1.5.2. Вага тіла і споживання їжі/води батьківських тварин
Батьківські тварини (Р і F1) зважуються на перший деньдозування, а потім - принаймні щотижня. Батьківські самки (Р і F1)зважуються мінімум в період вагітності в день 0, 7, 14 і 20 або 21і впродовж лактації в ті самі дні, в які проводиться зважуванняпосліду, а також вдень, коли тварин умертвляють. Ці оглядипроводяться індивідуально для кожної дорослої тварини. Впродовжперіоду, що передує спарюванню і впродовж періоду вагітності,об'єм їжі, що споживається повинен вимірюватись, принаймніщотижня. Об'єм води, що споживається, вимірюється щотижня, якмінімум, якщо дослідна речовина подається з питною водою.
1.5.3. Менструальний цикл
Тривалість і періодичність менструального циклу оцінюєтьсядля самок Р і F1 шляхом вагінального мазка до спарювання, і,можливо, впродовж спарювання до виявлення ознак спарювання. Приотриманні клітин з вагіни/шийки матки необхідно звернути увагу нате, щоб не пошкодити слизову оболонку, що може призвести допсевдо-вагітності (1).
1.5.4. Параметри сперми
Для самців Р і F1 при завершені досліду вага яєчок таепідідимісу записується і по одному органу зберігається дляпроведення гістопатологічного дослідження (див. Розділ 1.5.7.,1.5.8.1). З групи самців, що складається принаймні з 10 особингруп Р і F1, яєчка та епідідиміс, що залишились, використовуютьсядля виявлення сперматидів, стійких до гомогенізації і резервівсперми в хвості придатку яєчка відповідно. Для цієї самої груписамців сперма з хвоста придатку яєчка або з сім'япроводузбирається для оцінки рухомості і морфології сперми. Якщоспостерігаються ефекти, пов'язані з прийманням дослідної речовини,або у випадку наявності підтверджень на підставі інших дослідженьможливих ефектів сперматогенезу, оцінювання сперми здійснюєтьсядля всіх самців при всіх рівнях дозування; в інших випадках оглядобмежується оглядом самців Р і F1 контрольної групи і групи звисоким рівнем дозування.
Загальна кількість тестикулярних сперматидів, стійких догомогенізації і сперми, що міститься в хвості придатку яєчка,повинна бути виміряна (2)(3). Резерв сперми, що міститься в хвостіпридатку яєчка може бути отриманий завдяки концентрації і об'ємусперми, отриманих шляхом ослаблення і/або гомогенізації тканинихвосту придатку, що залишилась.
Рухливість сперми в епідідимісі (або сім'япроводі) оцінюєтьсяабо записується на відео плівку безпосередньо до вбивання тварин.Необхідно слідкувати за тим, щоб ушкодження сперми при відборібуло мінімальним, сперму необхідно розчинити, використовуючиприйнятний метод (4), для проведення аналізу рухливості. Відсотокпрогресивно рухливої сперми визначається суб'єктивно абооб'єктивно. При проведенні комп'ютерного аналізу рухливості(5)(6)(7)(8)(9)(10) відхилення поступової рухливості знаходиться вмежах, визначених користувачем для середньої швидкості по заданійтраєкторії, прямолінійності або лінійного показника. Якщопроводиться зйомка проб на відео (11) або зображення записуютьсябудь-яким іншим чином під час розтину, може бути проведено аналізвиключно контрольної групи і групи з найвищим дозуванням самців Рі F1, якщо не спостерігається ефектів, викликаних дією дослідноїречовини; в цьому випадку необхідно також дослідити групи знижчими рівнями дозування. При відсутності відео або цифровихзображень, всі проби всіх груп аналізуються при розтині.
Необхідно провести морфологічний аналіз проб сперми вепідідимісі (або сім'япроводі). Сперма (принаймні 200 на однупробу) аналізується в вигляді мокрих препаратів, що містятьфіксатор (12) і класифікувати як нормальні або ненормальні.Зразками морфологічних аномалій сперми можуть бути зрощування,ізольовані головки, зміна форми головок і/або хвостів. Оцінюваннявиконується для вибраної групи самців всіх груп дозування абонегайно після вбивання тварин, або пізніше на підставі відео абоцифрової зйомки. Мазки після додання фіксатора також аналізуютьсяпізніше. В цих випадках контрольна група і група з найвищимдозуванням аналізуються першими. Якщо не виявлено будь-якихефектів, пов'язаних з дією дослідної речовини (наприклад, впливуна морфологію сперми), нема необхідності в проведені аналізу дляінших груп дозування. При виявлені ефектів, пов'язаних з впливомдослідної речовини в групі з найвищим дозуванням, необхіднопровести аналіз також для груп з нижчими рівнями дозування.
Якщо будь-які параметри оцінювання сперми вже досліджувалисьвпродовж аналізу загальної токсичності не пізніше, ніж за 90 днів,нема необхідності в повторенні аналізу при дослідженні двохгенерацій. Рекомендується, однак, зберегти зразки або цифровізаписи сперми генерації Р для того, щоб при необхідності провестиїх аналіз.
1.5.5. Потомство
Кожний послід досліджується якнайшвидше після народження(день лактації 0) для визначення кількості і статі новонародженихособин, мертвонароджених особин, живих особин і наявності значниханомалій. Новонароджені особини, що знайдені мертвими в день 0,якщо їх не мацеровано, бажано дослідити на предмет виявленняможливих дефектів і причин смерті, після чого - зберегти звикористанням фіксатора. Живих особин необхідно перерахувати ізважити індивідуально при народженні (день лактації 0) або в день1, а потім у визначення для зважування дні, наприклад, в дні 4, 7,14 і 21 лактації. Необхідно записувати аномалії фізичного розвиткуабо поведінки самок або потомства.
Фізичний розвиток потомства реєструється, в основному, якзбільшення ваги тіла. Інші фізичні параметри (наприклад, відкриттявух і очей, прорізування зубів, ріст шерсті) можуть надатидодаткову інформацію, але ці дані бажано аналізувати в контекстіданих статевого дозрівання (наприклад, відкриття вагіни абовідділення крайньої плоті від яєчок) (13). Рекомендується провестифункціональні дослідження (наприклад, моторної активності,сенсорної функції, рефлекторного онтогенезу) потомства F1 до і/абопісля припинення лактації, зокрема, ті, що пов'язані зі статевимдозріванням, якщо ці дослідження не є складовою частиною окремихдослідів. Вік, в якому відбулось відкриття вагіни або відділеннякрайньої плоті від яєчок визначається для потомства F1, щоприпинило ссання і призначене для спарювання. Аногенітальнавідстань вимірюється після народження в день 0 для новонародженихособин F2, якщо спостерігаються зміни в пропорції між статями вгрупі або відхилення в статевому дозрівання вказують на такунеобхідність.
Можна не виконувати функціонального огляду в групах, в яких вінший спосіб явно спостерігаються клінічні ознаки шкідливихефектів (наприклад, значене зниження приросту ваги і т.ін.). Припроведенні функціонального огляду такому огляду не підлягаєновонароджене потомство, призначене для спарювання.
1.5.6. Загальний розтин
Під час припинення досліду або смерті тварин впродовж дослідувсі батьківські тварини (Р і F1), всі новонароджені особини, уяких виявлено зовнішні аномалії або клінічні ознаки, а такожвипадково вибрані новонароджені особини/стать/послід від генераційF1 і F2 піддаються макроскопічному огляду на предмет виявленнябудь-яких структурних аномалій або патологічних змін. Особливуувагу необхідно приділити органам репродуктивної системи.Новонароджені особини, яких було безболісно вбито в передсмертномустані, якщо їх не було мацеровано, мають бути оглянуті на предметвиявлення можливих дефектів і/або причин смерті, після чогозбережені з використанням фіксатора.
Матки всіх самок, що народжували перший раз, необхіднодослідити способом, який не впливає на результатигістопатологічного дослідження, на предмет виявлення наявності ікількості місць імплантації.
1.5.7. Вага органів
Під час припинення досліду необхідно визначити вагу тіла івагу наступних органів батьківських тварин Р і F1 (парні органиповинні зважуватись окремо):
- матки, яєчників,
- яєчок, епідідемісу (загальну вагу і вагу хвоста),
- простати,
- сім'яних міхурів з коагуляційними залозами з рідинами, щомістяться в них і простати (як один орган),
- мозку, печінки, нирок, селезінки, гіпофізу, щитовидної інадниркової залози і відомих органів-мішеней,
Остаточна вага тіла визначається для новонароджених особин F1і F2, які вибрані для розтину. Наступні органи вибраних випадковоновонароджених особин/статі/посліду (див. Розділ 1.5.6.) повиннібути зважені: мозок, селезінка і зобна залоза.
Результати розтину і визначення ваги тіла оцінюються вконтексті оглядів, що проводились під час проведення іншихдослідів з повторним дозуванням, коли це є доцільним.
1.5.8. Гістопатологія
1.5.8.1. Батьківські тварини
Наступні органи і тканини батьківських тварин (Р і F1) абопредставників їх групи мають бути збережені за допомогою фіксатораі зберігатись у відповідному середовищі для гістопатологічногодослідження.
- Вагіна, матка з шийкою, яєчники (збережені у відповідномуфіксаторі),
- Одне яєчко (збережене в фіксаторі Буена або подібномуфіксаторі), один епідідиміс, сім'яні міхури, простата і коагуляційна гланда,
- Попередньо ідентифікований орган (органи)-мішені тварин Р іF1, відібраних для спарювання.
Необхідно провести повну гістопатологію збережених органів ітканин, зазначених вище, для всіх груп з високим рівнем дозуванняі для контрольної групи тварин Р і F1, відібраних для спарювання.Дослідження яєчників тварин Р не є обов'язковим. Органи, щодемонструють зміни, викликані дією речовини, також піддаютьсяогляду в групах з низьким і середнім рівнем дозування що дозволяєбільш повно проаналізувати NOAE. Крім того необхідно піддатигістопатологічному огляду репродуктивні органи тварин в групах знизьким і середнім рівнем дозування, у яких підозрюється зниженняплодючості, наприклад, тварин, спарювання, зачаття, заплідненняабо народження потомства у яких було неуспішним або тварин зпорушеним менструальним циклом, зміненою кількістю, рухомістю абоморфологією сперми. Необхідно дослідити всі значні ушкодження,такі як атрофія або пухлини.
Необхідно провести детальний гістопатологічний огляд яєчок(наприклад, з використанням фіксатора Буена, парафінової заливки,поперечного розрізу товщиною 4-5 мю м) для виявлення ефектів,викликаних дією дослідної речовини, таких як затримка сперматидів,втрата шарів або типів статевих клітин, наявність багатоядернихгігантських клітин або відторгнення сперматогенних клітин впорожнині трубчатої протоки (14). Огляд неушкодженого епідідимісуповинен включати в себе огляд головки, тіла і хвостоподібногопридатку, цей огляд може супроводжуватись подовжнім розрізом.Епідідиміс оцінюється на предмет інфільтрації лейкоцитів, змінидомінування типу клітин, наявності відхилень в клітинах окремихтипів, і фагоцитозу сперми. При оцінювання чоловічихрепродуктивних органів необхідно використовувати метод забарвленняPAS або гематоксиліном.
Яєчники після припинення лактації повинні містити в собіпервинні фолікули і фолікули, що розвиваються, а також великіжовті лактаційні тільця. Гістопатологічний огляд повинен виявитикількісне зниження популяції первинних фолікул. Кількісна оцінкапервинних фолікул проводиться для самок F1; кількість тварин,вибір розрізу яєчників, і розмір розрізу повинні бути статистичноприйнятними для оцінювання використовуваної процедури. Дослідженняповинно включати в себе визначення кількості первинних фолікул, щоможуть комбінуватись з малими фолікулами, що розвиваються дляпорівняння яєчників тварин групи, що піддавались дії дослідноїречовини і тварин контрольної групи (15)(16)(17)(18)(19).
1.5.8.2. Новонароджені тварини, лактацію яких припинено
Тканини і органи, у який виявлено значні відхилення, всіхновонароджених тварин, що мають зовнішні аномалії або клінічніознаки, а також органи новонароджених тварин, вибраних випадково:тварина/стать/послід з генерацій F1 і F2, яких не вибрано дляспарювання, обробляються фіксатором і зберігаються у відповідномусередовищі для гістопатологічного огляду. Повна гістопатологічнахарактеристика збережених тканин складається з особливим наголосомна органи репродуктивної системи.
2. ДАНІ
2.1. ПРЕДСТАВЛЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Данні записуються окремо і зводяться в таблицю, в якійпоказується для кожної дослідної групи і для кожної генераціїкількість тварин на початку дослідження, кількість тварин, щовмерли впродовж дослідження або безболісно вбитих тварин, чассмерті або безболісного умертвіння, кількість плідних тварин,кількість вагітних тварин, кількість тварин, що виявляють ознакиінтоксикації, опис ознак інтоксикації, що спостерігаються,включаючи час появи ознак, тривалість ознак, і ступінь кожноготоксичного ефекту, тип огляду батьків і потомства, типигістопатологічних змін, і всі відповідні дані стосовно посліду.
Числові результати оцінюються відповідним статистичнимметодом; статистичний метод вибирається як частина схеми досліду іповинен бути обґрунтований. Статистичні моделі, що враховуютьреакцію на дозу дослідної речовини, можуть виявитись корисними прианалізуванні даних. Звіт повинен включати в себе відповіднуінформацію щодо методу аналізу і комп'ютерної програми, щовикористовувалась, для того, щоб незалежний експерт/статистик мавзмогу повторно оцінити і переконструювати аналіз.
2.2. ОЦІНКА РЕЗУЛЬТАТІВ
Результати дослідження репродуктивної токсичності двохгенерацій оцінюються у відповідності викликаних до ефектів,включаючи результати розтину і мікроскопічного дослідження.Оцінювання включає в себе зв'язок або відсутність такого, міждозою дослідної речовини і присутністю або відсутністю ознак іскладності аномалій, включаючи значні ушкодження, ідентифікованіоргани-мішені, погіршення плодючості, клінічні аномалії,погіршення народжуваності і зменшення кількості посліду, зміниваги тіла, вплив на рівень смертності та інші токсичні ефекти.Фізико-хімічні властивості дослідної речовини, і якщо можливо,токсикокінетичні дані необхідно взяти до уваги при оцінюваннірезультатів досліду.
Відповідно проведене дослідження репродуктивної токсичностіповинно надати достовірну інформацію щодо рівня речовини, який невикликає шкідливих ефектів, і розуміння шкідливих ефектів нанароджуваність, пологи, лактацію, постнатальний розвиток,включаючи зростання і статевий розвиток.
2.3. ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТАТІВ
Дослідження репродуктивної токсичності двох генерацій надаютьінформацію щодо ефекту від повторної дії дослідної речовинивпродовж всіх стадій репродуктивного циклу. Зокрема, дослід надаєінформацію щодо репродуктивних параметрів, а також щодо розвитку,дозрівання і виживання потомства. Результати дослідуінтерпретуються разом з результатами, отриманими в ходісубхронічних, пренатальних, токсикокінетичних та інших досліджень.Результати цього досліду можуть використовуватись для оцінюваннянеобхідності наступного дослідження хімікату. Екстраполяціярезультатів досліду впливу даної речовини на людину дозволяється впевних межах. Найкращим способом використання результатів єотримання інформації щодо рівнів, що не викликають наслідків ідопустимої дози для людей (20)(21)(22)(23).
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
Звіт з досліду повинен містити в собі наступну детальнуінформацію про:
Дослідну речовину:
- фізичну природу, і якщо необхідно, фізико-хімічнівластивості,
- ідентифікаційні дані,
- чистоту.
Середовище-носій (якщо використовувалось)
- обґрунтування вибору середовища-носія, якщо відрізняєтьсявід води.
Піддослідні тварини:
- вид/штам, що використовувався,
- кількість, вік і стать тварин,
- джерело, умови проживання, харчування, устілковий матеріал,і т.ін.,
- індивідуальна маса тіла тварин на початку дослідження.
Умови дослідження:
- раціональне обґрунтування рівня доз,
- детальний опис формули дослідної речовини/приготування їжі,концентрація,
- стабільність і гомогенність препарату,
- деталі, що стосуються подання дослідної речовини,
- перехід від концентрацій дослідної речовини в їжі/питнійводі (ppm) до окремої дози (мг/кг маси тіла/день), якщозастосовується,
- деталі щодо якості їжі і питної води.
Результати:
- споживання їжі і води, якщо застосовується, ефективністьїжі (збільшення ваги тіла на грам спожитої їжі), споживаннядослідної речовини для тварин P і F1 за виключенням періодуспільного проживання і принаймні до останньої третини періодулактації;
- дані, що стосуються засвоєння (якщо доступні),
- дані, що стосуються мас тіла тварин P і F1, призначених доспарювання,
- дані, що стосуються мас послідів і новонароджених особин,
- вага тіла під час умертвіння, дані щодо абсолютної івідносної ваги тіла органів батьківських тварин,
- природа, складність і тривалість клінічних наслідків(виліковних або ні),
- час смерті впродовж досліду або факт виживання тварин доумертвіння,
- дані щодо токсичної реакції за статтю і дозами, включаючипоказники спарювання, плодючості вагітності, народження, виживанняі лактації; звіт повинен містити цифри, що було використано длярозрахунку цих показників,
- токсичний або інший ефект на репродукцію, потомство,постнатальний розвиток і т.ін.,
- результати розтину,
- детальний опис всіх результатів гістопатологічних дослідів,
- кількість самок Р і F1 з нормальним циклом і тривалістьциклу,
- загальна кількість сперми в хвостоподібному придатку іепідідимісі, відсоток прогресивно рухомої сперми, відсотокморфологічно нормальної сперми і відсоток сперми з виявленимианомаліями,
- час до спарювання, включаючи кількість днів до спарювання,
- період вагітності,
- кількість імплантацій, жовтих тілець, розмір посліду,
- кількість живих новонароджених тварин і пост-імплантаційнівтрати,
- кількість новонароджених тварин з виявленими ознакамианомалій, якщо відомо, до звіту необхідно включити кількістькарликових тварин,
- дані щодо основних етапів фізичного розвитку новонародженихтварин та інші дані щодо постнатального розвитку, оцінені етапифізичного розвитку мають бути обґрунтовані,
- дані щодо функціональних оглядів новонароджених і дорослихтварин, якщо застосовуються,
- статистичне представлення результатів, якщо необхідно.
Обговорення результатів.
Висновки, включаючи значення NOAEL для ефекту на організмматері і потомства.
4. ПОСИЛАННЯ
(1) Sadleir, R.M.F.S., (1979) Cycles and Seasons, In:Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilisation, C.R.Auston and R.V. Short (eds), Cambridge, New York.
(2) Gray, L.E. et al., (1989) A Dose-Reponse Analysis ofMethoxychlor-Indiced Alterations of Reproductive Development andFunction in the Rat. Fundamental and Applied Toxicology, 12,p. 92-108.
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production andEpididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats. Journal ofreproduction and Fertility 54: 103-107.
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991) The Method of SpermCollection Significantly Influences Sperm Motion ParametersFollowing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.Reproductive Toxicology, 5, p. 39-44.
(5) Seed, J. Et al., (1996). Methods for Assessing SpermMotility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: aConsensus Report. Reproductive Toxicology, 10(3), p. 237-244.
(6) Chapin, R. E, et al., (1992) Methods for Assessing RatSperm Motility. Reproductive Toxicology, 6, p. 267-273.
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992) Direct Effects of EthaneDimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an InVitro Demonstration. Journal of Andrology, 13, p. 409-421.
(8) Slott, V.L. et al., (1991) Rat Sperm Motility Analysis :Methodologic Considerations. Reproductive Toxicology, 5,p. 449-458.
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993) Computer-AssistedSperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using theHamilton-Thorn Motility Analyzer. In: Methods in Toxicology, PartA., Academic, Orlando, Florida, p. 319-333.
(10) Toth, G.P. et al., (1989) The Automated Analysis of ratSperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration:Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology,10, p. 401-415.
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987) ComputerisedVideomicrographic Analysis of rat Sperm Motility. Journal ofAndrology, 8, p. 330-337.
(12) Linder, R.E. et al., (1992) Endpoints of Spermatoxicityin the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen ReproductiveToxicants. Reproductive Toxicology, 6, p. 491-505.
(13) Korbenrot, C.C. et al., (1977) Preputial Separation asan External Sign of Pubertal Dvelopment in the Male Rate.Biological Reproduction, 17, p. 298-303.
(14) Russell, L.D. et al., (1990) Histological andHistopathological Evaluation of the Testis, Cache River Press,Clearwater, Florida.
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds) (1993) Part B.Female Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic,Orlando, Florida.
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assesment ofOvarian Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity.In: Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum,New York, p. 421-426.
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989) Test Methods forAssessing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In:Principles and Methods of Toxocilogy, A.W. Hayes (ed.), Raven,New York.
(18) Smith, B.J. et al., (1991) Comparison of Random andSerial Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. ReproductiveToxicology, 5, p. 379-383.
(19) Heindel, J.J., (1999) Oocyte Quantitation and OvarianHistology. In: An Evaluation and Interpretation of ReproductiveEndpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston, and C.A.Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
(20) Thomas, J.A., (1991) Toxic Responses of the ReproductiveSystem. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O.Amdur, J.Doull,and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
(21) Zenik, H. And E.D. Clegg, (1989) Assessment of MaleReproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principlesand Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press,New York.
(22) Palmer, A.K., (1981) In: Developmental Toxicology,Kimmel, C.A. and J. Buekle-Sam (eds.), Raven Press, New York.
(23) Palmer, A.K., (1978) In Handbook of Teratology, Vol. 4,J.G. Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.
B.36. ТОКСИКОКІНЕТИКА
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Відсутні.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина подається відповідним шляхом. В залежностівід мети досліду речовина може подаватись одноразово абодекількома дозами впродовж визначених періодів одній або декількомгрупам піддослідних тварин. Таким чином, в залежності від типудослідження речовина і/або метаболіти визначаються в рідинах,тканинах і/або екскретах.
Дослідження проводяться з дослідною речовиною в "неміченій"або "міченій" формі. Якщо використовується мічення, його слідрозташовувати в речовині таким чином, щоб надати якомога більшеінформації щодо перетворень складових речовини.
1.5. ЯКІСНІ КРИТЕРІЇ
Відсутні.
1.6. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.6.1. Підготовка
Молоді здорові тварини проходять акліматизацію в лабораторнихумовах принаймні впродовж п'яти днів до початку досліду. Допочатку досліду тварини випадково вибираються до дослідних груп. Вокремих ситуаціях можуть використовуватись дуже молоді твариниабо, що раніше використовувались в дослідах.
1.6.2. Умови проведення досліду
1.6.2.1. Піддослідні тварини
Токсикокінетичні дослідження можуть проводитись на одному абодекількох відповідних видах тварин, при цьому необхідно взяти доуваги види тварин, що використовувались або мають бути використанів токсикологічних дослідженнях тієї самої дослідної речовини. Якщов досліді використовуються гризуни розбіжність в вазі не повиннаперевищувати +- 20% від середньої ваги.
1.6.2.2. Кількість і стать
При дослідженні засвоєння і екскреції на початку досліду вкожній групі дозування повинно бути по чотири тварини.Використання окремої статі є не обов'язковим, але в деякихвипадках необхідно дослідити обидві статі. Якщо різні статіпоказують різну реакцію на речовину, необхідно дослідити по чотиритварини кожної статі. У випадку використання тварин, що не єгризунами, можна використовувати тварин меншого розміру. Придосліджені розподілу тканини, при визначенні початкової кількостірозміру групи необхідно врахувати кількість тварин, що має бутивбито на кожному етапі і кількість етапів досліду.
При дослідженні метаболізму розмір групи визначається увідповідності до задач досліду. Для дослідів з повторнимдозуванням і дослідів, що складаються з декількох етапів, привизначенні розміру групи необхідно врахувати кількість етапів ікількість тварин, призначених до умертвіння, однак, ця кількістьне повинна бути меншою за дві тварини. Розмір групи повинен бутидостатнім для оцінювання характеристик засвоєння, утримання івиводу дослідної речовини і/або її метаболітів (у відповідності доситуації).
1.6.3. Рівні доз
У випадку досліду з однократною дозою, необхідновикористовувати принаймні два рівні доз. В досліді повиннавикористовуватись низька доза, при якій не спостерігаєтьсятоксичного ефекту і висока доза, що викликає змінитоксикокінетичних параметрів або при якій викликається токсичнийефект.
У випадку досліду з повторною дозою використання дозинизького рівня є достатнім, але в деяких випадках використаннявисокої дози також може виявитись необхідним.
1.6.4. Спосіб приймання
При токсикокінетичних дослідах речовина подається одним і тимсамим способом, і у відповідних випадках, з використанням тогосамого середовища, що використовувалось або повинно буловикористовуватись в інших дослідах на токсичність. Досліднаречовина звичайно подається групам піддослідних тварин черезтрубку, з їжею, наноситься на шкіру або приймається інгаляційнимспособом впродовж визначених періодів. Внутрішньовенне введеннядослідної речовини може бути корисним при визначенні відносноїзасвоюваності речовини, що приймається іншими способами. Крімтого, впродовж внутрішньовенного введення дослідної речовини,можна отримати корисну інформацію щодо схеми розподілення.
Необхідно врахувати можливість реакції середовища-носія здослідною речовиною. Необхідно звернути увагу на різний рівеньзасвоєння при подачі дослідної речовини через зонд і з їжею і нанеобхідність чіткого визначення дози, особливо у випадку, колидослідна речовина подається з їжею.
1.6.5. Період нагляду
Всі тварини повинні оглядатись щодня, а ознаки токсичності таінші відповідні клінічні характеристики - записуватись, включаючидату початку, ступеню тяжкості і періоду тривання.
1.6.6. Процедура
Після зважування піддослідних тварин, дослідна речовинаподається відповідним способом. Піддослідні тварини до прийомудослідної речовини можуть бути утримані від їжі, якщо цевважається необхідним.
Засвоєння
Рівень і ступінь засвоєння дослідної речовини може бутиоцінений з використанням різних методів з використаннямконтрольних груп(1) або без них, наприклад шляхом:
----------------
(1) В цьому методі дослідна група є групою, в якій досліднаречовина подається іншим шляхом, який забезпечує повну біологічнудоступність дози.
- визначення об'єму дослідної речовини і/або метаболітів векскретах, таких як сеча, жовч, кал, повітря, що видихається іоб'єму речовини, що залишилась в тілі,
- порівняння біологічної реакції (наприклад, впродовждослідження гострої токсичності) в дослідній і контрольній і/абосателітній групі,
- порівняння об'єму речовини, що виділяється нирками і/абометаболіту в дослідній і контрольній групах,
- визначення зон у відповідності до величини плазми/часовоїкривої дослідної речовини і/або метаболітів, а також порівняння зданими контрольної групи.
Розподіл
На даний момент існує два підходи, один або обидва можутьвикористовуватись з метою проведення аналізу схем розподілу:
- корисна кількісна інформація може бути отримана врезультаті авторадіографічної техніки дослідження всього тіла,
- кількісна інформація може бути отримана шляхом омертвленнятварин в різний час після експозиції і визначення концентрації іоб'єму дослідної речовини і/або метаболітів в тканинах і органах.
Екскреція
При досліджені екскреції збирається сеча, кал, і повітря, щовидихається, в окремих випадках збирається жовч. Об'єм дослідноїречовини і/або метаболітів в цих екскретах вимірюється декількаразів після експозиції або до виходу 95% дози, що приймається, абовпродовж семи днів, в залежності від того, яка подія настанепершою.
В окремих випадках необхідно врахувати вихід дослідноїречовини в молоко тварин, що годують потомство.
Метаболізм
Для визначення обсягу і схеми метаболізму біологічні зразкианалізуються за допомогою відповідних технік. Необхідно визначитиструктури метаболітів і запропонувати відповідні метаболічнішляхи, де є необхідність відповісти на питання, що повстали врезультаті попередніх токсикологічних досліджень. Для отриманняінформації щодо шляхів метаболізму може бути корисно провестидослідження в лабораторних умовах.
Подальша інформація щодо взаємозв'язку метаболізму ітоксичності може бути отримана в результаті біохімічних дослідів,таких як визначення впливу на систему метаболізму ферментів,ослаблення зв'язків ендрогенних небілкових сульфгідрильнихскладових з макромолекулами.
2. ДАНІ
У відповідності до типу дослідження дані мають бутипредставлені у вигляді таблиці, проілюстрованої графічно, якщо ценеобхідно. Для кожної дослідної групи у відповідних випадкахнеобхідно визначити середнє і статистичне відхилення вимірів взв'язку з часом, дозуванням, тканинами і органами. Призастосуванні відповідних методів необхідно визначити областьзасвоєння, а також кількість і норми екскреції. У випадкудослідження метаболізму необхідно представити структуруідентифікованих метаболітів і можливі шляхи метаболізму.
3. ЗВІТНІСТЬ
3.1. ЗВІТ З ДОСЛІДУ
У відповідності до типу дослідження звіт з досліду, якщо цеможливо, повинен містити в собі наступну детальну інформацію про:
- вид/штам, джерело, умови оточення, дієту,
- характеристики мічених матеріалів, якщо вонивикористовуються,
- рівні дозування та інтервали між вживанням доз,
- шлях (шляхи) прийому речовини і середовища, щовикористовуються,
- токсичний та інші ефекти, що спостерігаються,
- метод визначення дослідної речовини і/або метаболітів вбіологічних зразках, включаючи повітря, що видихається,
- виміри, представлені в таблиці, стосовно статі, дози,режиму, часу, тканин і органів,
- представлення обсягу і часу засвоєння,
- метод характеризування та ідентифікації метаболітів вбіологічних зразках,
- метод біохімічних вимірів, пов'язаних з метаболізмом,
- запропоновані шляхи метаболізму,
- обговорення результатів,
- інтерпретація результатів.
3.2. ОЦІНКА ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
4. ПОСИЛАННЯ
Дивіться Загальний вступ до частини В.
В.37. ЗАТРИМАНА НЕЙРОТОКСИЧНІСТЬ ФОСФОРОРГАНІЧНИХ
РЕЧОВИН ПІСЛЯ ЗНАЧНОЇ ЕКСПОЗИЦІЇ
1. МЕТОД
1.1. ВСТУП
При оцінюванні і аналізі токсичних ефектів речовин важливовзяти до уваги потенціал окремих класів речовин викликатиспецифічні типи нейротоксичності, які не можуть бути виявлені підчас інших досліджень токсичності. Виявлено, що певніфосфорноорганічні речовини викликають затриману нейротоксичність ітому, їх слід розглядати як такі, що мають бути досліджені.
Можуть бути застосовані лабораторні скрінінг-тести дляідентифікації речовин, що можуть викликати затримануполіневропатію; однак, негативні результати лабораторнихдосліджень не є доказом того, що речовина не викликаєнейротоксичного ефекту.
Дивіться Загальний вступ до частини В.
1.2. ВИЗНАЧЕННЯ
Фосфорорганічні речовини містять вільні фосфорорганічніефіри, тіоефіри або ангідриди, що є органічними похіднимифосфорної кислоти, фосфорної кислоти і фосфороамідних кислот, таїхніх тіопохідних, або інші речовини, що можуть викликатизатриману нейротоксичність, що інколи спостерігається в речовинахцього класу.
Затримана нейротоксичність є синдромом, пов'язаним з тривалимзатриманим початком атаксії, дистальною аксонопатією хребта іпериферійного нерву, а також пригніченням і старіннямневропатичної цільової естерази (NTE) в нервовій тканині.
1.3. ЕТАЛОННІ РЕЧОВИНИ
Дослідні речовини можуть бути перевірені в позитивнійконтрольній групі з метою демонстрації того факту, що влабораторних дослідних умовах реакція дослідних тварин значно незмінюється.
Прикладом широко застосовуваного невротоксиканту єтри-о-трикрезилфосфат (CAS 78-30-8, Einecs 201-103-5, номенклатураCAS: фосфорна кислота, тріс(2-метилфенил)ефір), також відомий яктріс-о-трикрезилфосфат.
1.4. ПРИНЦИП МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дослідна речовина подається пероральним шляхом єдиною дозоюдомашнім курям, захищеним від холінергічних ефектів, коли ценеобхідно. За тваринами ведеться нагляд впродовж 21 дня на предметвиявлення аномалій в поведінці, атаксії і паралічу. Біохімічніаналізи, зокрема, пригнічення невропатії цільової естерази (NTE)проводяться на курях, що випадково вибираються до кожної групи, якправило, через 24 і 48 годин після дозування. Через двадцять одиндень після експозиції кури, що залишились умертвляються, післячого проводиться гістопатологічний огляд вибраних нервових тканин.
1.5. ОПИС МЕТОДУ ДОСЛІДЖЕННЯ
1.5.1. Підготовка
Здорові молоді дорослі кури, що не заражені інфекційнимихворобами, не приймали медикаментів, і не мають аномалій в ходівипадково відбираються і розподіляються до дослідних і контрольнихгруп, після чого вони проходять акліматизацію в лабораторнихумовах впродовж принаймні п'яти днів до початку досліду.
Клітки або приміщення, що мають достатню площу для того, щобкури могли вільно пересуватись, для того, щоб можна було оцінитиходу.
Дозування дослідної речовини відбувається звичайнопероральним шляхом з використанням зонду, желатинових капсул абоіншим подібним способом. Рідини можуть подаватись нерозчиненимиабо розчиненими у відповідному середовищі такому як кукурудзянемасло; тверді речовини необхідно розчинити, якщо це можливо,оскільки значні дози твердих речовин в желатинових капсулах можутьне засвоїтись організмом належним чином. Для безводних середовищнеобхідно знати токсичні характеристики середовища, а якщо вони невідомі, їх необхідно визначити до початку досліду.
1.5.2. Умови досліду
1.5.2.1. Піддослідні тварини
Рекомендується відбирати молодих дорослих курей в періодяйцекладки (Gallus gallus domesticus), віком від восьми до12 місяців. Використовуються породи і штами стандартного розміру,кури повинні бути вирощені в умовах, що дозволяють їм рухатисьвільно.
1.5.2.2. Кількість і стать
Крім дослідної групи використовується контрольна група, щовикористовує середовище-носія і позитивна контрольна група. Умови,в яких знаходиться контрольна група, що використовуєсередовище-носія, є ідентичними умовам дослідної групи окрімприймання дослідної речовини.
Кількість птахів в кожній групі повинна бути достатньою длятого, щоб можна було умертвити принаймні шість птахів дляпроведення біохімічного аналізу (по три особини за два етапи). Ашість залишити живими для проведення 21-денного огляду на предметвиявлення патології.
Досліди в позитивній контрольній групі можуть поводитисьпаралельно або може використовуватись остання контрольна групазгідно з історією досліду. Група може складатись принаймні з шестикурей, що піддавались дії відомого хімікату, що викликає затриманунейротоксичність - три птаха для біохімічного аналізу і три птахадля дослідження патології. Рекомендується періодичне поновленняісторичних даних. Нові дані щодо позитивної контрольної групирозробляються у випадках, коли в лабораторії, що проводить дослідзмінюється будь-який значний елемент (наприклад, штам, раціон,умови проживання) або умови проведення досліду.
1.5.2.3. Рівні доз
Необхідно провести попередній дослід з використаннямвідповідної кількості курей і груп з різними рівнями доз длявстановлення рівня, що буде використовуватись під час основногодосліду. Певний рівень летальності є необхідним при проведенніцього попереднього досліду для визначення адекватної дози дляосновного досліду. Однак, для уникнення смертності в результатігострих холінергічних ефектів, можна використовувати атропін абоіншу захисну речовину, що відома як така, що не впливає назатриману нейротоксичну реакцію. Можуть використовуватисьрізноманітні методи досліду для визначення максимальної дозидослідної речовини, що не призводить до смерті (Дивіться методВ.1bis). Історичні дані щодо курей або інша токсикологічнаінформація може також бути використана при виборі дози.
Рівень дози дослідної речовини в основному досліді повиненбути якомога вищим, приймаючи до уваги результати попередньогодосліду для вибору дози, і найвищу граничну дозу 2 000/мг/кг вагитіла. Можливі випадки смертності не повинні вплинути на необхіднукількість птахів, що будуть використовуватись в біохімічномуаналізі (шість) і в гістологічному дослідженні (шість) впродовж21 дня. Атропін або інша захисна речовина, що відома як така, щоне впливає на затриману нейротоксичну реакцію повиннавикористовуватись для уникнення смертності внаслідок гостриххолінергічних ефектів.
1.5.2.4. Тест на граничний вміст
Якщо в результаті досліду при рівні дози принаймні2 000 мг/кг ваги тіла з використанням процедур, описаних для цьогодосліду, не виявлено токсичних ефектів і, якщо токсичність неочікується на підставі даних, отриманих відносно структурнопов'язаних речовин, в проведенні досліду з вищим рівнем дози неманеобхідності. Цей тест на граничний вміст застосовується завинятком тих випадків, коли дія дослідної речовини на людинувказує не необхідність застосування вищого рівня дози.
1.5.3. Період нагляду
Період нагляду повинен складати 21 день.
1.5.4. Процедура
Після прийому захисної речовини для уникнення смертностівнаслідок гострого холінергічного ефекту, подається одна дозадослідної речовини.
Загальний огляд
Огляди повинні розпочатись негайно після експозиції. Всі куриуважно оглядаються декілька разів впродовж перших двох днів, апотім принаймні один раз на день вподовж 21 дня або дозапланованого умертвіння. Всі ознаки токсичності необхіднозаписати, включаючи час виявлення, тип, ступінь складності ітривалість аномалій в поведінці. Атаксія оцінюється увідповідності до звичайної шкали, що складається принаймні зчотирьох рівнів, випадки виявлення паралічу мають бути записані.Принаймні два рази на тиждень кури, відібрані для патологічногодослідження, виводяться за межі кліток і примушуються доперіодичної моторної активності, такої як, піднімання по драбині,для полегшення виявлення мінімального токсичного ефекту. Птахи впередсмертному стані або тварини, що мають значні розлади або більпісля виявлення цих ознак повинні бути усунені, безболісно вбиті іпіддані розтину.
Вага тіла
Всі кури мають бути зважені безпосередньо до поданнядослідної речовини і принаймні один раз на тиждень після цього.
Біохімія
Шість курей, вибраних випадково з дослідної і контрольноїгрупи, що використовували середовище-носія, і три курки зпозитивної контрольної групи (якщо ця група досліджуєтьсяпаралельно) вбиваються впродовж декількох днів після дозування, амозок і поперековий відділ хребта мають бути підготовлені іпроаналізовані на предмет виявлення ознак пригніченняневропатичної цільової естерази. Крім того, може виявитисьнеобхідною підготовка і аналіз тканини сідалищного нерву напредмет виявлення ознак пригнічення невропатичної цільовоїестерази. Звичайно три птаха з контрольної і кожної дослідноїгрупи умертвляються після 24 годин, а три птаха - після 48 годин,оскільки три курки з позитивної контрольної групи мають бути вбитівпродовж 24 годин. Якщо огляд на предмет виявлення клінічних ознакінтоксикації (часто можуть оцінюватись шляхом визначення часупочатку холінергічних ознак) вказує на те, що токсична речовинавиводиться дуже повільно, доцільнішим може бути взяття пробитканини трьох птахів впродовж кожного з двох термінів між 24 і72 годиною після дозування.
Аналіз ацетилхолінестерази (AChE) також може бути проведенона цих зразках, якщо це доцільно. Однак, спонтанна реактиваціяAChE може відбутись in vivo і, таким чином, призвести донедооцінки потенціалу речовини в якості інгібітору AChE.
Загальний розтин
Загальний розтин всіх тварин (вбитих за планом і вбитих впередсмертному стані) повинен включати в себе огляд зовнішньоговигляду мозку і хребта.
Гістопатологічний огляд
Нервові тканини тварин, що вижили впродовж періоду огляду, іне використовувались для біохімічних дослідів, повинні піддатисьмікроскопічному огляду. Тканини обробляються фіксатором in situ звикористанням техніки перфузії. Необхідно виконати розрізи мозочку(середній подовжній рівень), видовженого мозку, хребта іпериферійних нервів. Розріз хребта виконується на потиличномусегменті, середньо-грудній і попереково-крижовій зоні. Необхідновиконати розрізи дистальної зони, тибіального нерву і їхвідгалуження до литкового м'язу, а також сідалищного нерву.Розрізи необхідно дослідити, шляхом мієлінового абоаксон-специфічного плямування.
2. ДАНІ
Негативні результати в критичних точках, вибраних для цьогометоду (біохімія, гістопатологія і дослідження поведінки) звичайноне вимагають подальшого дослідження затриманої невпротоксичності.Неоднозначні або неостаточні результати в цих критичних точкахможуть вимагати проведення подальших дослідів.
