Для речовин, введених з їжею або питною водою, важливозабезпечити, щоб кількості досліджуваної речовини не впливали нанормальне харчування чи водний баланс. Коли тестована речовинавводиться з їжею, може використовуватись або постійна концентраціяїжі (ppm), або постійний рівень дози в залежності від маси тілатварин; має бути вказана використана альтернатива. Для речовини,введеної через шлунковий зонд, дози повинні вводитись в один і тойже час, та регулюватись, оскільки необхідно підтримувати постійнийрівень дози в залежності від маси тіла. У випадках, колидослідження введення повторної дози проводиться в якостіпопереднього дослідження до довготривалого дослідження, то слідвикористовувати однаковий режим харчування в обох дослідженнях.Для дослідження гострих впливів, якщо використання одноразовоїдози є неможливим, дозу вводити меншими порціями протягом періоду,що не перевищує 24 години.
1.6. ДАНІ СПОСТЕРЕЖЕНЬ
1.6.1. Частота спостережень та тестів
В дослідженнях повторних доз, період спостереження повиненохоплювати період дозування. В дослідженні на виявлення гострихвпливів, потрібно дотримуватись 14-ти денного періоду післяобробки. Для тварин у супутніх групах, які утримуються безекспозиції під час періоду після обробки, спостереження мають таксамо охоплювати цей період.
Спостереження мають виконуватись з достатньою частотою, щобмаксимізувати можливість виявлення будь-яких неврологічниханомалій та/чи відхилень у поведінці. Спостереження повинніздійснюватись бажано в один і той же час кожного дня, враховуючиперіод піку передбачених явищ після введення дози. Частотаклінічних спостережень та функціональних тестів коротко викладеніу Таблиці 2. Якщо кінетичні або інші дані, узагальнені зпопередніх досліджень, вказують на потребу використання різнихвідрізків часу для спостереження, періодів проведення тестів, таспостережень після проведення тестів, потрібно слід затвердитиальтернативний графік для того, щоб отримати максимум інформації.Також мають наводитись обґрунтування для зміни графіку проведеннядосліджень.
1.6.1.1. Спостереження за загальним станом здоров'я тасмертністю
Всіх тварин потрібно ретельно оглядати принаймні один разщоденно для виявлення їхнього стану здоров'я, так само як і двічіщоденно з метою виявлення захворювань та смертності.
1.6.1.2. Деталізовані клінічні спостереження
Деталізовані клінічні спостереження мають проводитись на всіхтваринах, обраних з цією метою (див. Таблицю 1) один раз передпершою експозицією (щоб надати можливість порівняння в межахпредмету дослідження) та відтак при різних інтервалах, залежно відтривалості дослідження (див. Таблицю 2). Деталізовані клінічніспостереження супутніх груп, що відновлюються, мають здійснюватисьнаприкінці відновлювального періоду. Деталізовані клінічні оглядиповинні проводитись за межами клітки, де утримуються тварини, настандартній площині. Їх потрібно уважно записувати, використовуючисистеми оцінки та шкали оцінок для кожного вимірювання під часогляду. Використані критерії або шкали повинні бути чітковизначені лабораторією, яка проводить дослідження. Слід докладатизусиль для забезпечення того, щоб варіювання умов тестування буломінімальним (не обов'язково систематично пов'язане здослідженням), та щоб спостереження проводились кваліфікованимидослідниками, які не були ознайомлені з результатами цьогодослідження.
Рекомендується проводити огляди у структурованій формі, уякій точно визначені критерії (включаючи визначення звичайного"діапазону") застосовуються систематично до кожної тварини під часкожного періоду огляду. "Звичайний діапазон" повинен мативідповідне документальне підтвердження. Всі потрібно записуватиознаки, які спостерігались. За можливістю, потрібно записуватидіапазон показників, які спостерігаються. Клінічні спостереженняале включати, але не обмежуватися, змінами шкіри, хутра, очей,слизистої оболонки, появою секреції та екскреції та активностівегетативної нервової системи (напр., сльозоточивість,пілоерекція, розміри зіниці, незвичний характер дихання та/чидихання ротом, будь-які незвичні явища сечовипускання тавипорожнення та знебарвлена сеча).
Будь-які незвичні реакції відповідно до положення тіла, рівняактивності (наприклад, зменшення або збільшення дослідженнязвичайної площі) та координації рухів, мають також записуватись.Зміни ходи (наприклад, хода перевальцем, атаксія (розладкоординаційних рухів), стан (наприклад, горбань) та реактивністьманіпулювання, розміщення, або інші стимули навколишньогосередовища, так само як і присутність клонічних або тонізуючихрухів, судом або тремтіння, стереотипи (наприклад, надмірнечищення, незвичні рухи головою, повторний рух по колу) або дивнаповедінка (кусання або надлишкове облизування, завдання ушкодженьособинам того самого виду, рух у зворотному напрямку, подаваннязвуків) або агресія повинні записуватись.
1.6.1.3. Функціональні тести
Подібно до деталізованих клінічних спостережень,функціональні тести повинні проводитись один раз перед експозицієюта часто стосовно всіх тварин, обраних з цією метою (див.Таблицю 1). Частота функціонального тестування також залежить відтривалості дослідження (див. Таблиця 2). Окрім періодівдослідження, як встановлено у Таблиці 2, функціональніспостереження за супутніми відновлювальними групами також маютьздійснюватись наскільки це можливо до остаточного знищення.Функціональні тести повинні включати сенсорну реактивність достимулів різних видів (наприклад, слухових, візуальних,пропріоцептивних стимулів (5)(6)(7)), оцінку сили хватки (8) таоцінювання моторної активності (9). Моторна активність маєвимірюватись автоматичним приладом, який здатний виявити якзменшення, так і збільшення активності. Якщо використовується іншавизначена система, вона має бути кількісною, та має бутипродемонстровано її чутливість та надійність. Кожен прилад слідпротестувати, щоб забезпечити достовірність у часі тапослідовності з'єднання між приладами. Подальша інформація щодопроцедур, яких можна дотримуватися, наведена у відповіднихпосиланнях. Якщо дані відсутні (наприклад, дані щодоструктурна-активності, епідеміологічні дані та інші токсикологічнідослідження), з метою визначення потенціалу нейротоксичнихвпливів, слід проаналізувати включення більш спеціалізованихтестів на сенсорну та моторну функцію або на процеси навчання тапам'яті, з метою проведення більш деталізованого дослідженняможливих впливів. Більше інформації про більш спеціалізовані тестита їхнє застосування наведені у (1).
Виключно ті тварини, які проявляють ознаки токсичності, якізавдають значного впливу на перебіг функціонального тесту, можутьбути виключені з цього тесту. Слід навести обґрунтування длявиключення тварин з функціонального тесту.
1.6.2. Маса тіла та споживання води/їжі
Для досліджень, які тривають до 90 днів, всіх тварин слідзважувати принаймні раз на тиждень та слід вимірювати кількістьспожитої їжі (споживання води, коли досліджувана речовинавводиться через цей спосіб) принаймні щотижня.
Для довгострокових досліджень, всіх тварин потрібно зважуватипринаймні один раз на тиждень протягом перших 13 тижнів та зінтервалом щонайменше кожні чотири тижня після цього. Потрібновимірювати споживання їжі (споживання води, коли тестованаречовина вводиться у цей спосіб) щонайменше щотижнево протягомперших 13 тижнів і потім з інтервалом приблизно три місяці, якщозміни стану здоров'я чи маси тіла не вмагатимуть іншого.
1.6.3. Офтальмологія
Для досліджень з тривалістю, що перевищує 28 днів,офтальмологічне дослідження з використанням офтальмоскопа аборівноцінного підходящого інструменту має проводитися передзастосуванням досліджуваної речовини, та по закінченнідослідження, бажано на всіх тваринах, але принаймні на тваринах згруп з високими дозами та контрольними групами. Якщо виявленозміни в очах або, якщо клінічні ознаки вказують на потребу, товсіх тварин потрібно обстежити. Для довготривалих досліджень,офтальмологічна перевірка має також проводитись протягом13 тижнів. Офтальмологічні дослідження не потрібно проводити, якщоці дані вже наявні з інших досліджень такою ж тривалістю тарівнями застосування доз.
1.6.4. Гематологія і клінічна біохімія
Коли проводиться дослідження нейротоксичності в поєднанні здослідженням системної токсичності повторних доз, гематологічнівипробовування та клінічні біохімічні визначення повинніпроводитися так як визначено у відповідному методі дослідженнясистемної токсичності. Забір зразків має здійснюватись такимчином, щоб мінімізувати будь-які потенціальні впливи на нервовуповедінку.
1.6.5. Гістопатологія
Нейропатологічне дослідження має бути розроблене таким чином,щоб доповнювати та розширювати спостереження, зроблені під часфази дослідження in vivo. Тканини щонайменше п'ятитварин/статей/груп (див. Таблицю 1 та наступний пункт) повинніфіксуватись in situ, використовуючи загальновизнані технікиоббризкування та фіксації (див. посилання 3, розділ 5 та посилання4, розділ 50). Потрібно записувати будь-які помітні значні зміни.Коли дослідження проводиться як незалежне дослідження, перевіркана нейротоксичність або характеристика нейротоксичних впливів,решта тварин можє використовуватись або для окремих процедурдосліджень поведінки (10)(11), для окремих нейропатологічнихдосліджень (10)(11)(12)(13) та для окремих нейрохімічнихдосліджень (10)(11)(14)(15) або електрофізичних досліджень(10)(11)(16)(17), які можуть доповнити процедури та дослідження,описані у цьому пункті, або збільшити кількість суб'єктівперевірених на гістопатологію. Ці додаткові процедури мають окремезастосування, коли емпіричні спостереження або передбачені ефективказують на особливий тип чи мішень нейротоксичності (2)(3). Вякості альтернативи, решта тварин можуть також використовуватисьдля звичайних патологічних оцінювань, як описано в методідослідження при застосуванні повторних доз.
Загальна процедура фарбування, така як гематоксилін та еозін(H & E), повинна проводитись на всіх зразках тканин, покритихпарафіном та повинно бути проведене здійснюватись мікроскопічнедослідження. Якщо спостерігаються, або очікуються, то повиннідосліджуватись пластикові зразки периферійної нервової тканини.Клінічні ознаки можуть теж надавати додаткові питання длядослідження використання спеціальних процедур фарбування.Інструкція по дослідженню додаткових питань наведена у (3)(4).Відповідні специфічні барвники, що представляють особливі видипатологічних змін, можуть також стати в нагоді (18).
Зразки частин центральної та периферійної нервової системиповинні перевірятись шляхом проведення гістологічних досліджень(див. посилання 3, розділ 5 та посилання 4, розділ 50). Ділянки,які досліджуються, мають, як правило, включати: передній мозочок,центр головного мозку, в тому числі ділянку амонового рогу,середній мозочок, мозочок, варолієві мости, кістковий мозок, око зоптичним нервом та сітчаткою, спинний мозок на шийних та крижнихвипуклостях, нервові ганглії дорсального кореня та черевніволокна, найближчий сідничний нерв, найближчий тибіальний нерв (наколіні) та тибіальний нерв відгалужень м'язів. Спинний мозок тапериферійні ділянки нервів повинні включати як перехресні абопоперечні, так і ділянки довготи. Слід звернути увагу на судининервової системи. Зразок скелетної мускулатури, особливо м'язителяти, потрібно також дослідити. Особливу увагу також слідзвернути на боки з клітинною та волокнистою структурою та зразок уCNS та PNS, відомий як той, що особливо вразливий донейротоксикантів.
Інструкція щодо нейропатологічних змін які, зазвичай, єрезультатом піддавання впливу токсиканта можна знайти у посиланнях(3)(4). Покрокове дослідження зразків тканин рекомендується длятих ділянок, де частини груп з високою дозою порівнюються спочаткузі зразками з інших груп, послідовний аналіз не вимагається. Якщоневропатологічні зміни спостерігаються у групах з високою дозою,то зразок кожної потенційно ураженої тканини з груп з середньою танизькою дозою повинні бути закодовані та досліджені в подальшому.
Якщо виявлено будь-які докази невропатологічних змін укількісному дослідженні, слід провести друге дослідження на всіхділянках нервової системи із демонстрацією цих змін. Зрізи дляаналізу з кожної групи дозування з потенційно вражених ділянокмають кодуватись та досліджуватись навмання, не беручи до увагиінформацію про код. Частота та тяжкість кожного пошкодження маютьзаписуватись. Після проведення оцінки на всіх ділянках групдозування, код може бути зламано, і здійснено статистичний аналізз метою визначення співвідношення реакції та дози. Приклади різнихступенів тяжкості пошкодження потрібно описувати.
Невропатологічні дані мають бути оцінені у контекстіспостережень за змінами у поведінці та вимірювань, так само як іінші дані з попередніх та супутніх досліджень системноїтоксичності тестованої речовини.
2. ДАНІ
2.1. ОБРОБКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Індивідуальні дані повинні надаватись. Додатково, всі даніповинні підсумовуватись у формі таблиці і показувати для кожноготесту чи контрольної групи, кількість тварин на початку досліду,кількість тварин, які померли під час тесту або були вбиті згуманістичних міркувань, кількість ознак токсичності, опис ознактоксичності, які спостерігались, включаючи початок, тривалість,вид та тяжкість пошкодження(нь).
2.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати дослідження мають оцінюватись з точки зору сферивпливу, тяжкості та співвідношення явищ, що спостерігаються унервовій поведінці та невропатологічних явищ (нейрохімічні чиелектрофізіологічні явища, а також додаткові дослідження маютьвраховуватись) та будь-які інші шкідливі впливи, якіспостерігались. Якщо можливо, то результати, виражені у цифровійформі, повинні оцінюватись належним чином та, як правило, ізвикористанням прийнятного статистичного методу. Статистичні методислід обирати під час розробки дослідження.
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має містити наступнуінформацію:
Досліджувана речовина:
- фізичні властивості (включаючи ізомерію, чистоту тафізико-хімічні властивості),
- ідентифікаційні дані.
Розчинник (у випадку використання):
- підтвердження вибору розчинника.
Піддослідні тварини:
- вид/порода, яку використовують,
- кількість, вік та стать тварин,
- джерело, умови утримування, акліматизація та ін.,
- індивідуальна вага тварин на початку тесту.
- Умови тесту: детальна інформація щодо приготування їжі таскладу досліджуваної речовини, отримана концентрація, стабільністьта гомогенність приготування,
- детальний опис дозувань, які застосовуються, включаючидетальну інформацію про розчинник, об'єм та фізичну формуматеріалу, який використовують,
- деталі застосування досліджуваної речовини
- обґрунтування обраних рівнів дозувань,
- обґрунтування напряму та тривалості піддавання дії,
- перехід від концентрації дієтичної/питної води вдосліджуваній речовині (ppm) до фактичної дози (мг/кг маситіла/день), якщо застосовується,
- деталі якості їжі та води.
Спостереження та процедури дослідження:
- докладна інформація про розподіл тварин в кожній групі напідгрупи перфузії,
- деталі систем категоризації, включаючи критерії та шкалибалів для кожного вимірювання у детальних клінічнихспостереженнях,
- деталі функціональних тестів на сенсорну реакційнуспроможність щодо стимулів різних видів (наприклад, слухових,візуальних, та пропріоцептивних) для оцінки міцності хватки,моторної активності (включаючи деталі автоматичних приладів яківиявляють їх активність), та інші процедури, які використовуються,
- деталі офтальмологічних дослідів та, якщо застосовуються,гематологічних досліджень і клінічних біохімічних тестів зрелевантними базовими значеннями,
- деталі конкретних нейробіхевіоральних, невропатологічних,нейрохімічних або електрофізичних процедур.
Результати:
- маса тіла/зміна ваги, включаючи масу тіла при знищенні,
- споживання їжі та води, відповідно,
- дані токсичної реакції за статтю та рівнем дози, включаючиознаки токсичності або смертності,
- природа, суворість, тривалість (час початку та подальшийперебіг) клінічних спостережень (оборотний чи ні),
- детальний опис всіх результатів функціональних тестів,
- результати автопсії,
- детальний опис всіх нейробіхевіоральних, невропатологічнихабо електрофізичних даних, якщо вони доступні,
- дані про поглинання та метаболізм, якщо наявні,
- статистична обробка результатів, де необхідно.
Обговорення результатів:
- інформація про реакцію на дозування;
- відношення будь-яких інших токсичних явищ до висновку щодонейротоксичного потенціалу хімікату, який тестують.
- рівень, за якого шкідливого впливу не спостерігається.
Висновки:
- конкретна заява про загальну нейротоксичність речовини, якутестують, заохочується.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity TestingStrategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study,OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
(3) World Health Organisation (WHO) (1986) EnvironmentalHealth Criteria document 60: Principles and Methods for theAssessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980) Experimentaland Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg,H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B., (1980) Utility of theNeurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40,p. 999-1003.
(6) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use inIndustrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691-704.
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M., (1991)Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional ObservationalBattery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl.Pharmacol., 108, p. 267-283.
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T.,(1979) A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limbGrip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1,p. 233-236.
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W.,Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991)Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments:Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol.Teratol., 13, p. 599-609.
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds., (1992)Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press,New York.
(11) Chang, L.W., ed., (1995) Principles of Neurotoxicology.Marcel Dekker, New York.
(12) Broxup, B., (1991) Neuopathology as a screen forNeurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, p. 689-695.
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail,R.C., (1992) Comparison of Subchronic Neurotoxicity of2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund.Appl.Toxicol., 18, p. 343-352.
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and GliotypicProteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol.Teratol., 10, p. 445-452.
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B., (1988) Acute Exposureof the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changesin Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther.,244, p. 368-378.
(16) Fox D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G., (1982)Electrophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: NervousSystem Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York,p. 299-335.
(17) Johnson, B.L., (1980) Electrophysiological Methods inneurotoxicity Testing. In: Experimental and ClinicalNeurotoxicology. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williamsand Wilkins Co., Baltimore/ London, p. 726-742.
(18) Bancroft, J.D. and Steven A., (1990) Theory and Praticeof Histological Techniques. Chapter 17, NeuropathologicalTechniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. ChurchillLivingstone.
Таблиця 1
Мінімальні кількості тварин на групу,
коли дослідження на нейротоксичність проводиться
окремо, або в поєднанні з іншими дослідженнями
-------------------------------------------------------------------------------
| | ДОСЛІДЖЕННЯ НЕЙРОТОКСИЧНОСТІ ПРОВОДИТЬСЯ ЯК: |
| |--------------------------------------------------|
| |Окреме |Комбіноване |Комбіноване |Комбіноване |
| |дослідження|дослідження |дослідження |дослідження |
| | |з 28-ми |з 90-денним |з |
| | |денним |дослідженням|дослідженням|
| | |дослідженням| |на хронічну |
| | | | |токсичність |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Загальна кількість тварин |10 самців |10 самців та|15 самців |25 самців та|
|на групу |та 10 самок|10 самок |15 самок |25 самок |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Кількість тварин обраних |10 самців |10 самців та|10 самців та|10 самців та|
|для функціонального |та 10 самок|10 самок |10 самок |10 самок |
|тестування включаючи | | | | |
|клінічні спостереження | | | | |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Кількість тварин обраних |5 самців та|5 самців та |5 самців та |5 самців та |
|для оббризкування in situ |5 самок |5 самок |5 самок |5 самок |
|та нейрогістопатології | | | | |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Кількість тварин для | |5 самців та |10 самців * |20 самців * |
|спостережень повторних | |5 самок |та |та |
|доз/субхронічної/хронічної| | |10 самок * |20 самок * |
|токсичності, гематології, | | | | |
|клінічної біохімії, | | | | |
|гістопатології та ін. як | | | | |
|визначено у відповідних | | | | |
|Інструкціях | | | | |
|--------------------------+-----------+------------+------------+------------|
|Додаткові спостереження, |5 самців та| | | |
|якщо використовуються |5 самок | | | |
|-----------------------------------------------------------------------------|
|* Включає 5 тварин обраних для функціонального тестування та детальних |
|клінічних спостережень як частина дослідження нейротоксичності. |
-------------------------------------------------------------------------------
Таблиця 2
Частота клінічних спостережень та функціональних тестів
---------------------------------------------------------------------------------------------
| Вид спостережень | Тривалість дослідження |
| |-------------------------------------------------|
| | Гостре | 28 днів | 90 днів | Хронічне |
|-----------------------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|У всіх тварин |Загальний стан здоров'я |щоденно |щоденно |щоденно |щоденно |
| |-------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
| |Смертність/захворюваність|двічі щоденно|двічі |двічі |двічі |
| | | |щоденно |щоденно |щоденно |
|---------------+-------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
|У тварин |Детальні клінічні |- перед |- перед |- перед |- перед |
|обраних для |спостереження |першим |першим |першим |першим |
|функціонального| |піддаванням |піддаванням|піддаванням|піддаванням|
|спостереження | |дії |дії |дії |дії |
| | |- протягом |- 1 раз в |- один раз |- один раз |
| | |8 годин |тиждень |протягом |в кінці |
| | |дозування при|після того |першого чи |першого |
| | |оціненому | |другого |місяця |
| | |часі | |тижня |піддавання |
| | |максимального| |піддавання |дії |
| | |ефекту | |дії |- кожні |
| | |- на 7-мий та| |- щомісячно|3 місяці |
| | |14-тий день | |після того |післі того |
| | |після | | | |
| | |дозування | | | |
| |-------------------------+-------------+-----------+-----------+-----------|
| |Функціональні тести |- перед |- перед |- перед |- перед |
| | |першим |першим |першим |першим |
| | |піддаванням |піддаванням|піддаванням|піддаванням|
| | |дії |дії |дії |дії |
| | |- протягом |- протягом |- один раз |- один раз |
| | |8 годин |4-го тижня |протягом |наприкінці |
| | |дозування при|обробки |першого чи |першого |
| | |оцінці часу |якомога |другого |місяця |
| | |максимального|ближче до |тижня |піддавання |
| | |ефекту |кінця |піддавання |дії |
| | |- на 7-мий та|періоду |дії |- кожні три|
| | |14-тий день |піддавання |- щомісячно|місяця |
| | |після |дії |після того |після того |
| | |дозування | | | |
---------------------------------------------------------------------------------------------
B.44. АБСОРБЦІЯ ЧЕРЕЗ ШКІРУ: МЕТОД IN VIVO
1. МЕТОД
Цей метод тестування еквівалентний TI OECP 427 (2004).
1.1. ВСТУП
Піддавання дії багатьох хімікатів спостерігається головнимчином через шкіру, тоді як більшість токсикологічних досліджень,що проводяться на піддослідних тваринах використовують пероральнийметод введення. Дослідження поглинання через шкіру методомin vivo, встановлене в цій інструкції, забезпечує зв'язокнеобхідний, щоб перейти в іншу область від пероральних дослідженьпід час оцінювання безпеки наступного піддавання дії через шкіру.
Речовина повинна пройти через багато шарів клітин шкіри дотого, як вона потрапить у кровообіг. Шар, який визначає показникидля більшості речовин є роговим та складається з мертвих клітин.Проникність шкіри залежить як від ліпофільності хімікату татовщини зовнішнього шару епідермісу, так і від таких факторів якмолекулярна вага та концентрація речовини. Загалом, шкіра щурів такроликів є більш проникною ніж шкіра людини, тоді як проникністьшкіри морських свинок та мавп є більш близькою до шкіри людини.
Методи для вимірювання абсорбції через шкіру можна розділитина дві категорії, in vivo та in vitro. Метод in vivo може надативичерпну інформацію, про поглинання шкірою різними піддосліднимивидами тварин. Нещодавно були розроблені методи in vitro. Вонивикористовують переміщення через повну або часткову товщину шкіритварин чи людей до резервуару рідини. Метод in vitro описується вокремому методі тестування в (1). Рекомендується консультуватись зметодичними вказівками з дослідження шкірної абсорбції ОЕСР в (2)для того, щоб сприяти у виборі найбільш придатного методу в данійситуації, оскільки він надає більше деталей про придатність якметодів in vivo, так і in vitro.
Метод in vivo, описаний у цьому методі, дозволяє визначитипроникність досліджуваної речовини через шкіру у систематичневідділення. Ця техніка використовувалась протягом багатьох років в(3)(4)(5)(6)(7). Хоча дослідження абсорбції через шкіру in vitroможе в багатьох випадках бути придатним, можуть виникати ситуаціїколи лише дослідження in vivo може забезпечити необхідні дані.
Переваги методу in vivo в тому, що він використовуєфізіологічно і метаболічно непошкоджену систему, використовує видвикористовуваний для багатьох досліджень токсичності. Недоліки -це використання живих тварин, потреба у міченому радіоактивнимізотопом матеріалі для того, щоб сприяти достовірним результатам,труднощі у визначенні ранньої стадії поглинання та різниця упроникності видів, яким надано перевагу (щур), та людської шкіри.Шкіра тварин загалом є більш проникною, а отже можна переоцінитипідшкірне поглинання у людини (6)(8)(9). Каустичні/корозійніречовини не повинні тестуватись на живих тваринах.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Доза, яка не поглинулась: це та доза, що була змита зповерхні шкіри після піддавання дії та будь яке неокклюзивнепокриття, включаючи будь яку дозу того вказану, як така, щовипаровується зі шкіри під час піддавання дії.
Поглинута доза (in vivo): включає в себе дозу, наявну всечовині, після миття клітки, фекаліях, повітрі, яке видихається(якщо воно вимірюється), крові, тканинах (якщо їх збирають) татуші, яка залишилася після видалення ділянки шкіри, на якунаносили препарат.
Доза, що поглинається: це доза, присутня на або в шкірі післязмивання.
1.3. ПРИНЦИП МЕТОДУ ТЕСТУВАННЯ
Досліджувана речовина, бажано мічена радіоактивним ізотопом,наноситься на виокремлену шкіру тварин на одному або більше рівняхдозування у формі зразка використаного для приготування.Досліджуваний препарат може залишатись в контакті зі шкірою нафіксований період часу за придатного покриття (неокклюзивний,напівокклюзивний, чи окклюзивний) щоб запобігти всмоктуваннюдосліджуваного препарату. Наприкінці періоду піддавання впливупокриття усувається, а шкіра очищується за допомогою відповідногоочищувального агента, покриття та очисні матеріали зберігаютьсядля аналізу та застосовується свіже покриття. Тварин поміщають до,під час та після періоду піддавання впливу в індивідуальнихклітках для метаболізму, а випорожнення та повітря, якевидихається під час цих періодів збирається для аналізу.
Збір використаного повітря може бути опущений, якщо єдостатньо інформації про те, що леткий радіоактивний метаболіт неутворюється, або його утворюється не багато. Кожне дослідженнязазвичай включатиме декілька груп тварин, які будуть піддаватисьдії досліджуваного препарату. Одну групу знищують в кінці періодупіддавання впливу. Інші групи знищують у заплановані часовіінтервали після того (2). В кінці дослідження тварин, якізалишилися знищують, а кров беруть на аналіз, ділянка аплікаціївидаляється для аналізу, а туша аналізується на наявністьбудь-якого не виділеного матеріалу. Зразки піддають хімічномуаналізу відповідними засобами та оцінюють ступінь підшкірноїабсорбції в (6)(8)(9).
1.4. ОПИС МЕТОДУ
1.4.1. Вибір виду тварин
Щур є видом тварин, який як правило найбільш використовують,але безшерстні породи та види мають показники шкірної абсорбціїбільш схожі з людськими (3)(6)(7)(8)(9). Молоді дорослі здоровітварини однієї статті (з ссавцями як стать по умовчанню) та видів,які зазвичай використовуються в лабораторіях, повиннізастосовуватись. На початку дослідження, коливання ваги тварин неповинно перевищувати +- 20% середнього значення. Для прикладу щурисамці вагою 200 г - 250 г є придатними, особливо у вищій половиніцього ряду.
1.4.2. Кількість та стать тварин
Група з щонайменше чотирьох тварин однієї статі повиннавикористовуватись для кожного приготування тесту та кожногозапланованого терміну його закінчення. Кожну групу тварин знищуютьпід час різних часових інтервалів, наприклад в кінці періодупіддавання дії (як правило 6 чи 24 год) та наступних подій(наприклад, 48 та 72 год). Якщо є доступні дані, які можутьпроказати вагомі відмінності в термальній токсичності самців тасамок, то обирається та стать, яка є більш чутливою. Якщо такихданих немає, тоді може використовуватись будь-яка стать.
1.4.3. Умови утримування та годування тварин
Температура в експериментальній кімнаті тварин повиннастановити 22 град.C (+- 3 град.C). Незважаючи на те що відноснавологість повинна бути щонайменше 30% та бажано не перевищувати70% за виключенням коли кімнату прибирають, цільовим рівнем є50-60%. Освітлення повинно бути штучним, в послідовності 12 годинсвітла, 12 годин темряви. Стосовно годування, можливе використанняузгоджених лабораторних дієт з безперервним постачанням питноїводи. Під час дослідження, а також бажано під час акліматизації,особин тварин потрібно утримувати в камерах для дослідженняметаболізму окремо одне від одного. Оскільки їжа та вода можутьвикривляти результати, то потрібно мінімізувати можливість такихвипадків.
1.4.4. Підготовка тварин
Тварин маркують, щоб забезпечити індивідуальну ідентифікаціюта тримають в клітках принаймні п'ять днів перед початкомдослідження, щоб зробити можливою акліматизацію до лабораторнихумов.
Після акліматизаційного періоду, та приблизно за 24 год переддозуванням, кожній тварині виокремлюють ділянку шкіри на плечах тана спині. Властивості проникнення пошкодженої шкіри відрізняютьсявід цілісної шкіри, тому потрібно потурбуватись щоб уникнутиздирання шкіри. Після виокремлення та приблизно за добу до того якречовину нанесуть на шкіру, (див. Пункт 1.4.7) поверхню шкірипотрібно протерти ацетоном, щоб усунути шкірний жир. Додатковемиття милом та водою не рекомендується, тому що будь-яке мило можесприяти абсорбції досліджуваної речовини. Ділянка повинна бутидостатньо великою, щоб забезпечити надійний обрахунок кількостіпоглинутої досліджуваної речовини на кв.см шкіри, бажано був10 кв.см. Такий розмір ділянки застосовується для щурів вагою200-250 г. Після підготовки, тварин повертають в камери.
1.4.5. Досліджувана речовина
Досліджувана речовина це суб'єкт, проникні властивості якогопотрібно дослідити. В ідеалі, досліджувана речовина повинна бутимічена радіо ізотопом.
1.4.6. Підготовка до тесту
Підготовка досліджуваної речовини (наприклад, нерозведений,розбавлений, або приготований матеріал, що містить хімікат, якийтестують та який наносять на шкіру) повинен бути такий самий (абореальний замінник) як той, дії якого будуть піддаватись люди чипотенціальні цільові види. Будь-які варіації препарату "увикористанні" повинні бути обґрунтовані. Якщо необхідно, тотестову речовину розчиняють або опускають у відповідний розчинник.Для розчинників окрім води характеристики абсорбції та потенціалвзаємодії з тестовою речовиною повинен бути відомий.
1.4.7. Нанесення на шкіру
Місце нанесення певної ділянки поверхні визначається наповерхні шкіри. Відома кількість препарату рівномірно наноситьсяна ділянку. Ця кількість повинна як правило імітувати потенціалпіддавання дії людини, зазвичай 1-5 мг/кв.см для твердих речовинчи до 10 мю l/кв.см для рідин. Будь-які інші кількості повиннібути обґрунтовані очікуваними умовами використання, об'єктамидослідження чи фізичними характеристиками підготовки тесту. Приподальшому нанесенні, оброблена ділянка повинна бути захищена відчистки. Приклад типового приладу наведений на Малюнку 1. Зазвичай,ділянка нанесення захищена неокклюзивним покриттям (наприклад,проникне нейлонове марлеве покриття). Однак, для необмеженихнанесень ділянка нанесення повинна бути закритою. У випадкувипаровування напівлетючої тестової речовини, коефіцієнтвідновлення речовини, яку тестують зменшується до неприйнятноївеличини (див. також параграф 1.4.10, перший абзац), томунеобхідно затримати випаровування речовини у фільтрі з деревноговугілля, який накриває прилад аплікації (див. Рисунок 1). Важливо,щоб будь-який прилад як не пошкоджував шкіри, так і не поглинавабо не вступав в реакцію з тестовою речовиною. Тварин повертаютьдо одиночних камер для метаболізму для того, щоб зібративипорожнення.
1.4.8. Тривалість піддавання дії та відбору проб
Тривалість піддавання дії - це інтервал часу між нанесеннямта видаленням досліджуваного препарату, через миття шкіри.Потрібно використовувати відповідний період піддавання впливу(зазвичай 6 або 24 години), який засновується на очікуванійтривалості піддавання дії людини. При подальшому періодіпіддавання дії, тварин утримують в метаболічних камерах дозапланованого закінчення терміну. Тварин потрібно зважати наознаки токсичності/аномальні реакції при однакових інтервалахпротягом всього дослідження. В кінці дослідження оброблена шкіраповинна оглядатись на наявність видимих ознак подразнення.
Метаболічні камери повинні забезпечувати окремий збірсечовини та фекалій протягом всього дослідження. Вони повиннідозволяти збір 4C-карбон діоксину та летких складових 14C-карбону,які повинні аналізуватись, коли продукуються в кількості (> 5%).Сечовина, фекалії та поглинаючі рідини (наприклад, 14C-карбондіоксин та леткі складові 14C) повинні збиратись окремо з кожноїгрупи при кожному разі відбору проб. Якщо наявна інформація, щоутворюється мало або не утворюється радіоактивний метаболіт, томожуть використовуватись відкриті клітки.
Екскременти збирають під час періоду піддавання дії, до24 годин після першого контакту зі шкірою, а потім щоденно післяпроведення експерименту. Хоча буде достатньо трьох інтервалівзбору екскрементів, передбачена мета підготовки тесту або існуючікінетичні дані можуть надавати більш придатні або додаткові часовіпереваги для дослідження.
В кінці періоду піддавання дії захисний механізм видаляєтьсяз кожної тварини та зберігається окремо для аналізу. Шкіра тварин,яка була оброблена, повинна промиватись принаймні тричі очисноюречовиною з використанням відповідних тампонів. Потрібнопотурбуватись, щоб інші частини тіла не забруднилися. Очиснаречовина повинна бути відповідати вимогам практичної гігієни,наприклад, водний мильний розчин. Наприкінці шкіру необхідновисушити. Всі тампони та миючі засоби можна зберегти для аналізу.Потрібно застосувати свіже покриття, щоб захистити обробленуділянку тих тварин, які формують групу для пізнішого дослідженняперед поверненням до індивідуальних кліток.
1.4.9. Заключні процедури
В кожній групі, потрібно знищити окремих тварин взапланований час та зібрати кров на аналіз. Захисний механізм абопокриття повинно видалятись для аналізу. Шкіра з обробленоїділянки та схожа ділянка не дозованої, виокремлено шкіри повинновидалятись з кожної тварини для окремого аналізу. Обробленаділянка може бути поділена на частини, щоб відділити роговий шарвід епідермісу, який лежить в основі, для того щоб надати більшеінформації про характер хімікату, який тестується. Визначенняцього характеру протягом часового періоду після періоду піддаваннядії повинні забезпечувати визначення долі будь-якого хімікату,який тестується, в роговому шарі. Щоб спростити поділ шкіри начастини (вслід за кінцевим миттям тканини та знищенням тварин)кожне захисне покриття видаляється. Оброблену ділянку шкіри, зкільцеподібним обідком оточуючої шкіри виокремлюють з тіла щура таприкріпляють до дошки. Смужка клейкої стрічки наноситься наповерхню шкіри за допомогою легкого тиску і стрічка видаляєтьсяразом з роговим шаром шкіри. Наступні смужки стрічки застосовуютьпоки стрічка вже більше не прилипає до шкіри, коли весь роговийшар видалений. Для кожної тварини, всі смужки стрічки можутькомбінуватись в окремому контейнері до якого додається засіб, якийстимулює травлення тканини для того, щоб розчинити роговий шар.Будь-які цільові тканини можуть видалятися для окремоговимірювання перед аналізом залишків туш тварин на дозу абсорбціїтушей. Туші окремих тварин повинні зберігатись для аналізу.Зазвичай достатньо аналізу загального вмісту. Цільові органиможуть видалятись для окремого аналізу (якщо визначено іншимидослідженнями). Сечовина, наявна у сечовому міхурі при знищенні,повинна додаватись до попереднього збору сечовини. Після зборуекскрементів з метаболічних кліток під час планового вбивства,клітки та пастки потрібно промити відповідним розчинником. Іншепотенційно забруднене обладнання повинно також аналізуватись.
1.4.10. Аналіз
У всіх дослідженнях потрібно досягнути відповідноговідновлення (тобто середнє значення 100 +- 10% радіоактивності).Відновлення за межами цих значень потрібно обґрунтовувати.Кількість застосованих доз в кожному зразку повинна аналізуватисьчерез відповідні обґрунтовані процедури.
Статистичні аналізи повинні включати величину коливань дляповторних експериментів для кожного застосування.
2. ДАНІ
Наступні вимірювання потрібно проводити для кожної тварини,при кожному відборі проб хіміката, який тестують та/абометаболітів. На додаток до індивідуальних даних, вони групуютьсяза періодами вибірки та повинні звітуватись як середні значення.
- кількість, що пов'язана з захисними пристроями,
- кількість, яку можна отримати зі шкіри,
- кількість в/на шкірі, яку не можна з неї змити,
- кількість у пробах шкіри,
- кількість в екскрементах та повітрі, що видихається (якщозастосовується),
- кількість, що залишилася у туші та будь-яких органах,видалених для окремого аналізу.
Кількість досліджуваної речовини та/чи метаболітів уекскрементах, у повітрі, що видихається, крові та в туші дозволяєвизначити загальну кількість, яка поглинається на кожний окремиймомент часу. Також можна отримати обрахунок кількості хімікату,який тестується, абсорбованого на кв.см шкіри та підданого діїдосліджуваної речовини протягом періоду піддавання дії.
3. ЗВІТУВАННЯ
3.1. ЗВІТ ПРО ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ
Звіт про проведення дослідження має включати вимоги,обумовлені в протоколі, включаючи обґрунтування тестової системи,яка використовувалась, та повинен охоплювати наступне:
Досліджувана речовина:
- ідентифікаційні дані (наприклад, номер РСХ, якщо віннаявний), джерело, чистоту (радіохімічну чистоту), відомі домішки,номер партії),
- фізичну природу, фізико-хімічні властивості (наприклад, pH,леткість, розчинність, стабільність, молекулярну масу такоефіцієнт розподілу).
Підготування тесту:
- формулювання та обґрунтування використання,
- докладна інформація про підготування дослідження, кількістьречовини, яка застосовується, отримана концентрація, розчинник,стабільність та гомогенність.
Піддослідна тварина:
- біологічні види/породи, які були використані,
