенілетил Бромід |203-130-8 |103-63-9 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Тетрахлоретилен |204-825-9 |27-18-4 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|Ізостеаринова кислота |250-178-0 |30399-84-9 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+----------+-----------+------------------|
|4-(Метилен)- |222-365-7 |3446-89-7 |Не роз'їдаюча |
|бензальдегід | | | |
------------------------------------------------------------------
Більшість еталонних хімічних реагентів обрані з ЄЦОАМД(Європейського центру з оцінки альтернативних методів досліджень)(4). Їхній вибір засновано на наступних критеріях:
(i) однакова кількість речовин, що мають роз'їдаючу та нероз'їдаючу дію;
(ii) наявні в продажі речовини, що охоплюють більшістьнеобхідних для дослідження хімічних класів;
(iii) включення сильно роз'їдаючих так само як і меншроз'їдаючих речовин з метою застосування диференційованогопідходу, що засновується на потенціалі роз'їдання;
(iv) вибір хімічних реагентів, які можна використовувати влабораторії, уникаючи інших, більш серйозних ризиків, таких якроз'їдаюча дія.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Матеріал для дослідження застосовується впродовж 24 годин доповерхонь епідерми шкіряних дисків у тестовій системі з двомавідсіками, в якій шкіряні диски функціонують як відокремлення міжвідсіками. Шкірні диски отримують від щурів віком 28-30 днів, якібули вбиті гуманним способом. Роз'їдаючі матеріали розпізнають заїх можливістю спричиняти втрату цілісності нашарування рогівки тафункції бар'єру, яка визначається як зменшення ОДЕСЧШ нижчепорогового рівня (12). Для ОДЕСЧШ щурів, було обрано граничнезначення 5 k Омега що засновується на обширних даних щодо великогоряду хімічних речовин, де переважна більшість значень були абонабагато вище (часто > 10 k Омега), або набагато нижче (часто< 3 k Омега) цього значення (12). Загалом, речовини які не єроз'їдаючими для тварин, але викликають або не викликаютьподразнення, не зменшують ОДЕСЧШ нижче цього граничного значення.Крім того, використання інших препаратів шкіри чи іншогообладнання може змінити граничне значення, що викликає потребу уподальшій перевірці.
Етап фіксації барвника включений до процедури тестування напідтвердження позитивних результатів ОДЕСЧШ, включаючи значенняблизько 5 k Омега. Етап фіксації барвника визначає чи спричиненезбільшення іонної проникності фізичним руйнуванням шару рогівки.Метод ОДЕСЧШ, для якого використовують шкіру щурів, прогнозуєроз'їдаючу дію in vivo на шкіру кроликів, оцінка яких проводиласявідповідно до Методу дослідження B.4 (2). Слід зауважити, щотестування на кроликах in vivo є надзвичайно консервативнимпорівняно з роз'їдаючою дією на шкіру людини та її подразнення, щовиявляються під час проведення тестування на алергічні реакціїшкіри (15).
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Тварини
Щури є біологічним видом, якому надається перевага, оскількичутливість їхньої шкіри до хімічних речовин є попередньо доведеною(10). Вік (коли беруть зразки шкіри) та штами щурів є особливоважливими для забезпечення того щоб волосяні фолікули перебували устадії покою до того як почнеться ріст дорослого волосся.
Шерсть зі спини та боків молодих, приблизно віком 22 дні,щурів жіночої чи чоловічої статі (похідні Вістару або співставленіштами), ретельно видаляється маленькими ножицями. Потім, тваринмиють, обережно очищуючи, а острижену ділянку занурюють у розчинантибіотику (який містить, наприклад, стрептоміцин, пеніцилін,хлорамфенікол та амфотерицин у концентраціях, які ефективноперешкоджають росту бактерій). Тварин миють з антибіотиком ще разна третій чи четвертий день після першого миття та використовуютьпротягом трьох днів після другого миття, коли шар рогівкивідновився після видалення шерсті.
1.5.2. Приготування шкіряних дисків
Тварин віком 28-30 днів знищують гуманним способом; цей вік єкритичним. Дорсолатеральна шкіра кожної тварини видаляється таочищується від надлишку підшкірного жиру, обережно відділяючи йоговід шкіри. Шкірні диски діаметром приблизно 20 мм кожний,видаляються. Шкіру можуть зберігати до використання дисків, коливиявляється, що дані позитивного та негативного контролюеквівалентні даним, отриманим зі свіжої шкіри.
Кожен диск розміщують над одним з країв ПТФЕ(політетрафлуороретиленової) трубки, забезпечуючи контакт поверхніепідерми з трубкою. Гумове кільце "O" вставляється під тиском накінець трубки щоб тримати шкіру на місці, та надлишкова тканиназабирається, розміри трубки та кільця "O" показані на Малюнку 2.Потім гумове кільце "O" обережно та герметично закріплюється накінці ПТФЕ трубки із використанням вазеліну. Трубка опирається напружинну клему всередині камери рецептора, що містить розчин MgSO
4
(154 мМ) (Малюнок 1). Шкіряний диск має бути повністю занурений у
розчин MgSO . Зі шкіри одного щура можна отримати не менше
4
10-15 шкіряних дисків.
До початку тестування, опір дії електричного струму двохшкіряних дисків вимірюється як процедура контролю якості для шкірикожної тварини. Обидва диски мають давати показники опору, щоперевищують 10 k Омега для того, щоб решту дисків використати длятесту. Якщо показники опору є меншими ніж 10 k Омега, то диски, щозалишилися з цієї шкіри, слід викинути.
1.5.3. Застосування тестованих та контрольних речовин
Супутній позитивний і негативний контроль маютьвикористовуватись для кожного дослідження з метою забезпеченняналежного функціонування експериментальної моделі. Потрібновикористовувати шкіряні диски з однієї тварини. Речовинами, якірекомендуються для позитивного та негативного контролю, є,відповідно, 10 M хлористоводнева кислота та дистильована вода.
Рідкі досліджувані речовини (150 мю L) застосовуютьсярівномірно до поверхні епідерми всередині трубки. При проведеннітестування твердих матеріалів, достатня кількість твердої речовинирівномірно наноситься на диск з метою забезпечення покриття всієїповерхні епідерми. Деіонізована вода (150 мю L) додається наверхівку твердої речовини, і трубку обережно збовтують. Для тогощоб досягнути максимального контакту зі шкірою, може бутинеобхідно нагрівання твердих речовин до 30 град.C щоб розплавитичи пом'якшити досліджувану речовину, або подрібнення догранульованого матеріалу чи порошку.
Три шкіряних диски використовуються для кожного тесту та длякожної контрольної речовини. Тестовані речовини використовуютьсявпродовж 24 годин при температурі 20-23 град.C. Досліджуванаречовина видаляється миттям під струменем водопровідної води, притемпературі близько 30 град.C до повного усунення речовини.
1.5.4. Вимірювання ОДЕСЧШ
Повний опір шкіри визначається як ОДЕСЧШ та вимірюється ізвикористанням низької напруги, мосту змінного струму Уітстона(13).Загальними технічними характеристиками мосту є робоча напруга 1-3Вольта, змінна напруга в формі синуса чи прямокутника 50-1 000 Гц,та діапазон вимірювання щонайменше 0,1-30 k Омега. Міст, щовикористовується під час аналізу значень індуктивності, ємності таопору з використанням неупередженої вибірки становить відповідно ,до 2 000 Н, 2 000 мю F,та 2 M Омега, при частоті 100 Гц чи 1 кГц,із використанням послідовних чи паралельних значень. З метоюаналізу роз'їдаючої дії при проведенні тесту на ОДЕСЧШ,вимірювання записуються при опорі, частоті 100 Гц та ізвикористанням послідовних значень. Перед вимірюванням електричногоопору, напруга на поверхні шкіри зменшується додаваннямдостатнього об'єму 70% розчину етанолу, щоб покрити епідерму.Через декілька секунд, етанол видаляють з трубки, і тканини потімзволожують шляхом додавання 3 мл розчину MgSO (154 мМ). Електроди
4
мосту розміщують на іншій стороні шкіряного диску, щоб виміряти
опір у k Омега/для шкіряного диску (Малюнок 1). Розміри електрода
та його довжина виставляються нижче зубчатого затискача, що
показано на Малюнку 2. Затискач, який приєднується до внутрішнього
електроду, залишається на верхівці ПТФЕ трубки, під час
вимірювання опору, з метою повністю повного занурення електроду у
розчин MgSO . Зовнішній електрод розміщують всередині камери
4
рецептора таким чином, щоб він залишався на дні камери. Відстань
між пружинною клемою та дном ПТФЕ трубки зберігається незмінною
(Малюнок 2), тому що ця відстань впливає на отриманий показник
опору. Отже, відстань між внутрішнім електродом та шкіряним диском
має бути сталою і мінімальною (1-2 мм).
Якщо виміряний показник опору є більшим, ніж 20 k Омега, тоце може бути через залишки шару досліджуваної речовини на поверхніепідерми шкіряного диску. Може бути вжита спроба подальшоговидалення шару, наприклад, герметизація ПТФЕ трубки великимпальцем руки і збовтування її приблизно протягом 10 секунд; розчинMgSO усувають, і вимірювання опору повторюється зі свіжим
4
розчином MgSO .
4
Властивості та розміри апарату для проведення тестування тапроцедури експерименту, за умови використання, можуть впливати наотримані величини показники ОДЕСЧШ. Поріг роз'їдання 5 k Омега буврозроблений на основі даних, отриманих за допомогою спеціальногоапарату та процедури, що описані в цьому методі. Різні порогові таконтрольні значення можуть застосовуватись, якщо умови тестуваннябули змінені або використовувався інший апарат. Отже, необхідноперевіряти методологію та граничні показники опору, черезтестування ряду вторинних еталонних речовин, обраних з поміжхімічних речовин, що використовуються під час аналізунеупередженої вибірки (4)(5), або з хімічних класів, схожих зтестованими речовинами. Перелік відповідних еталонних хімічнихречовин наведений у Таблиці 1.
1.5.5. Методи зв'язування барвника
Наслідком піддавання дії деяких не роз'їдаючих речовин можебути зменшення опору нижче межі 5 k Омега, що дозволяє проходженняіонів через шар рогівки, при цьому зменшуючи електричний опір (5).Наприклад, нейтральні органічні та хімічні речовини, які маютьповерхнево-активні властивості (включаючи детергенти, емульгаторита інші поверхнево-активні речовини), можуть видаляти ліпідишкіри, що робить бар'єр більш проникним для іонів. Хоча, якщопоказники ОДЕСЧШ досліджуваних речовин є меншими або приблизнодорівнюють 5 k Омега за відсутністю видимого пошкодження, оцінкаглибини проникнення барвника має здійснюватись на контрольних тадосліджуваних тканинах з метою визначення чи отримані показникиОДЕСЧШ були результатом збільшення проникної властивості шкіри, чироз'їдаючої дії на неї (3)(5). В останньому випадку, де шаррогівки розривається, барвник сульфуродамін B, при застосуванні доповерхні шкіри, швидко проникає у підлягаючу тканину і фарбує її.Цей особливий барвник є стійким до широкого ряду хімічних речовині не піддається впливу процедури видалення, описаної нижче.
1.5.5.1. Застосування та видалення барвника Сульфуродаміну B
Після оцінки ОДЕСЧШ сульфат магнію видаляється з трубки, ішкіру ретельно обстежують на видиме пошкодження. Якщо очевидногопошкодження немає, то барвник Сульфуродамін B (Кислота Ред 52;C.I. 45100; Номер ЄРІКХР 222-529-8; номер РСХ 3520-42-1),150 мю L 10% (w/v) розчину в дистильованій воді, застосовуєтьсядо поверхні епідерми кожного шкіряного диску протягом двох годин.Потім ці диски миють у водопровідній воді при кімнатнійтемпературі протягом приблизно 10 секунд, щоб видалити будь-якийнадлишковий/вільний барвник. Кожен шкіряний диск ретельновидаляється з ПТФЕ трубки та поміщується у пляшечку (наприклад,ускляну сцинтиляційну пляшечку об'ємом 20 мл) що міститьдеіонізовану воду (8 мл). Пляшечки злегка збовтують протягом5 хвилин, для того щоб позбавитись будь-якого додаткового вільногобарвника. Ця процедура полоскання потім повторюється, після чогошкіряні диски видаляють і поміщають в пляшечки, що містять 5 мл30% розчину (w/v) сульфату додецилу натрію (СДН) у дистильованійводі і інкубуються на ніч при температурі 60 град.C.
Після інкубації, кожен диск шкіри видаляється та викидається,а розчин, який залишився, центрифугується впродовж 8 хвилин притемпературі 21 град.C (відповідна сила центрифугування приблизно175 x g). 1 мл зразка надосадової рідини розбавляється успіввідношенні 1 до 5 (v/v) (тобто, 1 мл + 4 мл) 30% (w/v)розчином СДН у дистильованій воді. Оптична щільність (ОЩ) розчинувимірюється при 565 нм.
1.5.5.2. Розрахунок вмісту барвника
Вміст барвника Сульфуродаміну B на одному диску розраховуютьвід показників ОЩ (5) (молярний коефіцієнт поглинання барвника
4
Сульфуродаміну B при 565 нм = 8,7 x 10 ; молекулярна маса = 580).
Вміст барвника визначається для кожного шкіряного диску з
використанням відповідної калібрувальної кривої, а середній
показник вмісту барвника, потім обраховується для повторних
експериментів.
2. ДАНІ
Показник опору (k Омега) та середнього вмісту барвника(мкг/диск), якщо можливо, щодо досліджуваного матеріалу, так самояк і позитивний і негативний контролі повинні подаватись у формітаблиці (дані індивідуального випробовування та середні показники+- S.D.), включаючи дані повторних експериментів, середні таіндивідуальні показники.
2.1. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Середні показники ОДЕСЧШ приймаються, якщо показникипозитивного та негативного контролю знаходяться в межах прийнятнихмеж для методу, що застосовується у лабораторії проведення тесту.Прийнятні діапазони опору для методології та апарату описано вищепредставлен у наступній таблиці:
------------------------------------------------------------------
| Контроль | Речовина | Діапазон Опору |
| | | (k Омега) |
|-----------+----------------------------+-----------------------|
|Позитивний |10M Хлористоводнева кислота |0,5-1,0 |
|-----------+----------------------------+-----------------------|
|Негативний |Дистильована вода |10-25 |
------------------------------------------------------------------
Середні показники зв'язування барвника приймаються за умови,що показники супутнього контролю знаходяться в межах прийнятнихдля методу діапазонів. Рекомендовані допустимі показники об'ємувмісту барвника для контрольних речовин для описаної вищеметодології та апарату подаються нижче:
------------------------------------------------------------------
| Контроль | Речовина | Об'єм вмісту барвника |
| | | (мг/диск) |
|----------+--------------------------+--------------------------|
|Позитивний|10M Хлористоводнева |40-100 |
| |кислота | |
|----------+--------------------------+--------------------------|
|Негативний|Дистильована вода |15-35 |
------------------------------------------------------------------
Досліджувану речовину вважають не роз'їдаючою шкіру:
(i) якщо середній показник ОДЕСЧШ, отриманий під частестування речовини, є більшим ніж 5 k Омега; або
(ii) якщо середній показник ОДЕСЧШ є меншим, ніж 5 k Омега;та
- шкіряний диск немає явних пошкоджень, та
- середній показник вмісту барвника на диску набагато нижчесереднього показника вмісту барвника 10M HCl, отриманого присупутньому позитивному контролі.
Досліджувана речовина вважається роз'їдаючою шкіру:
(i) якщо середній показник ОДЕСЧШ є меншим або дорівнює5 k Омега, та шкіряний диск помітно пошкоджений; або
(ii) якщо середній показник ОДЕСЧШ є меншим ніж або дорівнює5 k Омега; та
- шкіряний диск немає явних ознак пошкодження, але
- середній показник вмісту барвника на диску є більший ніж,або дорівнює середньому показнику вмісту барвника 10M HCl,отриманого при супутньому позитивному контролі.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має містити наступнуінформацію:
Досліджувані та контрольні речовини:
- назва(и) хімічної речовини, такі як: назва ЄРІКХР чи РСХ таномер РСХ, якщо відомо,
- чистота та склад речовини чи препарату (у відсотку(ах) навагу) та фізичні властивості,
- фізико-хімічні властивості, такі як фізичний стан, pH,стійкість, розчинність у воді, що важливі для проведеннядослідження,
- обробка досліджуваних/контрольних речовин перед проведеннямдослідження тестування у випадку застосування (наприклад,нагрівання, розмелювання),
- стійкість, якщо відома.
Піддослідні тварини:
- використані штами та стать,
- вік тварин, коли їх використовують в якості донорів,
- походження, умови утримування, режим харчування, та ін.,
- докладна інформацію про приготування шкіри.
Умови дослідження:
- калібрувальні криві для апарату для тестування,
- калібрувальні криві для здійснення тесту на зв'язуваністьбарвника,
- докладна інформація про процедури тестування, щовикористовувались для вимірювання ОДЕСЧШ,
- докладна інформація про процедури тестування, щовикористовувались для оцінювання зв'язування барвника; у випадкузастосування,
- опис будь-яких змін процедури тестування,
- опис критеріїв оцінювання, які використовують.
Результати:
- складання таблиць даних ОДЕСЧШ та аналізу зв'язуваностібарвника (у випадку доцільності) для кожної тварини та кожногозразка шкіри;
- опис будь яких явищ, якщо вони спостерігались.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD, (2001) Harmonised Integrated Classification Systemfor Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substancesand Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33.ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: DermalIrritation/Corrosion.
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren,R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C.,Hildebrand, B.,Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M.,Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M., (1995) Aprevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. Thereport and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23,p. 219-255.
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I.,Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM internationalvalidation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1.Selection and distribution of the test chemicals. Toxicology. InVitro 12, p. 471-482.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G., andLiebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on invitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by theManagement Team. Toxicology. In Vitro 12, p. 483-524.
(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop onHarmonisation of Validation and Acceptance Criteria forAlternative Toxicological Test Methods, p. 62.
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L.,Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis,R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D.,Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of thevalidation of toxicity test procedures. The report andrecommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129-147.
(8) ICCVAM, (Interagency Coordinating Committee on theValidation of Alternative Methods)., (1997) Validation andRegulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIHPublication No 97-3981. National Institute of Environmental HealthSciences, Research Triangle Park, NC, USA.http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
(9) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on theValidation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation ofEpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin TranscutaneousElectrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods forassessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIHPublication No 02-4502. National Toxicology Program InteragencyCenter for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods,National Institute of Environmental Health Sciences, ResearchTriangle Park, NC, USA.http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on TheIn Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st-2ndNovember 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat.
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C., (1986)An in vitro skin corrosivity test-modificationsand validation. Fd.Chem.Toxicol. 24, 507-512.
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C.,Basketter, D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., andGardner, J., (1992) The skin corrosivity test in vitro: results ofan interlaboratory trial. Toxic.In Vitro6, p. 191-194.
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile D.J., Liebsch, M., (1998) AnEvaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for SkinCorrosion. ATLA 26, p. 709-720
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A.,Rowson, M., Whittle, E., York, M., (1997) The classification ofskin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35,p. 845-852.
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C., (1988) An InVitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. InitialValidation. Toxicology In Vitro. 2, p. 7-17.
Малюнок 1
Малюнок 2
B.40BIS. РОЗ'ЇДАННЯ ШКІРИ IN VITRO: ДОСЛІДЖЕННЯ
ЗРАЗКА ЛЮДСЬКОЇ ШКІРИ
1. МЕТОД
Цей метод еквівалентний методу, описаному у TI OECP 431(2004).
1.1. ВСТУП
Роз'їдання шкіри пояснюється виникненням необоротногопошкодження тканини шкіри внаслідок застосування досліджуваноїречовини (як визначено Глобальною Гармонізованою СистемоюКласифікації та Мічення Хімічних речовин та Сумішей (ГГС)) (1).Цей метод тестування не потребує використання живих тварин аботканини тварин для оцінки роз'їдаючої дії на шкіру.
Оцінка роз'їдаючої дії на шкіру, зазвичай, включаєвикористання піддослідних тварин (2). Через стурбованість болем тастраждання, яких тварини зазнають під час проведення цьогодослідження, було переглянуто метод. B.4, який надає можливістьвизначити роз'їдання шкіри із використанням альтернативних методівin vitro, уникаючи при цьому спричинення болю та стражданнятваринам.
Першим кроком для визначення альтернативних методівдосліджень, які можна було б використовувати для дослідженняроз'їдаючої дії на шкіру, в регулятивних цілях, було проведенняпопереднього аналізу неупередженої вибірки (3). Після цьогоофіційний аналіз неупередженої вибірки методів оцінки роз'їданняшкіри in vitro (4)(5) було проведено (6)(7)(8). Результатипроведення цих аналізів та іншої опублікованої літератури (9)призвели до появи рекомендацій про те, що наступні тести можутьвикористовуватись для оцінки роз'їдання шкіри in vivo(10)(11)12)(13): тестування на моделі людської шкіри (див. цейметод) та тест на опір дії електричного струму через шкіру (див.метод тестування В.40).
Аналіз неупередженої вибірки повідомляє, що тестування намоделі людської шкіри (3)(4)(5)(9) надають можливість чіткорозрізняти відомі роз'їдаючі і не роз'їдаючі шкіру речовини. Упротоколі про проведення тестування може також надаватисяінформація про відмінності між гострими роз'їдаючими та меншроз'їдаючими шкіру речовинами.
Дослідження, описане в цьому методі, надає можливістьвизначити роз'їдаючі шкіру хімічні речовини та суміші. Окрім того,дослідження надає можливість визначити речовини та суміші, які незавдають роз'їдаючого впливу на шкіру, за умови підтвердженняцього факту іншою наявною інформацією (наприклад, pH,взаємозв'язок між структурою та роз'їдаючою дією, дані щодо людинита/чи тварини) (1)(2)(13)(14). Дослідження не надає інформаціїщодо подразнення шкіри, а також не дозволяє вивестипід-класифікацію роз'їдаючих шкіру речовин, що дозволяєтьсяГлобальною Гармонізованою Системою Класифікації (ГГС) (1).
Для проведення детальної оцінки місцевих впливів на шкірупісля одноразової дії на шкіру, рекомендується дотримуватисьпослідовної стратегії проведення тестувань, що додається до методупроведення дослідження B.4 (2) і надається ГлобальноюГармонізованою Системою (1). Ця стратегія проведення тестуваньвключає проведення досліджень щодо роз'їдання шкіри in vitro (якописано в цьому методі) та щодо подразнення шкіри перед тим, якрозглядати можливість проведення тестування на живих тваринах.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Роз'їдання шкіри in vivo: це виникнення необоротних ушкодженьшкіри, а саме видимого некрозу крізь епідерму та у дермі, впродовжчотирьох годин після застосування досліджуваної речовини. Реакціїроз'їдання характеризуються язвами, кровотечами, кривавимиструпами та наприкінці спостереження на 14-ий день, знебарвленнямшкіри через відбілювання шкіри, ділянками повного облисіння, ташрамами. З метою оцінки підозрілих ушкоджень, слід враховуватирезультати гістопатологічних досліджень.
Життєздатність клітин: параметр, що вимірює загальнуактивність популяції клітин (наприклад, здатність клітиннихмітохондріальних дегідроназ зменшувати кількість життєздатногобарвника МТТ), що, залежить від виміряної кінцевої точки та планупроведення тестування, який використовується та співпадає ззагальною кількістю та/чи життєздатністю клітин.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Таблиця 1
Еталонні хімічні речовини
------------------------------------------------------------------
| Назва | EINECS N | CAS N | |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|1,2-Диамінопропан |201-155-9 |78-90-0 |Дуже роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Акрилова кислота |201-177-9 |79-10-7 |Дуже роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|2-трет Бутилфенол |201-807-2 |88-18-6 |Роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Калій гідроксид (10%) |215-181-3 |1310-58-3 |Роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Сірчана кислота (10%) |231-639-5 |7664-93-9 |Роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Октанова кислота |204-677-5 |124-07-02 |Роз'їдаюча |
|(каприлова кислота) | | | |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|4-аміно-1,2,4-триазол |209-533-5 |584-13-4 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Евгенол |202-589-1 |97-53-0 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Фенетил бромід |203-130-8 |103-63-9 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Тетрахлоретилен |204-825-9 |27-18-4 |Не роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|Ізостеаринова кислота |250-178-0 |30399-84-9|Не роз'їдаюча |
|----------------------+------------+----------+-----------------|
|4-(метило)- |222-365-7 |3446-89-7 |Не роз'їдаюча |
|бензальдегід | | | |
------------------------------------------------------------------
Більшість еталонних хімічних реагентів обрані з ЄЦОАМД(Європейського центру з оцінки альтернативних методів досліджень)(4). Їхній вибір засновано на наступних критеріях:
(i) однакова кількість речовин, що мають роз'їдаючу та нероз'їдаючу дію;
(ii) наявні в продажі речовини, що охоплюють більшістьнеобхідних для дослідження хімічних класів;
(iii) включення сильно роз'їдаючих так само як і меншроз'їдаючих речовин з метою застосування диференційованогопідходу, що засновується на потенціалі роз'їдання;
(iv) вибір хімічних реагентів, які можна використовувати влабораторії, уникаючи інших, більш серйозних ризиків, таких якроз'їдаюча дія.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Досліджуваний матеріал застосовується до трьохвимірногозразка шкіри людини, що вміщує щонайменше відновлений епідерміс зфункціональним шаром рогівки. Роз'їдаючі речовини визначаються заїхньою здатністю спричиняти зменшення життєздатності клітин (щовизначено, наприклад, при використанні аналізу на зменшення МТТ(15)) нижче порогового рівня під час встановлених періодівпіддавання впливу. Принцип проведення дослідження зразка шкірилюдини заснований на припущенні, що роз'їдаючі хімічні речовиниможуть проникати до шару рогівки шляхом дифузії чи ерозії, та єцитотоксичними порівняно з прилеглими шарами клітин.
1.4.1. ПРОЦЕДУРА
1.4.1.1. Моделі шкіри людини
Моделі шкіри людини можна сконструювати або придбати(наприклад, моделі торгівельних марок ЕпіДерм(ТМ) та ЕПІСКІН(ТМ))(16)(17)(18)(19) або розробити та створити лабораторії (20)(21).Визнано, що використання шкіри людини є об'єктом національних таміжнародних етичних міркувань та положень. Будь-яка нова модельповинна бути затвердженою (принаймні в межах, описаних у пункті1.4.1.1.2). Моделі шкіри людини, які використовуються для цьоготесту, мають відповідати наступним вимогам:
1.4.1.1.1. Загальні вимоги до моделі:
Кератиноцити людини мають використовуватись для побудовиепітелію. Численні шари життєздатних клітин епітелію мають бутинаявними під функціональним роговим шаром. Модель шкіри також можемати шар стромальних клітин. Роговий шар повинен мати багато шарівз необхідним прошарком ліпідів, щоб створювати функціональнийбар'єр з такою міцністю, щоб він протистояв швидкому проникненнюцитотоксичних маркерів. Захисні властивості моделі шкіри маютьзапобігати проходженню речовин навколо рогового шару дожиттєздатної тканини. Проходження досліджуваних хімічних речовиннавколо рогового шару призведе до неправильного відтворення моделішкіри. Модель шкіри не повинна бути заражена бактеріями (включаючимікоплазму) чи грибками.
1.4.1.1.2. Умови функціонування моделі:
Показник життєздатності, зазвичай, вимірюється використаннямMTT або інших метаболічно перетворених життєздатних барвників. Утаких випадках оптична щільність (ОЩ) видаленого (розчиненого)барвника з тканини негативного контролю повинна бути принаймні в20 разів більше ніж ОЩ самої екстракції розчинника (для огляду,див. (22)). Тканина негативного контролю має бути стійкою укультурі (забезпечувати однакові вимірювання життєздатності) наперіод експозиції під час проведення тесту. Роговий шар має бутидостатньо міцним, щоб опиратися швидкому проникненню певнихцитотоксичних мічених хімічних речовин (напр. 1% Тритону X-100).Ця властивість може бути оцінена за тривалістю експозиції, що єнеобхідною для зменшення життєздатності клітин до 50% (ET )
50
(напр. для моделей ЕпіДерм(ТМ) та ЕПІСКІН(ТМ) це становить
> 2 годин). Тканина має виявляти репродуктивність з часом та
переважно між лабораторіями. Більше того, вона має бути здатною
прогнозувати потенціал роз'їдання еталонних речовин (див.
Таблицю 1), якщо вона використовується в обраному протоколі
проведення тесту.
1.4.1.2. Нанесення досліджуваних та контрольних речовин
Дві копії тканини використовуються для кожної обробки (періодекспозиції), включаючи контролі. Для рідких матеріалів, маєзастосовуватись достатня кількість досліджуваної речовини, дляоднорідного покриття поверхні шкіри: слід використовувати мінімум25 мкл/кв.см. Для твердих матеріалів, має застосовуватись достатнякількість речовини для рівномірного покриття шкіри, і вона повиннабути зволожена деіонізованою або дистильованою водою длязабезпечення тісного контакту зі шкірою. У випадку необхідностітверді речовини мають бути подрібнені у порошок передзастосуванням. Метод нанесення має підходити для досліджуваноїречовини (див. наприклад, посилання 5). Наприкінці періодуекспозиції, досліджуваний матеріал слід ретельно змити з поверхнішкіри з використанням відповідного 0,9% буферного розчину, NaCl.
Супутній позитивний і негативний контроль маютьвикористовуватись для кожного дослідження з метою забезпеченнявідповідного функціонування експериментальної моделі.Рекомендованими речовинами для позитивного контролю єкристалізована оцтова кислота або 8N KOH. Рекомендованимиречовинами для негативного контролю є 0,9% розчин NaCl або вода.
1.4.1.3. Вимірювання життєздатності клітин
Лише затверджені методи кількісного аналізу можуть бутивикористані для вимірювання життєздатності клітин. Більш того,оцінка життєздатності клітин повинна бути сумісною з використаннямтрьохвимірної побудови тканини. Не характерне зв'язування барвникане повинно перешкоджати вимірюванню життєздатності. Отже,барвники, що зв'язують протеїни та ті, які не зазнаютьметаболічного перетворення (наприклад, нейтральний червоний) не єпридатними. Найбільш вживаним аналізом є відновлення MTT(3-(4,5-Диметилтіазол-2-ил)-2,5-дифенілтетразолін бромід, тіазолилсиній: номер ЄРІКХР 206-069-5, номер РСХ 298-93-1)), яке показалоточні результати, що можна відтворити(5), проте, інші видианалізів також можуть використовуватись. Зразок шкіри поміщають врозчин MTT з відповідною концентрацією (наприклад, 0,3-1 мг/мл) таінкубаційною температурою на 3 години. Осад блакитного формазанупотім видаляється за допомогою розчинника (ізопропанолу), аконцентрація формазану вимірюється визначенням ОЩ при довжиніхвилі 540-595 нм.
Хімічна дія тестованого матеріалу на життєздатний барвникможе імітувати клітинний метаболізм, що призводить донеправильного оцінювання життєздатності. Це трапляється у томувипадку, коли тестовий матеріал був не повністю видалений зі шкірипромиванням (9). Якщо тестована речовина діє безпосередньо нажиттєздатний барвник, то слід застосовувати додаткові видиконтролю, для того щоб виявити та усунути вплив тестованих речовинна вимірювання життєздатності (9)(23).
2. ДАНІ
Показники ОЩ для кожної тканини, та дані обрахованої увідсотках життєздатності клітин для досліджуваного матеріалу,позитивних та негативних контролів мають подаватись у формітаблиці, включаючи дані повторних експериментів, за умовипроведення, середні та індивідуальні показники.
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Показники ОЩ, отримані з кожного зразка, можутьвикористовуватись для обрахування у відсотках життєздатностівідповідно до негативного контролю, яка довільно встановлюється нарівні 100%. Середній показник життєздатності клітин у відсотках,що розрізняє роз'їдаючі досліджувані матеріали від не роз'їдаючих(або розрізняє різні класи роз'їдаючих речовин), або статистичнапроцедура(и), що використовуються для оцінки результатів тавиявлення роз'їдаючих матеріалів, мають бути чітко визначені тазадокументовані, а також вони мають бути виправданими. Загалом, цісередні показники встановлюються під час оптимізації тесту,перевіряються протягом фази попереднього контрольного дослідженнята підтверджуються під час проведення аналізу неупередженоївибірки. Наприклад, прогнозування роз'їдаючої дії, пов'язане змоделлю ЕпіДерм(ТМ) викладено у (9):
Досліджувану речовину вважають роз'їдаючою шкіру:
(i) якщо життєздатність після 3-х хвилин експозиції є меншою,ніж 50%; або
(ii) якщо життєздатність через три хвилини експозиції єбільшою, ніж або дорівнює 50%, і життєздатність після 1 годинивпливу експозиції є меншою, ніж 15%.
Досліджувану речовину вважають не роз'їдаючою шкіру:
(i) якщо життєздатність впродовж трьох хвилин експозиції єбільшою або дорівнює 50%, і життєздатність після 1 годиниекспозиції є більшою або дорівнює 15%.
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має містити наступнуінформацію:
Досліджувані та контрольні речовини:
- назва(и) хімічних речовин, такі як: назва ЄРІКХР чи РСХ,реєстраційний номер РСХ, якщо відомі,
- відсутність домішок та склад речовини або препарату (увідсотку(ах) на вагу),
- фізико-хімічні властивості такі як фізичний стан, pH,стійкість, розчинність, що важливі для проведення дослідження,
- обробка досліджуваних/контрольних речовин перед проведеннямтестування, у випадку застосування (напр. нагрівання,подрібнення),
- стабільність, якщо відома.
Обґрунтування використаної моделі шкіри та протоколу
Умови проведення тесту:
- використана клітинна система,
- інформація про калібрування вимірювального пристрою, якийвикористовується для вимірювання клітинної життєздатності(наприклад, спектрофотометр),
- докладна допоміжна інформація щодо окремої моделі шкіри,яка використовується, включаючи її дійсність,
- докладна інформація про процедуру тестування, якавикористовується,
- досліджувані дози, які використовуються,
- опис будь-яких змін процедури дослідження,
- посилання на історичні дані моделі,
- опис використаних критеріїв оцінювання.
Результати:
- складання таблиць даних індивідуальних досліджуванихзразків,
- опис інших явищ, якщо вони спостерігались.
Обговорення результатів.
Висновки.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification Systemfor Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substancesand Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33.ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: DermalIrritation/Corrosion.
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren,R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B.,Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M.,Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M., (1995) Aprevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. Thereport recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, p. 219-255.
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I.,Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM internationalvalidation study on in vitro tests for skin corrosivity.1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxicology InVitro 12, p. 471-482.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A.,Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. andLiebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on invitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by theManagement Team. Toxicology In Vitro 12, p. 483-524.
(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop onHarmonisation of Validation and Acceptance Criteria forAlternative Toxicological Test Methods, p. 62.
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L.,Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis,R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D.,Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of thevalidation of toxicity test procedures. Test report andrecommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129-147.
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on theValidation of Alternative Methods)., (1997) Validation andRegulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIHPublication No 97-3981. National Institute of Environmental HealthSciences, Research Triangle Park, NC, USA.http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H.,Uphill, P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann,T., Remmele, M. and Holzhutter, H.G., (2000) The ECVAMprevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivitytesting. ATLA 28, p. 371-401.
(10) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, p. 275-280.
(11) ECVAM, (2000) ECVAM News & Views. ATLA 28, p. 365-67.
(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on theValidation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation ofEpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin TranscutaneousElectrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods forassessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIHPublication No 02-4502. National Toxicology Program InteragencyCenter for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods,National Institute of Environmental Health Sciences, ResearchTriangle Park, NC, USA.http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
